CN108977457A - 一种黄鳝抗菌肽的制备方法 - Google Patents

一种黄鳝抗菌肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄鳝抗菌肽的制备方法，属于基因工程技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与Triton X‑100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。所述方法获得的黄鳝抗菌肽表达量高、活性好，对多种细菌均有抑制作用。

Description

一种黄鳝抗菌肽的制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种黄鳝抗菌肽的制备方法。
背景技术
黄鳝是一种底栖小型鱼类，黄鳝肉质细嫩，鲜美可口，营养价值高等特点，因此受到大众的欢迎，出现供不应求的局面。我国已经开始大规模的人工养殖黄鳝，随着养殖规模不断扩大，养殖黄鳝的疾病发生率越来越高，而传统的抗生素虽然对于细菌有杀灭作用，但是长期使用，细菌的耐药性增加，黄鳝对细菌抵抗能力下降，最终会导致养殖过程的细菌疾病不断增加。寻找黄鳝养殖过程中抗生素的安全替代品，减少抗生素的使用，是降低黄鳝疾病率的关键。
黄鳝抗菌肽是黄鳝体内受到外界刺激时所分泌的一类小分子肽类，具有生物活性。对于寄生虫，细菌，病毒均会产生抑制作用，具有广谱抗菌活性。黄鳝抗菌肽主要是自然杀伤细胞与淋巴细胞分泌的蛋白物质，黄鳝NK-lysin抗菌肽基因的阳离子与疏水性结构组成能够细胞膜裂解，抑制细菌的核酸的形成，阻止了细菌的快速繁殖。机体受到外来细菌的侵袭时，抗菌肽迅速分泌，保护机体免受外来细菌的伤害。但是目前对于黄鳝抗菌肽的制备多采用直接提取或原生表达的方法，表达量低，表达活性低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达量高，活性高的黄鳝抗菌肽的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种黄鳝抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与Triton X-100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。
优选的，步骤3)中所述诱导培养时间为47～49h。
优选的，步骤3)中重组菌株的接种体积为0.9～1.1％。
优选的，步骤3)中接种重组菌的OD600为0.8～1.2。
优选的，步骤3)中所述诱导培养过程中添加甲醇。
优选的，所述蜗牛酶孵育的温度为35～40℃，所述蜗牛酶孵育的时间为50～70min。
优选的，所述蜗牛酶与菌体细胞的质量比为(6～8)：200。
优选的，所述载体为pPIC9K载体，所述黄鳝抗菌肽基因连接在载体中EcoRI和NotI酶切位点之间。
优选的，所述连接体系包括以下组分：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，黄鳝抗菌肽基因3μL，载体1μL，T4 DNA Ligase 1μL和ddH2O 4μL。
优选的，所述连接的温度为3～5℃，所述连接的时间为10～14h。
本发明还提供了上述制备方法制备获得的黄鳝抗菌肽在制备鱼类饲料中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的黄鳝抗菌肽的制备方法，通过将黄鳝抗菌肽基因与载体连接后，转入毕赤酵母中进行诱导表达，并对蛋白的诱导表达条件进行了限定，本发明所述方法制备获得的黄鳝抗菌肽，表达量高，活性高，对黄鳝不同细菌有明显抑制作用。
附图说明
图1为黄鳝NK-lysin抗菌肽蛋白的少量表达(western blot图谱)；
图2为黄鳝NK-lysin最终纯化的蛋白(western blot图谱)；
图3为NK lysin基因序列连接载体扩增电泳检测图；
图4为不同浓度的黄鳝抗菌肽对迟缓爱德华氏菌的抑制作用；
图5为不同浓度的黄鳝抗菌肽对维氏气单胞菌的抑制作用；
图6为不同浓度的黄鳝抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用；
图7为不同浓度的黄鳝抗菌肽对嗜水气单胞菌的抑制作用；
图8为不同浓度的黄鳝抗菌肽对肺炎伯克雷菌的抑制作用；
图9为不同浓度的黄鳝抗菌肽对乳酸菌的抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了一种黄鳝抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与TritonX-100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。
