RU2606014C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Download PDFInfo
- Publication number
- RU2606014C1 RU2606014C1 RU2015121032A RU2015121032A RU2606014C1 RU 2606014 C1 RU2606014 C1 RU 2606014C1 RU 2015121032 A RU2015121032 A RU 2015121032A RU 2015121032 A RU2015121032 A RU 2015121032A RU 2606014 C1 RU2606014 C1 RU 2606014C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pefn877
- cells
- domain
- properties
- plyss
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title abstract description 24
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 241000373062 Psychrobacter cryohalolentis K5 Species 0.000 claims abstract description 18
- 108010073429 Type V Secretion Systems Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 79
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 11
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 9
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 claims description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 28
- 101710152525 Esterase P Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 9
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 2
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710169308 AIDA-I autotransporter Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001135557 Enteric coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 241000309106 Psychrobacter cryohalolentis Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 101710117021 Tyrosine-protein phosphatase YopH Proteins 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения гибридного полипептида альтернативный каркасный белок 10-й домен фибронектина человека. Рекомбинантную плазмидную ДНК pEFN877 конструируют на основе плазмиды pET20b(+) длиной 3,654 т.п.о. Полученная плазмида pEFN877 содержит гибридный ген EFN877 с SEQ ID NO: 8, кодирующий аминокислотные последовательности эстеразы P. cryohalolentis K5T, 10-го домена фибронектина человека и аутотранспортера P. cryohalolentis K5T в единой рамке считывания, расположенные в соответствии с фиг. 1. Штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 получают путем трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS плазмидной ДНК pEFN877. Изобретение позволяет получить штамм клеток Е. coli - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 9 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Может быть использовано для получения клеток Escherichia coli, экспрессирующих на поверхности альтернативный каркасный белок 10-й домен фибронектина человека и его варианты - искусственные связывающие белки.
Наиболее распространенными связывающими белками являются моноклональные антитела, однако их терапевтическое применение ограничивается высокой стоимостью производства из-за использования дорогостоящей системы экспрессии в клетках млекопитающих. Кроме того, слабое проникновение в ткани в силу большого размера снижает эффективность антител в лечении ряда заболеваний. Искусственные молекулы, обладающие способностью к высокоаффинному связыванию антигена, но лишенные указанных недостатков, могут быть получены на основе альтернативных каркасных белков (АКБ). Такие белки, являющиеся основой для конструирования искусственных связывающих молекул методами белковой инженерии, характеризуются высокой стабильностью, небольшой молекулярной массой и могут быть получены с помощью бактериальной системы экспрессии [Wurch Т., Pierré A., Depil S. (2012) Novel protein scaffolds as emerging therapeutic proteins: from discovery to clinical proof-of-concept. Trends Biotechnol. V. 30. P. 575-582].
10-й домен фибронектина человека (10Fn3) является одним из наиболее часто используемых АКБ. 10Fn3 имеет небольшой размер, обладает исключительной термостабильностью и растворимостью. В его молекуле отсутствуют остатки цистеина, что способствует высокому уровню его экспрессии в Е. coli. Присутствие в нормальной сыворотке в концентрации 0,1 мг/мл обеспечивает низкую иммуногенность этого белка и открывает широкие возможности его использования в качестве основы для создания терапевтических средств.
Три из экспонированных петель 10Fn3 - ВС, DE и FG - являются структурными аналогами участков антител, обеспечивающих связывание антигенов. В состав петли FG входит последовательность Arg-Gly-Asp (RGD), которая необходима для специфического связывания интегринов. Таким образом, фибронектиновый модуль представляет собой специализированный связывающий белок, структура которого обеспечивает природную способность взаимодействовать с различными лигандами. На основе 10Fn3 получен ряд искусственных связывающих белков, обладающих высокой специфичностью и константой диссоциации в пико- и наномолярной области [Lipovšek D. (2011) Adnectins: engineered target-binding protein therapeutics. Prot. Engin. Des. Sel. V. 24. P. 3-9].
Экспонирование комбинаторных библиотек связывающих белков на поверхности микробных клеток (клеточный дисплей) является современным высокоэффективным методом, позволяющим проводить селекцию вариантов, обладающих высокой аффинностью к целевому лиганду [van Bloois Е., Winter R.Т., Kolmar Н., Fraaije М.W. (2011) Decorating microbes: surface display of proteins on Escherichia coli. Trends Biotechnol. V. 29. P. 79-86]. Для отбора вариантов 10Fn3 чаще всего используется система дрожжевого дисплея, в которой белки экспонируются на поверхности в виде гибрида с субъединицей белка Aga2p [Lipovšek D., Lippow S.M., Hackel В.J., Gregson M.W., Cheng P., Kapila A., Wittrup K.D. (2007) Evolution of an interloop disulfide bond in high-affinity antibody mimics based on fibronectin type III domain and selected by yeast surface display: molecular convergence with single-domain camelid and shark antibodies. J. Mol. Biol. V. 368. P. 1024-1041]. Недостатком данной системы является пониженная эффективность трансформации дрожжей по сравнению с Е. coli, вследствие чего размер библиотек (число вариантов) в этом случае оказывается существенно меньше. Системы бактериального дисплея на основе Е. coli позволяют проводить скрининг более представительных библиотек, кроме того, для этих бактерий известны различные способы экспонирования связывающих белков на поверхности.
