CN102329766A - 可用于预防或治疗人溃疡性结肠炎的重组食品级乳酸菌、其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌,及其制备方法,特别是涉及利用Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子进行融合表达的方法。本发明将编码上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌组成型表达载体pMG36m中,然后转化至乳酸乳球菌NZ9000,并利用蜜二糖作为碳源进行重组子筛选。重组乳酸工程菌在发酵表达过程中能持续分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白。本发明还涉及所述重组食品级乳酸菌在制备化妆品和用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物或食品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域。更具体地,本发明涉及一种制备含人酸性成纤维细胞生长因子的重组食品级乳酸菌,及其制备方法及所述重组食品级乳酸菌在制备化妆品或用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物或食品中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)又称非特异性溃疡性结肠炎,是一种原因不明的慢性炎症性肠道病疾病。该疾病的发病部位主要位于结肠的粘膜层,常以溃疡为主,多累及直肠和远端结肠,亦可遍及整个结肠[连军等,2009,新疆医科大学学报,32(11):1619]。UC患者临床表现有持续性或反复发作的腹泻、粘液血便,腹疼或者不同程度的全身疼痛等症状。而从病理方面则显示肠组织呈弥漫性的组织反应,包括溃疡形成、隐窝脓肿、小血管炎症、杯状细胞减少以及各种类型炎症细胞浸润等。此外,流行病学统计分析结果表明,UC的发生率与人口的年龄及性别没有密切相关性。由于UC病程长,常反复发作及容易导致结肠癌的发生,现时已被世界卫生组织列为亟待解决的疑难疾病之一[郝薇薇,2002,陕西医学杂志,31(12):1100]。
越来越多的证据显示,UC的发病与多种因素有关,其中遗传因素是患病的基础、免疫紊乱则是发病的关键,而其它因素诸如精神紧张、病原体感染、过敏等是UC发病的可能诱因[赵旭东和张薇,现代医药卫生,2008,24(10):1501]。现有的UC治疗方法包括药物治疗、心理治疗、免疫治疗、生物制剂治疗和手术治疗。尽管这些治疗方法在影响炎症过程有着一定的效果,但并不能改变其病程,因此寻找新的治疗方法已成为现时 临床上治疗UC的迫切需要。
酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)是成纤维细胞因子家族中的基本成员,是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型细胞具有广泛生物学活性的细胞生长因子。酸性成纤维细胞生长因子包括促分裂活性与非促分裂激素样活性,其中促分裂活性主要包括促血管生成、组织发生、创伤修复以及神经营养作用;而非促分裂激素样活性则主要有抑制细胞凋亡、降低血压、调节细胞Ca2+平衡、促激素分泌和参与中枢反馈调节[Huang Y et al.,2008,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(5):1015]。本实验室动物实验研究结果表明,酸性成纤维细胞生长因子具有抗肠道、心肌、肾脏、脑以及视网膜等多种组织器官缺血性损伤的功能,且对急性肝损伤以及各类皮肤创伤疗效显著。此外,酸性成纤维细胞生长因子还参与脊髓损伤的修复、可延缓和阻止耳蜗毛细胞在声损过程中的进一步损害以及神经细胞的营养等[Wang W et al.,2008,Life Sci.,82(3-4):190;Huang Z et al.,2007,Toxicol Lett.,170(2):146;Huang Y et al.,2008,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(5):1015;Wu X et al.,2010,J.Cell Mol.Med.,14(1-2):351]。
在众多生物学功能中,酸性成纤维细胞生长因子在促进皮肤创伤修复的作用方面最为人熟知,其主要作用机理是诱导伤口附近的组织细胞如血管平滑肌、成纤维细胞、肌纤维母细胞的分裂和增殖,同时加速胶原纤维的合成和分泌,最终促进皮肤和黏膜创面愈合[许华等,2002,中国药科大学学报,34(1):46]。在此研究的基础上,我们实验室对酸性成纤维细胞生长因子在急性和生殖毒性方面的研究,结果表明,在药效学有效量的范围内应用酸性成纤维细胞生长因子(≤11,200μg/kg),实验动物各项主要生理、生化指标、组织病理学基本未见明显变化,说明酸性成纤维细胞生长因子在常规条件下使用是安全的[李校坤等,2002,药学学报,37(6):424]。有见及此,我们进而对酸性成纤维细胞生长因子进行了三期外用临床试验:1)I期临床研究结果是酸性成纤维细胞生长因子用于治疗30%以内的烧烫伤创面是安全的、酸性成纤维细胞生长因子很少经表皮创面吸收进入血液以及酸性成纤维细胞生长因子试验用各剂量在用药后21天内均可使烧、烫伤创面愈合,但以100U/cm2剂量组创面愈合所需时间最短; 2)II期临床研究结论是该药用于治疗深II°的烧、烫伤创面是安全有效的;3)III期临床研究结论则显示该药用于治疗创伤性难愈合性创面、糖尿病性难愈合性创面和静脉回流障碍性及其他难愈合性创面,其愈合率为56.4%,有效率为83.8%,平均愈合所需天数为33.39天,而不良反应发生率仅为2.88%[许华等,2005,中国新药杂志,14(12):1476]。由于酸性成纤维细胞生长因子在治疗各种皮肤创伤方面安全有效,现时其已被国家药监局批准成为国家一类新药(国药证字S20060078)。
