RU2558295C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGST/ART/X, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ ХИМЕРНЫЙ ПОЛИПЕПТИД GST/ART/X ДЛЯ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ АПТАМЕРОВ К БЕЛКУ-МИШЕНИ X В СОСТАВЕ ПОЛИПЕПТИДА - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для отбора аффинных молекул. Конструируют плазмидную ДНК pGST/APT/X длиной 6193 п. н., массой 4,09 МДа, содержащую в качестве генетического маркера ген β-лактамазы и уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: BgIII 665 п. н., BamHI 779 п. н., XhoI 801 п. н. Плазмида pGST/APT/X состоит из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+) и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, встроенной по сайтам NdeI-XhoI и объединяющей в своем составе последовательности, кодирующие фрагмент гена глутатион-S-трансферазы, пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, пептид GGLNDIFEAQKIEWHED, биотинилирующийся in vivo под действием биотин-лигазы E.coli, и линкерную последовательность, заменяемую с помощью генно-инженерных манипуляций по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI на последовательность, кодирующую белок-мишень В-субъединицу шига-токсина I. Изобретение позволяет проводить отбор высокоспецифических аптамеров к данному белку-мишени. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к биоинженерии, конкретно - к областям нанобиотехнологии, молекулярной медицины, лабораторных медицинских исследований, получения медицинских терапевтических препаратов, медицинской микробиологии, разработки биосенсоров, создания средств диагностики и терапии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез слитного химерного полипептида, содержащего в своем составе диагностически и/или терапевтически значимый рекомбинантный белок-мишень для высокоспецифического отбора аффинных молекул (аптамеров).

Основными сферами применения слитного химерного полипептида для селекции аптамеров, синтезируемого на основе заявленной кодирующей последовательности ДНК, являются медицинские и биологические исследования, биомедицина, разработка диагностических и лекарственных препаратов, в том числе средств вакцинации, плановой и экстренной диагностики и терапии, включающая создание высокоспецифичных и высокочувствительных систем детекции белков, обладающих медицинским и народно-хозяйственным значением в качестве терапевтических мишеней и диагностических маркеров, а также получение средств ингибирования ферментативной и связывающей активности терапевтически важных белков и нейтрализации действия токсинов белковой природы.

Аптамеры представляют собой небольшие молекулы (олигонуклеотиды или пептиды), способные специфически узнавать и эффективно связывать различные молекулярные мишени [James W. // Curr. Opin. Pharmacol. - 2001. - V. 1. - P. 540-546].

Наиболее перспективными для использования в качестве терапевтических и диагностических молекул являются ДНК-аптамеры, олигонуклеотиды длиной 8-100 п. н., которые способны функционировать как высокоэффективные аффинные лиганды за счет формирования уникальной трехмерной структуры [Hamula C.L.A., Guthrie J.W., Zhang Η. С соавт. // Trends Anal. Chem. - 2006. - V. 25, №7. - P. 681-691]. Преимуществами ДНК-аптамеров перед их пептидными и РНК-аналогами являются их большая стабильность в окружающей среде и кровяном русле, низкая иммуногенность, простота синтеза и легкость воспроизводства последовательности ДНК с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Song K.-М., Lee S., Ban С. // Sensors. - 2012. - V. 12. - P. 612-631].

Формирование трехмерной структуры одноцепочечного олигонуклеотида определяется его нуклеотидным составом и внутримолекулярной гибридизацией. Трехмерные структуры ДНК обладают значительным разнообразием, таким образом, успешность отбора высокоаффинных и специфичных аптамеров зависит как от масштаба стартовой комбинаторной олигонуклеотидной библиотеки (как правило, 10¹²-10¹⁵ индивидуальных последовательностей), так и от эффективности используемых стратегий селекции аптамеров.

Процесс селекции аптамеров, как правило, основывается на технологии SELEX ("Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment") [US Patent 5567588] и включает повторяющиеся раунды связывания библиотеки олигонуклеотидов с мишенью, удаления несвязавшихся олигонуклеотидов и амплификации связавшихся кандидатных аптамеров при помощи ПЦР с применением праймеров к их констатным фланкирующим областям. С использованием SELEX возможно провести получение высокоаффинных аптамеров как к малым молекулам, так и к рекомбинантным белкам, вирусам и бактериям [Pestourie С, Tavitian В., Duconge F. // Biochimie. - 2005. - V. 87, №9-10. - P. 921-930].

