RU2804544C2

RU2804544C2 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста фибробластов человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека

Info

Publication number: RU2804544C2
Application number: RU2021139362A
Authority: RU
Inventors: Андрей Сергеевич Герасимов; Анна-Анастасия Викторовна Мистерова
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-10-02

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полную аминокислотную последовательность полипептида основного фактора роста фибробластов человека, обеспечивающая стабильную рекомбинацию экспрессионных кассет в геноме Pichia pastoris, а также экспрессию целевого белка в культуральной жидкости. Также предложен рекомбинантный штамм Pichia pastoris GS115FGF2, являющийся продуцентом основного фактора роста фибробластов человека и полученный путем трансформации клеток штамма Pichia pastoris GS115 (his4, mut+) вышеуказанной рекомбинантной плазмидой pFGF2. Изобретение обеспечивает высокий уровень экспрессии целевого белка в культуральной жидкости. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 4 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано в медицинских исследованиях для получения основного фактора роста фибробластов человека.

Основный фактор роста фибробластов (bFGF или FGF2), открытый в 1976 году, в качестве члена семейства гепарин-связывающих ростовых факторов, является одним из основных пролиферативных факторов организма человека. Он вовлечен в большое число биологических процессов, включая эмбриональное развитие, рост и дифференцировку клеток мезенхимального происхождения, морфогенез и как следствие - в восстановление тканей. Помимо этого, bFGF стимулирует миграцию эндотелиальных клеток и выступает как ангиогенный фактор, играет ключевую роль в активации клеток соединительной ткани, синтезе коллагена и образовании рубца на раневом ложе. Именно по этим причинам этот митогенный фактор привлекает большое внимание биофармацевтического рынка.

На сегодняшний день в целях регенеративной медицины на рынке доступно лишь несколько препаратов рекомбинантного основного фактора роста фибробластов. Например, лекарственный препарат «Fiblast», зарегистрированный в Японии, показан для лечения ожогов II степени тяжести, различных повреждений кожи - в том числе, нейропатических язв. Препарат «Otic», выпускаемый в виде тонкой желатиновой губки, с адсорбированным на ней основным фактором роста фибробластов, показан для лечения травм барабанной перепонки. Возможные применения основного фактора роста фибробластов включают в себя также терапию челюстно-лицевых травм, последствий синдрома «сухого глаза» и ишемических синдромов. Также применение фактора в качестве компонента питательных сред необходимо для развития технологий тканевой инженерии и клеточного репрограммирования. Именно поэтому существует острая потребность в разработке более эффективной, отечественной технологии получения основного фактора роста фибробластов при помощи методов молекулярного клонирования и гетерологичных систем экспрессии генов. Использование бактериальной системы экспрессии Е. coli позволяет получить высокие количества основного фактора роста фибробластов, однако сложная пространственная структура молекулы, активная форма которой содержит три интрамолекулярных дисульфидных связи и два неспаренных остатка цистеина, является причиной агрегации гетерологичного белка и накопления преимущественно в тельцах включения в неактивной форме; длительность, трудоемкость и дороговизна методов - характерная черта экспрессии гетерологичного белка при использовании клеточных линий млекопитающих. Клетки дрожжей, в частности P. pastoris, сочетают в себе преимущества данных систем. Эти низшие эукариоты обладают развитой системой эндоплазматического ретикулума для осуществления разнообразных посттрансляционных модификаций протеинов, а также просты и удобны в культивировании. Одно из важнейших преимуществ перед бактериальной системой экспрессии состоит в том, что биосинтез рекомбинантного фактора роста осуществляется в виде зрелого, функционально активного белка, который секретируется в культуральную жидкость. Это также существенно облегчает последующие стадии выделения и очистки нарабатываемого продукта, а значит - упрощает технологию.

Аналогом-прототипом получаемого рекомбинантного белка является трафермин, который производится в качестве активного фармацевтического ингредиента в перечисленных выше лекарственных препаратах. В данном случае фактор роста фибробластов получают при помощи бактериальной системы экспрессии на основе Е. coli [патенты СА 002626206 А, опубл. 26.04.2007, US 5439818, опубл. 08.08.1995, US 2005014 2076 А1, опубл. 30.06.2005, US 6046164 A, опубл. 04.04.2000, WO 87/01728, опубл. 18.05.1995].

