CN1345927A - 重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因工程酵母菌及生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用甲醇营养型酵母Pichia Pastoris高水平表达系统,将人或牛bFGF基因克隆到酵母整合型质粒载体,经转化、筛选、诱导表达,获得高效表达的重组bFGF基因工程酵母菌。对于胞内表达产物,采用细胞破碎、离子交换层析和亲和层析纯化,获得高纯度产品;对于分泌表达产物,将发酵上清液采用离子交换层析和亲和层析纯化,获得高纯度重组bFGF。

Description

专利 重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因工程酵母菌及生产方法

本发明涉及重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程酵母菌PichiaPastoris的构建及使用该菌制备rhbFGF的方法。

在国内外报导的有关碱性成纤维细胞生长因子基因工程的工作，大部分是采用大肠杆菌(E.coli)表达系统。虽然大肠杆菌在基因工程领域被广泛地选用，但是由于它属于原核生物，对真核生物蛋白的正确表达存在一定的缺陷。而酵母作为异源蛋白的表达宿主，克服了大肠杆菌的缺点，体现在表达蛋白可以正确折叠、糖基化等，是真核生物蛋白的良好表达宿主。有关酵母表达系统的早期研究工作大多集中在酿酒酵母。酿酒酵母表达系统存在的不足之处是，不易实现高密度培养、表达效率低、对外源基因表达产物的分泌不够理想，以及翻译后加工方面与高等真核生物存在不同，存在过度糖基化问题，使其表达产物有很强的抗原性而不能用于药物。酿酒酵母的这些不足，促使人们研究开发新的酵母表达系统，目前已报道的有巴斯德毕赤酵母、多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶鲁酵母、施旺酵母等系统，统称为非常规酵母表达系统，其中，尤其是甲醇营养型酵母表达系统，由于其具有独特的优点，近年来日益引起人们的重视。巴斯德毕赤酵母具有如下优点：

(1)含特有的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可以严格地调控表达；

(2)有完备的发酵方法，可以高密度连续培养，细胞干重达100g/L以上，

   外源蛋白表达产量高；

(3)表达质粒易于整合到基因组，稳定性高，不易丢失；

(4)胞内存在过氧化物酶体，表达产物进入过氧化物酶体，能使表达产物免

   受蛋白酶降解或使细胞免受外源蛋白毒害。

本发明的目的在于构建一种能够在胞内或胞外高效表达bFGF的酵母工程菌Pichia Pastoris。

本发明将碱性成纤维细胞生长因子基因克隆到酵母高效表达载体中，利用锂盐法转入酵母。通过PCR技术和地高辛(DIG)标记的探针从转化子中筛选出十个高拷贝的含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的菌株。实验室里用进行摇瓶发酵表达，表达量约为20-100mg/L，因此有很好的工业发酵前景。

本发明基于前期的碱性成纤维细胞生长因子基因序列的测定和酵母，尤其是甲醇营养型毕赤酵母Pichia Pastoris的优越性，构建了一种高效表达的重组人碱性成纤维细胞生长因子基因工程酵母菌，为开发基因工程新药打下基础。1.菌株及质粒

所用菌株和质粒见表1。

表1菌株和质粒

菌株、质粒	来源
		大肠杆菌
E.coliDH5α	本室
		酵母
GS115，KM71	Invitrogen
		质粒
pUC-bFGF	本室
		pGEM-T easy vector	Promage
pPIC-9，pHIL-S1，，pPICZ-ApHIL-D2，pPIC3.5，pPICZα-A	Invitrogen