Важнейшим этапом, определяющим успешность отбора аптамеров, является сепарация белка со связанными кандидатньгми аптамерами от несвязавшихся олигонуклеотидов, для которой как наименее дорогостоящий и наиболее доступный подход часто применяют иммобилизацию белка на твердой фазе. Помимо прямых способов твердофазной иммобилизации белка (например, на нитроцеллюлозных мембранах [Tuerk С, Gold L. // Science. - 1990. - V. 249, №4968. - Р. 505-510], решение данной задачи осуществляют за счет модификации структуры белка-мишени. Для этой цели используют либо химическую модификацию белка, которая может нарушить его структуру, либо химеризацию белка с универсальными вспомогательными последовательностями, способными специфически связываться с веществом, иммобилизованным на твердофазной матрице (аффинные пары глутатион/глутатион-S-трансфераза, бивалентный металл/последовательность шести гистидинов, биотин/белки авидинового ряда) [Toscano-Garibay J.D., Benites-Hess M.L., Alvares-Salas L.M. // Arch. Med. Res. - 2011. - V. 42. - P. 88-96; Tanaka Y., Honda Т., Matsuura K. с соавт. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - V. 329, №1. - P. 57-63; Mayer D., Hover T. // Methods Mol. Biol. - 2009. - V. 535. - P. 19-32].

Ключевым условием эффективности процесса селекции аптамеров является их направленный отбор к заданной белковой структуре [Dua P., Kim S., Lee D.-J. // Recent Patents on DNA & Gene Sequences. - 2008. - V. 2. - P. 172-186], однако при использовании твердофазной селекции нежелательный отбор аптамеров проходит как в отношении поверхности использованного твердофазного носителя, так и на введенные в белок вспомогательные последовательности, обеспечивающие его иммобилизацию, в частности описаны аптамеры, отобранные на последовательность шести гистидинов [Tsuji S., Tanaka Т., Hirabayashi N. с соавт. // Biochem. Biochys. Res. Commun. - 2009. - V. 386, №1. - P. 227-231]. Наиболее остро возникает эта проблема при селекции аптамеров к небольшим белкам или пептидам, для которых длина цепи вспомогательной последовательности может превышать длину цепи белка-мишени. Структуры рекомбинантных белков-мишеней, ранее примененные для селекции аптамеров, не предусматривают возможности отделения вспомогательной последовательности от собственной последовательности белка в процессе отбора. Большинство исследователей преодолевает эту проблему за счет проведения набора дополнительных раундов негативного скрининга с применением в качестве матрицы твердофазного носителя и/или связанного с ним вспомогательного полипептида, изолированного от белка-мишени [Weiss S., Proske D., Neumann Μ. с соавт. // J. Virol. - 1997. - V. 71, №11. - Р. 8790-8797; Shui В., Ozer Α., Zipfel W. С соавт. // Nucleic Acids Res. - 2012. - V. 40, №5. - P. е39]. Техническое решение физического разделения целевого белка-мишени с отобранными аптамерами и вспомогательной последовательности, связанной с твердофазной компонентой в процессе отбора, ранее предложено не было.

Известна модификация мишени для селекции аптамеров (антибиотика дауномицина) сульфо-№18-88-биотином, позволяющая провести иммобилизацию мишени на твердофазном носителе (магнитных частицах) за счет взаимодействия биотина со стрептавидином на поверхности частиц и отделить мишень со связанными аптамерами от магнитных частиц посредством разрушения дисульфидной связи S-S восстановительными агентами (дитиотрейтолом) [Wochner Α., Cech В., Menger Μ. с соавт. // BioTechniques. - 2007. - V. 43. - Р. 344-353]. Будучи идеологически близким к принципу протеолитического отделения белка-мишени от твердой фазы, лежащему в основе настоящего изобретения, данное техническое решение, однако, неприменимо для селекции аптамеров к молекулам белковой природы, поскольку химическая модификация аминогрупп белка, с которыми взаимодействует сульфо-NHS-SS-биотин, изменяет природную конформацию полипептида и осложняет отбор аптамеров, специфичных к нативной структуре белка. Помимо этого обработка восстановительным агентом может изменять поверхностные свойства магнитных частиц и приводить к элюции неспецифически связавшихся с ними молекул олигонуклеотидной библиотеки.