尽管研究已经证实,酸性成纤维细胞生长因子可以有效用于治疗胃肠道创伤[翁立新等,2005,中国危重病急救医学,17(2):98.],然而,由于人胃肠道具有结构复杂、长度超过6米且含有大量的蛋白酶等特点,因此,通过直接口服的方法并不能使酸性成纤维细胞生长因子直达溃疡部分。由此可见,寻找一种理想的食品级表达载体表达酸性成纤维细胞生长因子就具有十分重要的研究意义和应用价值。
乳酸菌(lactis acid bacteria,LAB)是一类能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌,其包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属,在食品工业各个领域中的长期应用已证明其无致病性,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物。其是人和大多数动物肠道内的常见细菌,广泛分布于消化系统、呼吸系统、泌尿系统、口腔系统、皮肤系统和粪便当中。
人们早就知道饮用酸奶有益健康。历史研究表明,早在4000多年前在古巴比伦、古印度以及古埃及等地区就已经有食用酸奶的记录。而中国后魏时期的农业著作《齐民要术》中也详细描述了酸奶的制作工艺。随着法国微生物学家路易斯巴斯德(Louis Pasteur)首先发现乳酸菌后,其重要的生物学活性和应用价值才逐渐为人们所知。研究发现,乳酸菌具有提供人体必需的营养物质、维持泌尿生殖系统健康、增强机体免疫作用、降低胆固醇含量、改善胃肠道功能以及抗肿瘤作用等多种重要的生理功能。而在这些功能中,后两种研究得最多,也最有应用价值。乳酸菌在人体消化道和生殖道中大量存在,其它部位比较少。一般情况下,从口腔、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠到直肠,其数量会逐渐增加(103--1012/每克细菌)。其改善胃肠道功能的机理在于:一方面,其通过自身及其代谢产 物和其它细菌之间的相互作用,维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定,抑制有害菌的增殖,降低了有害菌毒素的产生;另一方面,通过产酸、表达细菌素、合成维生素以及分解胆盐维持内环境的稳定。而在抗肿瘤活性方面,乳酸菌可以通过降解或者吸附致癌物、阻止肠内致癌物的形成、增强宿主免疫系统、产生抗突变的物质、改变肠道的生理生化环境以及通过增加NADPH还原酶的活性等方面来显著改善人体的生理机能,抑制肿瘤细胞的增殖。
有鉴于其具有极其重要应用价值,从20世纪80年代开始,人们就开始致力于对各种乳酸菌,尤其是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),的生物学特性和分子机制研究。乳球菌作为表达外源蛋白的理想菌株有其独特的优势:首先,该菌已经进行全基因组测序,其所有的功能基因以及生化途径一清二楚;其次,乳球菌抗原性弱,不会产生内毒素,宿主本身不会引起强烈的免疫应答;再次,乳球菌不在胃肠道内定殖,这一特点可以避免因其长期定殖而导致的免疫耐受。目前,乳球菌已作为一种食品级表达宿主用于表达各种抗原、生长因子以及功能蛋白。
乳球菌属中的质粒是研究最多的乳酸菌质粒,作为理想的表达载体,现时已经广泛应用于基因工程领域。然而,传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氨苄青霉素等)抗性的基因,如果将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内,由于抗性因子的转移,将会对生物安全性产生严重后果。为了构建一个食品级的表达载体,最有效的办法就是用安全的食品级标记替代抗生素抗性标记。现时,用于乳球菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类:糖类利用标记、营养缺陷型标记和编码细菌素抗性,而糖类作为碳源是最为常用的筛选方法。
本发明的主要目的就是实现酸性成纤维细胞生长因子在乳酸菌中持续分泌表达,并用于在溃疡性结肠炎,尤其是难愈性结肠炎,治疗方面的应用。由于乳球菌具有可以在人体肠道内维持(停留)一周左右,贴伏肠壁(不受肠道蠕动的影响)以及数量逐渐增加等特点,因此,贴伏患处的乳球菌可以利用旁分泌作用方式分泌酸性成纤维细胞生长因子促进患处修复。而肠道中的蛋白酶以及偏碱性的微环境则可迅速水解多余的酸性成纤维细胞生长因子。最后,工程菌从人体内排出,从而完成整个治疗的过 程。
发明内容
针对上述研究背景,本发明涉及一种分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子(Human acidic fibroblast growth factor,haFGF)的融合蛋白的重组食品级乳酸菌,及其制备方法,特别是涉及利用Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子进行融合表达的方法。本发明将编码上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌组成型表达载体(例如,pMG36m)中,然后转化至乳酸乳球菌NZ9000中,并利用蜜二糖作为碳源进行重组子筛选。重组乳酸工程菌在发酵表达过程中能持续分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白。本发明还涉及所述重组食品级乳酸菌在制备化妆品或用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物中的应用。
因此,本发明涉及以下各项:
