CN106222175A - 斑点叉尾鮰leap‑2成熟肽的优化基因及其重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了斑点叉尾鮰LEAP‑2成熟肽的优化基因，其重组蛋白的制备方法。本发明还提供了包含该优化基因的重组表达载体和酵母宿主细胞，该优化基因在生产斑点叉尾鮰LEAP‑2成熟肽中的应用，和该重组蛋白在制备抗菌药物中的应用。本发明在不改变斑点叉尾鮰LEAP‑2成熟肽氨基酸序列的前提下，按照毕赤酵母偏爱密码子对斑点叉尾鮰LEAP‑2成熟肽基因的核苷酸序列进行了优化，优化后的序列为SEQ ID NO:2。本发明通过在毕赤酵母宿主细胞中表达该优化基因，制备了重组斑点叉尾鮰LEAP‑2成熟肽。该制备方法可高效地制备LEAP‑2成熟肽，所用培养条件简单，成本较低，得到的LEAP‑2成熟肽抗菌效果好。

Description

斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因及其重组蛋白的制备 方法

技术领域

本发明涉及一种密码子经过优化的基因，尤其涉及按照毕赤酵母偏爱密码子对斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因进行改造后的优化基因，以及其编码的重组蛋白的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

综观国内养殖业，海水和淡水养殖区大多分布于沿海港湾和河口附近水域，这些水域也是沿海陆源污染物和海上排污的主要受纳场所。据统计，我国每年直接入海的废水量高达80亿吨，富含营养物质、病原微生物和有机农药的农业污水也随地表流进沿海水体，致使水体水质恶化。这样的养殖环境污染导致水产养殖生物的抵抗力大大降低，目前针对这种情况采取的主要措施是给水产生物过量服用抗生素，其直接后果就是微生物耐药性增加、水产品质量和安全问题日渐突出,并导致我国水产品出口遭受技术性贸易壁垒。据此，开发无微生物耐药问题、能够替代或部分替代抗生素的绿色饲料添加剂对于水产生物的养殖安全和水产食品安全来讲刻不容缓。

抗菌肽是动物先天免疫系统的重要组成成分，其分子量一般为1.5-10kDa，它们对细菌、真菌、有包膜的病毒乃至癌细胞等均有抑制作用，故又被称为动物的“第二防御体系”，也是水产养殖中饲用抗生素替代品的最佳候选者。LEAP-2(Liver expressedantimicrobial peptide-2)抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽，其抑菌活性主要来自于其成熟肽区域，最初是从人血液超滤产物中得到。鱼类中的LEAP-2基因首次发现于虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，目前，多种鱼类的LEAP-2基因已经被相继分离和克隆，包括斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)等。但迄今为止，关于LEAP-2基因外源表达方面的研究报道较少，已有的报道大多数也是基于大肠杆菌原核表达系统的重组DNA表达，例如斑点叉尾鮰(高北，陶妍.斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达[J].生物技术通报，2014，(2)：130-135.)、大黄鱼(蔡灿，薛良义，孙爱飞.大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达[J].生物学杂志，2012，29(4)：55-59.)和人类(刘晓萌，周琳，陈龙.肝脏表达的抗菌肽-2[J].生命的化学，2008，28(6)：723-726.)LEAP-2基因在大肠杆菌中的表达，但由于大肠杆菌原核表达系统存在表达量低、无翻译后折叠修饰功能、易在细胞内形成包涵体等众所周知的缺点，很难获得具有良好生物学活性的重组蛋白。迄今为止，LEAP-2基因在毕赤酵母中表达的文献仅仅局限于小鼠LEAP-2(王红亮.小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达[J].新乡学院学报(自然科学版),2011，28(4)：333-335.)，和斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2(中国专利CN103755795A，发明名称“斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用”)。但前者小鼠LEAP-2在毕赤酵母中表达使用的基因为天然的cDNA，并未对基因进行优化，重组蛋白没有进行纯化、鉴定以及活性的检测，而作者也未给出原因。后者斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2在毕赤酵母中表达存在以下几点不足：一是其采用的是理论上不具备直接生物学活性的前体肽基因进行重组表达，所获得的目的蛋白的活性在理论上会受到影响；二是其使用的基因为天然cDNA，没有根据毕赤酵母的密码子偏爱性进行优化，没有对表达的目的蛋白进行纯化，导致其表达量未知；三是其在构建真核表达载体的时候，使用的是EcoRI与XbaI酶切位点，导致其所得到的重组蛋白会在N端携带有额外的两个氨基酸残基(YV)，它们对其活性产生怎样的影响是未知的，所以存在降低产物活性的可能；四是其产物仅仅通过SDS-PAGE和Western-blot分析进行鉴定，并未提供质谱检测的数据(一般确证目的蛋白是否正确表达，需要通过质谱检测分析后，通过捕获目的蛋白的片段与目的蛋白的理论氨基酸序列进行对比，从而确定产物是否为重组目的蛋白)，因此不能完全确定其产物是重组目的蛋白。对于其他来源的抗菌肽，虽然有文献报道了其具体的表达量，但是表达也不理想。例如蔡晶晶等(蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚。黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达，厦门大学学报，2009，48(5)：738-743)在毕赤酵母中表达黑鲷抗菌肽hepcidin，其表达量在120h达到最高为1.1mg/L。Jin等(Feng-liang Jin,Xiao-xia Xu,Xiao-qiang Yu,Shun-xiang Ren.Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinADin the methylotrophic yeast Pichia pastoris.Process Biochemistry 2009；44:11-16)利用密码子优化后的基因在毕赤酵母中表达家蝇和天蚕抗菌肽，他们从100ml培养液中得到1.8mg纯肽(即表达量约18mg/L)。Vasiliki Koliaraki等人(Vasiliki Koliaraki,Martha Marinou,Martina Samiotaki,George Panayotou,Kostas Pantopoulos,AvgiMamalaki.Iron regulatory and bactericidal properties of human recombinanthepcidin expressed in Pichia pastoris.Biochimie 2008；90:726-735)在毕赤酵母中表达得到人hepcidin，其在培养液中的表达量为5-7mg/L。