Известен задействованный при создании настоящего изобретения принцип протеолитического отщепления рекомбинантного белка с поверхности магнитных частиц, примененный для одностадийной очистки рекомбинантного фермента уриказы Bacillus [Nishiya Y., Hibi Т., Oda J. // Protein Expr. Purif. - 2002. - V. 25, №3. - P. 426-429]. Помимо того, что перед исследователями не стояла задача получения аптамеров к данному ферменту, отщепление уриказы с поверхности частиц проводили с помощью протеиназы К, не обладающей высокой специфичностью, таким образом, аминокислотная последовательность, расщепляемая в данном случае протеиназой К, не может быть рекомендована в качестве универсального сайта ограниченного протеолиза с целью отделения комплекса аптамеров с рекомбинантным белком-мишенью.

Известна рекомбинантная ДНК, кодирующая белок-мишень для селекции аптамеров, слитый с последовательностью шести гистидинов с целью его иммобилизации на поверхности магнитных частиц на основе металл-хелатного взаимодействия [Patent WO 05024042]. Тироидный транскрипционный фактор 1, слитый с последовательностью шести гистидинов, полученный с использованием данной рекомбинантной ДНК, элюируют имидазолом с поверхности частиц, несущих хелатирующий агент со связанным ионом бивалентного металла. Однако избранная в данном изобретении стратегия отбора аптамеров не предусматривает отщепления последовательности шести гистидинов от белка-мишени и сепарации пула аптамеров, отобранных на данную последовательность, от аптамеров, аффинных к белку-мишени.

Известны рекомбинантные ДНК, кодирующие белки-мишени для отбора аптамеров, слитые с последовательностью глутатион-S-трансферазы (GST) для иммобилизации на поверхности магнитных частиц, покрытых глутатионом [Weiss S., Proske D., Neumann Μ. с соавт. // J. Virol. - 1997. - V. 71, №11. - Р. 8790-8797; Jeong S., Han S.R., Lee Y.J., с соавт. // Biotechnol. Lett. - 2010. - V. 32, №3. - P. 379-385; и др.].

Хотя, как правило, в конечном счете отбор аптамеров на химерные белки-мишени, слитые с GST, оказывался успешным, в большинстве работ высокий уровень неспецифического связывания олигонуклеотидов с поверхностью твердой фазы и GST в процессе отбора приводил к наращиванию количества раундов позитивной селекции, необходимости проведения раундов негативного отбора на конкретный носитель, к временным и трудовым затратам и обязательному комплексу экспериментов по верификации специфичности для больших панелей первичных аптамерных кандидатов.

Описание последовательностей рекомбинантных ДНК, использованных ранее для кодирования рекомбинантных полипептидов для селекции аптамеров, содержащих белок-мишень, отделенный от вспомогательной последовательности, обеспечивающей иммобилизацию полипептида на твердой фазе, сайтом для расщепления специфической протеазой, которые могли бы служить технически и идеологически наиболее близкими аналогами заявленного изобретения, являющихся объектами правовой охраны, неизвестно.

Изобретение решает задачу создания рекомбинантной ДНК, кодирующей экспрессионную кассету gst-apt-x, обеспечивающую синтез белка-мишени в виде слитного полипептида со вспомогательной последовательностью, ответственной за иммобилизацию полипептида на твердой фазе, отделенной от белка-мишени уникальным сайтом для расщепления специфической протеазой. Полученный слитный полипептид применим для отбора к заданному белку-мишени высокоаффинных специфичных аптамеров, имеющих диагностический и терапевтический потенциал и употребимых для нужд здравоохранения, клинической диагностики, терапии, мониторинга окружающей среды и качества продуктов питания.