1.一种表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌,其通过下述方法制备:构建一种以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组表达载体,并转化到乳酸菌宿主细胞中。
2.上述1中所述的重组食品级乳酸菌,其中所述的乳酸菌宿主细胞选自:乳球菌,例如,乳球菌MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800,粪肠球菌,例如,粪肠球菌OGIX、FA2-2,或植物乳杆菌(例如,ATCC 8014),优选乳酸乳球菌NZ9000。
3.上述1中所述的重组食品级乳酸菌,其中所述的融合蛋白由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成,且三种蛋白是按照所述顺序从融合蛋白的N端到C端依次编码。
4.上述3中所述的重组食品级乳酸菌,其中所述Usp45蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,所述促分泌蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示,所述的人酸性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
5.上述1中所述的重组食品级乳酸菌,其中糖类筛选标记α-半乳糖苷酶的序列如SEQ ID No:4所示。
6.上述1中所述的重组食品级乳酸菌,其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。
7.上述1中所述的重组食品级乳酸菌,其中所述重组表达载体衍生于pMG36e(SEQ ID No:6)。
8.一种制备分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法,该方法包括以下步骤:
1)构建以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组表达载体;
2)将1)中构建的重组表达载体转化到乳酸菌宿主细胞中,并且用含蜜二糖的乳酸菌培养基(成分:2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化钠,0.15%乙酸钠,0.5%蜜二糖和1.5%琼脂粉)筛选转化成功的重组乳酸菌。
9.上述8中所述的方法,其还包括下述步骤:
3)在适于分泌表达融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌;和
4)通过3)的重组乳酸菌分泌表达出所述含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白。
10.上述8中所述的方法,其中所述融合蛋白由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成,其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。
11.上述8中所述的方法,其中步骤1)中所用的重组表达载体衍生于pMG36e。
12.上述8中的方法,其中所述的乳酸菌宿主细胞选自:乳球菌,例如,乳球菌MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800,粪肠球菌,例如,粪肠球菌OGIX、FA2-2,或植物乳杆菌(例如,ATCC8014),优选乳酸乳球菌NZ9000。
13.根据上述9中的方法,其中所述适于分泌表达融合蛋白的条件是指在含有蜜二糖的乳酸菌培养基(成分:3.725%M17肉汤,0.5%蜜二糖)中,37℃厌氧静置培养48小时。
14.上述1-7中任一项的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌在制备化妆品或用于预防和治疗人溃疡性结 肠炎的药物或食品中的应用。
15.一种用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物,其中包含药效学有效量的上述1-7中任一项所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
16.一种用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的食品,其中包含有效量的上述1-7中任一项所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
17.一种化妆品,其中包含有效量的上述1-7中任一项所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
更具体地,在本发明的重组食品级乳酸菌中,其中所述融合蛋白中编码Usp45蛋白信号肽的核苷酸序列(SEQ ID No:7)、编码促分泌蛋白肽的核苷酸序列(SEQ ID No:8)、编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列(SEQ ID No:9)以及编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No:10)可以是天然来源中筛选的野生序列或人工化学合成的序列。
在本发明的一个方面中,所述Usp45蛋白信号肽是指来源于乳酸乳球菌MG1363中(Lactococcus lactis subsp,lactis strain MG1363)未知功能的45kD分泌蛋白(Unidentified secreted 45kDa protein,Usp45)的信号肽。