Наиболее популярным подходом для конструирования систем клеточного дисплея связывающих белков является использование механизма секреции V типа на основе аутотранспортеров внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Их молекулы состоят из N-концевого пассажирского и С-концевого транслокаторного доменов, соединенных альфа-спиральным сегментом [Dautin N., Bernstein H.D. (2007) Annu. Rev. Microbiol. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. V. 61. P. 89-112]. Замена природного пассажирского домена на рекомбинантный белок с помощью генноинженерных методов позволяет получать гибридные аутотранспортеры, экспонирующие целевой белок на поверхности клеток.
Известен способ получения клеток Е. coli, экспрессирующих на поверхности одноцепочечное антитело (scFv) против коронавируса TGEV-возбудителя гастроэнтерита, с использованием транслокаторного домена IgA протеазы Neisseria gonorrhoeae [Veiga Е., de Lorenzo V., Fernández L.A. (2003) Neutralization of enteric coronaviruses with Escherichia coli cells expressing single-chain Fv-autotransporter fusions. J. Virol. V. 77. P. 13396-13398]. С этой целью ген, кодирующий гибрид нейтрализующего TGEV одноцепочечного антитела 6AC3-scFv и транслокаторного домена, клонировали в плазмиде р6АС3β в единой рамке считывания с кодирующей последовательностью сигнального пептида PelB под контролем lac-промотора. Для обеспечения синтеза рекомбинантного белка проводили индукцию добавлением 0.1 мМ ИПТГ и выращивали культуру штамма-продуцента в течение 3 часов при 30°С. Анализ экспрессии методом Вестерн-блота обнаружил наличие большого количества продуктов протеолитической деградации рекомбинантного белка, что указывает на отсутствие правильного фолдинга пассажирского домена и является недостатком данного способа.
Описан способ получения клеток Е. coli, экспрессирующих на поверхности однодоменное верблюжье антитело (VHH домен) в виде гибрида с транслокаторным доменом аутотранспортера EhaA [Salema V, Marín Е, Martínez-Arteaga R, Ruano-Gallego D, Fraile S, et al. (2013) Selection of Single Domain Antibodies from Immune Libraries Displayed on the Surface of E. coli Cells with Two β-Domains of Opposite Topologies. PLoS ONE 8(9): e75126], а также способ получения клеток, экспрессирующих на поверхности аффибоди (альтернативный каркасный белок на основе IgG-связывающего домена Staphyllococcus aureus) в виде гибридного белка с аутотранспортером AIDA-I энтеропатогенных штаммов Е. coli [Fleetwood F., Andersson K.G., Ståhl S., Löfblom J. (2014) An engineered autotransporter-based surface expression vector enables efficient display of Affibody molecules on OmpT-negative E. coli as well as protease-mediated secretion in OmpT-positive strains. Microb. Cell Fact. V. 13. P. 179]. Оба способа характеризуются высоким уровнем экспрессии белков на поверхности клеток Е. coli, позволяющим проводить отбор вариантов, связывающих целевые лиганды. Однако как VHH домены, так и аффибоди по своему происхождению не являются человеческими белками, поэтому их использование может приводить к развитию нежелательных иммунных реакций в организме.
Наиболее близким к заявленному является способ получения клеток Е. coli, экспрессирующих на поверхности CTLA4-связывающий антикалин в виде гибрида с транслокаторным доменом аутотранспортера EspP. Ген рекомбинантного аутотранспортера, объединенный в единую рамку считывания с кодирующей последовательностью сигнального пептида OmpA, клонировали под контролем регулируемого tet-промотора. Экспрессию гена индуцировали добавлением 25 нг/мл ангидротетрациклина и выращивали культуру в течение 2 часов при 30°С. Недостатком указанного способа является относительно низкий уровень экспрессии связывающего белка на поверхности клеток - около 3000 молекул на клетку [Binder, U., Matschiner, G., Theobald, I., & Skerra, A. (2010) High-throughput sorting of an Anticalin library via EspP-mediated functional display on the Escherichia coli cell surface. J. Mol. Biol. V. 400. P. 783-802].