在本发明中，首先将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体。在本发明中，所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；本发明对所述黄鳝抗菌肽基因的来源没有特殊限定，可以采用PCR扩增的方法或人工合成的方法获得。在本发明具体实施过程中，所述黄鳝抗菌肽基因来源于全基因合成的质粒NK lysin。在本发明中优选的采用EcoRI和NotI酶双酶切质粒NK lysin，获得447bp黄鳝抗菌肽基因。在本发明中，所述载体优选为pPIC9K载体，所述pPIC9K载体优选的采用EcoRI和NotI酶双酶切获得与黄鳝抗菌肽基因同样的酶切末端，然后将所述黄鳝抗菌肽基因与双酶切后的载体连接。本发明中，所述连接体系优选的包括以下组分：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，黄鳝抗菌肽基因3μL，载体1μL，T4 DNA Ligase 1μL和ddH2O 4μL。在本发明中，所述连接的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述连接的时间优选为10～14h，更优选为12h。
本发明在获得所述重组载体后，将获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株。在本发明中，所述转入优选的采用电转化法进行。本发明中，所述毕赤酵母为毕赤酵母感受态细胞；所述重组载体和毕赤酵母以体积比优选为8:1的比例混合进行电转化；所述电转化的电压优选为1.5KV，电容优选为50MF，电阻优选为200-400Ω；所述电转化的时间优选为8～10ms。本发明在所述电转化完成后，优选的将电转化产物与山梨醇溶液以(8～10):100的体积比例混合；本发明中所述山梨醇的浓度优选为1M。本发明将上述混合后的溶液涂布平板培养，进行重组菌株的筛选。本发明中所述筛选优选的采用菌落PCR的方法进行，本发明对具体的菌落PCR的条件参数没有特殊限定，采用本领域常规的菌落PCR条件和参数即可。
本发明将检测为阳性的单克隆重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液。在本发明中所述接种体积优选为0.8～1.2％，更优选为1.0％；本发明中所述接种的单克隆重组菌株的OD600优选为0.8～1.2，更优选为1.0。在本发明中所述诱导培养的时间优选为47～49h，更优选为48h。在本发明中，所述诱导培养过程中添加甲醇，所述甲醇的添加体积优选为0.4～0.6％，更优选为0.5％。
本发明在所述诱导培养结束后，收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽。在本发明中，所述培养液中菌体细胞的收集优选的采用离心的方法，所述离心的离心力优选为1200～1700g，更优选为1500g，所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明将收集到的菌体细胞与S1溶液混合后用蜗牛酶孵育获得孵育后的细胞，S1溶液主要为细胞裂解缓冲液，它的组成是：Na2HPO4`2H20 50mmol/L，NaCl 300mmol/L配置而成的溶液，主要的作用是裂解细胞，释放蛋白。本发明中所述蜗牛酶孵育的温度优选为35～40℃，更优选为37℃，所述蜗牛酶孵育的时间优选为50～70min，更优选为60min。在本发明中所述蜗牛酶孵育的作用是水解破坏酵母细胞壁，利于后续酵母细胞破碎，在本发明中，所述蜗牛酶与菌体细胞的质量比优选为(6～8)：200，更优选为7:200；本发明中所述菌体细胞以湿重计，每1g菌体加入35mg蜗牛酶粉末。本发明中，所述菌体细胞的破碎优选的将蜗牛酶孵育后的细胞与Triton X-100、PMSF混匀进行超声破碎；所述蜗牛酶孵育后的细胞与Triton X-100和PMSF的体积比优选为1:1.2。所述超声破碎(33KHz)的时间优选为8～12min，更优选为10min，本发明在所述超声破碎后，离心，收集上清为细胞破碎液。所述离心的转速优选为16000～20000rpm，更优选为18000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。
本发明在获得细胞破碎液后，用镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽。本发明中所述镍柱在上样前进行平衡，本发明中所述平衡采用本领域常规方法进行，无特殊要求。本发明中，所述上样采用4℃摇床低速孵育过夜上样，所述细胞破碎液中的黄鳝抗菌肽蛋白吸附于镍柱上。本发明在所述收集和纯化结束后，分离镍柱，洗脱获得黄鳝抗菌肽蛋白。本发明在获得所述黄鳝抗菌肽蛋白后，优选的利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的大小。
本发明还提供了上述制备方法制备获得的黄鳝抗菌肽在制备鱼类饲料中的应用。所述应用具体为将上述制备方法制备获得的黄鳝抗菌肽添加到鱼类饲料中，增强鱼类对病原菌侵染的抵抗力。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
黄鳝抗菌肽的蛋白真核表达方法
黄鳝抗菌肽用EcoRI--NotI酶切全基因合成的质粒NK lysin，此时会切下447bp的目的条带。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。
黄鳝抗菌肽基因片段(SEQ ID No.1)为：
>antimicrobialpeptide
黄鳝NK-lysin酶切引物为F:atctggttccgcgtggatccatggagacatcttcagttctacttgtgt
(SEQ ID No.2)
R:tcgtgatggtgatggtgatgcttgcaggctctggtgttgac(SEQ ID No.3)