Поставленная задача решается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/X, используемой для экспрессии слитного химерного полипептида GST/APT/X, состоящего из последовательности глутатион-S-трансферазы, пептида, расщепляемого протеазой летальным фактором Bacillus anthracis, пептида, биотинилируемого in vivo ферментом биотин-лигазой, и белка-мишени X, к которому осуществляется отбор аптамеров и в качестве которого может выступать фермент, токсин белковой природы, рекомбинантное антитело, или его фрагмент, или другой диагностически и терапевтически значимый рекомбинантный белок.

А также задача решается введением в состав последовательности ДНК, кодирующей фрагмент gst-apt-x для экспрессии слитного химерного полипептида, фрагмента гена глутатион-S-трансферазы, продукт которого обеспечивает иммобилизацию полипептида с белком-мишенью на покрытых глутатионом магнитных частицах, выступающих в качестве твердофазного носителя, с целью отделения аптамеров к полипептиду от несвязавшихся олигонуклеотидов комбинаторной библиотеки, находящихся в жидкой фазе.

А также задача решается введением в состав последовательности ДНК, кодирующей фрагмент gst-apt-x для экспрессии слитного химерного полипептида, последовательности GGLNDIFEAQKIEWHED, кодирующей пептид, биотинилирующейся in vivo под действием фермента биотин-лигазы E. coli, который отщепляется будучи связанным с белком-мишенью при обработке полипептида летальным фактором B. anthracis. Таким образом, оказывается возможным связать белок-мишень на парамагнитных частицах, несущих белок авидинового ряда (нейтравидин, стрептавидин и др.), и провести промывку частиц с иммобилизованным белком-мишенью и аптамерами от летального фактора B. anthracis, находящегося в растворе. Пептид, биотинилирующийся in vivo под действием фермента биотин-лигазы E. coli, представляет собой короткую аминокислотную последовательность, и риск контаминации пула отобранных на целевой белок-мишень ДНК-аптамеров олигонуклеотидами, связавшимися с данным пептидом, невысок.

А также задача решается введением в состав последовательности ДНК, кодирующей фрагмент gst-apt-x для экспрессии слитного химерного полипептида, последовательности RRKKVYPYPME, кодирующей пептид, способный к специфическому расщеплению протеазой летальным фактором В. anthracis с выщеплением из состава полипептида белка-мишени X со связанным пулом аптамеров.

А также задача решается введением в состав последовательности ДНК, кодирующей фрагмент gst-apt-x для экспрессии слитного химерного полипептида, последовательности, кодирующей белок-мишень X для селекции аптамеров, который выщепляется из состава полипептида обработкой сайт-специфической протеазой летальным фактором B. anthracis. В качестве белка X может выступать любой терапевтически, диагностически или народнохозяйственно значимый рекомбинантый белок, который производится в клетках E. coli BL21(DE3) в растворимой форме.

Техническим результатом изобретения является рекомбинантная плазмидная ДНК pGST/APT/X с молекулярной массой 4,09 МДа, длиной 6193 п. н., содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pGST/APT/X, к антибиотикам пенициллинового ряда, содержащая уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: BglII 665 п. н., BamHI 779 п. н., XhoI 801 п. н., состоящая из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+), обеспечивающая синтез в клетках Escherichia coli химерного полипептида GST/APT/X, применимого для селекции высокоаффинных аптамеров, специфичных к белку-мишени X.

А также техническим результатом изобретения является рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая фрагмент gst-apt-x для экспрессии белка-мишени X для высокоспецифического отбора аптамеров, слитого с in vivo биотинилируемым пептидом и N-концевым полипептидным фрагментом глутатион-S-трансферазы, выщепляемым из состава полипептида протеазой летальным фактором В. anthracis.

В предлагаемом техническом решении специфичность селекции аптамеров с использованием слитного химерного полипептида GST/APT/X, кодируемого последовательностью gst-apt-x в составе заявленной рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/X, достигается с использованием принципа твердофазной иммобилизации белка-мишени на покрытых глутатионом магнитных частицах либо на магнитных частицах, несущих белок авидинового ряда (авидин, стрептавидин, нейтравидин) за счет наличия в составе химерного полипептида последовательностей глутатион-S-трансферазы и in vivo биотинилируемого пептида, что позволяет провести разделение аптамеров, связавшихся с белком-мишенью X, от несвязавшихся с ним олигонуклеотидов комбинаторной библиотеки.

