CN113862277B - 一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用 - Google Patents

一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用，通过编码斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin基因的ORF获得斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白，并利用斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的斜带石斑鱼抗菌肽NK‑Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。

Description

一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术制药工业中基因工程领域，特别是一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用。
背景技术
斜带石斑鱼NK-Lysin蛋白是一种抗菌肽，结构非常保守，属于鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like proteins，SALIP)家族成员。研究显示，该蛋白由白细胞介素2激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞产生，可以有效抵御致病菌感染，提高机体免疫功能。NK-Lysin蛋白是由5个外显子和4个内含子组成，具有非常保守的鞘脂激活蛋白B结构域和6个半胱氨酸，同时这6个半胱氨酸两两配对(C1-C6；C2-C5；C3-C4)形成特殊的内二硫键结构，使得该蛋白可以有效的附在细胞膜上形成孔，有效穿过微生物的脂质双层膜，进入细胞内部，杀灭细菌。
近些年来，采用原核表达系统生产基因工程药物已经非常成熟，但抗菌肽对细菌具有杀灭作用，不适用于原核表达系统直接表达抗菌肽。因此，本研究采用真核表达菌株酵母菌作为基因工程受体菌，酵母菌具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。
因此，本技术方案将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin蛋白作为外源基因，成功转化入酵母，利用酵母表达抗菌肽，可以有效降低成本，提高产量，如后期能在表达产率上得到进一步提高，将及早实现抗菌肽进入临床应用，解决市场需求。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因，以斜带石斑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增获得，所述斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。以斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明的以另一种实施方案，一种制备斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，包括以下步骤：
1)构建斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体；
2)制备毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；
3)将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株；
4)将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。
进一步地，所述步骤1)具体包括：
利用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶Takara Bio对成熟肽蛋白序列纯化后的PCR产物和pPIC9K质粒，同时进行双酶切，37℃水浴处理4h，酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完全，并利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，利用T4 DNA连接酶TakaraBio16℃水浴过夜处理，重组载体导入TOP感受态细胞中，阳性克隆后进行测序，筛选测序正确后的菌株，摇瓶大量培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒备用；构建成功的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体命名为pPIC9K/NK-Lysin。
进一步地，所述步骤2)具体包括：
挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于10mL YPD培养基，置于30℃、250rpm振荡过夜培养；吸取活化后的菌液加入到新鲜的100mL YPD液体培养基中，重新置于30℃、250rpm振荡培养至OD600值达到1.3-1.5；取该培养液在4℃、5000rpm离心5min，弃上清，扣干离心管壁，加入50mL冰预冷无菌水振荡重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体；加入20mL、1mol/L冰预冷的无菌山梨醇溶液重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体；最后加入200μL冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100μL/管，-80℃冰冻保存即得毕赤酵母GS115菌株感受态细胞。
进一步地，所述步骤3)具体包括：
将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体用SalⅠ酶切线性化，胶回收目的片段；将上述制备的液体分别加入到预冷0.2cm的电转杯中，混匀后置于冰上10min，然后在电转仪(Bio-Rad)中进行电击(电击条件：1500V，5ms)，立即取1mol/L山梨醇500μL加入到电转杯中，吸取200μL涂布在MD平板上30℃培养3-5d，取200μL毕赤酵母GS115菌株感受态细胞涂布到MD平板上培养，获得重组毕赤酵母GS115菌株pPIC9K/NK-Lysin-GS115；
用灭菌牙签挑取MD平板上长出的单菌落递进接种到含有浓度梯度为1、2、3、4、5mg/mL的G418-YPD平板上，置于30℃培养2-3d，挑取能在5mg/mL的G418-YPD平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA，利用pPIC9K质粒通用引物进行PCR扩增，鉴定Mut+或Muts表型，Mut+表型的菌株即为重组毕赤酵母GS115菌株。