在本发明的一个方面中,所述的促分泌蛋白肽是人工合成序列。已有文献报道,在目的蛋白N端添加该促分泌蛋白肽可以显著提高该蛋白的细胞外表达量(Loir et al.,2005,Microbial cell factories,4:2.)。
在本发明的一个方面中,所述的α-半乳糖苷酶是指植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)α-半乳糖苷酶。
得到编码由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的基因的优选方法是人工合成方法,因为这样可以避免氨基酸密码子偏好性的影响,从而增加目的蛋白的表达量。可以按照Itatura等人所述的技术(Science,1977,198:1056-1063)来合成基因,也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。而本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞的转化和培养以及表达产物的分离鉴定等操作(参见 Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。
可以使用任何一种适于在其中分泌表达目的蛋白质(Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白)的乳酸菌作为宿主,这样的菌株包括乳球菌(MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800)、粪肠球菌(OGIX、FA2-2)以及植物乳杆菌(ATCC 8014)等。本发明优选的宿主是乳酸乳球菌NZ9000(购自NIZOCo.Ltd.,Netherlands)。
在本发明的另一个方面中,本发明涉及一种制备分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法,该方法包括以下步骤:
1)构建以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组表达载体,其中所述融合蛋白由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成,其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示;
2)将1)中构建的重组表达载体转化到乳酸菌宿主细胞中,并且用含蜜二糖的乳酸菌培养基(成分:2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化钠,0.15%乙酸钠,0.5%蜜二糖和1.5%琼脂粉)筛选转化成功的重组乳酸菌。
所述方法还可以包括下述步骤:
3)在适于分泌表达融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌;和
4)通过3)的重组乳酸菌分泌表达出由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白。
其中所述的乳酸菌宿主细胞选自:乳球菌,例如,乳球菌MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800,粪肠球菌,例如,粪肠球菌OGIX、FA2-2,或植物乳杆菌(例如,ATCC 8014),优选乳酸乳球菌NZ9000。
在本发明的一个具体的实施方案中,本发明涉及一种制备含人酸性成纤维细胞生长因子(Human acidic fibroblast growth factor,haFGF)的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法,该方法包括以下步骤:
1)提供编码由Usp45蛋白信号、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No:11);
2)从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中获得编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No:10),然后用限制性内切酶EcoR I和Nsi I对编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列进行酶切反应;
3)将步骤2)中核苷酸序列连接到用限制性内切酶EcoR I和Nsi I处理过的乳酸菌组成型表达载体pMG36e上,获得重组表达质粒pMG36m;
4)用步骤3)的重组表达载体转化适当的乳酸菌宿主细胞NZ9000中,蜜二糖作为碳源筛选重组子;
5)从阳性重组子中抽提重组表达质粒pMG36m,然后利用限制性内切酶Sac I以及Sph I对该重组质粒进行酶切,然后与经相同限制性内切酶处理的步骤1)中核苷酸序列相连,获得重组表达质粒pMG36m-ULHA;
6)用步骤5)的重组表达载体转化乳酸菌宿主细胞NZ9000中,蜜二糖作为碳源筛选重组子;
7)在适于以分泌表达融合蛋白的条件下培养步骤6)中被转化的乳酸菌宿主细胞;
8)通过分子生物学技术,例如链式聚合酶反应(Polymerase chain reaction,PCR)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白质杂交技术(Western blot,WB),筛选和分析高效表达目的融合蛋白的重组乳酸菌表达菌株。
根据本发明的方法,其中所述适于分泌表达融合蛋白的条件是指在含有0.5%蜜二糖的乳酸菌培养基(3.725%M17肉汤,0.5%蜜二糖)中,37℃厌氧静置培养48小时。