На наш взгляд, по получению фактора роста фибробластов человека генно-инженерными методами на сегодняшний день имеется 3 работы. В первой работе рекомбинантный фактор роста фибробластов был получен в клетках бактерии Е. coli в составе гибрида с коллаген-связывающим доменом фактора фон-Виллебрандта [Andrades J.A., J.A., Wu L.T. Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain, 2001]. В данной работе была получена рекомбинантная плазмидная ДНК, которая содержала ген искусственного предшественника основного фактора роста фибробластов человека, который состоит из последовательности, кодирующей дополнительный функциональный пептид для аффинной очистки, кДНК гена FGF2, синтетическую последовательность, кодирующую пептидный линкер, а также оптимизированную синтетическую последовательность коллаген-связывающего домена фактора фон-Виллебрандта под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7. Продуцент был получен путем электропорации экспрессионного вектора в штамм BL21 (DE3) и при последующей селекции с использованием маркера канамицина. Биосинтез рекомбинантного белка осуществляли при культивировании клеток на среде 2 YT, содержащей 1 мМ индуктора синтеза ИПТГ. Культивирование в фазе индукции проводили в течение 5 часов. Целевой продукт накапливался в виде телец включения. Анализ уровня биосинтеза продукта проводили методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм после трехстадийной очистки из лизата бактериальной культуры E. coli. Полученный основный фактор роста фибробластов содержит дополнительные последовательности, такие как пептидный линкер, последовательность для аффинной очистки методом металло-хелатной хроматографии, а также гетерогенный белковый домен, связывающий коллаген. По этим причинам этот белок не может считаться биоаналогом. Более того, структура пептида подразумевает наличие стадии ферментативной конверсии, а агрегация в тельца включения - трудоемких стадий солюбилизации и рефолдинга, на которых может теряться более половины всего целевого белка. Белок синтезируется клетками бактерии в неактивной форме. К недостаткам данной технологии можно отнести получение не нативной формы FGF2, которое ограничивает применение продукта для выращивания клеточных линий, с целью функционализации поверхностного субстрата. Выход целевого продукта составил порядка 20 мг с литра, однако, технология его получения является трудоемкой, не масштабируемой, и с применением хаотропных агентов в высокой концентрации.

Во второй работе получали функционально активный фактор роста фибробластов [Yang J., Qiang W., Ren S. High-efficiency production of bioactive oleosin-basic fibroblast growth factor in A. thaliana and evaluation of wound healing, 2018], однако в качестве системы экспрессии используются семена растения A. thaliana, что характеризуется трудоемкостью, длительностью экспрессии, а также большими сложностями в организации технологического процесса. Более того, основный фактор роста фибробластов в этой работе экспрессируется с белком-партнером олеозином, без которого накопление функционально активного пептида в семенах невозможно; поэтому нельзя считать данный пептид биоаналогом.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [Mu X. et. al. High-level expression, purification, and characterization of recombinant human basic fibroblast growth factor in Pichia pastoris, 2008]. В данной работе была получена рекомбинантная плазмидная ДНК, которая содержала ген искусственного предшественника основного фактора роста фибробластов человека, который состоит из последовательности, кодирующей препросигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae, кДНК FGF2, полученную методом ОТ-ПЦР, клонированную под контроль индуцибельного промотора pAOX1. Продуцент был получен путем электропорации экспрессионного вектора в штамм P. pastoris Х33, и при последующей селекции на антибиотике зеоцине отбирали высококопийного трансформанта с фенотипом Mut^S. Биосинтез рекомбинантного белка осуществляли при культивировании клеток на среде BMMY, содержащей 0.5% (v/v) метанола. Культивирование проводили в течение 72 часов, целевой продукт секретируется в культуральную жидкость. В процессе секреции функциональный сигнальный пептид отщепляется собственной протеазой kex2, таким образом оставляя пептид FGF2. Анализ уровня экспрессии белка проводили при помощи иммуноферментного анализа со специфическими анти-FGF2 антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Недостатком способа-прототипа является клонирование и экспрессия неоптимизированной нуклеотидной последовательности, что может также существенно негативно повлиять на выход целевого продукта; а также отсутствие контроля копийности интеграции целевого вектора в дрожжевую хромосому, что также может снизить выходы целевого белка. Авторы предполагают, что уровень биосинтеза целевого продукта составляет 150 мг с литра культуры, однако, специфическая активность продукта на порядок ниже, чем у существующих коммерческих аналогов.