Технической задачей изобретения является получение штамма-продуцента, экспрессирующего на поверхности клеток полипептид со свойствами альтернативного каркасного белка в виде гибрида с транслокаторным доменом аутотранспортера, а также повышение уровня его экспрессии на поверхности клеток. Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pEFN877, детерминирующей экспрессию на поверхности клеток гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека, с мол. массой 3,52 Md (5,801 т.п.о.), состоящей из NcoI/XhoI-фрагмента ДНК плазмиды pET20b(+) длиной 3,654 т.п.о., включающего промотор T7lac, терминатор транскрипции бактериофага Т7, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pEFN877 клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации, сигнальную последовательность pelB пектатлиазы В Erwinia carotovora; и NcoI/XhoI-фрагмента ДНК размером 2,147 т.п.о., содержащего гибридный ген EFN877, кодирующий аминокислотные последовательности эстеразы P. cryohalolentis K5T, 10-го домена фибронектина человека и аутотранспортера P. cryohalolentis K5T в единой рамке считывания; содержащей уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: NdeI - 2371, NcoI - 2305, BamHI - 1433, SalGI - 1151, XhoI - 158, а также за счет штамма бактерий Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцента гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на клеточной поверхности.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877 кодирует индуцибельный синтез гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека, а штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 обеспечивает синтез и секрецию этого полипептида на поверхность клеток с уровнем экспрессии не ниже 9000 молекул на клетку. Индуцибельный высокий уровень синтеза целевого полипептида обеспечивается тем, что плазмида pEFN877 содержит промотор T7lac и усилитель трансляции гена 10 бактериофага Т7, а экспрессия на поверхности клеток - наличием в составе кодирующей последовательности гибридного белка сигнальной последовательности pelB и С-концевого домена аутотранспортера P. cryohalolentis K5T, а также клонированием в 5'-направлении от гена 10Fn3 кодирующей последовательности эстеразы P. cryohalolentis K5T.
Особенностью предложенной плазмидной конструкции является наличие в ее составе кодирующей последовательности гибридного белка, состоящего из сигнальной последовательности pelB, эстеразы P. cryohalolentis K5T, 10Fn3 и С-концевого домена аутотранспортера P. cryohalolentis K5T (SEQ ID NO 9), под контролем сильного регулируемого промотора T7lac, что, в сочетании с наличием в хромосоме хозяйского штамма гена РНК-полимеразы бактериофага Т7 и компонентов системы секреции в мембране клеток, обеспечивает индуцибельный синтез целевого белка (SEQ ID NO 10) на поверхности клеток с высоким выходом, достигаемым при малых концентрациях индуктора. Клонирование в 5'-направлении от гена 10Fn3 кодирующей последовательности эстеразы P. cryohalolentis K5T обеспечивает более высокую скорость сворачивания С-концевой части пассажирского домена по сравнению с N-концевой. Известно, что 10Fn3 обладает высокой скоростью сворачивания и стабильной пространственной структурой [Plaxco K.W., Spitzfaden С., Campbell I.D., Dobson СМ. (1996) Rapid refolding of a proline-rich all-beta-sheet fibronectin type III module. Proc. Nat. Acad. Sci. V. 93. P. 10703-10706], а эстераза P. cryohalolentis K5T относится к холодоактивным ферментам, для которых характерна низкая стабильность [Novototskaya-Vlasova K., Petrovskaya L., Yakimov S., Gilichinsky D. (2012) Cloning, purification, and characterization of a cold-adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg. FEMS Microbiol. Ecol. V. 82. P. 367-75]. Наличие на N-конце пассажирского домена белка, обладающего низкой стабильностью, а в С-концевой части белка со стабильной пространственной структурой обеспечивает высокую эффективность его экспорта на поверхность клеток штамма-продуцента [Renn J.P., Junker M., Besingi R.N., Braselmann E., Clark P.L. (2012) ATP-independent control of autotransporter virulence protein transport via the folding properties of the secreted protein. Chem. Biol. V. 19. P. 287-296].
Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток компетентные клетки Е. coli штамма BL21(DE3)pLysS трансформируют рекомбинантной плазмидой pEFN877.
Полученный штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, подвижные, размером 1×3-5 мкм, неспороносные.
Культуральные признаки: при росте на агаризованной LB-среде преобладают мелкие колонии диаметром 1-3 мм; круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный; консистенция пастообразная. Могут встречаться крупные колонии диаметром 4-5 мм; круглые, гладкие, матовые, край волнистый. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется равномерным помутнением среды.
Физиолого-биохимические признаки. Клетки штамма продуцента могут расти в диапазоне температур 20-42°С, оптимальная температура роста составляет 37°С. Наиболее благоприятные для роста значения pH находятся в интервале 6,8-7,2. При росте в аэробных условиях, культура может усваивать азот как органических соединений (пептон, триптон, аминокислоты, дрожжевой экстракт), так и аммонийных солей. Углерод усваивается в форме углеводов, многоатомных спиртов (глицерин), аминокислот.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы, и к хлорамфениколу (до 34 мкг/мл), обусловленную присутствием в хозяйском штамме плазмиды pLysS.