Специфичность селекции аптамеров также достигается за счет наличия в составе слитного химерного полипептида GST/APT/X, кодируемого последовательностью gst-apt-x в составе заявленной рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/X, уникальной пептидной последовательности, расщепляемой протеазой летальным фактором В. anthracis, что позволяет провести выщепление белка-мишени X со связанными аптамерами из состава полипептида и, таким образом, отделить аптамеры, специфичные к белку-мишени, от олигонуклеотидов, неспецифически связанных с магнитными частицами и глутатион-S-трансферазой.

Отличием предлагаемой рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/X, определяющей синтез химерного полипептида для высокоспецифичного отбора аффинных молекул (аптамеров) к диагностически и терапевтически значимым рекомбинантным белкам, является одновременное кодирование в ее структуре последовательностей, обеспечивающих экспрессию фрагментов для иммобилизации полипептида на твердой фазе и последующего протеолитического отделения белка-мишени от твердой фазы. Отбор ДНК-аптамеров с использованием данного химерного полипептида не требует проведения негативных раундов селекции на глутатион-S-трансферазу, поскольку олигонуклеотиды, взаимодействующие с ее фрагментом, остаются связанными на парамагнитных частицах.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pGST/APT/X на основе плазмиды pET-GST, собранной на основе коммерческой плазмиды pET22b(+), не содержащей сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) [Патент РФ 2355769]. Фрагмент ДНК, содержащий сайт расщепления протеазой летальным фактором В. anthracis и in vivo биотинилируемый пептид, синтезируют при помощи ПЦР (Фиг. 1). Полученный ПЦР-продукт обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BglII и XhoI и клонируют в плазмиду pET-GST, расщепленную по тем же сайтам с получением плазмиды pGST/APT/X (Фиг. 2).

Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность для экспрессии белка X, избранный в качестве мишени для отбора аптамеров, клонируют в векторную плазмиду pGST/APT/X по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI и получают плазмиду, кодирующую последовательность gst-apt-x для экспрессии слитного химерного полипептида GST/APT/X для высокоспецифической селекции аптамеров к белку-мишени X в его составе.

Продуцент слитного химерного полипептида X получают трансформацией клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой pGST/APT/X. Продукцию полипептида GST/APT/X проводят в течение 3 часов после индукции жидкой культуры добавлением ИПТГ. Клеточную биомассу после окончания продукции собирают центрифугированием, суспендируют в лизирующем буфере, суспензию бактерий обрабатывают лизоцимом и ДНКазой и центрифугируют для получения осветленного лизата, содержащего полипептид GST/APT/X в растворимой форме.

Очистку белка GST/APT/X из лизата проводят на колонке с иммобилизованным глутатионом, белок элюируют добавлением буфера, содержащего глутатион. Дополнительную очистку белка и перевод его в буфер для расщепления протеазой летальным фактором В. anthracis осуществляют при помощи гель-фильтрационной хроматографии. Чистоту препарата белка GST/APT/X анализируют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле (Фиг. 3).

Для отщепления белка-мишени X белок GST/APT/X обрабатывают протеазой летальным фактором В. anthracis в соотношении 1 мкг/10 мг белка при 30°С в течение 1 часа. Анализ продуктов расщепления проводят гель-электрофорезом в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле (Фиг. 4).

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы.

Фиг. 1. Последовательности праймеров, использованные при получении экспрессионной конструкции плазмиды pGST/APT/X и производной от нее плазмиды pGST/APT/STX1B, используемой для экспрессии слитного химерного полипептида GST/APT/STX1B для отбора аптамеров к субъединице В шига-токсина типа 1.

Фиг. 2. Перечень последовательностей.

A) Полная последовательность плазмиды pGST/APT/X, кодирующей фрагмент gst-apt-x для продукции слитного рекомбинантного полипептида GST/APT/X.

Б) Структура и последовательность экспрессионной конструкции gst-apt-x в составе плазмиды pGST/APT/X для продукции слитного рекомбинантного полипептида GST/APT/X. Последовательность RRKKVYPYPME содержит сайт расщепления летальным фактором B. anthracis.

B) Аминокислотная последовательность, закодированная в экспрессионной конструкции gst-apt-x.

