CN115925861A - 驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因、蛋白、载体、重组细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及驼背鲈C‑型凝集素CaCTL4E基因、蛋白、载体、重组细胞及其应用，属于分子生物学领域，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因的结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述结构域对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；本发明还提供了包含所述基因的载体和重组细胞，所述蛋白对哈维氏弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌具有凝集作用。同时，所述蛋白具有糖凝集作用，所述的糖选自甘露糖、脂多糖、肽聚糖、半乳糖中的至少一种。

Description

驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因、蛋白、载体、重组细胞及其应用

技术领域

本申请属于分子生物学领域，具体涉及驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因、蛋白、载体、重组细胞及其应用。

背景技术

驼背鲈(Cromileptes altivelis)，俗称老鼠斑，味道鲜美，极具观赏价值和经济价值，是世界上最名贵的海水鱼种类之一，市场需求巨大。然而，随着驼背鲈养殖规模扩大和养殖时间延长，病害问题已日趋严重。为了有效防控病害对驼背鲈养殖造成的严重影响，保障驼背鲈人工养殖的健康持续发展，深入开展驼背鲈免疫生物学特征和抗病机制等研究已十分必要。

研究表明，鱼类C-型凝集素通过其糖识别结构域识别与结合微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖类结构的病原相关分子模式，引发凝集微生物、诱导吞噬、激活补体等过程，并随着特异性免疫的出现而参与调节特异性免疫。不同鱼类的C-型凝集素具有不同的识别机制，因此有必要对驼背鲈的C-型凝集素结合和识别病原相关分子模式的分子机制进行深入研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因、蛋白、载体、重组细胞及其应用。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E的基因，所述基因的cDNA核苷酸的序列如SEQ IDNO.1所示：

atggatagagacaactacaccggcctgcaggagttcacagaagagccaacaggagggaacaatctcattcacgagaacagcaacggctcccagggactgaagcagggcattgagtgtttgaggagtcggactgctctcctgttgcttattggcttcttggcctccatctgtgccaacatactgggttttaaactgaactcggtgcagaagcgttacatccagctgtgtgaggactacaccgctctgggacagagctgttcaaagacagtgaagcagtgcagggcgtgtcctgaacgatggattcagatcggggatcagtgctacttcttcagcagtaacaagctggactggcttcagagcagagatagctgcgcagagatgggcagccatcttaccatactgcacaccatggaacaacatgacgctctggaaaaagaagccaagaaaatcggcggattcgattaccacttctggattggcttgtctgatatagagaccgaaggagactggagatgggtggacaacacaacactgcaacacaattactgggatcagtggagctcagagccaaataaccaccagtcaggaggggaacatggagaggactgcgccaccttagacagccacgcaaagacatggtttgatgttccttgtaatcacatttataaacggatctgccagatggatgccattcagctcaactga.

所述驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E的cDNA核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MDRDNYTGLQEFTEEPTGGNNLIHENSNGSQGLKQGIECLRSRTALLLLIGFLASICANIALTVLLIGRPVPGAPLDSSSLGFKLNSVQKRYIQLCEDYTALGQSCSKTVKQCRACPERWIQIGDQCYFFSSNKLDWLQSRDSCAEMGSHLTILHTMEQHDALEKEAKKIGGFDYHFWIGLSDIETEGDWRWVDNTTLQHNYWDQWSSEPNNHQSGGEHGEDCATLDSHAKTWFDVPCNHIYKRICQMDAIQLN

本申请还提供了一种驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E的结构域的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

tgtcctgaacgatggattcagatcggggatcagtgctacttcttcagcagtaacaagctggactggcttcagagcagagatagctgcgcagagatgggcagccatcttaccatactgcacaccatggaacaacatgacgctctggaaaaagaagccaagaaaatcggcggattcgattaccacttctggattggcttgtctgatatagagaccgaaggagactggagatgggtggacaacacaacactgcaacacaattactgggatcagtggagctcagagccaaataaccaccagtcaggaggggaacatggagaggactgcgccaccttagacagccacgcaaagacatggtttgatgttccttgtaatcacatttataaacggatctgccag.

所述驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E的结构域对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

CPERWIQIGDQCYFFSSNKLDWLQSRDSCAEMGSHLTILHTMEQHDALEKEAKKIGGFDYHFWIGLSDIETEGDWRWVDNTTLQHNYWDQWSSEPNNHQSGGEHGEDCATLDSHAKTWFDVPCNHIYKRICQ.