表达载体的构建:
将回收后的目的片段与同样用EcoRI--NotI酶切的pPIC9K载体进行体外连接，连接体系见表1：
表1目的基因与pPIC9K重组质粒连接体系
吸打混匀，稍微离心；放入4℃冰箱中连接过夜。
连接产物的转化
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)
c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
e.吸500μL不含Kan的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
g.37℃恒温培养箱中培养16～20h。
表达载体的鉴定
将转化出来的单菌落通过摇菌后用引物进行菌液PCR鉴定(图3)。图3为NKlysin基因序列连接载体扩增电泳检测图。阳性克隆是第1个。Marker由上至下依次是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
将构建成功的黄鳝抗菌肽载体加入到毕赤酵母中，标记转化质粒，置于冰上预冷。将载体加入酵母体系中，利用电击的手段加强载体与毕赤酵母的融合在超净工作台，取2个1.5ml离心管，向每管中加入80μl上述感受态酵母和10μl线性化质粒(15μg，浓度>1μg/μl)，缓慢吸打混匀，全部转入预冷的0.2cm电转杯中，置于冰上。电击转化条件：1.5KV，电容50MF，电阻200-400Ω。电击时间为8-10ms，低于5ms或爆杯均属不正常或转化失败。转化成功的电转杯，向80μl感受态酵母和10μl线性化质粒中立即加入事先准备的1ml 1M山梨醇，混匀。转移到1.5ml离心管中，冰上放置。涂布于MD平板上，一般每个小平皿涂100-200μl，每个大平皿涂500μl，剩余菌液置于4摄氏度，平板置于30℃培养，2-3d可见转化克隆。
黄鳝NK-lysin蛋白的少量表达与优化条件探索
PCR检测为阳性的单克隆菌株，接种至含5ml MD培养基(加入适当抗生素)的50ml离心管中，30℃，220rpm过夜摇菌至OD600＝2。室温1500g离心5min，收集细胞，去除上清，将酵母转移至含25ml BMMY培养基的250ml锥形瓶，重悬酵母，从锥形瓶中收集1.5ml菌液作为未诱导，将锥形瓶置于30℃220rpm摇菌表达。24h后取出1.5ml菌液，并向锥形瓶中加入125μl(按5/1000加入)甲醇，放入摇床继续生长。重复步骤3两次。将取出的未诱导(a)、24h(b1)、48h(b2)、72h(b3)菌液，6500rpm 5min离心收菌。将上清转移到新的1.5ml离心管，向菌沉淀中加入100μl PBS和蜗牛酶并酶解处理。将菌和上清SDS-PAGE或Western Blot检测表达量。
黄鳝NK-lysin蛋白的大量表达
重组酵母按1/100转接至4个含25ml BMGY培养基(加入适当抗生素100ug/ml)室温1500g离心5min，收集细胞，去除上清，称量菌体湿重，菌体用于进一步纯化。上步中收集的酵母菌体(500ml离心瓶)，加入100ml S1溶液，混匀，按每g酵母加入35mg蜗牛酶粉末，混匀，37摄氏度摇床孵育1h。
(1)按比例加入Triton X-100和PMSF(100μL)，混匀后，分装到50ml离心管，利用超声破碎仪破碎10min,18000rpm，10min离心，上清保留用于上样，沉淀取出一点，加入100μlPBS，用于后续检测。
(2)将平衡好的1mlNi-柱加入酵母上清液中，置于500ML离心瓶中，4℃摇床低速孵育过夜上样。50ml离心管分装混合液，3000rpm 2min离心，上清收集为流穿，沉淀为Ni-柱，收集到纯化柱中。最终洗脱蛋白，利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的大小,最终纯化的蛋白结果为35KDa，蛋白浓度为500ug/ml，纯度为90％。
黄鳝抗菌肽蛋白活性分析
选取革兰氏阳性菌种与阴性菌种，主要选取了金黄色葡萄球菌，乳酸菌等阳性菌，阴性菌种为嗜水气单胞菌，中华鲟嗜水气单胞菌，副溶血弧菌，鳗弧菌，肺炎克伯雷菌，迟缓爱德华氏菌，维氏气单胞菌，将金黄色葡萄球菌与嗜水气单胞菌，中华鲟嗜水气单胞菌，维氏气单胞菌，副溶血弧菌，肺炎克伯雷菌，乳酸菌在37℃培养箱，而鳗弧菌与迟缓爱德华菌放置28℃培养箱中，培养到OD600值为0.4-0.6(时间为5-8h)，分别按照1：100比例稀释。稀释5个浓度梯度，放到培养箱培养4h，涂平板后计数细菌的个数，确定细菌最终浓度为5×10^5cfu/ml。
黄鳝抗菌肽蛋白被设置为不同浓度梯度，分别为400μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml等不同浓度梯度，每组三个重复，选取卡纳霉素与抗生素作为阳性对照，分别添加20微升黄鳝抗菌肽与80微升的细菌，在适宜的温度下培养48h，利用酶标仪OD600测定黄鳝抗菌肽蛋白对细菌的溶液吸光度。依据吸光度判定黄鳝抗菌肽蛋白最小抑菌效果，结果见表2。
表2黄鳝抗菌肽对不同细菌的最小抑制浓度
