RU2668828C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2668828C1 RU2668828C1 RU2017132061A RU2017132061A RU2668828C1 RU 2668828 C1 RU2668828 C1 RU 2668828C1 RU 2017132061 A RU2017132061 A RU 2017132061A RU 2017132061 A RU2017132061 A RU 2017132061A RU 2668828 C1 RU2668828 C1 RU 2668828C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- growth factor
- polypeptide
- human
- human platelet
- ppdgfb
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title abstract description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 7
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000614261 Citrus hongheensis Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150117945 PDGFB gene Proteins 0.000 description 2
- 102100040990 Platelet-derived growth factor subunit B Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229940116157 regranex Drugs 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108700021652 sis Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150057744 PDGFA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010019674 Proto-Oncogene Proteins c-sis Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- HYNPZTKLUNHGPM-KKERQHFVSA-N becaplermin Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](Cc2cnc[nH]2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]5CCCN5C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]6CCCN6C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@@H]7CCCN7C(=O)[C@H](Cc8c[nH]c9c8cccc9)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)N HYNPZTKLUNHGPM-KKERQHFVSA-N 0.000 description 1
- 229960004787 becaplermin Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано в медицинских исследованиях для получения фактора роста тромбоцитов ВВ человека. Представлена рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая синтез полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, которая обеспечивает биосинтез с уровнем порядка 40÷60 мг рекомбинантного белка/л культуры. Высокоэффективный синтез целевого полипептида обеспечивается тем, что целевой ген находится под контролем сильного индуцибельного промотора АОХ1. Представленный штамм Pichia pastoris GS115PDGFB обеспечивает синтез полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека в количестве не менее 40 мг целевого белка на литр культуры. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано в медицинских исследованиях для получения фактора роста тромбоцитов ВВ человека.
Фактор роста тромбоцитов (ФРТ) является основным фактором, способствующим делению и росту клеток фибробластов и гладкой мускулатуры. Несмотря на то, что на сегодняшний день не имеется четкого представления о молекулярных механизмах действия данного регуляторного белка, известно, что ФРТ ведет к повышению уровня биосинтеза специфических белков и обладает митогенным эффектом. Кроме того, при механическом повреждении клеток сосудистого эндотелия, они способны выделять в окружающую среду ФРТ, что приводит к закрытию повреждения в сосудистой стенке и остановке кровотечения. Фактор роста тромбоцитов, даже в концентрации 1÷2 нг/мл, индуцирует направленное перемещение клеток иммунной системы, таких как лейкоциты, гранулоциты, макрофаги, способствуя возникновению защитного иммунного ответа. ФРТ ответственен за активацию клеток соединительной ткани, ответственных за образование рубца и синтез коллагенов. По последним данным установлено, что ФРТ косвенно влияет на образование капилляров и клеток сосудов.
Фактор роста тромбоцитов PDGF-BB является уникальным регуляторным белком, проявляющим высокую биологическую активность в отношении регенерации клеток. Именно по этой причине, к нему проявляется интерес на биофармацевтическом рынке. На сегодняшний день существует единственный препарат рекомбинантного фактора роста тромбоцитов, выпускающегося под торговой маркой «Regranex». Основным показанием к применению данного препарата являются трофические язвы и поражения кожных покровов, возникающие в результате осложнений сахарного диабета. Поэтому существует острая потребность в разработке более эффективной, отечественной технологии получения фактора роста тромбоцитов при помощи методов молекулярного клонирования и гетерологичных систем экспрессии генов.
Использование бактериальной системы экспрессии Е. coli позволяет получить высокие количества фактора роста, однако, сложная пространственная структура белка, с образованием активной димерной формы через экстрамолекулярную дисульфидную связь является причиной агрегации гетерологичного белка и накопления преимущественно в тельцах включения; длительность, трудоемкость и дороговизна методов - характерная черта экспрессии при использовании клеточных линий млекопитающих. Клетки дрожжей, в частности P. pastoris, сочетают в себе преимущества данных систем. Эти низшие эукариоты обладают развитой системой ЭПР для осуществления разнообразных посттрансляционных модификаций протеинов, а также просты и удобны в культивировании. Следует отметить тот факт, что биосинтез рекомбинантного фермента осуществляется в виде зрелого белка, который секретируется в культуральную жидкость.