本申请还提供了驼背鲈C-型凝集素结构域的重组蛋白表达方法，包括以下步骤：

S1.构建载有所述驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因的重组表达载体；

S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；

S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；

S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行蛋白的提取和纯化。

在一些实施方案中，所述步骤S1包括以下步骤：

S1.1根据驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因的核苷酸序列设计引物Ca-CTL4E-F和Ca-CTL4E-R；

S1.2提取驼背鲈的RNA，将RNA反转录为cDNA；

S1.3以S1.2的cDNA为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；

S1.4将步骤S1.3的PCR扩增产物连接到表达载体上，得到重组表达载体。

在一些实施方案中，所述引物Ca-CTL4E-F和Ca-CTL4E-R含有EcoR V切割位点(gatatc)和Kozak序列(gccacc)。

在一些实施方案中，所述步骤S4中蛋白的纯化选自亲和层析法；所述亲和层析法选自Ni Focurose 6FF(IMAC)。

一方面，本发明还提供了一种重组表达载体，其包含所述C-型凝集素CaCTL4E的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述载体选自质粒、噬菌体、人工染色体、病毒中的至少一种；所述载体选自质粒；所述载体选自pET32a。

一方面，本申请提供了一种重组细胞，所述重组细胞包括所述C-型凝集素CaCTL4E的核苷酸序列或所述重组载体。

在一些实施方案中，所述细胞选自原核细胞；所述细胞选自大肠杆菌；所述细胞选自Rosseta菌株。

一方面，本申请提供了任一所述的C-型凝集素CaCTL4E的核苷酸序列及其重组蛋白，或所述的载体、细胞在细菌凝集、细菌结合及糖结合的作用，所述细菌选自哈维氏弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌中的至少一种；所述糖类选自甘露糖、脂多糖、肽聚糖、半乳糖中的至少一种。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本申请首次发现的驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E基因编码的蛋白，其CTL样结构域具有传统CTL的基本特征，以及与Ca²⁺相关的糖结合基序EPN，经过验证能较为广泛结合细菌表面的糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可发展为天然的抗菌活性物质。

附图说明

图1为实施例1中驼背鲈CaCTL4E与其他物种的C-型凝集素4E的氨基酸序列比对结果。

图2为实施例1中驼背鲈CaCTL4E蛋白结构域预测分析结果。

图3为本发明实施例2中提供的诱导及纯化的CaCTL4E重组蛋白电泳图。泳道M，分子量标准；泳道2，对照；泳道3，CaCTL4E重组蛋白诱导；泳道4，CaCTL4E重组蛋白纯化。

图4为本发明实施例3中提供的纯化的CaCTL4E重组蛋白的细菌凝集活性以及糖结合抑制蛋白凝集细菌活性分析。A中所用细菌为哈维氏弧菌，B中所用细菌为迟缓爱德华氏菌，C中所用细菌为无乳链球菌，D中所用细菌为金黄色葡萄球菌。

图5为本发明实施例4中提供的纯化的CaCTL4E重组蛋白的细菌结合活性分析，A中所用细菌为哈维氏弧菌，B中所用细菌为金黄色葡萄球菌，C中所用细菌为迟缓爱德华氏菌，D中所用细菌为无乳链球菌。

图6为本发明实施例5中提供的纯化的CaCTL4E重组蛋白的糖结合活性分析，A中所用糖类为脂多糖，B中所用糖类为肽聚糖，C中所用糖类为半乳糖，D中所用糖类为甘露糖。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步解释，但本发明的技术方案不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

驼背鲈C-型凝集素基因CaCTL4E的cDNA序列及结构域序列克隆和序列分析。

取驼背鲈头肾组织，进行总RNA提取，经逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR分别获得驼背鲈C-型凝集素基因CaCTL4E的cDNA序列和结构域序列。

CaCTL4E基因cDNA序列扩增引物如下。

F：5’-gatatcgccaccatggatagagacaactacaccgg-3’，

R：5’-gatatcgttgagctgaatggcatc-3’；

CaCTL4E基因结构域序列扩增引物如下。

Ca-CTL4E-F:：5’-gatatcgccaccatgtgtcctgaacgatggattc-3’

Ca-CTL4E-R:：5’-gatatcctggcagatccgtttataaatgt-3’

分析CaCTL4E基因序列发现，CaCTL4E基因的编码区全长765bp，编码254个氨基酸。

将CaCTL4E的cDNA序列编码的氨基酸序列以及其他同源物种的CTL4E氨基酸序列进行同源比对分析发现，驼背鲈CaCTL4E具有传统C-型凝集素的基本特征(图1)，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL，以及与Ca²⁺相关的糖结合基序QPD/EPN和WND的类似基序，预示着它们可能具有凝集素分子的基本活性。