Фиг. 3. Продукция слитного химерного полипептида GST/APT/STX1B в клетках E. coli BL21(DE3) с использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/STX1B и хроматографическая очистка белка GST/APT/STX1B.

Дорожка 1 - маркер молекулярной массы (Fermentas, SM0671); дорожка 2 - клеточный лизат до продукции белка; дорожка 3 - клеточный лизат по окончании продукции белка GST/APT/STX1B; дорожка 4 - белок GST/APT/STX1B, очищенный аффинной хроматографией на глютатион-сефарозе; 5 - белок GST/APT/STX1B, очищенный аффинной хроматографией на глютатион-сефарозе и гель-фильтрационной хроматографией.

Фиг. 4. Расщепление слитного рекомбинантного белка GST/APT/STX1B протеазой летальным фактором В. anthracis.

Дорожка 1 - маркер молекулярной массы (Fermentas, SM0671); дорожка 2 - белок GST/APT/STX1B без обработки; дорожка 3 - рекомбинантный белок протеазы летального фактора В. anthracis (ЛФ); 4 - белок GST/APT/STX1B, обработанный протеазой летальным фактором В. anthracis.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/X и производной от нее рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/STX1B для продукции слитного полипептида GST/APT/STX1B.

Плазмиду pGST/APT/X, кодирующую экспрессионный конструкт для встраивания гена белка-мишени для отбора аптамеров и несущую в своем составе фрагмент гена глутатион-S-трансферазы, получают на базе плазмиды pET-GST, собранной на основе коммерческой плазмиды pET22b(+), не содержащей сайта BglII (последовательность сайта рестрикции нарушают обработкой плазмиды эндонуклеазой рестрикции BglII с последующей достройкой концов фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием достроенных концов) [Патент РФ 2355769]. Фрагмент, содержащий сайт расщепления протеазой летальным фактором В. anthracis и in vivo биотинилируемый пептид, синтезируют при помощи ПЦР с праймеров AptFor и AptRev (температура отжига праймеров 70°С, время элонгации 15 секунд). Полученный ПЦР-продукт обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BglII и XhoI и клонируют в плазмиду pET-GST, расщепленную по тем же сайтам с получением плазмиды pGST/APTVX.

Последовательность, кодирующую В-субъединицу шига-токсина 1, получают ПЦР-амплификацией с геномной ДНК бактерий E. coli штамма O157:Н7 (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) с помощью праймеров STXIForBamHI и STXIRevXhoI, температура отжига праймеров составляет 56°С, время элонгации 20 секунд. Продукт апмлификации обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI и Xhol и клонируют в плазмиду pGST/APT/X, обработанную теми же эндонуклеазами. Полученная экспрессионная плазмида pGST/APT/STXIB кодирует экспрессионную конструкцию для синтеза химерного слитного белка, содержащего последовательность фрагмента глютатион-S-трансферазы, пептид RRKKVYPYPME, являющийся субстратом летального фактора В. anthracis, in vivo биотинилируемый пептид, а также В-субъединицу шига-токсина 1.

Пример 2. Продукция слитного рекомбинантного полипептида GST/APT/STX1 в клетках E. coli BL21(DE3) с использованием рекомбинантной плазмидной ДНК pGST/APT/STX1B.

Продуцент слитного рекомбинантного полипептида GST/APT/STX1B получают электротрансформацией (прибор ВТХ 600, режим 129 Ом, 2,5 кB) электрокомпетентных клеток E. coli BL21(DE3) плазмидой pGST/APT/STX1B.

Трансформанты высевают на чашки с 2xYT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы, и выращивают в течение ночи при 37°С.

Для препаративной продукции белка GST/APT/STX1B единичные колонии-продуценты выращивают в течение ночи при 37°С в среде 2xYT с добавлением 2% глюкозы, переносят 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYΤ, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С до оптической плотности 1 ОЕ. Выросшую культуру охлаждают до 30°С, добавляют ИПТГ до 0.2 мМ и проводят экспрессию белка в течение 3 часов при 30°С. Уровень продукции белка GST/APT/STX1B определяют электрофорезом в полиакриламидном геле. Для проведения электрофореза в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле отбирают аликвоты жидкой культуры продуцента, центрифугируют при 5000 об/мин 5 минут, осажденные клетки растворяют в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, обрабатывают 20 секунд ультразвуком, нагревают 3 минуты при 100°С и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. По денситометрическим измерениям количество слитного химерного белка GST/APT/STX1B составляет 30% от общего клеточного белка.