目前，很多文献报道了蛋白质的异源表达，特别是利用毕赤酵母异源表达目的蛋白质，具有高细胞密度发酵，蛋白质可分泌到胞外且杂蛋白少，遗传和表达稳定性好等诸多优点(Macauley-Patrick S,Fazenda M,McNeil B,et al.,Heterologous proteinproduction using the Pichiapastoris expression system,Yeast,2005,22:249-270)。但毕赤酵母作为一种异源蛋白质表达宿主，对于外源基因的表达具有相当的局限性，提高外源基因在毕赤酵母中的表达量通常有密码子优化、mRNA二级结构改造、GC含量调整等策略。密码子优化是一种重要的高效重组表达手段，它是根据宿主的密码子偏爱性优化异源基因的密码子以提高重组蛋白表达效率，这在一些原核生物和真核生物中均有报道。研究结果认为密码子优化提高了翻译效率从而提高了蛋白表达水平，进一步的研究发现密码子优化能够提高异源基因在真菌中的转录活性即mRNA水平。HugoG Menzella(HugoGMenzella.Comparision of two codon optimization strategies to enhancerecombinant protein production in Escherichia coli.Menzella Microbial CellFactories,2011,10:15)对小牛前凝乳酶(calf prochymosin)基因进行密码子的优化，其采用的随机密码子优化策略获得了5条优化序列。在大肠杆菌中的表达结果表明，经随机密码子策略优化后的序列的表达水平都较原始序列有明显提高，其中一条优化序列更是提高了70％。Jiangke Yang等(Jiangke Yang,Liying Liu.Codon optimization through atwo-step gene synthesis leads to a high-level expression of Aspergillusnigerlip2gene in Pichiapastoris.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2010,63:164-169)将黑曲霉lip2基因进行密码子优化后在毕赤酵母中表达，新的优化序列在酶活和蛋白表达量方面都有明显提高，分别提高了11.6和5.3倍。因此，密码子优化是提高外源基因高效转录和表达的途径之一。