毋庸置疑地,本发明所述的表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌可以用于制备食品,所述食品包括可以含有食品级乳酸菌的所有种类的食品,例如,酸奶,诸如纯酸奶、调味酸奶或果肉酸奶等。并且,包含本发明所述的表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的食品还具备预防和治疗人溃疡性结肠炎的功效。因此,本发明提供一种预防和治疗人溃疡性结肠炎的食品,其包含有效量的本发明所述的表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的 重组食品级乳酸菌。本发明还提供本发明所述的表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌用于制备用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的食品的应用。
本发明制备的分泌表达Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌可以在药品以及化妆品制剂方面应用:包括将上述的重组食品级乳酸菌加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂,按照化妆品领域的常规方法制成适于外用的霜剂、乳化剂或者水剂等剂型;也可以将上述的重组食品级乳酸菌加入药品领域技术人员熟知的载体或赋形剂按照食品领域的常规方法制成适于口服的固态或者液态药品。本发明优选药品方面的应用。
本发明的重组食品级乳酸菌可以单独使用或者作为组合物得主要成分用于作治疗和预防人溃疡性结肠炎疾病。其中所述的以药品组合物的形式,是指以片剂、包衣片剂、糖锭剂、硬和软明胶胶囊、溶液、乳剂或混悬剂的形式。
上述药品组合物可以通过用药用惰性的无机或有机载体加工本发明的重组乳酸菌来获得。例如可以将乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等用作这些用于片剂、包衣片剂、糖锭剂、和硬明胶胶囊的载体。软明胶胶囊的适当载体有,例如,植物油,蜡,脂肪,半固体和液体多元醇等。然而,取决于活性物质的性质,在软明胶胶囊的情形中通常不需要载体。生产溶液和糖浆的适当载体有,例如,水,多元醇,甘油,植物油等。栓剂的适当载体有,例如,天然或硬化油,蜡,脂肪,半液体或液体多元醇等。
此外,药品组合物可以含有防腐剂,增溶剂,稳定剂,润湿剂,乳化剂,甜味剂,着色剂,调味剂,改变渗透压的盐,缓冲液,掩蔽剂或抗氧化剂。它们也可以还含有其它的在溃疡性结肠炎治疗上有价值的药用物质,例如肾上腺皮质激素、5-氨基水杨酸等。
因此,本发明提供分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌在制备化妆品或用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物中的应用。本发明还提供一种用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物,其中包含药效学有效量的本发明所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生 长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌。本发明还提供一种化妆品,其中包含有效量的本发明所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
本领域技术人员应该注意,上述“药学有效量”或“有效量”意指治疗有效量,本领域技术人员根据现有技术、经过简单的、有限次的实验即可确定其具体的数值。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1.乳酸菌表达质粒pMG36e图谱;
图2.融合蛋白结构图;
图3.融合蛋白表达电泳检测以及Western Blot检测,1.低分子量蛋白质标准;2.纯化后的融合蛋白;3.含空载体乳酸菌发酵后的上清;4.含重组表达载体的乳酸工程菌发酵后的上清;5.纯化后融合蛋白的Western Blot检测;6.含空载体的乳酸工程菌发酵后上清的Western Blot检测;7.含重组表达载体乳酸工程菌发酵后上清的Western Blot检测;
图4.不同剂量的重组乳酸菌对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织影响的病理切片分析,A为对照组(生理盐水组);B为模型组(5%葡聚糖硫酸钠溶液处理组);C为高剂量乳酸菌组(108个细胞/ml/d);D为中剂量乳酸菌组(107个细胞/ml/d);E为低剂量乳酸菌组(106个细胞/ml/d);F为含空载体的乳酸工程菌组(108个细胞/ml/d);G为阳性对照组(5-氨基水杨酸溶液处理组,0.5g/kg)。
序列表说明:
为了清楚起见,以下对后附序列表中各个序列作简要说明:
SEQ ID NO.1:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp,lactis strain MG1363)Usp45蛋白信号肽的氨基酸序列(参见YP_001033744以及Dieye et al.,2001,J.Bacteriol.,183(14):4157;N端-C端,共26个氨基酸);
SEQ ID NO.2:促蛋白分泌肽的氨基酸序列(参见Loir et al.,2005, Microbial cell factories,4:2.;N端-C端,共9个氨基酸);
SEQ ID NO.3:人酸性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列(参见AAB29057;N端-C端,共154个氨基酸);
SEQ ID NO.4:植物乳杆菌α-半乳糖苷酶的氨基酸序列(参见CAI60220,N端-C端,共738个氨基酸);