Изобретение решает задачу получения полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека путем биосинтеза, а также увеличение выхода секретированного целевого белка в культуральной жидкости.

В настоящем изобретении была поставлена задача получения плазмидного вектора с геном основного фактора роста фибробластов человека, а также штамма-продуцента пептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека. Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pFGF2, кодирующей синтез полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека, обеспечивающей биосинтез с уровнем порядка 180÷200 мг рекомбинантного белка/л культуры. Высокоэффективный синтез целевого полипептида обеспечивается следующими факторами: целевой ген оптимизирован с учетом частоты использования кодонов, предсказания вторичной структуры мРНК и находится под контролем сильного индуцибельного промотора pAOX1; рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста фибробластов, характеризуется следующими признаками: имеет молекулярную массу 6.26 MDa (9.625 т.п.о.); кодирует аминокислотную последовательность гена основного фактора роста фибробластов человека; состоит из XhoI\XbaI - фрагмента ДНК плазмиды pPIC9K длиной 9.161 т.п.о., содержащего ген Kan, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pFGF2 клеток к генетицину, ген AmpR β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pFGF2 клеток к ампициллину, АОХ1-промотор P. pastoris, ген гистидинол дегидрогеназы His4; а также из XhoI/XbaI фрагмента длиной 464 п.о., включающей и синтетический ген основного фактора роста фибробластов человека.

Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: BamHI - 939, NcoI - 3982, PmeI - 414, SmaI - 5787, EcoRI - 1666. Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что нуклеотидная последовательность основного фактора роста фибробластов человека сконструирована с учетом частоты встречаемости кодонов P. pastoris с оптимальным процентным соотношением GC-пар и содержит на N-конце prepro сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae. В предложенную последовательность внесена мутация в положение 1 аминокислотной последовательности: пролин-1 заменен на аланин, что увеличивает эффективность секреции функциональной активной молекулы фактора роста фибробластов в культуральную жидкость.

Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой и свойствами основного фактора роста фибробластов человека трансформируют клетки Pichia pastoris штамма GS115 (his4, mut⁺) рекомбинантной плазмидой pFGF2. Полученный штамм GS115FGF2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки крупные округлой формы, почкующиеся, 1×4-7 мкм, подвижные.

Культуральные признаки. При росте на плотной среде YPD колонии круглые, гладкие, блестящие, кремовые, край ровный, диаметр колоний 3÷6 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде YPD характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.

Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 6÷28°С при оптимуме рН 3,5÷5,8. В качестве источника азота используют как минеральные соли в виде смеси, так и органические соединения в виде пептона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют глицерин, глюкозу, метанол. В отличие от исходного штамма не является ауксотрофом по гистидину.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы, а также к генетицину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена Kan. Штамм Pichia pastoris GS115FGF2 обеспечивает синтез полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека в количестве не менее 180 мг целевого белка на литр культуры. Совокупность перечисленных свойств штамма обусловливает большую технологичность процесса получения рекомбинантного фермента. На фиг. 1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pFGF2, где указаны уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, AmpR - ген β-лактамазы, KanR - ген фермента, обуславливающего устойчивость к генетицину, FGF2 - синтетический ген основного фактора роста фибробластов человека, aMF - prepro сигнальный пептид α-фактора S. cerevisiae, регуляторные последовательности отмечены как 5'AOX1 и 3'АОХ - фрагменты промотора P. pastoris, HIS4 - регуляторная последовательность и кДНК гистидинолдегидрогеназы; на фиг. 2 - нуклеотидная последовательность синтетического гена искусственного предшественника основного фактора роста фибробластов человека. Жирной линией подчеркнуты сайты рестриктаз XhoI и XbaI, жирным шрифтом выделены стартовая и терминирующая последовательности; на фиг. 3 - аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого рекомбинантной плазмидой pFGF2; на фиг. 4 - результаты денатурирующего ПААГ-гель электрофореза образцов культуральной жидкости трансформантов при определении уровня экспрессии и штамма-продуцента. Слева расположен маркер молекулярных весов (14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66,2 кДа), далее трансформанты; на фиг. 5 показано дозозависимая кривая 1 активности полученного FGF2 на клеточных линиях 3Т3 (фибробласты мыши) и кривая 2 HEK293 (отрицательный контроль).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [Sambrook, J., Fritsch, E,F„ and Maniatis, T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology, 1997, John Wiley and Sons, New York; Cregg J.M, Higgins D.R. Production of foreign proteins in the yeast Pichia pastoris, 1995, Canadian J. Botany Supp.73, 5981-5987].

