CN109536507A - 布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法 - Google Patents

布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法，属水生动物免疫技术领域，所述基因如SEQ NO.1所示，所述基因编码的布氏鲳鲹抗菌肽的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。本发明还提供了布氏鲳鲹抗菌肽TroLEAP‑2原核表达及其制备方法，载体为大肠杆菌DH5α感受态细胞，用于重组的菌株为Rosetta(DE3)。所述方法获得的布氏鲳鲹抗菌肽TroLEAP‑2可在终浓度为30μg/ml时，对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌具有极为明显的抑制作用。此外，与传统抗生素相比，抗菌肽TroLEAP‑2具有易降解、细菌不易产生耐药性。

Description

布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法
技术领域
本发明属水生动物免疫技术领域，具体地涉及一种布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法。
背景技术
抗菌肽是近年来发现的一类具有抗微生物活性的小分子多肽，广泛存在于细菌、真菌、植物、昆虫、甲壳类、鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物体内。抗菌肽具有杀伤范围广、杀伤力强、安全无毒副作用等特点，特别是其对耐药菌有较强的抑制作用，因而能在一定程度上替代抗生素，成为当今研究的热点。
鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受伤或受病原微生物感染时，能够迅速产生特定种类的抗菌肽以杀死病原菌，从而保证鱼体健康。目前，鱼体中已分离获得大量具显著抑菌和杀菌活性的抗菌肽，继而在体外表达，获得商品化抗菌肽产品。
布氏鲳鲹(Trachinotus ovatus)隶属于鲈形目，鲹科，鲳鲹属，俗称为金鲳、黄腊鲳，是一种暖水性海水鱼类，其已成为我国海南、广西和广东等地深水网箱养殖的最主要品种，年养殖产量达4万余吨。然而，随着近年来大力发展深水网箱养殖及布氏鲳鲹养殖规模的扩大和养殖时间的延长，创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、诺卡氏菌(Nocardia seriolea)等引起的细菌性疾病问题也日益严重，成为制约海南深水网箱养殖可持续健康发展的最主要因素之一。目前，布氏鲳鲹疾病防治依然主要依靠抗生素，从而造成细菌耐药性越来越强，危机生态安全。寻找安全、高效、杀伤范围广的布氏鲳鲹抗菌肽是解决上述问题的有效途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2，建立了该抗菌肽的原核表达载体，制备了具高效杀菌活性的重组抗菌肽。
本发明是通过采用如下技术方案实现的：
一种布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2，所述基因如SEQ NO.1所示。
所述布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2编码的布氏鲳鲹抗菌肽的氨基酸序列如SEQNO.2所示。
本发明还提供含有布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2的重组菌，菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)。
本发明还提供重组布氏鲳鲹抗菌肽在水产抗菌药物中的应用，所述菌为迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌或无乳链球菌。
本发明还提供所述重组布氏鲳鲹抗菌肽的原核表达及其制备方法，具体包括如下步骤：
1)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段的克隆与纯化
①提取布氏鲳鲹肝脏RNA，反转录获得布氏鲳鲹cDNA文库，用LEAP-2F1/R1引物扩增获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2去除信号肽的全长序列；
其中上游引物LEAP-2F1：5’-AATTGATATCGCCACCATGG GTCCACTGGCCTCTC-3’；下游引物LEAP-2R1：5’-CTAAATTGATATCATAGTTTACGGGCTCTGAGG-3’；
②采用胶回收试剂盒进行产物纯化，获得纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段；
③将纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段与pEASY-T1Simple克隆载体连接，转入至DH5α感受态细胞中，获得重组质粒；
④用质粒提取试剂盒提取重组质粒，而后对重组质粒进行EcoR32I酶切、纯化，获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段；
2)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2原核表达载体的构建
①用EcoR32I内切酶对原核表达质粒pET 32a质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，并回收获得目的条带；
②将步骤1)酶切后回收的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段和步骤①的pET32a质粒用T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；
③挑取单菌落至ddH2O中，充分混匀，取1μl作为模板，通过目的片段的上游引物LEAPF1：5’-AATTGATATCGCCACCATGGGTCCACTGGCCTCTC-3’，和载体上的下游引物T7t：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，进行PCR检测，筛选重组转化大肠杆菌；
