CN113817744A

CN113817744A - 一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因及成熟肽蛋白和应用

Info

Publication number: CN113817744A
Application number: CN202111339161.XA
Authority: CN
Inventors: 喻大鹏; 鲁义善; 夏立群; 夏洪丽; 黄瑜; 蔡佳; 黎源; 陈建林; 陈文捷
Original assignee: Shenzhen Yihai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Current assignee: Shenzhen Yihai Biotechnology Co ltd; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2021-12-21

Abstract

本发明公开了一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin基因及成熟肽蛋白和应用，本发明编码了尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin基因的ORF获得尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白，并利用尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的尼罗罗非鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

Description

一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因及成熟肽蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物技术制药工业中基因工程领域，特别是一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因及成熟肽蛋白和应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)是生物体内产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，具有广谱的抗菌性能，在生物体先天性免疫防御方面发挥重要作用。抗菌肽是一种由基因编码，富含正电荷氨基酸残基形成的阳性短肽，能够通过静电作用与阴离子靶膜相互作用，从而破坏入侵的病原微生物被膜结构完整性，起到抗菌的效果。由于这种特殊的作用机制，抗菌肽在发挥抗菌作用的同时不容易对病原微生物产生耐药性。目前，抗菌肽已经广泛应用于畜牧业的动物饲料添加剂，而在水产养殖业中能够使用的抗菌肽添加剂种类较少。因此，生产无公害抗菌肽替代抗生素应用于水产动物饲料添加剂的原料有助于疾病预防与治疗。

尼罗罗非鱼NK-Lysin蛋白也是一种抗菌肽，由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌，储存在溶细胞颗粒中，对多种细菌、真菌、原生动物、病毒，都具有广谱的抗菌性能。NK-Lysin蛋白属于鞘脂激活蛋白样蛋白(SALIP)家族成员，由5个外显子和4个内含子组成，其编码的成熟肽蛋白序列包含一个保守的鞘脂激活蛋白B结构域和六个半胱氨酸。NK-Lysin成熟肽保守的六个半胱氨酸通过两两配对(C1-C6；C2-C5；C3-C4)构成三对分子内二硫键，由此形成α-螺旋结构在细胞膜中形成孔，使得NK-Lysin蛋白以非特异性方式渗透穿过病原微生物的脂质双层膜，进入并且积聚于细胞质与核酸结合，最终导致病原微生物死亡。

因此，将尼罗罗非鱼NK-lysin蛋白作为一种水产养殖业病害预防与治疗药物的开发和利用将产生很高的经济价值，但采用提取或合成的方法生产NK-Lysin蛋白的工艺存在工艺复杂、成本较高、且获取量少的缺点，无法满足市场需求，提高NK-lysin蛋白产量是一个急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因及成熟肽蛋白和应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明的第一个目的是要提供一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因，所述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是要提供一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，利用上述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列通过PCR扩增获得，所述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是要提供一种包含上述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体。

本发明的第四个目的是要提供一种包含上述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株。

本发明的第五个目的是要提供一种重组毕赤酵母GS115菌株的制备方法，将尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选高拷贝转化子重组毕赤酵母GS115菌株。

本发明的第六个目的是要提供一种制备尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，将重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

本发明的第七个目的是要提供一种利用制备尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法制得的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

本发明的第八个目的是要提供尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白在制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明编码了尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF获得尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，并利用尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

附图说明

图1为尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因ORF及其编码成熟肽序列PCR扩增电泳图。

图2为表达重组载体pPIC9K/NK-Lysin酶切电泳图。

图3为重组毕赤酵母GS115菌株表型鉴定PCR电泳图。

图4为尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

本实施例的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因是利用本实验室尼罗罗非鱼转录组测序结果，结合在线比对NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，筛选出NK-Lysin基因(Accession number:MF678822.1)全长序列。根据NK-Lysin基因ORF序列，设计两对引物(表1)，以尼罗罗非鱼组织cDNA为模板进行巢式PCR扩增。第一轮PCR利用引物OnNK-OF/OnNK-OR扩增出尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因ORF序列，分子量大小为432bp。第二轮PCR利用的上游引物OnNK-MF是在ORF序列的第67位碱基起24个碱基前加入EcoRⅠ酶切位点以及3个保护碱基，下游引物OnNK-MR是在ORF序列的第408位碱基起22个碱基前加入His标签、NotⅠ酶切位点以及10个保护碱基，扩增出尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因编码成熟肽的序列，分子量大小为411bp。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃预变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃完全延伸10min。PCR扩增产物的电泳图如图1所示，图1中：M泳道：2000bp Marker；泳道1：尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因ORF；泳道2：尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin编码成熟肽序列。