Способ, условия и состав среды для хранения штамма. LB-бульон с 15% глицерином, при температуре -70°С, в криовиалах.
Технический результат заявленного изобретения заключается в получении штамма Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877, экспрессирующего гибридный полипептид со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток в количестве не менее 9000 молекул на клетку при концентрации индуктора 0,1 мМ. В отличие от прототипа в данном штамме достигается в 3 раза более высокий уровень экспрессии целевого белка на поверхности клеток. Совокупность перечисленных свойств штамма Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 обусловливает большую технологичность процесса получения клеток, экспрессирующих на поверхности гибридный полипептид со свойствами 10-го домена фибронектина человека.
Изобретение иллюстрируют графические материалы.
Фиг. 1. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pEFN877. Указаны уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции. Т7 promoter - промотор бактериофага Т7, Т7 terminator - терминатор транскрипции бактериофага Т7, Ар - ген устойчивости к ампициллину, ori - участок инициации репликации плазмиды, EFN877 - рекомбинантный ген EFN877, кодирующий аминокислотную последовательность гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека.
Фиг. 2. Электрофореграмма лизатов клеток штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 до (дорожка 1) и после индукции (дорожки 2) и мембранной фракции клеток штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 после индукции ИПТГ (дорожка 3) в 13%-ном полиакриламидном геле (М - белковые маркеры молекулярной массы); стрелкой указано положение целевого гибридного белка.
Фиг. 3. Анализ экспрессии 10Fn3 на поверхности клеток Е. coli с помощью дот-блота. Цифры на левой панели указывают температуру выращивания/концентрацию добавленного ИПТГ, на правой - количество в мкг очищенного рекомбинантного 10Fn3, нанесенного в качестве контроля; control - клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS без плазмиды.
Фиг. 4. Анализ методом ELISA ФНО-связывающей активности клеток BL21(DE3)pLysS, экспрессирующих на поверхности библиотеку генов 10Fn3. Приведены средние (из 5 повторностей) результаты измерений поглощения в культурах клеток, полученных в результате последовательных циклов отбора (1-3) и контрольных клеток того же штамма, трансформированных плазмидой pEFN877 (4).
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFN877
Для амплификации гена 10Fn3 проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на матрице плазмидной ДНК pETFN3 [Петровская Л.Е., Шингарова Л.Н., Крюкова Е.А., Болдырева Е.Ф., Якимов С.А., Гурьянова С.В., Новоселецкий В.Н., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (2012) Конструирование TNF-связывающих белков на основе домена фибронектина методом пересадки гипервариабельных участков антитела F10. Биохимия. Т. 77. С. 79-89] в реакционной смеси объемом 50 мкл, содержащей 50 пмоль праймера 877FN3for (SEQ ID NO 2), 50 пмоль праймера 877FN3rev (SEQ ID NO 3), 2 мМ каждого из четырех dNTP, 5 мкл 10× буфера для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas) и 2.5 е.а. Pfu ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в следующем режиме: денатурация - 40 с, 94°С; отжиг - 40 с, 52°С; достройка - 40 с, 72°С; количество циклов - 25. 2 мкг ПЦР-продукта обрабатывают рестриктазами NcoI и PauI (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем ферментов, фрагмент длиной 0,279 т.п.о. выделяют из 1% агарозного геля. 0,5 мкг полученного фрагмента и 0.2 мкг плазмидного вектора рАТ877 [Petrovskaya L.E., Novototskaya-Vlasova K.А., Kryukova Е.А., Rivkina E.M., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Cell surface display of cold-active esterase EstPc with the use of a new auto transporter from Psychrobacter cryohalolentis K5T. Extremophiles. 2015. V. 19. P. 161-170], кодирующего ген аутотранспортера, линеаризированного обработкой рестриктазами NcoI и PauI, длиной 4,634 п.о. лигируют в течение 4 ч при 12°С в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 3 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.
Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и обрабатывают рестриктазами NcoI и PauI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 1% агарозном геле. Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности. В результате получают плазмидную ДНК pFN877 (SEQ ID NO 1), содержащую кодирующую последовательность гибрида 10-го домена фибронектина человека и транслокаторного домена аутотранспортера P. cryohalolentis K5T. Кроме того, в данной плазмиде в результате клонирования возникает сайт узнавания рестриктазы SalGI, используемый на следующем этапе.