实验结果如图4～9所示，显示黄鳝的抗菌肽蛋白对金黄色葡萄球菌，乳酸菌等阳性菌有明显的抑制作用，而对迟缓爱德华氏菌，维氏气单胞菌，中华鲟嗜水气单胞菌，嗜水气单胞菌，肺炎克伯雷菌均有明显抑制作用，而对鳗弧菌，副溶血弧菌没有明显抑制作用。维氏气单胞菌，肺炎克伯雷菌，迟缓爱德华菌为常见的黄鳝病原菌，实验结果对这些细菌有抑制作用。将黄鳝的抗菌肽蛋白添加到饲料中，会对黄鳝常见细菌性疾病有一定抵抗作用。黄鳝抗菌肽蛋白表达一般为2种方式，原核表达与真核表达，之前采用原核表达方式，但是原核表达方式产生的蛋白活性比较弱，几乎表达量低下，产生的蛋白浓度为100μg/ml，对于黄鳝水产病原没有明显抑制作用，蛋白没有活性，因此采用真核表达方式来大量表达黄鳝抗菌肽蛋白，本实验结果显示了对于黄鳝病原菌有明显抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 长江大学
<120> 一种黄鳝抗菌肽的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> Monopterus albus
<400> 1
atggagacat cttcagttct acttgtgtgc atcctggtga catgttcagt ctggacagtt 60
cacgggagaa cctttgaggt cagcattgat gatcagaagc aagtggacgt ggaaatctct 120
gtggaggctg gcaagcgtcc aggtttgtgc tgggcctgta agtgggcttt aaacaaggtg 180
aaggcagtga tcggaccaaa caccaccacg gagaacataa caacaaagtt gaagtccatc 240
tgcgaccaac ttggcttttt aaaatcaaaa acaaagttga agtccatctg cgaccaaatt 300
ggcttattaa aatctatgtg ccgcaaattt gtgacaaagc acctgcaaga actgatcgag 360
gaactcacca ccaccgatga tgtgaggacg atctgcgtca acaccagagc ctgcaagtga 420
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctggttcc gcgtggatcc atggagacat cttcagttct acttgtgt 48
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtgatggt gatggtgatg cttgcaggct ctggtgttga c 41

Claims (10)

1.一种黄鳝抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将黄鳝抗菌肽基因与载体连接构建重组载体；
2)将步骤1)中获得的重组载体转入到毕赤酵母中获得重组菌株；
3)将重组菌株以0.5～1.5％接种体积接种到BMGY培养基中诱导培养46～50h获得培养液；
4)收集培养液中的菌体细胞进行破碎，获得细胞破碎液，镍柱收集和纯化所述细胞破碎液获得黄鳝抗菌肽；
所述黄鳝抗菌肽基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述菌体细胞采用蜗牛酶孵育后与Triton X-100、PMSF混合在超声作用下实现破碎。
2.根据权利要求1所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述培养时间为47～49h。
3.根据权利要求1所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤3)中重组菌株的接种体积为0.9～1.1％。
4.根据权利要求3所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤3)中接种的重组菌的OD600为0.8～1.2。
5.根据权利要求1所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述诱导培养过程中添加甲醇。
6.根据权利要求1所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述蜗牛酶孵育的温度为35～40℃，所述蜗牛酶孵育的时间为50～70min。
7.根据权利要求6所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述蜗牛酶与菌体细胞的质量比为(6～8)：200。
8.根据权利要求1所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述载体为pPIC9K载体，所述黄鳝抗菌肽基因连接在载体中EcoRI和NotI酶切位点之间。
9.根据权利要求1或8所述的黄鳝抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述连接的体系包括以下组分：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，黄鳝抗菌肽基因3μL，载体1μL，T4DNA Ligase 1μL和ddH2O 4μL；步骤1)中所述连接的温度为3～5℃，所述连接的时间为10～14h。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备获得的黄鳝抗菌肽在制备鱼类饲料中的应用。
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