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)纯化目的基因PCR产物，连接至T4载体(Takara Bio)，重组载体导入TOP10感受态细胞，阳性克隆送至生工生物工程(SHANGHAI)股份有限公司进行测序。根据测序结果，将基因序列进行NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与DNAMAN软件推导翻译的蛋白序列。NK-Lysin基因ORF序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

表1

实施例2

利用尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的可以构建重组毕赤酵母GS115菌株，其方法为：将尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选高拷贝转化子重组毕赤酵母GS115菌株，以下进行详细阐述。

首先，构建真核表达重组载体pPIC9K/NK-Lysin，具体操作如下：

利用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶(Takara Bio)对第二轮纯化后的PCR产物和pPIC9K质粒进行双酶切37℃处理4h，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)回收DNA片段，利用T4 DNA连接酶(TakaraBio)37℃过夜处理，重组载体导入TOP10感受态细胞，阳性克隆送至生工生物工程(SHANGHAI)股份有限公司进行测序。筛选测序正确后的菌株，摇瓶大量培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)提取质粒备用；构建成功的重组质粒分别命名为pPIC9K/NK-Lysin。构建成功的pPIC9K/NK-Lysin重组载体酶切电泳图如图2所示，图2中：M泳道：2000bp Marker；泳道1：重组载体pPIC9K/NK-Lysin酶切结果。

然后，需要制备毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，具体操作如下：

挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于10mL YPD培养基(Sangon Biotech,SHANGHAI)，置于30℃、250rpm振荡过夜培养。吸取活化后的菌液加入到新鲜的100mL YPD液体培养基，置于30℃、250rpm振荡培养至OD₆₀₀值达到1.3～1.5。取该培养液4℃、5000rpm离心5min，弃上清，扣干离心管壁。加入50mL冰预冷无菌水振荡重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体。加入20mL 1mol/L冰预冷的无菌山梨醇溶液(Sangon Biotech,SHANGHAI)重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体。最后加入200μL冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100μL/管，-80℃冰冻保存。

其次，将表达重组载体pPIC9K/NK-Lysin电击导入毕赤酵母GS115菌株获得重组毕赤酵母GS115菌株，具体操作如下：

将-80℃保存的毕赤酵母GS115菌株接种到液体YPD培养基(Sangon Biotech,SHANGHAI)中进行活化；将pPIC9K/NK-Lysin重组质粒用SalⅠ(Takara Bio)酶切线性化，胶回收目的片段；将鲑鱼精DNA(Takara Bio)沸水浴5min迅速置于冰上备用；将上述制备的液体分别加入到预冷0.2cm的电转杯(Bio-Rad)中，混匀后置于冰上10min，然后在电转仪(Bio-Rad)中进行电击(电击条件：1500V，5ms)，立即取1mol/L山梨醇500μL加入到电转杯中，吸取200μL涂布在MD平板上30℃培养3-5d。设定对照组1：空载体pPIC9K电转后，同样操作涂到MD平板上；对照组2：吸取制备的毕赤酵母GS115菌株感受态细胞200μL涂布到MD平板上。

最后，筛选高拷贝转化子重组毕赤酵母GS115菌株，具体操作如下：

通过设置G418(

LIFE SCIENCES)浓度梯度1、2、3、4、5mg/mL筛选重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株阳性高拷贝转化子。用灭菌牙签挑取MD平板上长出的单菌落递进接种到含有不同浓度G418的YPD平板上，置于30℃培养2-3d，挑取能在5mg/mL的G418-YPD平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒(TIANGENBIOTECH；BEIJING)提取基因组DNA，利用pPIC9K质粒通用引物进行PCR扩增(表1)，鉴定Mut⁺(methanol utilization plus)或Mut^s(methanol utilization slow)表型。重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株PCR扩增电泳结果如图3所示，图3中：1-4：GS115空载菌株；5-11：Mut+型的重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株。

实施例3

重组毕赤酵母GS115菌株可以高效表达尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白，具体操作如下：