SEQ ID NO.5:由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的氨基酸序列(N端-C端,共189个氨基酸);
SEQ ID NO.6:乳酸乳球菌表达质粒pMG36e的核苷酸序列(5’-3’,共3611个碱基);
SEQ ID NO.7:编码乳酸乳球菌Usp45蛋白信号肽的核苷酸序列(参见AM406671以及Dieye et al.,2001,J.Bacteriol.,183(14):4157;5’-3’,共78个碱基);
SEQ ID NO.8:编码促蛋白分泌肽的核苷酸序列(参见Loir et al.,2005,Microbial cell factories,4:2.;5’-3’,共27个碱基);
SEQ ID NO.9:编码人酸性成纤维细胞生长因子的核苷酸序列(参见NM_000800,5’-3’,共465个碱基);
SEQ ID NO.10:含有EcoR I和Nsi I限制性内切酶酶切位点的编码植物乳杆菌α-半乳糖苷酶(Mel A)的核苷酸序列(参见AJ888516,5’-3’,共2235个碱基);
SEQ ID NO.11:编码由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的基因的核苷酸序列(5’-3’,共576个碱基);
SEQ ID NO.12:mel AF(5’-3’,共32个碱基);
SEQ ID NO.13:mel AR(5’-3’,共29个碱基);
SEQ ID NO.14:ULHA-F(5’-3’,共32个碱基);
SEQ ID NO.15:ULHA-R(5’-3’,共30个碱基);
SEQ ID NO.16:经EcoR I和Nsi I双酶切表达质粒pMG36e后得到的载体DNA大片段(5’-3’,共2589个碱基)
SEQ ID NO.17:含Sac I和Sph I限制性内切酶酶切位点的编码由 Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成的融合蛋白的基因的核苷酸序列,ULHA(5’-3’,共594个碱基)
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解,所述实施例只是举例说明的目的,并不意欲限制本发明的范围和精神。
需要说明的是,本领域技术人员应该理解,下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外,均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。
实施例1:植物乳杆菌中编码α-半乳糖苷酶基因的获得
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum(Orla-Jehsen)Holland,ATCC11095,广东省微生物菌种保藏中心,编号:GIM1.191)菌株在GM17平板[成分:3.725%M17肉汤(M17 Broth,购自Biokar Diagnostics,France),0.5%葡萄糖,1.5%琼脂粉]上进行菌种活化,37℃厌氧培养48小时。然后,挑取单克隆转接至GM17液体培养基[成分:3.725%M17肉汤,0.5%葡萄糖],37℃厌氧静置培养直至OD600=0.6,离心收集菌体并利用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0,购自大连宝生物工程有限公司,大连,中国)抽提基因组DNA。以该基因组DNA为模板,加入mel AF(SEQ ID NO.12)和mel AR(SEQ ID NO.13)(均由中国上海生工生物工程技术服务有限公司合成)作为上下游引物,再加入dNTP(各2.5μmol·L-1)10μl,10x PCR pfu缓冲液10μl以及pfu Taq DNA聚合酶1μl(5U/μl),加水至总体积为100μl,按照标准的PCR反应条件(94℃变性4分钟后进入循环,循环参数为94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸180秒,共30个循环)进行目的片段的扩增。电泳检测并回收目的DNA片段(Agarose Gel DNAFragment Recovery Kit Ver.2.0,购自大连宝生物工程有限公司,大连,中国)并命名为Mel A。该片段包含植物乳杆菌的α-半乳糖苷酶基因,两端分别含有EcoR I(GAATTC)和Nsi I(ATGCAT)限制性内切酶酶切位点。
实施例2:重组食品级乳酸菌表达载体pMG36m的构建
将含有pMG36e质粒的野生型乳酸乳球菌MG1363(购自NIZO Co.Ltd.,Catalog:ELS09000-01,Netherlands)在含红霉素抗生素的EGM17固体培养平板(成分:3.725%M17肉汤,0.5%葡萄糖,1.5%琼脂粉,终浓度为10μg/ml的红霉素)上划线培养。37℃厌氧培养36小时后,从平板培养基上挑单菌落接种至含红霉素抗生素的EGM17液体培养基(成分:3.725%M17肉汤,0.5%葡萄糖,终浓度为10μg/ml的红霉素)中,37℃厌氧静置培养至OD600=0.6。离心收集菌体并利用质粒抽提试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,购自大连宝生物工程有限公司,大连,中国)获得质粒pMG36e。按照已有的方法建立标准的限制性内切酶消化体系,然后利用EcoR I(购自New England Biolabs,Inc.,Catalog:R0101L,USA)和Nsi I(购自New England Biolabs,Inc.,Catalog:R0127L,USA)处理pMG36e(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989),回收分子量约2.6kb的大片段(SEQ ID NO.16)。