进一步地，所述步骤4)具体包括：
重组毕赤酵母GS115菌株接种于25mL BMGY液体培养基中，置于30℃、250rpm振荡培养至OD600值达到2～6；4℃、5000rpm离心5min，弃上清，重悬菌体转移至1L锥形瓶，加入0.5％～1.0％甲醇，盖上两层灭菌纱布，30℃、250rpm诱导表达96h，诱导过程中每24h添加一次甲醇，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中，提取斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白后进行纯化获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。
另一方面，本发明的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白能够用于制备水产养殖病害预防和治疗药物或添加剂或日化用品添加剂。
与现有技术相比，本发明编码了斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF获得斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，并利用斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白构建能够大量表达斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的重组毕赤酵母GS115菌株，获得的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白纯化后能够制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。
附图说明
图1为斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因ORF及其编码成熟肽序列PCR扩增电泳图。
图2为重组载体pPIC9K/NK-Lysin酶切电泳图。
图3为重组毕赤酵母GS115菌株表型鉴定PCR电泳图。
图4为斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
首先，对以下实施例所需试剂及其配置方法进行如下说明：
(1)氨苄青霉素(Amp+)储存液：用超纯水配制终浓度为100mg/mL的氨苄青霉素溶液，经0.22μm滤膜过滤，分装成1mL/管，-20℃保存备用。
(2)LB液体培养基：称取酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g，溶于1000mLddH2O，高温高压灭菌，4℃保存。
(3)Amp+/LB液体培养基：在1000mL的LB液体培养基中加入1mL的Amp+储存液，使其终浓度达到100μg/mL；加入终浓度为1.5％的琼脂粉即为固体培养基。
(4)酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基：称取10g Yeast Extract(酵母膏)，20gPeptone(蛋白胨)溶解于900mL去离子水，高温高压灭菌，再加入100mL 20g Glucose(葡萄糖)灭菌溶液(过滤除菌或高温高压灭菌)。如制平板加入20g琼脂粉。
(5)10×YNB(13.4％的无氨基酸酵母氮源)：称取134g YNB固体溶于1L蒸馏水，过滤灭菌，4℃保存。
(6)500×B(0.02％生物素)：称取生物素20mg溶解于100mL ddH2O，过滤灭菌，4℃保存。
(7)10×D(20％葡萄糖)：称取200g D-葡萄糖溶于1L ddH2O，过滤灭菌，4℃保存。
(8)10×GY(10％的甘油)：量取100mL甘油溶于900mL ddH2O，过滤灭菌，4℃保存。
(9)MD选择培养基(100mL体系)：称取琼脂糖2g(20g/L)溶解于80mL ddH2O，121℃灭菌20min，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×D 10mL(20g/L)，500×B 0.2mL(4×10-4g/L)。
(10)BMGY培养基(Buffer Glycerol-complex)：称取酵母粉10g，蛋白胨20g，溶于700mL ddH2O，高压灭菌20min，冷却至室温，加入100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×GY，100mL 1mol/L磷酸钾(p H 6.0)，4℃保存备用。
(11)BMMY培养基(Methanol-complex Medium)：称取酵母粉10g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水中，高压高压灭菌20min，冷却至室温，加入100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 1mol/L磷酸钾(p H 6.0)，甲醇5mL，4℃保存备用。
(12)8×结合缓冲液：称取NaCl 46.75g，Tris 3.876g，ddH2O定容至200mL，调节pH至8.0；使用ddH2O稀释8倍成1×结合缓冲液。
(13)2M咪唑母液：称取13.6g咪唑用ddH2O定容至100mL；分别吸取400、800、1200、2000、5000咪唑母液加入到39.6、39.2、38.8、38.0、35.0mL的1×结合缓冲液，配制成20、40、60、100、250mM咪唑溶液。
(14)8×离子缓冲液：称取硫酸镍10.514g，ddH2O定容至100mL。
剥离液：称取NaCl 2.95g，Trizma Base 0.24g，EDTANa2 3.72g，ddH2O定容至100mL，调节pH至8.0。
首先，利用PCR技术扩增斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF及其编码成熟肽序列，具体方法为：
根据本实验室斜带石斑鱼转录组数据，比对NCBI上其他物种NK-Lysin基因序列。根据转录组中NK-Lysin基因ORF序列，设计一对引物(表1)，以斜带石斑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列，分子量大小为465bp，送测序检测正确后，再以斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出斜带石斑鱼NK-Lysin的成熟肽序列。克隆成熟肽序列的上游引物AoNK-MF插入EcoRⅠ的酶切位点，下游引物AoNK-MR依次加入NotⅠ的酶切位点和HIS组氨酸标签。PCR扩增程序为：PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃预变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃完全延伸10min。PCR扩增产物的电泳图如图1所示，图1中：M泳道：2000bp Marker；泳道1：斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因ORF；泳道2：斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin编码成熟肽序列。