2.主要药品、试剂

Taq DNA聚合酶                 Promega

T₄-DNA Ligase，10x反应缓冲液  Promega

EcoRI，10x反应缓冲液          SABC

X-gal                         Promega

IPTG                          Promega

RNase A                       Promega

溶菌酶                        SABC

PCR markers                   Promega

琼脂糖                        Promega

低熔点琼脂糖                  Promega

CIP                           Promega

EDTA                          Sigma

Tryptone                      Sigma

Yeast Extract                 Sigma

Biotin                        Sigma

Yease Nitrogen Base(YNB)      Sigma

Tris                          Sigma

Bgl II                        Promega

PET4000                       SABC

蜗牛酶                     SABC

Acrylamide                 Sigma

Bisacrylamide              Sigma

CM-Sephadex C-50           Phamacia

Heparin Sepharose CL-6B    Phamacia3.培养基

LB培养基(1000mL)

         Trypton          10g

         Yeast Extract     5g

         NaCI             10g

固体培养基加1.5％agar，半固体培养基加0.8％agarYPD完全培养基(1000mL)：

     Trypton          20g

     Yeast Extract    10g

     20％Glucose      100mL

    固体培养基加1.5％agar

MD培养基(1000mL)

         Yeast Nitrogen Base    13.4g

         dextrose                 20g

         4×10^-5％biotin

固体培养基加1.5％agar4.缓冲液

碱裂解法制备质粒DNA缓冲液：

溶液I：50mmol/L Glucose，100mmol/L EDTA，25mmol/L Tris·Cl

       (pH8.0)

溶液II：0.2mol/LNaOH，1％SDS(临用前配制)

溶液III：60mL 5mol/L Potassium Acetate，11.5mL Acetic Acid，

         28.5mL H₂O，所配成溶液中钾浓度为3mol/L，乙酸根

         浓度为5mol/L

TE缓冲液：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)

STE缓冲液：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L

       EDTA(pH8.0)

SCED缓冲液：1mol/L山梨醇，10mmol/L柠檬酸纳，pH7.5，

       10mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT

TAE电泳缓冲液：

使用液：                   浓贮存液(1000ml)

1x：0.04mol/L Tris-乙酸  50x：242g Tris

0.001mol/L EDTA            57.1mL冰乙酸

                           100mL0.5mol/L EDTA(pH8.0)5.bFGF基因的克隆与表达

实施例一：bFGF的分泌表达(1)引物设计与合成

Primer1

5′GCGCGAATTCGCAGCCGGGAGCATCACCACG 3′

Primer2

5′GCGCGAATTCTCAGCTCTTAGCAGACATTGG 3

Primer3

5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′

其中Primer1、Primer2用于bFGF基因改造，Primer3为AOX1引物，用于鉴定筛选重组表达质粒。合成产物经脱保护基，纯化后贮于-20℃。(2)PCR扩增反应

以含bFGF基因的pUC-bFGF重组质粒为模板，在0.5mL离心管中依次加入

Primer1(25pmol/μL)    1μL

Primer2(25pmol/μL)    1μL

pUC-bFGF               1μL

dNTP(25 mmol/L)        2.5μL

10xPCR reaction buffer 5μL

ddH₂O                 39.5μL

95℃变性1min，冷至45℃，加入Taq DNA聚合酶1μL(3U)，依52℃ 60sec，72℃ 60sec，94℃ 30sec步骤在PE9700 PCR仪上进行35个循环，进行至最后一步时，72℃延伸15min，确保产物3’端为单A核苷酸尾。回收PCR产物。(3)PCR产物与载体连接反应

0.5mL微量离心管中加入带3’单T核苷酸尾的pGEM easy vactor 20ng和含3’单A核苷酸PCR产物10ng，加入ddH₂O至8μL，45℃，5min，置冰上冷却至0℃，加入10xT₄LigasebufferlμL、T₄Ligase1uL(5U)，于4℃连接反应24hr。(4)E.coli感受态细胞制备与转化

参照《Molecular Cloning》(Sambrook J et al.1989)方法进行。将连接产物转化E.coli感受态细胞。挑取含IPTG、X-gal的LB平板上的白色菌落，接种于2mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃，300r/m培养过夜，取1mL转接于10mL LB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，剩余菌液贮于4℃冰箱。37℃，300r/m培养16hr，提取质粒。(5)pGEM-bFGF重组质粒提取与鉴定