另外，通常在实验室水平上通过毕赤酵母表达系统制备重组蛋白都是采用传统的含酵母膏和蛋白胨的培养基，这是因为考虑到是在摇瓶中表达，其供氧量等培养条件都不如发酵罐有优势，所以更注重营养条件的优化。值得注意的是上述“斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用”的专利中采用的培养基也是含有酵母膏和蛋白胨的实验室用的传统培养基，而这种培养基成本高、发酵液的后期处理较麻烦，一般在生产上用发酵罐发酵时是不用的，因此不具有实际生产应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种经过优化改造的斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因。该基因是根据毕赤酵母的密码子偏爱性对斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因进行了优化改造，以期提高重组蛋白，即斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的表达量。

本发明的第二个目的是提供斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因编码的天然N端重组蛋白，含有该优化基因的重组表达载体，以及含有该优化基因或重组表达载体的酵母宿主细胞。

本发明的第三个目的是提供一种制备斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的方法。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因，其具有核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者，该优化基因具有与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同源性且编码相同功能蛋白。

本发明参考高北等(高北,陶妍.斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP-2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达[J].生物技术通报,2014(2):130-135.)公布的斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的cDNA序列(斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，在不改变其氨基酸序列的前提下，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的ATG、ACA、CCC、CTT、TGG、AGA、ATC、ATG、GGT、ACT、AAA、CCC、CAT、GGG、GCA、TAC、TGT、CAG、AAT、AAC、TAT、GAG、TGT、TCC、ACG、GGA、ATA、TGC、AGG、AAA、GGA、CAC、TGC、TCC、TTT、AGC、CAA、CCT、ATA、ATT、TCC等密码子进行了优化，优化后的对应密码子分别为ATG、ACC、CCT、TTG、TGG、AGA、ATC、ATG、GGT、ACT、AAA、CCA、CAT、GGA、GCT、TAC、TGT、CAA、AAC、AAT、TAT、GAA、TGC、TCC、ACA、GGG、ATA、TGT、CGT、AAG、GGC、CAC、TGT、AGT、TTT、TCT、CAG、CCC、ATT、ATT、TCA，即得到编码LEAP-2成熟肽的优化基因(SEQ IDNO:2)。该优化基因特别适合在毕赤酵母中表达。

本发明另一方面提供了一种重组蛋白，其由所述优化基因编码，具有氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，还提供了一种包含斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因的重组表达载体，以及含有斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因或其重组表达载体的酵母宿主细胞。

本发明的酵母包括能够表达编码斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽优化基因的常用酵母的任一种。选择用于表达斑点叉尾鮰LEAP2抗菌肽的合适酵母是所述领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可以包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳定的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内胞霉目(Endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。上述产子囊酵母分为两科，即蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium属和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科，即掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(Candida)。优选地，本发明的酵母为毕赤酵母(Pichiapastoris)。更优选地，本发明的酵母为毕赤酵母X-33。

本发明再一方面提供了一种制备斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的方法，该方法包括在酵母宿主细胞中表达斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因或表达斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因的重组表达载体。优选地，该酵母是毕赤酵母，更优选地，该毕赤酵母是毕赤酵母X-33。

在本发明的另一优例中，制备斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的方法中，所用发酵培养基包含无氨基酵母氮源和山梨醇。

将斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因引入到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：Hsiaoet al.，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和Van Solingen et al.，J.BACT.(1977)130:946。然而，也可如通常在SAMBROOK et al.，Molecular Cloning,A LabManual(2001)中所述，使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式，将外源DNA引入细胞。一旦建立重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞)，则在适于产生重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的条件下培养重组宿主细胞菌株。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。本发明制备重组蛋白过程中使用包含无氨基酵母氮源和山梨醇的培养基。

本发明的重组蛋白于重组系统中表达之后进行纯化，可以采用多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化。任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽，例如：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAESEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEX G-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。

本发明还提供了斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因在生产重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽中的应用。

本发明还提供了斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因编码的重组蛋白在制备抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌ATCC25922、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的药物中的应用。