Пример 1. Создание экспрессионного вектора pFGF2.

В качестве исходного материала служил вектор pPIC9K (Invitrogen, США). С целью накопления плазмиды, проводили трансформацию компетентных клеток штамма Е. coli XL1-Blue [recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 re1A1 lac [F'proAB laclqZ M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Исходя из известной нуклеотидной последовательности плазмидного вектора и гена ростового фактора были сконструированы олигонуклеотидные последовательности для наработки искусственного гена со свойствами основного фактора роста фибробластов человека с необходимыми концевыми сайтами рестрикции. ПЦР-амплификацию проводили в два этапа. В реакцию вносили эквимолярную смесь (1 мкМ каждого) олигонуклеотидных праймеров (всех, кроме крайних), составляющих ген, взаимно перекрывающихся между собой на 15-17 нуклеотидов, 0.2 мкМ раствора dNTP, 1/10 часть реакционного 10х буфера и 1 U термостабильной ДНК-полимеразы PƒuI. Температуру отжига праймеров рассчитывали по стандартной формуле: Tm(°С)=2×[Ν_Α+Ν_T]+4×[N_C+N_G]-10, где N_X - количество соответствующих оснований. Реакцию проводили по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°С, 5 минут; затем 10 циклов: денатурация ДНК при 95°С, 1 минута; отжиг праймеров при 46,5°С, 55 секунд; синтез ДНК при 74°С, 2,5 минуты. Вторую амплификацию проводили, используя в качестве матрицы, раствор первой реакции и крайние праймеры, обеспечивающие синтез гена с необходимыми сайтами рестриктаз, по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°С, 5 минут; затем 30 циклов: денатурация ДНК при 95°С, 1 минута; отжиг праймеров при 55°С, 1 минута; синтез ДНК при 74°С, 2.5 минуты. Смесь для ПЦР (50 мкл): 5 мкл 10-кратного буфера для PƒuI-полимеразы («Thermo Fisher Scientific»); 5 мкл реакции 1; 0,5 мкл 100 мкМ праймера FGF1; 0.5 мкл 100 мкМ праймера rFGF; 1 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Thermo Fisher Scientific»); 43 мкл деионизованной воды; 0,5 мкл PƒuI ДНК-полимеразы («Thermo Fisher Scientific»). После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализировали методом электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле и выявляли гомогенный фрагмент размером около 470 пн. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора GelElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя. 200 нг исходной плазмиды и 100 нг фрагмента (гена FGF2) гидролизовали 20 единицами рестриктаз XhoI (New England Biolabs, США) и XbaI (New England Biolabs, США). Выделенный из агарозного геля XhoI/XbaI фрагмент клонировали в XhoI/XbaI вектор pPIC9K - лигировали с помощью Т4 ДНК лигазы (на 20 нг вектора добавляли 2.7 нг фрагмента). Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Е. coli XL1-Blue, затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Полученные образцы ДНК анализировали совместным гидролизом рестриктазами XbaI/XhoI, NdeI/NcoI, и отбирали «положительные» клоны, содержащие XbaI/XhoI фрагменты размером 464 и 9161 п. н., фрагменты NdeI/NcoI размером 3477 п.н. и 6148 п.н., а плазмиды анализировали на наличие мутаций методом секвенирования ДНК (ЗАО «Евроген»). В конечном счете отбирают экспрессионный вектор, который обозначали как pFGF2.