SMART预测结果显示，CaCTL4E基因编码的蛋白质是由N端信号肽和1个CLECT结构域组成，属于分泌型的凝集素分子(图2)。

实施例2

CaCTL4E结构域重组蛋白的原核表达

PCR扩增CaCTL4E结构域的序列，反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增后的片段(396bp)经胶回收后与pMD19-T-simple载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测；检测正确后提取重组质粒，EcoR V限制性内切酶酶切后回收396bp片段；提取pET32a质粒同时使用EcoR V酶切；然后利用T4 DNA连接酶将上述396bp回收片段与酶切后的pET32a质粒相连构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有CaCTL4E结构域序列，将其命名为pCaCTL4E；将上述的质粒pCaCTL4E用常规方法转入表达菌株Rosseta感受态细胞(购于北京全式金生物技术有限公司)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12-20h，挑取阳性转化子；将阳性菌株接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，25℃条件下继续以180rpm/min振荡培养16h，而后在8000g，4℃条件下离心20min，收集菌液，加入8mL裂解液，－80℃速冻之后，4℃解冻，而后再进行超声破碎后，以10000g，4℃条件离心30min，收集蛋白。将诱导出的蛋白用Ni Focurose 6FF(IMAC)亲和层析法回收纯化。将诱导的蛋白、纯化的蛋白及对照空载体诱导的蛋白(rTrx)用SDS-PAGE电泳分析检测(8v/cm电压下电泳25-30min，随后15v/cm电压下电泳2-2.5h)，测定其诱导及分子量大小(图3)。发现诱导出的蛋白及纯化出的蛋白大小均与CaCTL4E结构域蛋白预测理论大小35.5kDa一致。获得的纯化蛋白命名为rCaCTL4E。

包涵体蛋白复性

将装有变性纯化蛋白的透析袋浸没在复性液中，置于4℃，每隔12h更换尿素浓度逐渐降低(6M、4M、3M、2M、1M、0.5M)的复性液(pH 6.5)，最后将复性的rCaCTL4E以及rTrx蛋白于PBS缓冲液(pH＝7.0)中透析，结束后收集蛋白，即获得复性后的rCaCTL4E。

所述PBS组成成分为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，pH 7.2～7.4，余量为水。所述裂解液为终浓度50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl和10mMimidazole，pH 8.0，复性液为终浓度100mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM EDTA·2Na、2mM还原性谷胱甘肽、0.2mM氧化性谷胱甘肽、20％甘油、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5～6M尿素，补足ddH₂O至1L。

实施例3

微生物凝集实验及糖抑制微生物凝集实验

为研究纯化后的rCaCTL4E是否会引起微生物的凝集，实验采用迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌四种菌种进行分析，以rTrx蛋白为阴性对照，PBS为空白对照。

1)细菌菌液制备：将迟缓爱德华氏菌，哈维氏弧菌和无乳链球菌，在LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6；将金黄色葡萄球菌在LB培养基中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，将上述菌液以1:100的比例转移至新的培养基中培养约3小时至对数生长期来进行下述微生物凝集实验及糖抑制微生物凝集实验。

2)细菌凝集活性测定：将纯化复性的rCaCTL4E在TBS(50mM Tris-HCl，100mMNaCl；pH＝7.5)中稀释至300μg/mL。将上述制备的细菌菌液离心(6000rpm，5min)收集菌体，用TBS洗涤菌体两次后，取洗涤后的菌体950μL，加入50μL FITC溶液(溶于DMSO，终浓度为10mg/mL)，置于TBS中进行避光振荡12h。接着，用大量TBS洗去未结合的FITC，最后把细菌悬浮在TBS缓冲液，将各种菌的菌浓度调整到1×10⁸CFU/mL，取10μL上述菌液加入96孔板中，再向其中依次加入50μL重组蛋白(终浓度为300μg/mL)+40μL TBS，50μL重组蛋白(终浓度为300μg/mL)+40μL TBS+Ca²⁺(10mM CaCl₂)，其余孔中加入50μL重组蛋白(终浓度为300μg/mL)+40μL甘露糖/脂多糖/肽聚糖/半乳糖(80μg/mL)+Ca²⁺(10mM CaCl₂)，孵育1h后，在DMi8倒置荧光显微镜(LeCia)下观察拍照，观察凝集情况，同时设rTrx为阴性对照。

结果显示，rCaCTL4E可以显著凝集革兰氏阴性细菌(迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌)，且多种糖类(甘露糖/脂多糖/肽聚糖/半乳糖)可有效抑制其凝集作用(图4)。