参照《Molecular Cloning》(Sambrook J et al.1989)碱裂解法从E.coli抽提pGEM-bFGF重组质粒。

采用EcoRI单酶切，鉴定含插入bFGF基因的重组pGEM质粒。反应液组成如下：

                  1μL质粒DNA溶液

               7μL ddH₂O

               1μL10xbuffer

               1μLEcoRI(2U)

37℃温育1小时，加入十分之一体积的3mol/LNaAc，混匀，再加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min。4℃，12,000r/m离心15min，弃上清，70％冷乙醇洗涤，抽干，沉淀溶于10μL TE中。1.5％琼脂糖凝胶电泳分析限制酶消化的DNA片段，以PCR Marker为DNA分子量标准。(6)DNA序列分析

对克隆到pGEM上的bFGF基因的序列测定按ABI370 DNA自动测序仪和DNA测序试剂盒说明书进行。(7)重组表达载体的构建A.目的基因片段的酶切回收

目的基因片段从供体质粒pGEM-bFGF上用EcoRI酶切回收。37℃酶切反应4小时，消化完全的反应液用等体积酚、酚：氯仿、氯仿个抽提一次，取上层水相加入1/10体积3mol/L乙酸钠，充分混匀，加入等体积异丙醇混匀，-20℃放置2小时，4℃，12,000r/m离心15min，弃上清，4℃70％乙醇洗涤，抽干，沉淀溶于20μLTE(Ph8.0)。1.5％低熔点脂糖凝胶电泳回收140bp目的基因片段。B.载体质粒pPIC9的酶切回收

用EcoRI消化载体质粒pPIC9，取少量DNA在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测消化程度。用酚：氯仿抽提样品，2倍体积乙醇沉淀，12,000离心10min，重溶于10μLTE(pH8.0)备用。C.线状质粒DNA的去磷酸化

质粒DNA                  10μL

10×CIP去磷酸化缓冲液    10μL

CIP                      1U

ddH₂O                   80μL

37℃温育30min，加入SDS和EDTA(pH8.0)至终浓度分别为0.5％和5mmol/L，充分混匀，加蛋白酶K消化CIP至终浓度100μg/mL，56℃温育30min。用酚、酚：氯仿各抽提一次，2倍体积乙醇沉淀，TE溶解，浓度100μg/mL。D.目的基因片段与载体的连接反应

按《Molecular Cloning》(Sambrook，1989)方法进行。

连接反应液组成：

目的基因/EcoR I    1μL

PPIC9/EcoRI        1μL

ddH₂O             6μL

冷却至0℃，加入10×T₄DNA连接酶缓冲液1μL，T₄DNA连接酶1μL，12℃过夜。E.转化E.coli感受态细胞

方法同(4)。F.重组pPIC-bFGF质粒的PCR鉴定

碱裂解法提取E.coli转化子质粒为模板，以引物primer2、primer3进行PCR扩增，筛选正向插入质粒。在0.5mL离心管中依次加入

Primer2(25pmol/μL)    1μL

Primer3(25pmol/μL)    1μL

质粒DNA                1μL

dNTP(25mmol/L)         2.5μL

10xPCR reaction buffer 5μL

ddH₂O                 39.5μL

93℃变性1min，冷至45℃，加入Taq DNA聚合酶1μL(3U)，依52℃60sec，72℃ 60sec，94℃ 30sec步骤在PE9700 PCR仪上进行35个循环。

取5μL PCR产物作1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。G.重组表达载体的线性化及变性

采用BglII酶切线性化。

反应液组成：

质粒DNA       20μL(1μg/μL)