本发明首次通过构建毕赤酵母真核表达系统实现斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的重组DNA表达，并进一步对获得的重组蛋白的抗菌活性进行验证，对其应用提供了依据。发明人通过密码子优化，在毕赤酵母中以较高的量(33.6mg/L)表达了重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽，从而非常容易地从表达产物中纯化到了该肽，(参见图8，其中很清晰地显示了目的蛋白条带)，该表达量明显高于背景技术中述及的几种抗菌肽在毕赤酵母中的表达量。也明显高于本申请发明人在以下“实施例1”中提到的未优化的斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的天然cDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1)在毕赤酵母中的表达量(2.2mg/L)。另外，本发明得到的重组蛋白的抑菌活性良好(参见图11，其显示很明显的对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌ATCC25922、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌效果)。此外，本发明还对表达产物做了纯化和质谱鉴定，从而证明了本发明得到的是预期目的蛋白。

另外，本发明的制备斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的方法，相比于现有技术，考虑到生产实际中培养基的情况，对于传统培养基进行了优化，舍去了酵母膏和蛋白胨，添加了山梨醇(添加山梨醇的好处：一是山梨醇价格相较于酵母膏蛋白胨低；二是山梨醇不会对发酵液后续处理产生影响)；只使用无机氮源，即节省了成本、提高了产量又方便了后期操作，且与生产实际更贴近，缩短了到达产业化的路径。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。

术语“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1是编码斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的未经密码子优化的cDNA序列(A)及其重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”的构建图(B)。

图2A和2B分别是对未经密码子优化的cDNA表达不同时间的培养液上清的Tricine-SDS-PAGE和Western-blot分析图。

图3是未经密码子优化的cDNA表达的含重组体mLEAP2的培养液上清对枯草芽孢杆菌的抑菌活性测定结果。

图4是在编码斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化的cDNA序列(SEQ ID NO:2)的5′端添加XhoⅠ酶切位点、α因子信号肽酶切位点Kex2对应的核苷酸序列以及在3′端添加6×His编码基因、XbaⅠ酶切位点和终止密码子，其中，CTCGAG为XhoⅠ的酶切位点，TCTAGA为XbaⅠ的酶切位点，星号为2个终止密码子，方框为信号肽酶切位点，阴影部分为优化过的密码子。

图5是重组表达载体pPICZαA-mLEAP2构建图。

图6是酵母转化子的PCR鉴定图。泳道M为DNA分子量标准；泳道1为含pPICZαA的酵母转化子；泳道2是酵母X-33，泳道3为含PICZαA-mLEAP2的酵母转化子。

图7是采用BMMS培养基、经甲醇诱导表达72h后的培养液经离心后上清的Tricine-SDS-PAGE分析图。泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为表达产物。

图8是上清经Ni-IDA亲和层析纯化后的重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的Tricine-SDS-PAGE分析。泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为纯化后的重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽。

图9是重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的MALDI-TOF-TOF鉴定图谱。

图10是重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的MALDI-TOF-TOF的搜索结果。

图11是通过菌落计数法检测含重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的上清的抑菌活性的结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛和深入的研究，对斑点叉尾鮰LEAP2的基因序列进行了大量筛选，选出了特别适合在毕赤酵母中表达的优化序列，在此基础上完成了本发明。

斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽的天然cDNA序列如SEQ ID NO:1所示：

ATGACACCCCTTTGGAGAATCATGGGTACTAAACCCCATGGGGCATACTGTCAGAATAACTATGAGTGTTCCACGGGAATATGCAGGAAAGGACACTGCTCCTTTAGCCAACCTATAATTTCC(SEQ ID NO:1)

斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：

ATGACCCCTTTGTGGAGAATCATGGGTACTAAACCACATGGAGCTTACTGTCAAAACAATTATGAATGCTCCACAGGGATATGTCGTAAGGGCCACTGTAGTTTTTCTCAGCCCATTATTTCA(SEQ ID NO:2)。

斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因编码的重组蛋白(即斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：

MTPLWRIMGTKPHGAYCQNNYECSTGICRKGHCSFSQPIIS(SEQ ID NO:3)。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽未优化的天然cDNA(SEQ ID NO:1)在毕赤酵母GS115中的重组表达

1.1斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因酶切位点的添加

设计3个分别含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点和6×His标签的引物(参见表1)。第一次PCR以既有的斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽基因“mLEAP2”的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板，以LF和LR1为引物，反应体系和条件如下：