Аналогом-прототипом получаемого рекомбинантного белка является бекаплермин, являющийся активным компонентом препарата «Regranex». В данном случае, фактор роста тромбоцитов ВВ получают при помощи дрожжевой системы экспрессии на основе S. cerevisiae [патенты US 4766073, опубл. 23.08.1988, C12N 15/67, A61K 38/00, C12N 15/78, A61K 35/16 и US 4845075, опубл. 04.08.1989, A61K 38/00, C07K 14/49, C12N 15/81, A61K 35/16, C12N 15/62, C07K 14/15, C12N 15/18]. На наш взгляд, по системе экспрессии на основе клеток метилотрофных дрожжей P. pastoris, которые способны к производству большего количества белков, по получению фактора роста тромбоцитов в клетках P. pastoris на сегодняшний день имеется 3 работы. В первой был получен фактор роста тромбоцитов А, который не имеет высокой терапевтической актуальности [Н. Li, et al. High level expression, efficient purification and bioactivity assay of recombinant human platelet-derived growth factor AA dimer (PDGF-AA) from methylotrophic yeast Pichia pastoris, 2013]. В данной работе была получена рекомбинантная плазмидная ДНК содержала ген искусственного предшественника PDGF-AA человека, который состоит из последовательности, кодирующей сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces сеге-visiae, кДНК гена PDGFA, под контролем индуцибельного промотора АОХ1. Продуцент был получен путем электропорации экспрессионного вектора в штамм GS115 и при последующей «зеоциновой» селекции. Биосинтез рекомбинантного белка осуществляли при культивировании клеток на среде BMMY, содержащей 1% (v/v) метанола. Культивирование проводили в течение 120 часов, целевой продукт секретируется в культуральную жидкость. Анализ уровня экспрессии белка проводили при помощи ПААГ-электрофо-реза в неденатурирующих условиях.
Второй работой является патент «Штамм дрожжей Pichia pastoris 2-2-продуцент тромбоцитоврного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитоврного фактора роста человека» [RU 2290434, опубл. 27.12.2006, С12Р 21/02, C12N 15/12, C12N 1/19]. Однако в данном патенте описан способ получения ФРТ с дополнительной синтетической последовательностью, способствующей димеризации, и последовательностью, содержащей 6 остатков гистидина. Следовательно, данный белок не является биоаналогом ФРТ. К тому же при конструировании экспрессионного вектора используется промотор глицеральдегид-3-фосфат гидрогеназы, который является недостаточно сильным.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [М. Dai et al, Identification and Functional Characterization of Glycosylation of Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor-BB in Pichia pastoris, 2015]. В данной работе была получена рекомбинантная плазмидная ДНК содержала ген искусственного предшественника PDGF-BB человека, который состоит из последовательности, кодирующей сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae, кДНК гена PDGFB, под контролем индуцибельного промотора АОХ1. Продуцент был получен путем электропорации экспрессионного вектора в штамм GS115 и при последующей «зеоциновой» селекции. Биосинтез рекомбинантного белка осуществляли при культивировании клеток на среде BMMY, содержащей 0,5% (v/v) метанола. Культивирование проводили в течение 72 часов, целевой продукт секретируется в культуральную жидкость. Анализ уровня экспрессии белка проводили при помощи ПААГ-электрофореза в неденатурирующих условиях. Недостатком способа-прототипа является относительно низкий уровень синтеза и секреции рекомбинантного ФРТ, а также клонирование и экспрессия неоптимизированной нуклеотидной последовательности, что может также существенно негативно повлиять на выход целевого продукта.
Изобретение решает задачу получения полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов ВВ человека путем биосинтеза, а также увеличение выхода секретированного целевого белка в культуральной жидкости.
В настоящем изобретении была поставлена задача получения плазмиды с геном фактора роста тромбоцитов В человека, а также штамма-продуцента фактора роста тромбоцитов ВВ.
Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pPDGFB, кодирующей синтез полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, обеспечивающей биосинтез с уровнем порядка 40÷60 мг рекомбинантного белка/л культуры. Высокоэффективный синтез целевого полипептида обеспечивается тем, что целевой ген находится под контролем сильного индуцибельного промотора АОХ1.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ, характеризуется следующими признаками:
имеет молекулярную массу 6,52 MDa (8,778 т.п.о.);
кодирует аминокислотную последовательность гена фактора роста тромбоцитов-В человека;
состоит из XhoI lEcoRI - фрагмента ДНК плазмиды pPIC9K длиной 9,246 т.п.о., содержащего ген Kan, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pPDGFB клеток к генетицину, ген AmpR β-лактамазы, определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pPDGFB клеток к ампициллину, АОХ1-промотор P. pastoris, ген гистидинол дегидрогеназы His4; а также из XhoI /EcoRI фрагмента длиной 342. п.о., включающей и синтетический ген фактора роста тромбоцитов-ВВ человека. Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: AleI - 8096, Nco I - 2380, PmeI - 8434, XhoI - 438, EcoRI - 780.
Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что нуклеотидная последовательность фактора роста тромбоцитов-В человека сконструирована с учетом частоты встречаемости кодонов P. pastoris с оптимальным процентным соотношением GC-пар и содержит на N-конце prepro сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae.
Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой и свойствами фактора роста тромбоцитов-В человека трансформируют клетки Pichia pastoris штамма GS115 (his4, mut+) рекомбинантной плазмидой pPDGFB. Полученный штамм GS115PDGFB характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки крупные округлой формы, почкующиеся, 1×4-7 мкм, подвижные.
Культуральные признаки. При росте на плотной среде YPD колонии круглые, гладкие, блестящие, кремовые, край ровный, диаметр колоний 3-6 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде YPD характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.
Физико-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-30°С при оптимуме рН 4,0-6,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в виде смеси, так и органические соединения в виде пептона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют глицерин, глюкоза, метанол. В отличие от исходного штамма не является ауксотрофом по гистидину.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы, а также к генетицину (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена Kan.
Штамм Pichia pastoris GS115PDGFB обеспечивает синтез полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека в количестве не менее 40 мг целевого белка на литр культуры. Совокупность перечисленных свойств штамма обусловливает большую технологичность процесса получения рекомбинантного фермента.
На фиг. 1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды pPDGFB, где указаны уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, AmpR - ген β-лактамазы, KanR - ген фермента, обуславливающего устойчивость к генетицину, PDGFB- синтетический ген фактора роста тромбоцитов-В человека, aMF - prepro сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae, регуляторные последовательности отмечены как 5'АОХ1 и 3'АОХ - фрагменты промотора P. pastoris, HIS4 - регуляторная последовательность и кДНК гистидинолдегидрогеназы; на фиг. 2 - нуклеотидная последовательность синтетического гена искусственного предшественника фактора роста тромбоцитов-В человека. Жирной линией подчеркнут сайт рестриктазы EcoRI, терминирующий кодон выделен жирным шрифтом; на фиг. 3 - аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого рекомбинантной плазмидой pPDGFB.; на фиг. 4 - результаты денатурирующего ПААГ-гель электрофореза образцов культуральной жидкости трансформантов при определении уровня экспрессии и штамма-продуцента. Слева расположен маркер молекулярных весов (10; 18,4; 25; 35; 62; 90 КДа), далее трансформанты (номер подписан снизу).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [Sambrook, J., Fritsch, E,F„ and Maniatis, T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology, 1997, John Wiley and Sons, New York; Cregg J.M, Higgins D.R. Production of foreign proteins in the yeast Pichia pastoris, 1995, Canadian J. Botany Supp. 73, 5981-5987].