直接将PCR产物送由至生工生物工程(SHANGHAI)股份有限公司进行测序。根据测序结果，将基因序列进行NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与DNAMAN软件推导翻译的蛋白序列。NK-Lysin基因ORF序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
表1
然后进行真核表达重组载体pPIC9K/NK-Lysin的构建，利用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶(Takara Bio)对成熟肽序列纯化后的PCR产物和pPIC9K质粒，同时进行双酶切，37℃水浴处理4h，酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完全，并利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)回收目的片段，利用T4 DNA连接酶(Takara Bio)16℃水浴过夜处理，重组载体导入TOP感受态细胞中，阳性克隆送至生工生物工程(SHANGHAI)股份有限公司进行测序。筛选测序正确后的菌株，摇瓶大量培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)提取质粒备用；构建成功的重组质粒分别命名为pPIC9K/NK-Lysin。构建成功的pPIC9K/NK-Lysin重组载体酶切电泳图如图2所示，图2中：M泳道：2000bp Marker；泳道1：重组载体pPIC9K/NK-Lysin酶切结果。
进一步地，进行毕赤酵母GS115菌株感受态细胞的制备，挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于10mL YPD培养基(Sangon Biotech,SHANGHAI)，置于30℃、250rpm振荡过夜培养。吸取活化后的菌液加入到新鲜的100mL YPD液体培养基中，重新置于30℃、250rpm振荡培养至OD600值达到1.3～1.5。取该培养液在4℃、5000rpm离心5min，弃上清，扣干离心管壁。加入50mL冰预冷无菌水振荡重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体。加入20mL 1mol/L冰预冷的无菌山梨醇溶液(Sangon Biotech,SHANGHAI)重悬菌体，然后4℃、5000rpm离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体。最后加入200μL冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100μL/管，-80℃冰冻保存。
制备好毕赤酵母GS115菌株感受态细胞后就可进行表达重组载体pPIC9K/NK-Lysin电击导入毕赤酵母GS115菌株，将pPIC9K/NK-Lysin重组质粒用SalⅠ(Takara Bio)酶切线性化，胶回收目的片段；将上述制备的液体分别加入到预冷0.2cm的电转杯(Bio-Rad)中，混匀后置于冰上10min，然后在电转仪(Bio-Rad)中进行电击(电击条件：1500V，5ms)，立即取1mol/L山梨醇500μL加入到电转杯中，吸取200μL涂布在MD平板上30℃培养3-5d。设定对照组1：空载体pPIC9K电转后，同样操作涂到MD平板上；对照组2：吸取制备的毕赤酵母GS115菌株感受态细胞200μL涂布到MD平板上；然后通过设置G418(LIFESCIENCES)浓度梯度1、2、3、4、5mg/mL筛选重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株阳性高拷贝转化子。用灭菌牙签挑取MD平板上长出的单菌落递进接种到含有不同浓度G418的YPD平板上，置于30℃培养2-3d，挑取能在5mg/mL的G418-YPD平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒(TIANGEN BIOTECH；BEIJING)提取基因组DNA，利用pPIC9K质粒通用引物进行PCR扩增(表1)，鉴定Mut+(methanol utilization plus)或Muts(methanol utilization slow)表型。重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株PCR扩增电泳结果如图3所示，图3中：1：GS115空载菌株；2-5：Mut+型的重组毕赤酵母pPIC9K/NK-Lysin-GS115菌株。
进而，选取表型为Mut+单克隆接种于25mL BMGY液体培养基中，置于30℃、250rpm振荡培养至OD600值达到2～6；4℃、5000rpm离心5min，弃上清，重悬菌体转移至1L锥形瓶，加入0.5％～1.0％甲醇，盖上两层灭菌纱布，30℃、250rpm诱导表达96h(诱导每24h添加一次甲醇)，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中。
最后即可进行斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的纯化，真核重组抗菌肽NK-Lysin蛋白具有His标签，选用His-Bind填料能够特异性结合His标签。通过改变pH及离子强度可洗脱结合于His-Bind上的抗菌肽真核重组蛋白，从而达到纯化效果。具体纯化方法如下：
1.塞子堵紧纯化柱底部，加入1mL Ni-NAT His-Bind Resin，静置待填料自然沉降，填充柱子，形成柱体。
2.取下塞子，使液体自然流出，滤完保护液，按如下顺序洗柱：5mL ddH2O洗柱2次；2mL 1×离子缓冲液洗柱3次；5mL 1×结合缓冲液洗柱1次。
3.将PBS溶解的蛋白轻轻上柱，重复3次，并收集过柱液。
4.用4mL不同浓度1×咪唑(20、40、60、80、100、250mM)洗柱1次，收集每次过柱液。
5.加入4mL 1×剥离液洗脱蛋白，收集过柱液。
6.将收集的过柱液进行SDS-PAGE检测，确定蛋白纯化效果。
7.通过检测得到条带单一且大小正确的过柱液加入透析袋(规格8000-14000Da)中，透析夹夹紧，放入冷冻的1×PBS溶液中进行透析。每隔3h更换透析液，共换3次。
8.透析完成后，向透析袋表面加入适量PEG 2000进行浓缩，浓缩到一定体积后，收集蛋白溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