“pET-32a-mLEAP2”2.5μL、正反引物各4.0μL(10μmol/L)、dNTP(10mmol/L)8.0μL、PCR缓冲液10μL、Taq DNA聚合酶(Takara，Otsu，Japan)1μL，用无菌水调至100μL；94℃预变性3min、94℃变性30s、54.6℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环，最终72℃延伸5min。以该PCR产物为模板，以LF和LR2为引物，进行第二次PCR，反应体系和条件同上，除了退火温度改为60℃。将第二次PCR扩增的目的片段“mLEAP2”连接至pMD19-T质粒后用于DNA测序。

1.2“pPIC9K-mLEAP2”重组表达载体的构建及转化毕赤酵母GS115细胞

采用EcoRⅠ和NotⅠ对重组质粒“pMD19-T-mLEAP2”进行双酶切，将获得的目的片段“mLEAP2”与经同样酶处理过的表达载体pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，通过菌落PCR、双酶切和DNA测序证明，重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”被成功构建(参见图1)。“pPIC9K-mLEAP2”经SacⅠ酶切割后电转入毕赤酵母GS115细胞，取适量涂于His^–的MD平板上，30℃培养至单克隆产生。

1.3高拷贝酵母转化子的筛选及鉴定

将MD平板上的单菌落依次接种于G418浓度为1.0、2.0、3.0、4.0g/L的YPD平板，30℃培养2-5天后筛选高拷贝酵母转化子；将筛选到的转化子在MM平板上培养以筛选Mut⁺或Mut^－表型；对筛选到的甲醇利用快速型高拷贝酵母转化子提取基因组DNA，以此为模板，采用pPIC9K上的通用引物5’AOX1和3’AOX1(参见表1)，进行PCR鉴定。

表1引物序列

注：下划线为限制性酶切位点。

1.4斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽在毕赤酵母GS115中的表达及Western-blot分析

挑取筛选到的酵母转化子，接种于500mL BMG液体培养基中，29℃、250r/min培养至OD₆₀₀为4，10 000×g离心后用1000mL BMM液体培养基重悬细胞至OD₆₀₀约为1.0，加入0.5％甲醇诱导表达120h，每隔24h取培养液以备电泳分析，图2A是表达不同时间的培养液上清的Tricine-SDS-PAGE分析结果，可以发现表达120h较合适，故将此表达时间的约1000mL培养液进行Ni-IDA亲和层析，得到的纯化产物经Folin-酚法测定，其浓度为0.22mg/mL，推算至表达量约为2.2mg/L(推算过程：1000mL的发酵液经纯化得到100mL纯品；纯品经浓缩得到10mL浓缩液，其蛋白质浓度0.22mg/mL，1000mL的发酵液中的目的蛋白总量为2.2mg，所以1L样品的目的蛋白浓度为2.2mg/L)。经Tricine-SDS-PAGE分析后的凝胶用于Western-blot分析，阴性对照为含pPIC9K空载体的酵母表达上清。100V恒压1h，将蛋白转至PVDF膜上，依次用抗his标签鼠单克隆抗体和HRP标记山羊抗鼠IgG孵育，最后采用HRP-DAB显色试剂盒显色，图2B是对表达120h的培养液上清的Western-blot分析结果，可以看到明显的杂交条带。

1.5重组体mLEAP2(rmLEAP2)的抑菌活性测定

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)37℃、150r/min培养至OD₆₀₀为1.0，取1μL与100μL培养液上清混匀，37℃培养2h；取30μL培养液涂布于营养琼脂平板，观察细菌生长情况。空白对照为100μL含pPIC9K空载体的酵母培养液。图3是含rmLEAP2的培养液上清对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性测定结果。

发明人通过分析认为采用上述“实施例1”中的天然cDNA进行酵母表达，可能是导致表达量偏低(仅2.2mg/L)的主要原因，所以考虑对该天然cDNA进行密码子优化后再作表达。另外，上述“实施例1”中使用的表达载体是“pPIC9K”(对应毕赤酵母GS115)，它导致了后续阳性酵母转化子的筛选步骤烦多，且也有可能影响表达量，所以在以下实施例中，发明人改为选择“pPICZαA”作为表达载体(对应毕赤酵母X-33)，它可以避免“pPIC9K”的缺点。

实施例2

斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽密码子优化后的cDNA在毕赤酵母X-33中的重组表达与纯化