利用相同的限制性内切酶处理并回收实施例1中得到的Mel A,然后与上述约2.6kb的载体大片段相连,构建出重组乳酸菌组成型表达质粒pMG36m。将该重组质粒利用电转方法转化宿主菌NZ9000(购自NIZO Co.Ltd.,Catalog:ELS09000,Netherlands)中,在蜜二糖为碳源的培养平板(成分:2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化钠,0.15%乙酸钠,1.5%琼脂粉和0.5%蜜二糖)筛选重组子。培养增殖后从转化株中抽提重组质粒pMG36m,按本领域工作人员熟知的方法测序确定片段插入的方向以及编码的氨基酸都是正确的(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。抽取测序正确的重组载体质粒备用。
实施例3:重组表达质粒pMG36m-ULHA的构建
将编码由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成融合蛋白的DNA片段(序列为SEQ ID NO.11)送到广州杰特伟生物科技有限公司(Guangzhou Jetway Biotech Co.Ltd.,Guangzhou, China)进行全基因合成。以此DNA片段为模板,ULHA-F(SEQ ID NO.14)和ULHA-R(SEQ ID NO.15)为上下游引物,再加入dNTP(各2.5μmol·L-1)10μl,10x PCR pfu缓冲液10μl以及pfu Taq DNA聚合酶1μl(5U/μl),加水至总体积为100μl,按照标准的PCR反应条件(94℃变性4分钟后进入循环,循环参数为94℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸60秒,共35个循环)进行目的片段的扩增。电泳检测并回收目的DNA片段并命名为ULHA(SEQ ID NO.17),该片段两端分别含有Sac I(GAGCTC)和Sph I(GCATGC)的限制性内切酶酶切位点。建立标准的限制性内切酶消化体系,然后利用Sac I(购自New England Biolabs,Inc.,Catalog:R0156L,USA)和Sph I(购自New England Biolabs,Inc.,Catalog:R0182L,USA)处理ULHA。回收片段后,与利用相同限制性内切酶处理并回收的实施例2中得到的pMG36m相连,构建重组食品级乳酸菌表达质粒pMG36m-ULHA。
实施例4:重组食品级乳酸菌的制备及融合蛋白的表达
将乳酸乳球菌NZ9000在GM17固体培养平板(成分:3.725%M17肉汤,0.5%葡萄糖,1.5%琼脂粉)上划线培养。37℃厌氧培养36小时后,从平板培养基上挑单菌落接种至GSGM17B(成分:3.725%M17,0.5%葡萄糖,17%蔗糖,2%甘氨酸)液体培养基中,37℃厌氧静置培养至OD600=0.3。4℃,6000rpm离心20分钟,弃上清。然后用预冷的GSGM17B洗涤2次后置于冰上,制备成乳酸菌感受态细胞。取出5μg重组乳酸菌表达质粒pMG36m-ULHA,加入到上述准备好的乳酸菌感受态细胞中。在电压为2000V,脉冲时间为4ms的条件下进行电转化。电转后,取100~200μl菌液涂布于筛选培养平板(成分:2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化钠,0.15%乙酸钠,1.5%琼脂粉和0.5%蜜二糖)上,37℃、厌氧静置培养2天。利用PCR技术鉴定阳性重组子。挑取阳性重组子并接种到分泌表达培养基中(3.725%M17肉汤,0.5%蜜二糖),37℃、厌氧静置培养2天。发酵结束后,18000rpm离心30分钟收集发酵上清,并弃去菌体。将上清利用低温干燥、超滤或者冻干等方法浓缩后,15%SDS-PAGE以及Western-blot检测和分析融合蛋白的表达(具体操作参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。通过薄层凝胶扫描以及灰度分析结果表明,重组融合蛋白在乳酸菌中得到分泌表达(蛋白结构如图2),其分子量约为23kDa,表达量约为50mg/L。此外,融合蛋白可以与人酸性成纤维细胞生长因子单克隆抗体产生阳性反应(图3)。
实施例5:分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组食品级乳酸菌在治疗小鼠溃疡性结肠炎方面的应用
在5ml的表达培养基(3.725%M17肉汤,0.5%蜜二糖)接种上述能表达重组融合蛋白的乳酸工程菌,然后,37℃、厌氧静置培养2天。将所有的培养液全部接入到50ml新鲜表达培养基中,37℃、厌氧静置培养2天。取200μl菌液接种到固体培养基(3.725%M17肉汤,0.5%蜜二糖,1.5%琼脂粉)中进行菌落计数,其余部分通过5℃,12000rpm离心30分钟后,收集菌体并利用常规的方法冻干,置于5℃保存[周华伟等,2005,生命科学研究,9(2):72.]。通过平板计数的方式得到原来菌液中乳酸菌的含量后,用生理盐水稀释冻干的乳酸菌,分别调整为5x106、5x107以及5x108个细胞/ml的不同剂量。
从广东省实验动物中心购买SPF级昆明种雄性小鼠(8周龄,体重约20±2g/只),适应性喂饲3天后,用5%葡聚糖硫酸钠水溶液(v/w)作为唯一水源供小鼠日常饮用,连续饮用7天,建立溃疡性结肠炎小鼠模型。建模后,每天通过灌胃方式分别服用不同剂量的重组乳酸菌制剂(分别含重组乳酸菌低剂量106个细胞/ml/d,中剂量107个细胞/ml/d,高剂量108个细胞/ml/d,每天1次,每次0.2ml)、5-氨基水杨酸溶液(50mg/ml,服用量0.5g/Kg,每天1次,每次0.2ml)、以及含空载体的乳酸工程菌溶液(5x108个细胞/ml/d,每天1次,每次0.2ml),连续饲养2周。