9.用NanaDrop 2000微量分光光度计测量浓缩蛋白浓度，随后将蛋白溶液分装于1.5mL离心管，转移至-80℃冰箱待用。斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE电泳结果如图4所示，图4中：泳道1：上清表达的OnNK-Lysin蛋白；泳道2：纯化后的OnNK-Lysin蛋白；M泳道：180-10kDa蛋白Marker。
为了验证斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的抑菌效果，对斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白进行最小抑菌浓度检测，检测方法如下：
选取4株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌、海豚链球菌)和12株革兰氏阴性菌(迟缓爱德华氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌、宋内志贺氏菌、铜绿假单胞菌、豚鼠气单胞菌、普通变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、奇异变形杆菌)，分别吸取新鲜活化的菌液，用LB液体培养基稀释至1×106CFU/mL，依次吸取100μL菌液加入96孔板第1～6孔，然后依次加入100μL浓度为500、250、125、62.5、32.15、15.63μg/mL的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin重组蛋白，使得每孔抗菌肽NK-Lysin重组蛋白的终浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.63、7.81μg/mL；阳性对照组加入等体积终浓度为200μg/mL卡那霉素溶液，阴性对照加入等体积的无菌PBS溶液；置于37℃培养24h，酶标仪测定各孔OD600吸光值，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白抑菌效果如表2所示。
表2
由表2可知，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin重组蛋白对部分革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有显著的抑菌效果，根据表2的检测结果可以确定本发明的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白能够用于制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东海洋大学深圳研究院 深圳义海生物科技有限公司
<120> 一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因)
<400> 1
atggaaaagt cttcattcct ccttgtgtgc attctggtgg catgttcagt ctggacagtc 60
gacgggagga gactcaaggt cagcattgac gatcaggagc aggtggacat ggaaatctca 120
gtgatggctg acaaggaagt ctctttgaag gacggcgagg aaatctctct gaaagctgga 180
aagcttcccg gtgtgtgctg ggcgtgcaag tgggctttga acaaggtgaa gaaagctatc 240
ggacccaacg ccactgcaga gaaactgaca acaaagctga aatccatctg tgaccaaatt 300
ggcctcttga aagctctgtg ccgcaagttt gtgaagacgc acctcgcaga gttaatcgag 360
gagctcacca ccactgatga tgtgagaacc atttgtgtca acaccggagc ctgcaagcca 420
aaggagttgg acctgctgga ttatccacac gacgaggatt cagagattga agtgattgaa 480
tatgtccgag gtcgtatgcg tgcacaataa 510
<210> 2
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白)
<400> 2
Met Glu Lys Ser Ser Phe Leu Leu Val Cys Ile Leu Val Ala Cys Ser
1 5 10 15
Val Trp Thr Val Asp Gly Arg Arg Leu Lys Val Ser Ile Asp Asp Gln
20 25 30
Glu Gln Val Asp Met Glu Ile Ser Val Met Ala Asp Lys Glu Val Ser
35 40 45
Leu Lys Asp Gly Glu Glu Ile Ser Leu Lys Ala Gly Lys Leu Pro Gly
50 55 60
Val Cys Trp Ala Cys Lys Trp Ala Leu Asn Lys Val Lys Lys Ala Ile
65 70 75 80
Gly Pro Asn Ala Thr Ala Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Cys Asp Gln Ile Gly Leu Leu Lys Ala Leu Cys Arg Lys Phe Val Lys
100 105 110
Thr His Leu Ala Glu Leu Ile Glu Glu Leu Thr Thr Thr Asp Asp Val
115 120 125
Arg Thr Ile Cys Val Asn Thr Gly Ala Cys Lys Pro Lys Glu Leu Asp
130 135 140
Leu Leu Asp Tyr Pro His Asp Glu Asp Ser Glu Ile Glu Val Ile Glu
145 150 155 160
Tyr Val Arg Gly Arg Met Arg Ala Gln
165

Claims (4)

1.一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因，其特征在于：以斜带石斑鱼组织cDNA为模板进行PCR扩增获得，所述斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin基因的ORF序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白，其特征在于，以斜带石斑鱼NK-Lysin基因ORF序列为模板，克隆出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白序列，其序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种制备如权利要求2所述的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白的方法，包括以下步骤：