2.1培养基配方：

(BMG培养基：YNB 13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L pH6.0，甘油10ml/L；BMMS培养基：YNB 13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇7.5mL/L，磷酸钾缓冲液0.1mol/L pH6.0，山梨醇18.2g/L)。

2.2对斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的cDNA进行优化合成及酶切位点的添加

参考高北等(高北,陶妍.斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达[J].生物技术通报,2014(2):130-135.)公布的斑点叉尾鮰LEAP2成熟肽的cDNA序列，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的ATG、ACA、CCC、CTT、TGG、AGA、ATC、ATG、GGT、ACT、AAA、CCC、CAT、GGG、GCA、TAC、TGT、CAG、AAT、AAC、TAT、GAG、TGT、TCC、ACG、GGA、ATA、TGC、AGG、AAA、GGA、CAC、TGC、TCC、TTT、AGC、CAA、CCT、ATA、ATT、TCC等密码子进行了优化，优化后的对应密码子分别为ATG、ACC、CCT、TTG、TGG、AGA、ATC、ATG、GGT、ACT、AAA、CCA、CAT、GGA、GCT、TAC、TGT、CAA、AAC、AAT、TAT、GAA、TGC、TCC、ACA、GGG、ATA、TGT、CGT、AAG、GGC、CAC、TGT、AGT、TTT、TCT、CAG、CCC、ATT、ATT、TCA，即得到优化后的核苷酸序列SEQ ID NO:2，在其5′端添加XhoⅠ酶切位点、α因子信号肽酶切位点Kex2对应的核苷酸序列以及在3′端添加6×His编码基因、XbaⅠ酶切位点和终止密码子(参见图4)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因。

2.3重组表达载体pPICZαA-mLEAP2的构建及鉴定

将上述基因与经XhoⅠ和XbaⅠ消化的pPICZαA载体相连(图5)，连接条件：目的片段mLEAP2 7.0μL、载体pPICZαA1.0μL、10×T₄DNA Ligase Buffer1.0μL、T₄DNA Ligase(350U/μL)，终体积10μL，16℃反应12h。重组表达载体pPICZαA-mLEAP2构建完成后，转化至大肠杆菌中进行增殖，收集菌体分离纯化pPICZαA-mLEAP2后，对其进行测序以证明重组表达载体pPICZαA-mLEAP2已成功构建。

2.4pPICZαA-mLEAP2转化毕赤酵母X-33及酵母转化子的鉴定

采用SacⅠ对pPICZαA-mLEAP2进行线性化处理(pPICZαA-mLEAP2 84μL、10×LBuffer10μL、SacⅠ(10U/μL)6μL，37℃8h)后，转化至感受态的毕赤酵母X-33(感受态细胞80μL、线性pPICZαA-omLEAP2 10μL，2000V、25μF、200Ω、5ms)。通过Zeocin筛选阳性酵母转化子，对其基因组DNA提取纯化后，以酵母基因组DNA为模板，使用载体pPICZαA上的通用引物5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)进行目的基因的PCR鉴定(无菌水14.1μL、10×TaqBuffer 2.0μL、dNTP(2.5mmol/L)1.6μL、5′AOX1(10μmol/L)0.8μL、3′AOX1(10μmol/L)0.8μL、酵母基因组DNA0.5μL、Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.2μL，终体积20μL；反应条件：94℃预变性3min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、30个循环，最终72℃延伸5min)。PCR产物的电泳结果见图6，其中707bp处为扩增的含目的基因的条带；泳道1为含空质粒pPICZαA酵母转化子的扩增结果(阴性对照)。由此看出重组表达载体pPICZαA-mLEAP2已成功嵌合进毕赤酵母染色体。