Пример 3. Выделение белка GST/APT/STX1B из биомассы бактерий E. coli BL21(DE3) и его хроматографическая очистка.

Клетки (1 л жидкой культуры) после экспрессии белка собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок суспендируют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 8,100 мМ NaCl, дополненном протеазным ингибитором (Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail, Roches), и обрабатывают лизоцимом (20 мкг/мл) при +4°С в течение 30 минут. Лизируют клетки добавлением Triton Х-100 до концентрации 0.5%. К лизату добавляют MgCl₂ до концентрации 1 мМ и разрушают геномную ДНК E. coli ДНКазой (10 мкг/мл). Полученный лизат центрифугируют 20 минут при 18000 g и наносят на колонку с сорбентом с иммобилизованным глутатионом (GE Healthcare) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 8 и 100 мМ NaCl. Колонку промывают 10 объемами того же буфера и элюируют белок раствором, содержащим 20 мМ глутатиона в том же буфере.

Вторую стадию очистки осуществляют на гель-фильтрационной колонке Superdex 200 в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7,4 и 70 мМ NaCl. Фракции, содержащие очищенный белок GST/APT/STX1B (38 кДа), определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле, как описано в примере 2, и замораживают для хранения на -70°С. Чистота перапарата составляет 95% по данным денситометрии. Выход рекомбинантного белка летального фактора составляет 25 мг с литра культуры после полной процедуры очистки.

Пример 4. Проведение расщепления рекомбинантного белка GST/APT/STX1B протеазой летальным фактором В. anthracis.

Очищенный рекомбинантный белок GST/APT/STX1B в количестве 10 мкг в течение 1 часа инкубируют при температуре 30°С в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl рН 7,4 с протеазой летальным фактором В. anthracis (получение активного фермента летального фактора - патент РФ №2355769), взятым в количестве 1 мкг. В контрольные реакции протеазу не добавляют.

Прохождение реакции контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле как описано в Примере 2. На электрофореграмме в пробах, обработанных протеазой, наблюдают исчезновение полосы молекулярной массой 38 кДа, соответствующей белку GST/APT/STX1B, и появление двух полос, соответствующих молекулярной массе фрагмента глутатион-S-трансферазы (26 кДа) и субъединице В шига-токсина 1 с in vivo биотинилируемым пептидом (12 кДа).

Claims (2)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGST/APT/X длиной 6193 п. н., обладающая молекулярной массой 4,09 МДа, содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pGST/APT/X, к антибиотикам пенициллинового ряда, содержащая уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, расположенные на следующем расстоянии вправо от сайта NdeI: BgIII 665 п. н., BamHI 779 п. н., XhoI 801 п. н., состоящая из NdeI-XhoI фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pET22b(+) и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, встроенной по сайтам NdeI-XhoI и объединяющей в своем составе последовательности, кодирующие фрагмент гена глутатион-S-трансферазы, пептидный субстрат летального фактора сибирской язвы RRKKVYPYPME, пептид GGLNDIFEAQKIEWHED, биотинилирующийся in vivo под действием биотин-лигазы E.coli, и линкерную последовательность, заменяемую с помощью генно-инженерных манипуляций по сайтам эндонуклеаз рестрикции BamHI и XhoI на последовательность, кодирующую белок-мишень В-субъединицу шига-токсина I, для отбора высокоспецифических аптамеров к данному белку-мишени.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК по п. 1, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, обеспечивающая синтез слитного химерного полипептида в клетках E.coli BL21(DE3) для высокоспецифической селекции аптамеров к введенному в его состав белку-мишени В-субъединице шига-токсина I, осуществляемой с помощью иммобилизации слитного химерного полипептида на магнитных частицах, несущих глутатион, и отщепления из состава полипептида белка-мишени со связанными аптамерами сайт-специфической протеазой летальным фактором В. anthracis.

Images