10×buffer    20μL

BglII    2μL(15U/μL)

ddH₂O   158μl

37℃反应5hr，等体积异丙醇沉淀，重溶于20μL TE中，100℃水浴5min，冰浴冷却，贮于-20℃。H.LiCl法制备酵母感受态细胞及转化

       接种酵母单菌在3mL YEPD培养基，

           30℃，200r/m过夜

                 ↓

       取1mL转接50mLYEPD培养基，

    30℃，200r/m培养6hr，OD₆₀₀0.8-1.0

                 ↓

1500g离心10min，收集细胞，用蒸馏水洗涤一次，

重悬于1mL 100 mmol/L LiCl中，10000g离心15Sec

                 ↓

     重悬于0.4mL 100 mmol/L LiCl中

                 ↓

取50μL细胞悬浮液，1500g离心，弃上清，依次加入

240μL50％PEG，36μL 1mol/L LiCl，25μL(2mg/mL)单链DNA，

         混匀，30℃静置30min

                 ↓

      42℃热激20-25min，冷却至室温

   6000r/m离心，沉淀悬浮于1mL无菌水中

                 ↓

   取0.1mL涂布MD选择培养基平板(His^-)

                 ↓

           30℃培养2-4天I.Pichia酵母总DNA提取

 10mL培养基中，30℃培养酵母至OD₆₀₀达5-10

                 ↓

       1500g离心10min，收集菌体

                 ↓

       10mL蒸馏水洗涤菌体两次

                 ↓

  细胞重悬于2mL SCED(pH7.5)缓冲液中

                     ↓

     加入0.1-0.3mg蜗牛酶，30℃温育50min

                     ↓

     加入2mL SDS，轻轻混匀，置冰上5min

                     ↓

   加入1.5mL 5mol/L乙酸钾，pH8.9，轻轻混匀

                     ↓

        4℃，10000g离心10min，取上清

                     ↓

       加入2倍体积乙醇，室温放置15min

                     ↓

           4℃，10000g离心20min

                     ↓

 沉淀溶于0.7mL TE(pH7.4)，用等体积酚：氯仿抽提

                     ↓

     上层水相加入二分之一体积的7.5mol/L乙酸铵，

          加2倍体积乙醇，置-20℃，60min

                     ↓

   4℃，10000g离心20min，70％乙醇洗涤沉淀，抽干

                     ↓

             溶于50μLTE，-20℃保存J.DIG标记基因探针

回收bFGF基因片段，置100℃水浴中10min，立即置于冰盐浴中冷却，依次加入2μL六聚核苷酸混合物，2μL dNTP标记混合物，加无菌双蒸水至10μL，加入1μLKlenow酶(2U/μl)，混匀后，置于37℃温育20hr，加入2μ L0.2mol/LEDTA(pH8.0)终止反应，加入2.5μL 4Mol/L LiCl，75μL预冷乙醇标记DNA，-20℃过夜，12000r/m，4℃离心15min，50μL 70％乙醇洗涤，抽干，-20℃保存备用。K.点杂交和Southen杂交鉴定

按DIG试剂盒说明书操作。L.表达产物分离纯化转化酵母培养及发酵液预处理：转化酵母单菌落接种于2mL MD培养基，30℃，200r/m过夜

                     ↓

取1mL培养液转接于100mL MD培养基或YEPD培养基，

            30℃，200r/m培养24hr

                    ↓

               加入0.5mL甲醇

                    ↓

            30℃，200r/m培养72hr

                    ↓

       4℃，5000r/m离心10min，取上清

                    ↓

     调pH4.2，90℃水浴15min，冰浴冷却

                    ↓

       12000g，4℃离心15min，取上清表达产物的分离纯化：

  将上述所得上清液首先过CM-Sephadex(-50离子交换柱，以含0-0.6M氯化钠的确25mN磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行梯度洗脱，收集第三洗脱峰蛋白质溶液直接过Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱，用含0.5-2.0氯化钠的25Mm的磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行梯度洗脱，收集第三洗脱峰。将获得的活性组份用G25柱除盐或对双蒸水透析除盐，冻干成干粉。实施例二：bFGF的胞内表达(1)引物设计与合成