选取表型为Mut⁺单克隆接种于25mL BMGY液体培养基中，置于30℃、250rpm振荡培养至OD600值达到2～6；4℃、5000rpm离心5min，弃上清，重悬菌体转移至1L锥形瓶，加入0.5％～1.0％甲醇，盖上两层灭菌纱布，30℃、250rpm诱导表达96h(诱导每24h添加一次甲醇)，尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中。获得尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白后，需要对其进行纯化，具体纯化方法如下：1.塞子堵紧纯化柱底部，加入1mL Ni-NAT His-Bind Resin，静置待填料自然沉降，填充柱子，形成柱体。2.取下塞子，使液体自然流出，滤完保护液，按如下顺序洗柱：5mL ddH₂O洗柱2次；2mL 1×离子缓冲液洗柱3次；5mL 1×结合缓冲液洗柱1次。3.将PBS溶解的蛋白轻轻上柱，重复3次，并收集过柱液。4.用4mL不同浓度1×咪唑(20、40、60、80、100、250mM)洗柱1次，收集每次过柱液。5.加入4mL1×剥离液洗脱蛋白，收集过柱液。6.将收集的过柱液进行SDS-PAGE检测，确定蛋白纯化效果。7.通过检测得到条带单一且大小正确的过柱液加入透析袋(规格8000-14000Da)中，透析夹夹紧，放入冷冻的1×PBS溶液中进行透析。每隔3h更换透析液，共换3次。8.透析完成后，向透析袋表面加入适量PEG 2000进行浓缩，浓缩到一定体积后，收集蛋白溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。9.用NanaDrop 2000微量分光光度计测量浓缩蛋白浓度，随后将蛋白溶液分装于1.5mL离心管，转移至-80℃冰箱待用即得尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE电泳结果如图4所示，图4中：泳道1：上清表达的OnNK-Lysin蛋白；泳道2：纯化后的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白；M泳道：180-10kDa蛋白Marker。

实施例4

为了验证尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的抗菌性能，检测尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白最小抑菌浓度，具体检测过程如下：选取4株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌、海豚链球菌)和12株革兰氏阴性菌(迟缓爱德华氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌、宋内志贺氏菌、铜绿假单胞菌、豚鼠气单胞菌、普通变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌)，分别吸取新鲜活化的菌液，用LB液体培养基稀释至1×10⁶CFU/mL，依次吸取100μL菌液加入96孔板第1～6孔，然后依次加入100μL浓度为500、250、125、62.5、32.15、15.63μg/mL的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白，使得每孔尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的终浓度依次为250、125、62.5、32.15、15.63、7.81μg/mL；阳性对照组加入等体积终浓度为200μg/mL卡那霉素溶液，阴性对照加入等体积的无菌PBS溶液；置于37℃培养24h，酶标仪测定各孔OD₆₀₀吸光值。尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白抑菌效果如表2所示。

表2

由表2可知，本发明的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白对部分革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有显著的抑菌效果；因此，能够用于制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东海洋大学深圳研究院深圳义海生物科技有限公司

<120> 一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因及成熟肽蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因)

<400> 1

atggagatgc cttcactcat ctttccgtgc cttgtggcaa cattttcagt ccgtgctgtc 60

catggacgga ccttagaggt cagcatcgat gatgaagagg acgtggacat ggaagtcttg 120

atggggcttc caggaaagtg ctgggcttgc aagtggattt taaacaaggt gaagaaactt 180

gcaggaccaa accccactgc agagagcctg aagtcaaagt tgctctctgt ctgcgatggt 240

attggactct taaaatcact gtgccgcaaa tttgtgaagg cccaccttgg agaattaatt 300

gaggaactca caacaactga tggtgtgagg accatctgtg tcaacatggg agcatgcaag 360

tcaaaggagt tggagctgct cttttatgca gagaatggag gtccacttat tgacgttaag 420

gagcttgact ga 432

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列(尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白)

<400> 2

Met Glu Met Pro Ser Leu Ile Phe Pro Cys Leu Val Ala Thr Phe Ser

1 5 10 15

Val Arg Ala Val His Gly Arg Thr Leu Glu Val Ser Ile Asp Asp Glu

20 25 30

Glu Asp Val Asp Met Glu Val Leu Met Gly Leu Pro Gly Lys Cys Trp

35 40 45

Ala Cys Lys Trp Ile Leu Asn Lys Val Lys Lys Leu Ala Gly Pro Asn

50 55 60

Pro Thr Ala Glu Ser Leu Lys Ser Lys Leu Leu Ser Val Cys Asp Gly

65 70 75 80

Ile Gly Leu Leu Lys Ser Leu Cys Arg Lys Phe Val Lys Ala His Leu

85 90 95

Gly Glu Leu Ile Glu Glu Leu Thr Thr Thr Asp Gly Val Arg Thr Ile

100 105 110

Cys Val Asn Met Gly Ala Cys Lys Ser Lys Glu Leu Glu Leu Leu Phe

115 120 125

Tyr Ala Glu Asn Gly Gly Pro Leu Ile Asp Val Lys Glu Leu Asp

130 135 140

Claims

1.一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因，其特征在于：所述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，其特征在于，利用权利要求1所述的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列通过PCR扩增获得，所述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求2所述尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体。

4.一种包含权利要求2所述的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株。

5.一种如权利要求4所述的重组毕赤酵母GS115菌株的制备方法，其特征在于：将尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选高拷贝转化子重组毕赤酵母GS115菌株。

6.一种制备尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，其特征在于，将重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

7.一种如权利要求6所述的制备尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法制得的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。

8.如权利要求7所述的尼罗罗非鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白在制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的药物中的应用。