Пример 2
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pEFN877
Для амплификации гена 10Fn3 проводят ПЦР на матрице плазмидной ДНК pETFN3 в смеси объемом 50 мкл, содержащей 50 пмоль праймера Bam_FN (SEQ ID NO 4), 50 пмоль праймера FN_Sal (SEQ ID NO 5), 2 мМ каждого из четырех dNTP, 5 мкл 10× буфера для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas) и 2.5 е.а. Pfu ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в следующем режиме: денатурация - 40 с, 94°С; отжиг - 40 с, 52°С; достройка - 40 с, 72°С; количество циклов - 25. 2 мкг ПЦР-продукта обрабатывают рестриктазами BamHI и SalGI (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем ферментов, фрагмент длиной 0,282 т.п.о. выделяют из 1% агарозного геля.
Для амплификации гена эстеразы P. cryohalolentis K5T проводят ПЦР на матрице плазмидной ДНК pET32a(+)/EstPc [Novototskaya-Vlasova K., Petrovskaya L., Yakimov S., Gilichinsky D. Cloning, purification, and characterization of a cold-adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg. FEMS Microbiol. Ecol. 2012. V. 82. P. 367-375] в смеси объемом 50 мкл следующего состава: 50 пмоль праймера 23NcoF (SEQ ID NO 6), 50 пмоль праймера 23BamR (SEQ ID NO 7), 2 мМ каждого из четырех dNTP, 5 мкл 10× буфера для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas), 2.5 е.а. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas). Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 40 с, 94°С; отжиг - 40 с, 52°С; достройка - 60 с, 72°С; количество циклов - 25. 2 мкг ПЦР-продукта обрабатывают рестриктазами NcoI и BamHI (Fermentas) в условиях, рекомендованных производителем ферментов, фрагмент длиной 0,885 т.п.о. выделяют из 1% агарозного геля.
По 0,5 мкг полученных фрагментов и 0.2 мкг плазмидного вектора pFN877, линеаризированного обработкой рестриктазами NcoI и SalGI, длиной 4,647 п.о. лигируют в течение 4 ч при 12°С в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 3 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина.
Из выросших клонов выделяют плазмидную ДНК и обрабатывают рестриктазами NcoI и SalGI с последующим электрофоретическим анализом длин рестрикционных фрагментов в 1% агарозном геле. Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности. В результате получают плазмидную ДНК pEFN877.
Пример 3
Получение штамма-продуцента гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток
Рекомбинантной плазмидной ДНК pEFN877 трансформируют компетентные клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) и после выращивания рекомбинантных клонов на LB-arape с ампициллином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (34 мкг/мл) при 37°С получают штамм-продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток.
Пример 4
Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток
Для определения продуктивности клетки E. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 выращивают при 37°С в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, в течение 16 ч на качалке при 250 об/мин. Полученную ночную культуру в объеме 200 мкл переносят в 5 мл жидкой среды LB (разбавление до оптической плотности 0.15-0.20 при длине волны 560 нм), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивают до оптической плотности 0,8 (длина волны 560 нм) при 37°С и перемешивании 250 об/мин. Добавляют ИПТГ до конечной концентрации 0,1 мМ, после чего клетки выращивают в течение 1,5 ч при 27°С и перемешивании 200 об/мин. Отбирают пробу культуры в количестве 1 оптическая единица (длина волны 560 нм) и центрифугируют 5 мин при скорости 7000 об/мин. Осажденные клетки суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005%) бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 10 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. По окончании электрофореза гель прокрашивают при помощи кумасси R-250. После отмывки красителя гель сканируют и проводят математическую обработку результатов с помощью программы Scion Image (Scion Corp., США). По данным сканирования содержание гибридного белка, состоящего из эстеразы, 10Fn3 и С-концевого домена аутотранспортера P. cryohalolentis K5T, составляет 10% от общего клеточного белка. На фиг. 2 представлена электрофореграмма лизатов клеток штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 (дорожки 1 и 2) в 13%-ном полиакриламидном геле до (дорожка 1) и после индукции ИПТГ (дорожка 2) (М - белковые маркеры молекулярной массы; стрелкой указано положение целевого полипептида).
Пример 5
Анализ локализации гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека в клетках штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877
Проводят индукцию биосинтеза целевого белка в клетках штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 ИПТГ (конечная концентрация 0,1 мМ) в течение 3 ч при 27°С. Клетки центрифугируют 15 мин при 7000 об/мин. 1 г влажной биомассы индуцированных клеток ресуспендируют в 10 мл буфера (50 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, pH 8,0) после чего разрушают клетки обработкой в ультразвуковом дезинтеграторе Branson Sonifier 450, не допуская нагрева выше 10°С. Полученную суспензию центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин. Полученный супернатант повторно центрифугируют 1 час при 100000 g для осаждения мембранных белков. Осадок суспендируют в 1 мл буфера 50 мМ Трис-HCl pH 8,0; 5 мкл полученной суспензии смешивают с 5 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 3% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, инкубируют 10 мин в кипящей водяной бане, образцы объемом 10 мкл анализируют электрофорезом в 13% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, гель прокрашивают при помощи кумасси R-250. По результатам электрофореза гибридный белок, состоящий из эстеразы, 10Fn3 и С-концевого домена аутотранспортера P. cryohalolentis K5T, обнаруживается в мембранной фракции клеток штамма-продуцента (фиг. 2, дорожка 3).