Пример 1. Создание экспрессионного вектора рСРВН В качестве исходного материала служил вектор pPIC9K (Invitrogen, США). С целью накопления плазмиды, проводили трансформацию компетентных клеткок штамма Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB laclqZ M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Исходя из известной нуклеотидной последовательности плазмиды и гена фермента, были с конструированы олигонуклеотидные последовательности для наработки искусственного гена со свойствами фактора роста тромбоцитов-В человека с необходимыми концевыми сайтами рестрикции. ПЦР-амплификацию проводили в два этапа. В реакцию вносили эквимолярную смесь (5 мкМ каждого) олигонуклеотидных праймеров (всех, кроме крайних), составляющих ген, взаимно перекрывающихся между собой на 15-20 нуклеотидов, 0.2 мкМ раствора dNTP, 1/10 часть реакционного 10х буфера и 1 и термостабильной ДНК-полимеразы PƒuI. Температуру отжига праймеров рассчитывали по стандартной формуле: Tm(°C)=2⋅[NA+NT]+4⋅[NC+NG]-10,
где Nx - количество соответствующих оснований. Реакцию проводили по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°С, 5 минут; затем 10 циклов: денатурация ДНК при 95°С, 1 минута; отжиг праймеров при 55°С, 1 минута; синтез ДНК при 74°С, 2,5 минуты. Вторую амплификацию проводили, используя в качестве матрицы, раствор первой реакции и крайние праймеры, обеспечивающие синтез гена с необходимыми сайтами рестриктаз, по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°С, 5 минут; затем 30 циклов: денатурация ДНК при 95°С, 1 минута; отжиг праймеров при 55°С, 1 минута; синтез ДНК при 74°С, 2,5 минуты.
Смесь для ПЦР (50 мкл):
5 мкл 10-кратного буфера для РƒuI-полимеразы («Евроген»);
5 мкл реакции 1;
0,5 мкл 100 мкМ праймера PDGF_f;
0,5 мкл 100 мкМ праймера PDGF_r;
1 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Fermentas»);
43 мкл деионизованной воды;
0,5 мкл PƒuI ДНК-полимеразы («Fermentas»).
После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и выявляли гомогенный фрагмент размером около 1230 пн. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора GelElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя.
200 нг исходной плазмиды и 100 нг фрагмента (гена proPDGF) гидро-лизовали 20 единицами рестриктаз XhoI (New England Biolabs, США) и EcoRI (New England Biolabs, США). Выделенный из агарозного геля XhoI/EcoRI фрагмент клонировали в XhoI/EcoRI вектор pPIC9K - лигировали с помощью Т4 ДНК лигазы (на 20 нг вектора 1,5 нг фрагмента). Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue, затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Полученные образцы ДНК анализировали совместным гидролизом рестриктазами EcoRI/XhoI, NotI/NcoI, и отбирали «положительные» клоны, содержащие EcoRI/XhoI фрагменты размером 372 и 8406 п.н., AleI/NcoI фрагменты размером 2397 и 6381 п.н, а плазмиды анализировали на наличие мутаций методом секвенирования ДНК (ЦКП центра «Биоинженерия» РАН). В конечном счете, отбирают экспрессионный вектор, который обозначали как pPDGFB.
Пример 2. Создание экспрессионных кассет и отбор трансформантов для синтеза GPCR в клетках метилотрофных дрожжей Pichia Pastoris.
Необходимым условием стабильной экспрессии генов является создание экспрессионной кассеты. Для этого необходимо линеаризовать векторную молекулу по 5'-участку алкогольоксидазного промотора. После электропорации, в результате гомологичной рекомбинации идентичных участков промотора генома дрожжей и линеаризованного вектора, происходит включением интересующего гена в геном Pichia pastoris.