Primer4

5′GCGCGAATTCATGGCAGCCGGGAGCATCACC 3′

Primer5

5′GCGCGAATTCTCAGCTCTTAGCAGACATTGG 3′

Primer3

5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′

其中Primer4、Primer5用于bFGF基因改造，Primer3为AOX1引物，用于鉴定筛选重组表达质粒。合成产物经脱保护基，纯化后贮于-20℃。(2)PCR扩增反应同实施例一中(2)。(3)PCR产物与载体连接反应同实施例一中(3)。(4)E.coli感受态细胞制备与转化

同实施例一中(4)。(5)pGEM-bFGF重组质粒提取与鉴定同实施例一中(5)。(6)DNA序列分析

同实施例一中(6)。(8)重组表达载体的构建A.目的基因片段的酶切回收同实施例一中(6)A。B.载体质粒pHIL-D2的酶切回收

用EcoRI消化载体质粒pHIL-D2，取少量DNA在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测消化程度。用酚：氯仿抽提样品，2倍体积乙醇沉淀，12,000离心10min，重溶于10μL TE(pH8.0)备用。C.线状质粒DNA的去磷酸化

同实施例一中(6)C。D.目的基因片段与载体的连接反应

同实施例一中(6)D。E.转化E.coli感受态细胞

方法同(4)。/.重组pHIL-bFGF质粒的PCR鉴定

同实施例一中(6)F。G.重组表达载体的线性化及变性

同实施例一中(6)G。H.LiCl法制备酵母感受态细胞及转化

         同实施例一中(6)H。I.Pichia酵母总DNA提取

同实施例一中(6)I。J.DIG标记基因探针

同实施例一中(6)J。K.点杂交和Southen杂交鉴定

按DIG试剂盒说明书操作。L.表达产物分离纯化转化酵母培养及菌体处理：

转化酵母单菌落接种于2mL MD培养基，30℃，200r/m过夜。取1mL培养液转接于100mL MD培养基或YEPD培养基，30℃，200r/m培养24hr。加入0.5mL甲醇。30℃，200r/m培养72hr。4℃，5000r/m离心10min，收集菌体沉淀。菌体的裂解与粗制bFGF的制备：

将收获的菌体悬浮于0.5mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)，加入蜗牛酶至终浓度为100μg/mL，30℃温育30min，用高压匀质机(5hp60/60)进行菌体裂解，控制初压为20-25Mpa，终压为50-60Mpa，循环4次，将所得的细胞裂解液以15000转/分的转速进行离心分离30分钟，取上清即得初制bFGF。表达产物的分离纯化：

将上述所得上清液首先过CM-Sephadex C-50离子交换柱，以含0-0.6M氯化钠的确25mN磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行梯度洗脱，收集第三洗脱峰蛋白质溶液直接过Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱，用含0.5-2.0氯化钠的25Mm的磷酸盐缓冲液(PH7.0)进行梯度洗脱，收集第三洗脱峰。将获得的活性组份用G25柱除盐或对双蒸水透析除盐，冻干成干粉。

Claims (7)

1.能在胞内或胞外表达重组碱性成纤维细胞生长因子的基因工程酵母菌。

2.权利要求1中所说的酵母菌为甲醇营养型毕赤酵母(Pichia Pastoris)，包括GS115和KM71。

3.权利要求1中基因工程酵母菌其表达载体包括pPIC3.5，pHIL-D2，pHIL-S1，pPIC9，pPICZ-A，pPICZα-A等酵母胞内及分泌型表达载体。

4.权利要求1中所说的基因工程酵母菌包括胞内表达和分泌表达两种类型。

5.权利要求4中所说的基因工程酵母菌胞内表达包括pPIC3.5，pHIL-D2，pPICZ-A。

6.权利要求4中所说的基因工程酵母菌分泌表达包括pPIC9，pHIL-S1，pPICZα-A。

7.权利要求1中所说的碱性成纤维细胞生长因子指人bFGF或牛bFGF。