Пример 6
Анализ уровня экспрессии гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток методом дот-блота
Проводят индукцию биосинтеза целевого белка в клетках штамма-продуцента Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 ИПТГ (конечная концентрация 0,02, 0.05, или 0,1 мМ) в течение 1,5 ч при 27°С, а также при 20°С. Клетки центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин и дважды промывают буфером PBS (pH 7.2). Осадок после промывки и центрифугирования суспендируют в буфере PBS, так, чтобы оптическая плотность полученной суспензии составила 10,0 (длина волны 560 нм). 2 мкл полученной суспензии наносят на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad), предварительно уравновешенную в PBS. В качестве отрицательного контроля наносят 2 мкл приготовленной аналогичным образом суспензии клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS, не содержащих плазмиду. В качестве положительного контроля наносят различные количества очищенного рекомбинантного 10Fn3, полученного как описано в (Петровская Л.Е., Шингарова Л.Н., Крюкова Е.А., Болдырева Е.Ф., Якимов С.А., Гурьянова С.В., Новоселецкий В.Н., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. (2012) Конструирование TNF-связывающих белков на основе домена фибронектина методом пересадки гипервариабельных участков антитела F10. Биохимия. Т. 77. С. 79-89]. Высушенную мембрану промывают PBS, после чего выдерживают в PBS+1% БСА в течение часа при комнатной температуре. Добавляют моноклональные мышиные антитела к 10Fn3 (Hybridoma Laboratories) в разведении 1:1000 и инкубируют в течение часа при комнатной температуре. Промывают мембрану 3 раза PBS+0.1% Tween 20 и добавляют конъюгат анти-мышь-HRP (Sigma) в разведении 1:5000. Инкубируют в течение часа при комнатной температуре, после чего промывают мембрану 3 раза PBS+0.1% Tween 20. Окрашивание осуществляют с использованием преципитирующего однокомпонентного раствора ТМВ (GenWay Biotech). После промывки дистиллированной водой окрашенную мембрану высушивают. На фиг. 3 приведены результаты анализа уровня экспрессии 10Fn3 на поверхности клеток методом дот-блота. По результатам эксперимента, уровень экспрессии альтернативного каркасного белка 10Fn3 на поверхности клеток штамма-продуцента в оптимальных условиях (27°С, 0,1 мМ ИПТГ, 1,5 ч) составляет около 0,3 мкг на 2×107 клеток. Это соответствует содержанию около 10000 молекул на клетку, что в 3 раза выше, чем у прототипа.
Пример 7
Конструирование библиотеки вариантов генов 10Fn3 в плазмиде pEFN877 для отбора TNF-связывающих белков методом бактериального дисплея
На первом этапе с помощью ПЦР получают набор вариантов (библиотеку) генов 1()Fn3, кодирующих петли ВС, DE и FG с рандомизированной последовательностью и фланкированных на 5'- и 3'-концах сайтами узнавания рестриктаз BamHI и SalGI для последующего клонирования. В качестве матрицы используют суммарную плазмидную ДНК, полученную в результате селекции библиотеки генов 10Fn3 методом бесклеточного CIS-дисплея [Шингарова Л.Н., Петровская Л.Е., Крюкова Е.А., Болдырева Е.Ф., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ3.54, кодирующая полипептид FN3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент полипептида FN3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека. Патент №2531547 от 26.08.2014]. Амплификацию проводят в присутствии праймеров Bam_FN (SEQ ID NO 4) и FN_Sal (SEQ ID NO 5) в объеме 50 мкл с использованием 0,5 мкг матрицы, 50 пмоль каждого из праймеров, 2 мМ каждого из четырех dNTP, 5 мкл 10× буфера для Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas) и 2.5 е.а. Pfu ДНК-полимеразы (Fermentas). Реакцию проводят в следующем режиме: денатурация - 1 мин, 94°С; отжиг - 40 с, 56°С; достройка - 40 с, 72°С; количество циклов - 25. Продукт ПЦР выделяют из агарозного геля с использованием MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen).
На втором этапе ПЦР-продукт обрабатывают совместно рестриктазами BamHI и SalGI, выделяют фрагмент (0,294 т.п.о.) из 1,5% агарозного геля. 0,5 мкг полученного фрагмента и 0.2 мкг плазмидного вектора pEFN877, линеаризированного обработкой рестриктазами BamHI и SalGI, лигируют в течение 3 ч при 13°С в 10 мкл раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl (pH 7,8), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ аденозинтрифосфата и 3 е.а. Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва). 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Полученные клоны смывают с чашки 5 мл среды LB и выделяют суммарную плазмидную ДНК, содержащую библиотеку генов 10Fn3.