Для электропорации получали 5 мкл раствора ДНК (pPDGFB), предварительно линеаризованной путем гидролитического расщепления рестриктазой PmeI (Fermentas, Литва), с рабочей концентрацией не менее 2 мкг/мкл. 20 мкг плазмиды гидролизовали 100 единицами рестриктазы PmeI в течение 3 часов. К 1 объему реакционной смеси добавляли равный объем фенол-хлороформа (1:1). Перемешивали 30 сек на вортексе. Центрифугировали в течение 3 мин. Отбирали водную фазу и переносили в новую пробирку. Добавляли в пробирку с фенолхлороформом 100 мкл ТЕ-буфера, затем перемешивали 30 сек на вортексе и центрифугируют в течение 3 мин. Отбирали водную фазу при помощи пипетки и объединяли с той частью раствора, которая была отобрана ранее. Добавляли к раствору ДНК 1/10 объема 3М раствора ацетата Na, рН 6.0 и 3 объема этанола. Перемешивают, переворачивая пробирку несколько раз, и оставляют на 10 минут. Затем центрифугировали в течение 15 мин. Супернатант сливали, пробирку с осадком ДНК центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант тщательно удаляли и добавляли 1 мл 70%-го этанола. Центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант сливали. Снова повторяли центрифугирование в течение 2 мин и отбирали оставшуюся жидкость. Осадок высушивали в течение 5 мин и растворяют в 5 мкл ТЕ-буфера.
Культуру дрожжей штамма GS115 (his 4, mut+) растили на среде YPD в колбах Эйрленмейера на 500 мл до оптической плотности 1-2 единицы. Центрифугируют при 3000 х g в течение 5 минут.Биомассу суспендировали в 1 мМ DTT и 0,1 М HEPES, инкубировали на шейкере, в течение 30 минут. Затем культуру снова центрифугировали. Биомассу промывли холодной деи-онизированной водой 2 раза и суспендируют в 1 мл 1М сорбитола. Полученные клетки разливали по эппендорфам (по 40 мкл в каждый) и хранили при -70°С. Электропорацию проводили на электропораторе 2510 (Eppendorf, Германия) в специальных кюветах с зазором 2 мм. Рабочие характеристики -напряжение: 1500 В; емкость: 25 мкФ; сопротивление: 600 Ом. После электропорации быстро добавляли 1 мл холодного раствора 1М сорбитола и ставили в термостат на 1 час при температуре 30°С.
Для отбора трансформантов проводили на минимальной среде, не содержащей гистидин. После электропорации культуру клеток рассевали на чашки с плотной питательной средой MD agar. Полученные трансформанты переносили на плотный питательный агар YPD, содержащей генетицин в концентрациях 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,5 мг/мл. Полученные клоны проверяли с помощью ПЦР-скрининга. Готовили ПЦР-смесь объемом 20 мкл по следующей схеме:
2 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы («Евроген»);
0,15 мкл 120 мкМ праймера AOX1_f;
0,15 мкл 150 мкМ праймера YCl_r;
0,4 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Fermentas»);
17 мкл деионизованной воды;
0,2 мкл Taq ДНК-полимеразы («Евроген»).
В каждую пробирку добавляли клетки трансформантов с плотной среды. Тщательно суспендировали и амплифицировали по следующей схеме: 95°, 5' (денатурация), 95°, 30”; 45°, 30”; 74°, 1’30” (амплификация).
«Положительные» клоны отбирали для определения уровня экспрессии рекомбинантного белка.
Пример 3. Культивирование трансформантов и определение уровня экспрессии гена PDGFB.
Трансформанты с чашек переносили на среду YPD (10 мл) и растили при 30°С до оптической плотности 2-4 единицы. Затем культурой клеток инокулировали среду BMGY (25 мл) (разведение в 100 раз) и инкубировали в течение 48 часов при 30°С в колбах объемом 250 мл. Полученную биомассу собирали центрифугированием при 2000×g в течение 5 минут и переносили в среду BMMY (10 мл), содержащей 1% (v/v) метанола. Выращивание проводили в колбах на 100 мл в течение 72 часов, добавляя каждые 24 часа в среду 1% (v/v) метанола. После выращивания культуральную жидкость отделяли от биомассы центрифугированием при 3000×g в течение 5 минут при 4°С. Полученные образцы смешивали с 1/6 объема «Sample Loading Buffer 6×» и анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-электрофореза в стандартном режиме. Клон с максимальным уровнем экспрессии обозначили как GS115PDGFBB.