④将PCR检测重组转化正确的所述重组转化大肠杆菌菌落，取菌悬液加入LB培养基，振荡培养过夜，而后用质粒提取试剂盒提取质粒，获得原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET 32a；
⑤将步骤④提取的原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET 32a转化Rosetta(DE3)表达菌株，检测确认无误后进行表达；
3)原核重组蛋白诱导表达及纯化
①将含有TroLEAP-2-pET 32a的Rosetta(DE3)菌株活化好的菌液接种到含有抗生素的LB培养基中，培养至OD600 0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG在16-20℃温度下进行诱导，16-20h；
②诱导结束，取出菌液，离心，弃上清；放在冰上，加入Lysis buffer，放入-80℃冰箱酒精中速冻10min，然后放在4℃自然解冻；
③将解冻后的菌液混匀倒入离心管中，放在冰上，超声破碎；
④将超声破碎后的菌液离心，吸取含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清至离心管中；
⑤重组布氏鲳鲹抗菌肽的纯化：将含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清液加入经平衡处理的Ni-NTA柱中，1h后依次向Ni-NTA柱中加入50mM咪唑和100mM咪唑清洗，最后加入Elution buffer洗脱2次，收集洗脱液，获得纯化后的重组布氏鲳鲹抗菌肽；
⑥将步骤⑤获得的重组布氏鲳鲹抗菌肽置于PBS中透析，即获得具抗菌活性的重组布氏鲳鲹抗菌肽，保存于-20℃。
进一步，步骤3)原核重组蛋白诱导表达及纯化中所述的超声破碎工作时间30min，超声5s停5s，功率为50％。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明提供布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法，经本方法获得的重组布氏鲳鲹抗菌肽可在终浓度为30μg/ml时，对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌具有极为明显的抑制作用。此外，与传统抗生素相比，布氏鲳鲹抗菌肽具有易降解、细菌不易产生耐药性。
附图说明
图1布氏鲳鲹抗菌肽TroLEAP-2基因cDNA序列及推断的氨基酸序列；其中cDNA序列部分方框标记的是起始密码子和终止密码子。氨基酸序列部分方框标记的是去除信号肽的成熟肽氨基酸序列，未框出的部分为信号肽序列。
图2重组布氏鲳鲹抗菌肽(简称rTroLEAP-2)和rTrx蛋白抗菌活性A迟缓爱德华氏菌菌落计数；B哈维氏弧菌菌落计数；C无乳链球菌菌落计数；
图3生长曲线分析PBS，rTrx和rTroLEAP-2对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌的抗菌活性：A迟缓爱德华氏菌生长曲线；B哈维氏弧菌生长曲线；C无乳链球菌生长曲线。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法，包括如下步骤：
1)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段的克隆与纯化
①提取布氏鲳鲹肝脏RNA，反转录获得布氏鲳鲹cDNA文库，用LEAP-2F1/R1引物扩增获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2去除信号肽的全长序列，具体序列见SEQ NO.1。
其中上游引物LEAP-2F1：
5’-AATTGATATCGCCACCATGGGTCCACTGGCCTCTC-3’
下游引物LEAP-2R1：
5’-CTAAATTGATATCATAGTTTACGGGCTCTGAGG-3’
②采用胶回收试剂盒进行产物纯化，获得纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段。
③将纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段与pEASY-T1Simple克隆载体连接，转入至DH5α感受态细胞中，获得重组质粒。
④用质粒提取试剂盒提取重组质粒，而后对重组质粒进行EcoR32I酶切、纯化，获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2。
2)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2原核核表达载体的构建
①用EcoR32I内切酶对原核表达质粒pET 32a质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，并胶回收获得目的条带。
②将步骤1)酶切后回收的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段和pET 32a质粒在T4DNA连接酶的作用下16℃连接16h，然后将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态中。
③挑取单菌落至10μl的ddH2O中，充分混匀，取1μl作为模板，通过目的片段的上游引物LEAPF1：5’-AATTGATATCGCCACCATGGGTCCACTGGCCTCTC-3’，和载体上的下游引物T7t：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，进行PCR检测，筛选重组转化大肠杆菌。
④将检测正确的菌落，取菌悬液加入5ml LB培养基，37℃，振荡培养过夜，而后按照OMEGA的质粒提取试剂盒提取质粒，获得原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET 32a。
⑤将提取的原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET 32a转化Rosetta(DE3)表达菌株。检测确认无误后进行表达。
3)原核重组蛋白诱导表达及纯化
①将含有TroLEAP-2-pET 32a的Rosetta(DE3)菌株活化好的菌液1mL接种到100mL含有抗生素的LB培养基中，37℃培养至OD600 0.6-0.8。加入终浓度为0.1mM IPTG在相应16-20℃温度下进行诱导，16-20h。