Пример 8
Селекция ФНО-связывающих вариантов 10Fn3 методом бактериального дисплея
Клетки E. coli штамма BL21(DE3)pLysS трансформируют суммарной плазмидной ДНК, содержащей библиотеку генов 10Fn3, и выращивают ночную культуру при 37°С в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), хлорамфеникол (34 мкг/мл), 0,2% глюкозу. Ночную культуру разбавляют 20 мл среды LB, содержащей (100 мкг/мл) до мутности 0,1 ОЕ560 нм, растят до 0,6-0,8 ОЕ560 нм и проводят индукцию экспрессии 0,1 мМ ИПТГ в течение 1 ч при 25°С и 220 об./мин. Клетки осаждают центрифугированием (2000 g, 4°С, 15 мин.) и ресуспендируют в 1,5 мл холодного буфера PBS. Для селекции клеток, экспонирующих на поверхности ФНО-связывающие белки, к суспензии добавляют биотинилированный ФНО до концентрации 100 нМ, инкубируют 1 ч. при 4°С и перемешивании и осаждают клетки центрифугированием. Далее ресуспендируют в 750 мкл PBS и добавляют 150 мкг магнитных шариков Dynabeads М-280 Streptavidin (Invitrogen), предварительно обработанных буфером ВВ (3% БСА, 0,1 мг/мл ДНК-носителя в PBS). Суспензию инкубируют 30 мин при 4°С и перемешивании, шарики со связавшимися клетками собирают магнитом, промывают 2 раза по 750 мкл холодным PBS, переносят в 5 мл среды LB с ампициллином, хлорамфениколом и глюкозой и выращивают ночную культуру. Аналогично проводят еще 2 раунда селекции. После 3 раундов выделяют суммарную ДНК, кодирующую библиотеку ФНО-связывающих вариантов 10Fn3.
Пример 9
Анализ эффективности селекции методом ИФА
Эффективность отбора библиотеки ФНО-связывающих вариантов 10Fn3, экспонированных на поверхности клеток E. coli, проверяют после каждого раунда селекции методом иммуноферментного анализа. Для этого 2 ОЕ560 клеток штамма BL21(DE3)pLysS, экспрессирующих на поверхности библиотеку генов 10Fn3, после индукции центрифугируют (2000 g, 4°С, 15 мин.), промывают холодным PBS и инкубируют в течение 1 ч при 4°С в присутствии 100 нМ биотинилированного ФНО. Клетки осаждают, промывают холодным PBS и обрабатывают в течение 30 мин конъюгатом нейтравидин-пероксидаза (Thermo Scientific, США). Затем клетки осаждают, промывают PBS для удаления конъюгата, суспендируют в 500 мкл PBS и помещают по 50 мкл суспензии в лунки планшета для ИФА (Corning). Для визуализации иммунных комплексов в лунки добавляют по 50 мкл однокомпонентного раствора ТМВ (GenWay Biotech), через 5 мин реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10% серной кислоты. Поглощение в лунках измеряют с помощью ридера Model 680 (Bio-Rad) при длине волны 450 нм. Измерения проводят в 5 повторностях. В качестве отрицательного контроля используют клетки того же штамма, трансформированные плазмидой pEFN877 и обработанные в тех же условиях. Результаты проведенного эксперимента (фиг. 4) показывают, что в результате отбора происходит постепенное повышение эффективности взаимодействия с ФНО клеток, экспрессирующих на поверхности библиотеку вариантов 10Fn3.
Перечень последовательностей, представленных в описании изобретения
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию на поверхности клеток гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека, с мол. массой 3,52 Md (5,801 т.п.о.), состоящей из NcoI/XhoI - фрагмента ДНК плазмиды pET20b(+) длиной 3,654 т.п.о., включающего промотор T7lac, терминатор транскрипции бактериофага Т7, ген bla β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pEFN877 клеток к ампициллину, участок ori инициации репликации, сигнальную последовательность pelB пектатлиазы В Erwinia carotovora; и NcoI/XhoI - фрагмента ДНК размером 2,147 т.п.о., содержащего гибридный ген EFN877 с SEQ ID NO: 8, кодирующий аминокислотные последовательности эстеразы P. cryohalolentis K5T, 10-го домена фибронектина человека и аутотранспортера P. cryohalolentis K5T в единой рамке считывания, расположенные в соответствии с фиг. 1.
2. Штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877, полученный путем трансформации компетентных клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS плазмидной ДНК pEFN877 по п. 1 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина человека на поверхности клеток.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015121032A RU2606014C1 (ru) | 2015-06-03 | 2015-06-03 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015121032A RU2606014C1 (ru) | 2015-06-03 | 2015-06-03 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2606014C1 true RU2606014C1 (ru) | 2017-01-10 |
Family
ID=58452280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015121032A RU2606014C1 (ru) | 2015-06-03 | 2015-06-03 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2606014C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2649132C1 (ru) * | 2017-08-03 | 2018-03-29 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Способ получения активного начала вакцины против ротавирусной инфекции белка FliCVP6VP8 |
CN116574193A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-11 | 浙江大学 | 一种可抑制肿瘤坏死因子的简化巨球蛋白及合成方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2526213C1 (ru) * | 2013-04-12 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российский академии наук (ИБХ РАН) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pEst877, ДЕТЕРМИНИРУЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis К5Т НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEst877-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis К5Т НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК |
RU2531547C1 (ru) * | 2013-03-04 | 2014-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Рекомбинантная плазмидная днк рет3.54, кодирующая полипептид fn3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида fn3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека |
-
2015
- 2015-06-03 RU RU2015121032A patent/RU2606014C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2531547C1 (ru) * | 2013-03-04 | 2014-10-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Рекомбинантная плазмидная днк рет3.54, кодирующая полипептид fn3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида fn3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека |
RU2526213C1 (ru) * | 2013-04-12 | 2014-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российский академии наук (ИБХ РАН) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pEst877, ДЕТЕРМИНИРУЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis К5Т НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEst877-ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА С АКТИВНОСТЬЮ ЭСТЕРАЗЫ Psychrobacter cryohalolentis К5Т НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BINDER U. ET AL., High-throughput sorting of an Anticalin library via EspP-mediated functional display on the Escherichia coli cell surface, J. Mol. Biol., 2010, v.400,n.4,p.783-802. ПЕТРОВСКАЯ Л. Е. и др., ГИБРИДНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИНА ОСНОВЕ 10-го ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА ЧЕЛОВЕКА, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, т. 40, н. 4, с. 405-413. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2649132C1 (ru) * | 2017-08-03 | 2018-03-29 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Способ получения активного начала вакцины против ротавирусной инфекции белка FliCVP6VP8 |
CN116574193A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-11 | 浙江大学 | 一种可抑制肿瘤坏死因子的简化巨球蛋白及合成方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Quevillon et al. | Macromolecular assemblage of aminoacyl-tRNA synthetases: identification of protein-protein interactions and characterization of a core protein | |
JP5242388B2 (ja) | 高レベルでの、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現の方法 | |
JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
US5089406A (en) | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences | |
US20080233614A1 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
JPH03501925A (ja) | 合成遺伝子 | |
RU2606014C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pEFN877, детерминирующая экспрессию гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток Escherichia coli, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pEFN877 - продуцент гибридного полипептида со свойствами 10-го домена фибронектина на поверхности клеток | |
EA038578B1 (ru) | Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата | |
KR20090039239A (ko) | 대장균에서 활성형 인간 상피세포 성장인자의 대량제조방법 | |
JPS62500280A (ja) | 組換プラスミド、当該プラスミドを含有する細菌及び当該細菌を使用して、酸酵食品、動物用飼料、同成分又は蛋白質を製造する方法 | |
JPS61275229A (ja) | ヒト血清アルブミンの微生物学的調製法 | |
KR20130096111A (ko) | 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터 | |
CN114057861B (zh) | 一种靶向UBE2C的bio-PROTAC人工蛋白 | |
JPH11514201A (ja) | 安定な融合タンパク質の産生に使用する細菌および該細菌の検出方法 | |
JPH06311884A (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ | |
RU2653750C1 (ru) | Способ получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина из периплазмы E.coli | |
JP2022539560A (ja) | 配列決定反応のための重合酵素 | |
JPS63502637A (ja) | 誘導性熱ショック及び増幅系 | |
JP2009525749A (ja) | 組換えタンパク質の精製のためのアフィニティーポリペプチド | |
RU2531547C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рет3.54, кодирующая полипептид fn3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида fn3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека | |
RU2728652C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pET19b-SAV, обеспечивающая синтез полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент растворимого полноразмерного белка стрептавидина Streptomyces avidinii | |
Park et al. | Genetic screen to dissect protein–protein interactions: ribonuclease inhibitor–ribonuclease A as a model system | |
RU2804544C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста фибробластов человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека | |
RU2558295C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGST/ART/X, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ ХИМЕРНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST/ART/X ДЛЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ АПТАМЕРОВ К БЕЛКУ-МИШЕНИ X В СОСТАВЕ ПОЛИПЕПТИДА | |
UA105459C2 (ru) | Композиция и способ получения энтерокиназы в дрожжах |