Пример 2. Создание экспрессионных кассет, трансформация клеток Р. pastoris и отбор трансформантов для синтеза функционально активного пептида со свойствами FGF2 человека.

Необходимым условием стабильной экспрессии генов является создание экспрессионной кассеты. Для этого необходимо линеаризовать векторную молекулу по 5'-участку алкогольоксидазного промотора. После электропорации, в результате гомологичной рекомбинации идентичных участков промотора генома дрожжей и линеаризованного вектора, происходит включением интересующего гена в геном P. pastoris. Для электропорации получали 10 мкл раствора ДНК (pFGF2), предварительно линеаризованной путем гидролитического расщепления рестриктазой PmeI ("Thermo Fischer Scientific", Литва), с рабочей концентрацией не менее 2 мкг/мкл. 30 мкг плазмиды гидролизовали 100 единицами рестриктазы PmeI в течение 4 часов. К 1 объему реакционной смеси добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1). Перемешивали 30 сек на вортексе. Центрифугировали в течение 4 мин. Отбирали водную фазу и переносили в новую пробирку. Добавляли в пробирку с фенол-хлороформом 100 мкл ТЕ-буфера, затем перемешивали 30 сек на вортексе и центрифугировали в течение 5 минут. Отбирали водную фазу при помощи пипетки и объединяли с той частью раствора, которая была отобрана ранее. Добавляли к раствору ДНК 1/10 объема 3М раствора ацетата Na, рН 6.0 и 3 объема этанола. Перемешивают, переворачивая пробирку несколько раз, и оставляют на 10 минут. Затем центрифугировали в течение 15 мин. Супернатант сливали, пробирку с осадком ДНК центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант тщательно удаляли и добавляли 1 мл 70%-го этанола. Центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант сливали. Снова повторяли центрифугирование в течение 2 мин и отбирали оставшуюся жидкость. Осадок высушивали в течение 5 мин и растворяют в 5 мкл ТЕ-буфера.

Культуру дрожжей штамма GS115 выращивали на среде YPD в колбах Эрленмейера на 500 мл до оптической плотности 1÷2 единицы. При достижении заданной плотности клеток в колбу добавляли 1/10 объема 1М раствора HEPES, рН 8.0 и 1/100 объема 1М DTT. Инкубировали на шейкере еще в течение 30 минут. Клетки собирали центрифугированием при 3000×g в течение 5 минут. Биомассу промывали холодной деионизованной водой 2 раза и суспендировали в 1 мл 1M сорбитола. Полученные клетки разливали по пластиковым пробиркам (по 40 мкл в каждой) и хранили при минус 70°С. Электропорацию проводили на электропораторе 2510 (Eppendorf, Германия) в специальных кюветах с зазором 2 мм. Рабочие характеристики - напряжение: 1500 В; емкость: 25 мкФ; сопротивление: 600 Ом. После электропорации быстро добавляли 1 мл холодного раствора 1М сорбитола и ставили в термостат на 1 час при температуре 28°С. Отбор транс формантов проводили на минимальной среде, не содержащей гистидин. После электропорации культуру клеток рассевали на чашки с плотной питательной средой MDS agar, содержащую 2% сорбитола. Полученные трансформанты переносили на плотный питательный агар YPD, содержащей генетицин в концентрациях 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,5 мг/мл. Полученные клоны проверяли с помощью ПЦР-скрининга. Готовили ПЦР-смесь объемом 20 мкл по следующей схеме: 2 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы («Евроген»); 0,15 мкл 120 мкМ праймера AOX1_f; 0,15 мкл 150 мкМ праймера YC1_r; 0,4 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Thermo Fischer Scientific», Литва); 17 мкл депонизованной воды; 0,2 мкл Taq ДНК-полимеразы («Евроген», Россия). В каждую пробирку добавляли клетки трансформантов с плотной среды. Тщательно суспендировали и амплифицировали по следующей схеме: 95°, 5' (денатурация), 95°, 30''; 45°, 30''; 74°, 1'30'' (амплификация). «Положительные» клоны отбирали для определения уровня экспрессии рекомбинантного белка.