②诱导结束，取出菌液，4℃条件下8000rpm离心10min，弃上清。放在冰上，加入10mL Lysis buffer，放入-80℃冰箱酒精中速冻10min，放在4℃自然解冻。
③将解冻后的菌液混匀倒入10mL离心管中，放在冰上，超声破碎，工作时间30min，超声5s停5s，功率为50％。
④将超声破碎后的菌液，4℃条件下12000rpm离心20min，吸取含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清至灭菌离心管中。
⑤重组布氏鲳鲹抗菌肽纯化：将含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清液加入经平衡处理的Ni-NTA柱中，1h后依次向镍柱中加入Wash buffer I(50mM咪唑)、Wash buffer II(100mM咪唑)清洗，最后加入Elution buffer洗脱2次，每次40min以上，收集洗脱液，获得纯化后的重组布氏鲳鲹抗菌肽。
⑥将步骤⑤获得的重组布氏鲳鲹抗菌肽置于PBS中透析，即获得具抗菌活性的重组布氏鲳鲹抗菌肽，保存于-20℃。
4)布氏鲳鲹抗菌肽成熟蛋白及原核重组布氏鲳鲹抗菌肽的分子量
布氏鲳鲹TroLEAP-2基因成熟蛋白预测相对分子质量为8.56kDa，大肠杆菌表达的重组布氏鲳鲹抗菌肽的分子量约11.7kDa。
实施例2：重组布氏鲳鲹抗菌肽体外抑菌活性实验
(1)菌落计数法
①将迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌三种生长至对数期的病原菌用LB培养基稀释至1×105CFU/mL。
②将重组布氏鲳鲹抗菌肽(简称rTroLEAP-2)和原核表达空载体蛋白rTrx用PBS稀释成20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL，另外，100μL PBS作为阴性对照。
③100μL稀释的病原菌与100μL稀释成不同浓度的蛋白28℃共孵育3h。
④孵育结束，将孵育液稀释100倍，取100μL涂布。28℃培养过夜。
⑤记录每个平板上的单菌落数量，计算公式：
细菌存活率(％)＝存活细菌数/阴性对照细菌数×100％
⑥结果表明重组布氏鲳鲹抗菌肽rTroLEAP-2工作浓度为30μg/mL时，即对革兰氏阴性菌哈维氏弧菌、迟缓爱德华氏菌和革兰氏阳性菌无乳链球菌具极显著地移植效果(p<0.01)。
(2)生长曲线法
①将迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌三种生长至对数期的病原菌用LB培养基稀释至1×105CFU/mL。
②将重组布氏鲳鲹抗菌肽rTroLEAP-2和原核表达空载体蛋白rTrx用PBS稀释成60μg/mL，PBS作为阴性对照。
③100μL稀释的病原菌与100μL稀释的蛋白混合，置于96孔板中，28℃共培养。
④每隔1h用酶标仪测定一次OD600。共检测72h。
⑤结果表明重组布氏鲳鲹抗菌肽蛋白rTroLEAP-2具有明显抑制细菌生长的作用，见图3。
实施例3：重组布氏鲳鲹抗菌肽rTroLEAP-2体内抑菌活性实验
(1)将纯化后的重组布氏鲳鲹抗菌肽蛋白TroLEAP-2重悬于PBS中至终浓度200μg/mL，后与等量铝和化合物佐剂混合。PBS亦与等量铝和化合物佐剂混合作为对照组。
(2)100条体重约10g的布氏鲳鲹随机分成2组，分别注射100μlrTroLEAP-2+铝和化合物佐剂和铝和化合物佐剂，养殖于循环水养殖系统中。
(3)免疫8周后，分别采用迟缓爱德华氏菌和无乳链球菌球菌进行攻毒，观察并记录各组布氏鲳鲹累计死亡率。相对保护效应RPS计算公式如下：
RPS＝(1-％样品组累计死亡率/％对照组累计死亡率)*100。
(4)结果表明注射rTroLEAP-2+铝和化合物佐剂组的布氏鲳鲹对迟缓爱德华氏菌和无乳链球菌球菌的免疫保护效应分别为75％和63％。
序列表
<110> 海南大学
<120> 布氏鲳鲹抗菌肽基因及其编码的肽和原核表达制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 561
<212> DNA
<213> 布氏鲳鲹(Trachinotus blochii )
<400> 1
agtttgctga gtcaggctga cttgaagaga cctccagcaa aactgcgact aataaaccaa 60
acttcataca actgccagac ttgctccttg gactggttga gtcctaaaga ggttcctaag 120
gtgctggaga tcagaaaacc ggcccggtcc aggtcagatt tcagcagcag gtcacagagg 180
ggaagagagt ctcatcacca aacacctgag ggcattgaac tgtaccataa gagcgtgaag 240
atgcaggaga aacgattttt cgcccaaaga aaaacagcag tggcgctgtg cattgtgctg 300
ttaatgctgg ctcagcaggt gtgtgcaggt ccactggcct ctcggttgca gtccagctct 360
gaacagggtg cagattcaag gggggaacac agcgtccaca cactgaggag gatagctcgg 420
atgaccccgc tgtggagaat catgaacagc aaaccattcg gtgcttactg ccaaaacaac 480
tatgagtgct ccacagggct ctgcagggcg ggacactgct ccaccaccca ccgttctccc 540
tcagagcccg taaactatta g 561
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)
<400> 2
Met Gln Glu Lys Arg Phe Phe Ala Gln Arg Lys Thr Ala Val Ala Leu
1 5 10 15
Cys Ile Val Leu Leu Met Leu Ala Gln Gln Val Cys Ala Gly Pro Leu
20 25 30
Ala Ser Arg Leu Gln Ser Ser Ser Glu Gln Gly Ala Asp Ser Arg Gly
35 40 45
Glu His Ser Val His Thr Leu Arg Arg Ile Ala Arg Met Thr Pro Leu
50 55 60