实验结束后,采集各组动物的整个结直肠进行分析。切片结果显示,正常组的小鼠结肠组织紧实、致密(图4A);模型组的上皮细胞排列松散,黏膜组织不完整(图4B);5-氨基水杨酸治疗组黏膜组织有所恢复,中性粒细胞浸润现象减轻(图4G);用分泌表达人酸性成纤维细胞生长因子乳酸菌处理的各组结直肠溃疡的现象都有所改善,且呈剂量依赖性。在乳酸 菌高剂量治疗组中,结直肠细胞恢复紧密排列,粘膜组织较完整,只有小量中性粒细胞浸润现象(图4C);中剂量处理组则显示肠组织上皮细胞排列较松散,有明显的粒细胞浸润现象、炎症细胞增多(图4D);而低剂量处理组、含空载体的乳酸工程菌处理组与模型组的病理结果之间没有显著差别(图4B、E、F),但前两者处理组的动物在体重以及结直肠长度方面都显著优于模型组。
实施例6:草莓酸牛奶的制备工艺及其食用方法
首先制备复原乳溶液:称取10g脱脂奶粉(市售)并置于1L三角瓶中,加入190mL蒸馏水溶解后,95℃处理15min,然后冷却至4℃保存。将本发明中能高效表达重组融合蛋白的食品级乳酸工程菌单克隆接种到5ml复原乳溶液中,37℃厌氧培养24hr后,按5%(v/v)的比例添加到新鲜复原乳溶液中备用。
其次制备草莓果肉泥:根据已有文献资料[马云杰,1999,冷饮与速冻食品工业,5(1):4],将草莓(市售)称重后,用沸水处理2-3分钟,置于4℃骤冷降温。然后按果肉的质量加入0.5%的柠檬酸(w/w)和0.25%的维生素C(w/w),室温下8000rpm匀浆搅拌2分钟成草莓果肉泥。
取10g草莓果肉泥与90ml上述含重组乳酸工程菌的复原乳混合均质,再加入2%的白砂糖(w/v)、0.1%明胶(w/v)和0.1%的羧甲基纤维素钠(w/v)混匀,95℃水浴条件下杀菌5分钟后,接种到小烧杯中,覆盖保鲜膜,37℃发酵8h,然后置于4℃冰箱10小时以上即为成品。按照本领域技术人员熟知的方法检测可知,这种酸奶每100ml中含有活乳酸工程菌达到1x1010个以上,且能在4℃条件下稳定储存1周[陈廷续,2011,农业技术与装备,208:36]。
食用方法:餐后0.5-2小时内服用100ml,每2-3天服用1次。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
等同实施方案:本发明可以体现为其他具体的但不偏离其精神或基本特征的形式,因此认为前述实施方案是在所有方面说明而不是限制本文所描述的发明。因此,本发明的范围包括在权利说明书等同目的和范围内的所有修改和组合。
Claims (10)
1.一种表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌,其通过下述方法制备:构建一种以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组表达载体,并转化到乳酸菌宿主细胞中。
2.根据权利要求1所述的重组食品级乳酸菌,其中所述融合蛋白由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成,其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,所用的重组表达载体衍生于pMG36e。
3.根据权利要求1所述的重组食品级乳酸菌,其中所述的乳酸菌宿主细胞选自:乳球菌,例如,乳球菌MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800,粪肠球菌,例如,粪肠球菌OGIX、FA2-2,或植物乳杆菌,优选乳酸乳球菌NZ9000。
4.一种制备分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法,该方法包括以下步骤:
1)构建以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的重组表达载体;
2)将1)中构建的重组表达载体电转化至乳酸菌宿主细胞中,并且用含蜜二糖的乳酸菌培养基筛选转化成功的重组乳酸菌。
5.根据权利要求4所述的方法,其还包括下述步骤:
3)在适于分泌表达融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌;和
4)通过3)的重组乳酸菌分泌表达出所述含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白。
6.根据权利要求4所述的方法,其中所述融合蛋白由Usp45蛋白信号肽、促分泌蛋白肽以及人酸性成纤维细胞生长因子组成,其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,其中步骤1)中所用的重组表达载体衍生于pMG36e。
7.根据权利要求4所述的方法,其中所述的乳酸菌宿主细胞选自:乳球菌,例如,乳球菌MG1363、LM0230、MG1614、NZ9000、NZ9700、NZ9800,粪肠球菌,例如,粪肠球菌OGIX、FA2-2,或植物乳杆菌,优选乳酸乳球菌NZ9000。
8.权利要求1-3中任一项的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌在制备化妆品或用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物或食品中的应用。
9.一种用于预防和治疗人溃疡性结肠炎的药物或食品,其中包含有效量的权利要求1-3中任一项所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
10.一种化妆品,其中包含有效量的权利要求1-3中任一项所述的分泌表达含人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120125 |