实施例4

微生物结合实验

为研究纯化后的rCaCTL4E是否会与微生物结合，实验采用迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌四种菌种，以rTrx蛋白为阴性对照，PBS为空白对照。

1)细菌菌液制备：将迟缓爱德华氏菌，哈维氏弧菌和无乳链球菌，在LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6；将金黄色葡萄球菌在LB培养基中，37℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，将上述菌液以1:100的比例转移至新的培养基中培养约3小时至对数生长期来进行细菌结合实验。

2)细菌结合活性分析：将四种菌体用包被液调整到菌浓度1×10⁸CFU/mL，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜，使菌体包被于孔中。将未被包被的菌体倾倒，使用TBST冲洗并甩干后加入200μL封闭液在37℃条件下封闭1h，接着，用TBST重新并倾倒封闭液后，加入不同浓度梯度的rCaCTL4E(0μg/mL,4.5μg/mL,9.0μg/mL,18.0μg/mL,36.0μg/mL,75.0μg/mL,150μg/mL)，每孔100μL，置于室温孵育3h后使用TBST进行多次冲洗，加入制备的一抗(鼠抗驼背鲈rCaCTL4E多克隆抗体，1:100稀释)，每孔100μL并置于37℃孵育1h，用TBST多次清洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1:10000)并置于37℃孵育1h，最后使用TBST多次冲洗后使用双组份TMB显色液(购自北京索莱宝科技有限公司)进行显色并在酶标仪中读取OD₄₅₀处的吸光值。rCaCTL4E与细菌的结合指数(Binding Index)计算如下：ELISA 反应中含有rCaCTL4E的细菌的吸光值/含有PBS的细菌的吸光值。通常Binding Index大于2即被认为是有意义的(positive reading)。其中，rTrx为阴性对照。

结果表明(图5)，rCaCTL4E能够与革兰氏阴性细菌(迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌)发生显著结合，并存在浓度依赖性。因此，rCaCTL4E有望在细菌性疾病的防控中应用。

实施例5

糖结合实验

为研究纯化后的rCaCTL4E在Ca²⁺参与下是否会与糖类结合，实验采用脂多糖、甘露糖、半乳糖、肽聚糖(购自北京索莱宝科技有限公司)四种糖类，以rTrx蛋白为阴性对照，PBS为空白对照。

1)糖类制备：将脂多糖、甘露糖、半乳糖、肽聚糖用含有CaCl₂(10mM)的包被液溶解至浓度为80μg/mL来进行下述糖结合结合实验。

2)将四种已调整好浓度的糖类分别加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜，使糖类包被于孔中。将未被包被的糖类倾倒，使用TBST冲洗并甩干后加入200μL封闭液在37℃条件下封闭1h，接着，用TBST重新并倾倒封闭液后，加入不同浓度梯度的rCaCTL4E(0μg/mL,4.5μg/mL,9.0μg/mL,18.0μg/mL,36.0μg/mL,75.0μg/mL,150μg/mL)，每孔100μL，置于室温孵育3h后使用TBST进行多次冲洗，加入制备的一抗(鼠抗驼背鲈rCaCTL4E多克隆抗体，1:100稀释)，每孔100μL并置于37℃孵育1h，用TBST多次清洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(1:10000)并置于37℃孵育1h，最后使用TBST多次冲洗后使用双组份TMB显色液进行显色并在酶标仪中读取OD₄₅₀处的吸光值。rCaCTL4E与糖类的结合指数(Binding Index)计算如下：ELISA 反应中含有rCaCTL4E的糖类的吸光值/含有PBS的糖类的吸光值。通常Binding Index大于2即被认为是有意义的(positive reading)。其中，rTrx为阴性对照。

结果表明(图6)，rCaCTL4E在Ca²⁺参与下能够与多种糖类(脂多糖、甘露糖、半乳糖、肽聚糖)发生显著结合，并存在浓度依赖性。

Claims (8)

1.一种驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的驼背鲈C-型凝集素CaCTL4E蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述基因的结构域，其特征在于，所述结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求3所述结构域，其特征在于，所述结构域对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

5.一种载体，其特征在于所述载体包含权利要求1所述基因。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括所述C-型凝集素CaCTL4E的核苷酸序列或所述载体。

7.权利要求2所述蛋白在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述菌选自哈维氏弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌中的至少一种。

8.权利要求2所述蛋白在制备糖结合药物中的应用，其特征在于，所属糖选自甘露糖、脂多糖、肽聚糖、半乳糖中的至少一种。

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