Claims (2)
1. Рекомбинантная плазмида pPDGFB, характеризующаяся конструктивным выполнением, представленным на фиг. 1, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 2, кодирущая полную аминокислотную последовательность полипептида фактора роста тромбоцитов ВВ человека, обеспечивающая стабильную рекомбинацию экспрессионных кассет в геноме Pichia pastoris, а также высокий уровень экспрессии целевого белка в культуральной жидкости.
2. Рекомбинантный штамм Pichia pastoris: GS115PDGFBB - продуцент фактора роста тромбоцитов ВВ человека, полученный путем трансформации клеток штамма Pichia pastoris GS115(his4, mut+) рекомбинантной плазмидой pPDGFB по п. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132061A RU2668828C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017132061A RU2668828C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2668828C1 true RU2668828C1 (ru) | 2018-10-02 |
Family
ID=63798482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017132061A RU2668828C1 (ru) | 2017-09-12 | 2017-09-12 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2668828C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2290434C1 (ru) * | 2005-06-02 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" | Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека |
-
2017
- 2017-09-12 RU RU2017132061A patent/RU2668828C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2290434C1 (ru) * | 2005-06-02 | 2006-12-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" | Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| M. DAI et al. Identification and Functional Characterization of Glycosylation of Recombinant Human Platelet-Derived Growth Factor-BB in Pichia pastoris, PLoS One. 2015; 10(12): e0145419, Published online 2015 Dec 23. doi: 10.1371/journal.pone.0145419. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2621344C (en) | Cleavage of precursors of insulins by a variant of trypsin | |
| US5324639A (en) | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells | |
| ES2401856T3 (es) | Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica | |
| US6410264B1 (en) | Pichia pastoris gene sequences and methods for their use | |
| RU2409670C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах pichia pastoris гена фитазы (варианты), штамм дрожжей pichia pastoris - продуцент фитазы (варианты) | |
| CN117025559A (zh) | 重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
| EP0950098B1 (en) | Stable expression of triple helical proteins | |
| JP5438259B2 (ja) | カンジダ・アンタークティカ由来リパーゼｂを細胞表層に提示する酵母 | |
| RU2668828C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pPDGFB, кодирующая полипептид со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами фактора роста тромбоцитов-ВВ человека | |
| CN117946251A (zh) | 一种重组人源iii型胶原蛋白制备方法及其应用 | |
| CN109929820B (zh) | 新型的甘油单-二酰酯脂肪酶 | |
| RU2658758C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена химерного белка ангиогенина человека и штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент рекомбинантного химерного белка ангиогенина человека | |
| EP2207795B1 (en) | Process for producing mature recombinant mite group i allergen | |
| RU2804544C2 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pFGF2, кодирующая полипептид со свойствами основного фактора роста фибробластов человека, и рекомбинантный штамм метилотрофных дрожжей Pichia pastoris - продуцент полипептида со свойствами основного фактора роста фибробластов человека | |
| US7223578B2 (en) | Canine COX-1 nucleic acid molecules and fragments thereof | |
| RU2531524C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCPBH ДЛЯ БИОСИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Б ЧЕЛОВЕКА, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Б ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2290434C1 (ru) | Штамм дрожжей pichia pastoris 2-2 - продуцент тромбоцитарного фактора роста человека (pdgf-bb) и способ получения тромбоцитарного фактора роста человека | |
| CN109384849B (zh) | 一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| RU2779307C2 (ru) | Способ микробиологического синтеза прохимозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта препрохимозина с модифицированной сигнальной последовательностью секреции | |
| CN101280018A (zh) | 突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备 | |
| WO2011115070A1 (ja) | グリシン繰り返し配列タンパク質を産生する形質転換体 | |
| CN113025595A (zh) | 耐酸脂肪酶 | |
| RU2766448C2 (ru) | Получение гена фосфолипазы А2 с измененным оптимумом рН путем удаления сайтов гликозилирования | |
| WO2017219455A1 (zh) | 编码截短型人角质细胞生长因子的基因及其制备方法 | |
| Ding et al. | Expression of monomeric insulin precursor in Pichia pastoris and its conversion into monomeric B27 Lys destripeptide insulin by tryptic hydrolysis |