Пример 3. Культивирование трансформантов и определение уровня экспрессии гена FGF2.

Трансформанты с чашек переносили на среду YPD (10 мл) и культивировали при 28°С до оптической плотности 2÷6 единиц. Затем культурой клеток инокулировали среду BMGY (400 мл) (разведение в 100 раз) и инкубировали в течение 48 часов при 28°С в колбах объемом 2000 мл. Полученную биомассу собирали центрифугированием при 2000×g в течение 5 минут и переносили в среду BMMY (50 мл), содержащей 2% (v/v) метанола. Выращивание проводили в колбах на 500 мл в течение 72 часов, добавляя каждые 12 часов в среду 3% (v/v) метанола. После выращивания культуральную жидкость отделяли от биомассы центрифугированием при 5000×g в течение 10 минут при 4°С. Полученные образцы смешивали с 1/6 объема «Sample Loading Buffer 6×» и анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-электрофореза в стандартном режиме. Клон с максимальным уровнем экспрессии обозначили как GS115FGF2. Пример 4.

На 96-луночный планшет были высеяно примерно по 150000 клеток линий 3Т3 и HEK 293 в питательной среде DMEM с добавлением 5% FBS. Затем клеточную линию инкубировали в 6 часов. По истечении этого времени питательную среду заменяли на DMEM с добавлением 1% сыворотки. Клеточную линию инкубировали 24 часа. По истечении 24 часов заменяли среду на DMEM с добавлением bFGF в различных концентрациях нг/мл (0; 0,06; 0,24; 0,98; 3,9; 15,63; 62,5; 250) и инкубировали еще 48 часов. Для оценки пролиферативной активности в каждую лунку добавляли по 10 мкл WST-1 реактива (Roche). Инкубировали 4 часа и измеряли поглощение при длинах волн 440 и 660 нм.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Перечень последовательностей FGF-2.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-07-03">

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

"Вятский государственный университет"</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Vyatka State University </ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Герасимов Андрей

Сергеевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Gerasimov Andrey Sergeevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК

pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста

фибробластов человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей

Pichia pastoris – продуцент полипептида со свойствами основного

фактора роста фибробластов человека</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">RECOMBINANT PLASMID DNA pFGF2

ENCODING A POLYPEPTIDE WITH HUMAN BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR

PROPERTIES, AND RECOMBINANT STRAIN OF METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA

PASTORIS, A PRODUCTION HOST OF A POLYPEPTIDE WITH HUMAN BASIC

FIBROBLAST GROWTH FACTOR PROPERTIES</InventionTitle>

<INSDSeq_length>461</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..461</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccgctcgagaaaagaccagctctgccagaagatggtggatctggtgctt

ttccaccaggtcacttcaaagatccaaaacgtctgtactgtaaaaatggaggtttcttcctgcgtattca

tccagatggtcgtgttgacggtgttcgtgaaaaatctgacccacacatcaaactgcaactgcaggctgag

gaacggtgttgtttctatcaaaggtgtttgcgctaaccgttacctggctatgaaagaagacggtcgtctg

ctggcttctaaatgcgttactgatgaatgtttctttttcgaacgtctggaatctaataactacaacactt

accgttctctaaatacacttcttggtacgttgctctgaaacgtactggtcagtacaaactgggttctaaa

actggtccaggtcagaaagcgatcctgttcctgccgatgtctgcgaaatcttaatctagagc</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>146</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..146</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDP

HIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALK

RTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Рекомбинантная плазмида pFGF2, характеризующаяся конструктивным выполнением, представленным на фиг. 1, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 2, кодирующая полную аминокислотную последовательность полипептида основного фактора роста фибробластов человека, обеспечивающая стабильную рекомбинацию экспрессионных кассет в геноме Pichia pastoris, а также экспрессию целевого белка в культуральной жидкости.

2. Рекомбинантный штамм Pichia pastoris GS115FGF2 – продуцент основного фактора роста фибробластов человека, полученный путем трансформации клеток штамма Pichia pastoris GS115 (his4, mut+) рекомбинантной плазмидой pFGF2 по п. 1.