1）构建斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体；
利用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限制性内切酶Takara Bio对表达成熟肽蛋白的核苷酸序列纯化后的PCR产物和pPIC9K质粒，同时进行双酶切，37℃水浴处理4h，酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完全，并利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，利用T4 DNA连接酶Takara Bio16 ℃水浴过夜处理，重组载体导入TOP感受态细胞中，阳性克隆后进行测序，筛选测序正确后的菌株，摇瓶大量培养，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒备用；构建成功的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体命名为pPIC9K/NK-Lysin；
2）制备毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；
挑取毕赤酵母GS115单菌落接种于10 mL YPD 培养基，置于 30 ℃、250 rpm 振荡过夜培养；吸取活化后的菌液加入到新鲜的100 mL YPD 液体培养基中，重新置于 30 ℃、250rpm 振荡培养至 OD600值达到1.3-1.5；取该培养液在4 ℃、5000 rpm 离心 5 min，弃上清，扣干离心管壁，加入50 mL冰预冷无菌水振荡重悬菌体，然后4 ℃、5000 rpm离心5 min，弃上清，吸干管壁残余液体；加入20 mL、1 mol/L 冰预冷的无菌山梨醇溶液重悬菌体，然后4℃、5000 rpm 离心5min，弃上清，吸干管壁残余液体；最后加入200 μL 冰预冷的无菌山梨醇溶液振荡混匀，分装成100 μL/管，-80 ℃冰冻保存即得毕赤酵母GS115菌株感受态细胞；
3）将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体酶切线性化后电击导入毕赤酵母GS115菌株感受态细胞，筛选出斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株；
将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白的表达重组载体用Sal Ⅰ酶切线性化，胶回收目的片段；将上述制备的液体分别加入到预冷 0.2 cm 的电转杯中，混匀后置于冰上 10min，然后在电转仪中进行电击，电击条件：1500 V，5 ms，立即取 1 mol/L 山梨醇 500 μL加入到电转杯中，吸取 200 μL 涂布在 MD 平板上 30 ℃培养 3-5 d，取200μL毕赤酵母GS115菌株感受态细胞涂布到MD平板上培养，获得重组毕赤酵母GS115菌株pPIC9K/NK-Lysin-GS115；
用灭菌牙签挑取MD平板上长出的单菌落递进接种到含有浓度梯度为1、2、3、4、5 mg/mL的G418-YPD平板上，置于30 ℃培养 2-3 d，挑取能在5 mg/mL 的G418-YPD 平板上长出来的单菌落扩大培养，用酵母基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA，利用pPIC9K质粒通用引物进行PCR扩增，鉴定Mut+ 或Muts表型，Mut+表型的菌株即为重组毕赤酵母GS115菌株；
4）将斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽蛋白重组毕赤酵母GS115菌株经过摇瓶发酵和甲醇诱导表达及纯化，获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白；
重组毕赤酵母GS115菌株接种于25 mL BMGY 液体培养基中，置于30 ℃、250 rpm振荡培养至OD600值达到2~6；4 ℃、5000 rpm 离心 5 min，弃上清，重悬菌体转移至1L锥形瓶，加入0.5%~1.0%甲醇，盖上两层灭菌纱布，30 ℃、250rpm诱导表达96 h，诱导过程中每24 h添加一次甲醇，斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白将分泌至培养液中，提取斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白后进行纯化获得高纯度斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白。
4.如权利要求2所述的斜带石斑鱼抗菌肽NK-Lysin成熟肽重组蛋白在制备抗革兰氏阳性和/或革兰氏阴性菌的水产养殖饲料添加剂或抗菌药物或日化用品添加剂中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101471975B1 (ko) * 2013-10-30 2014-12-12 중앙대학교 산학협력단 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물
CN108977457A (zh) * 2018-08-31 2018-12-11 长江大学 一种黄鳝抗菌肽的制备方法
CN110643612A (zh) * 2019-08-30 2020-01-03 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101471975B1 (ko) * 2013-10-30 2014-12-12 중앙대학교 산학협력단 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물
CN108977457A (zh) * 2018-08-31 2018-12-11 长江大学 一种黄鳝抗菌肽的制备方法
CN110643612A (zh) * 2019-08-30 2020-01-03 中国水产科学研究院南海水产研究所 一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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黄鳝 NK － lysin 基因的真核表达与体外活性分析;许巧情;黄鳝 NK － lysin 基因的真核表达与体外活性分析;第317-323页 *

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