Trp Arg Ile Met Asn Ser Lys Pro Phe Gly Ala Tyr Cys Gln Asn Asn
65 70 75 80
Tyr Glu Cys Ser Thr Gly Leu Cys Arg Ala Gly His Cys Ser Thr Thr
85 90 95
His Arg Ser Pro Ser Glu Pro Val Asn Tyr
100 105
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattgatatc gccaccatgg gtccactggc ctctc 35
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaaattgat atcatagttt acgggctctg agg 33
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattgatatc gccaccatgg gtccactggc ctctc 35
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (6)

1.一种布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2，其特征在于所述基因如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2编码的布氏鲳鲹抗菌肽的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
3.含有权利要求1所述布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2的重组菌，菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)。
4.重组权利要求2所述布氏鲳鲹抗菌肽在水产抗菌药物中的应用，所述药物针对的菌为迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌或无乳链球菌。
5.一种重组权利要求2所述布氏鲳鲹抗菌肽的原核表达及其制备方法，其特征在于所述方法具体包括如下步骤：
1)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段的克隆与纯化
①提取布氏鲳鲹肝脏RNA，反转录获得布氏鲳鲹cDNA文库，用LEAP-2 F1/R1引物扩增获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2去除信号肽的全长序列；
其中上游引物LEAP-2 F1：5’-AATTGATATCGCCACCATGG GTCCACT GGCCTCTC-3’；下游引物LEAP-2 R1：5’-CTAAATTGATATCATAGTTTA CGGGCTCTGAGG-3’；
②采用胶回收试剂盒进行产物纯化，获得纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段；
③将纯化的去除信号肽的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段与pEASY-T1Simple克隆载体连接，转入至DH5α感受态细胞中，获得重组质粒；
④用质粒提取试剂盒提取重组质粒，而后对重组质粒进行EcoR32I酶切、纯化，获得布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段；
2)布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2原核表达载体的构建
①用EcoR32I内切酶对原核表达质粒pET 32a质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的条带，并回收获得目的条带；
②将步骤1)酶切后回收的布氏鲳鲹抗菌肽基因TroLEAP-2片段和步骤①的pET 32a质粒用T4DNA连接酶连接，然后将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中；
③挑取单菌落至ddH2O中，充分混匀，取1μl作为模板，通过目的片段的上游引物LEAPF1：5’-AATTGATATCGCCACCATGGGTCCACTGGCCTCTC-3’，和载体上的下游引物T7t：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，进行PCR检测，筛选重组转化大肠杆菌；
④将PCR检测重组转化正确的所述重组转化大肠杆菌菌落，取菌悬液加入LB培养基，振荡培养过夜，而后用质粒提取试剂盒提取质粒，获得原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET32a；
⑤将步骤④提取的原核重组表达质粒TroLEAP-2-pET 32a转化Rosetta(DE3)表达菌株，检测确认无误后进行表达；
3)原核重组蛋白诱导表达及纯化
①将含有TroLEAP-2-pET 32a的Rosetta(DE3)菌株活化好的菌液接种到含有抗生素的LB培养基中，培养至OD600 0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG在16-20℃温度下进行诱导，16-20h；
②诱导结束，取出菌液，离心，弃上清；放在冰上，加入Lysis buffer，放入-80℃冰箱酒精中速冻10min，然后放在4℃自然解冻；
③将解冻后的菌液混匀倒入离心管中，放在冰上，超声破碎；
④将超声破碎后的菌液离心，吸取含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清至离心管中；
⑤重组布氏鲳鲹抗菌肽的纯化：将含重组布氏鲳鲹抗菌肽的上清液加入经平衡处理的Ni-NTA柱中，1h后依次向Ni-NTA柱中加入50mM咪唑和100mM咪唑清洗，最后加入Elutionbuffer洗脱2次，收集洗脱液，获得纯化后的重组布氏鲳鲹抗菌肽；
⑥将步骤⑤获得的重组布氏鲳鲹抗菌肽置于PBS中透析，即获得具抗菌活性的重组布氏鲳鲹抗菌肽，保存于-20℃。
6.根据权利要求5所述的一种重组权利要求2所述布氏鲳鲹抗菌肽的原核表达及其制备方法，其特征在于所述步骤3)原核重组蛋白诱导表达及纯化中所述的超声破碎工作时间30min，超声5s停5s，功率为50％。
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