2.5甲醇诱导表达重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽及其分离纯化

阳性酵母转化子接种至500mL BMG培养基中，8层纱布封口，29℃、250r/min摇床振荡培养至OD₆₀₀ 4.0左右，离心取菌体接种至1000mL BMMS培养基中，0.75％甲醇、29℃、250r/min诱导表达目的蛋白；每隔24h补加甲醇至终体积的0.75％；在72h时终止培养，取样用于电泳分析并进行纯化。图7为表达产物的Tricine-SDS-PAGE分析，由该图可以发现，1号泳道是采用含山梨醇的培养基(BMMS)表达的产物，其显示了明显的目的条带。由于重组mLEAP2的C-端带有6×His标签，故采用Ni-IDA亲和层析的方法纯化目的蛋白，具体方法：表达72h的约1000mL培养液经离心取上清调节其离子浓度，使其含有50mmol/L PB、300mmol/LNaCl、5mmol/L imidazole，并且调节pH至8.0，过0.22μm滤膜；纯化过程按照Bio-Rad公司(美国)说明书进行，大致过程如下：将5mL的预装柱连入Profinia蛋白质纯化仪，首先用预平衡液(50mmol/L PB、300mmol/L NaCl、5mmol/Limidazole)平衡柱子，接着以5mL/min的流速上样，上样完成后用漂洗液(50mmol/L PB、300mmol/L NaCl、10mmol/L imidazole、pH8.0)漂洗，之后用洗脱液(50mmol/L PB、300mmol/L NaCl、500mmol/L imidazole、pH8.0)将目的蛋白洗脱下来，经福林-酚法测定蛋白质浓度为0.269mg/mL，推算出表达量约为33.6mg/L。(推算过程：1000mL的发酵液经纯化得到125mL纯品，纯品的蛋白质浓度0.269mg/mL，1000mL的发酵液中的目的蛋白总量为33.625mg，所以1L样品的目的蛋白浓度为33.6mg/L)。该结果明显高于背景技术中述及的几种抗菌肽在毕赤酵母中的表达量和“实施例1”中使用未优化基因的表达量(2.2mg/L)。图8是对纯化的重组mLEAP2的Tricine-SDS-PAGE分析结果，其中左边泳道为蛋白质分子量标准，右边泳道的近7.8kDa处为亲和层析纯化后的重组mLEAP2。

2.6重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的MALDI-TOF-TOF质谱鉴定

纯化的电泳带切下后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行MALDI-TOF-TOF质谱分析，结果见图9和图10，捕获的6个片段见图10，片段为：①MTPLWR，②MTPLWR(位于第1的M残基被氧化)，③GHCSFSQPIISHHHHHH，④KGHCSFSQPIISHHHHHH(位于第3和第4的C残基被脲甲基化)，⑤IMGTKPHGAYCQNNYECSTGICR(位于第11、17、22的C残基被脲甲基化),⑥IMGTKPHGAYCQNNYECSTGICR(位于第11、17、22的C残基被脲甲基化，位于第2的M残基被氧化)，它们与重组mLEAP2的理论序列相吻合，覆盖率为97.9％，证明获得了预期目的蛋白。

实施例3

菌落计数法检测基于密码子优化的基因表达的重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的抑菌活性

选取的革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，革兰氏阴性细菌为大肠杆菌ATCC25922。LB液体培养基培养上述细菌过夜，再用新鲜的LB液体培养基将菌体的OD₆₀₀调至1.0，按照菌液与培养液上清1:100的比例在37℃的条件下孵育2h，以含pPICZαA空质粒的酵母转化子的培养液上清与细菌进行同样处理作为阴性对照；各取30μL涂布于LB固体培养基上，37℃恒温培养8h，观察菌落数量。如图11所示，含重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的培养液上清对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均有抑菌活性(所用的培养液上清含重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽33.6mg/L)。

相比已有的专利CN103755795A“斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用”中制备的LEAP-2重组前体蛋白对大肠杆菌抑制效果不太明显的结果，通过本专利技术获得的重组斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽具有明显的抑制大肠杆菌的活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的优化基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种重组蛋白，其由权利要求1所述的优化基因编码，具有氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的优化基因。

4.一种酵母宿主细胞，其含有权利要求1所述的优化基因或权利要求3所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母是毕赤酵母。

6.一种制备斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽的方法，其包括在酵母宿主细胞中表达权利要求1所述的优化基因或权利要求3所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酵母是毕赤酵母。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中该方法所用发酵培养基包含无氨基酵母氮源和山梨醇。

9.权利要求1所述的优化基因在生产斑点叉尾鮰LEAP-2成熟肽中的应用。

10.权利要求1所述的优化基因编码的重组蛋白在制备抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌ATCC25922、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的药物中的应用。