CN105400791A - 斑马鱼防御素defbl3的优化基因及其重组蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了斑马鱼防御素defbl3的优化基因，其重组蛋白的制备方法。本发明还提供了包含该优化基因的重组表达载体和酵母宿主细胞，该优化基因在生产斑马鱼防御素defbl3中的应用，和该重组蛋白在制备抗菌药物中的应用。本发明在不改变斑马鱼防御素defbl3氨基酸序列的前提下，按照毕赤酵母偏爱密码子对斑马鱼防御素defbl3基因的核苷酸序列进行了优化，优化后的序列为SEQ？ID？NO:2。本发明通过在毕赤酵母宿主细胞中表达该优化基因，制备了重组斑马鱼防御素defbl3。该制备方法可高效地制备防御素defbl3，所用培养条件简单，成本较低，得到的防御素defbl3抗菌效果好。

Description

斑马鱼防御素defbl3的优化基因及其重组蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种密码子经过优化的基因，尤其涉及按照毕赤酵母偏爱密码子对斑马鱼防御素defbl3基因进行改造后的优化基因，以及其编码的重组蛋白的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

综观国内养殖业，海水和淡水养殖区大多分布于沿海港湾和河口附近水域，这些水域也是沿海陆源污染物和海上排污的主要受纳场所。据统计，我国每年直接入海的废水量高达80亿吨，富含营养物质、病原微生物和有机农药的农业污水也随地表流进沿海水体，致使水体水质恶化。这样的养殖环境污染导致水产养殖生物的抵抗力大大降低，目前针对这种情况采取的主要措施是给水产生物过量服用抗生素，其直接后果就是微生物耐药性增加、水产品质量和安全问题日渐突出,并导致我国水产品出口遭受技术性贸易壁垒。据此，开发无微生物耐药问题、能够替代或部分替代抗生素的绿色饲料添加剂对于水产生物的养殖安全和水产食品安全来讲刻不容缓。

抗菌肽是由生物细胞特定基因编码的一类具有抗菌免疫功能的小分子多肽，其抗菌谱广、不容易产生耐药性、分子量小而耐热性好，在机体天然免疫和获得性免疫中发挥了重要作用，被认为是抗生素替代品的最佳候选者，因此，极具开发应用前景。目前对于抗菌肽的研究应用比较成熟的是昆虫来源的抗菌肽，它们的应用领域主要是畜禽养殖业。相比之下，对于水产生物来源抗菌肽的研究报道很少，更谈不上应用。水产生物因其栖息的水域环境比其他生物复杂而更易遭遇病原微生物的侵染，它们的机体必须拥有比其他生物更强的免疫系统才能适应这种复杂的生存环境，而这种特殊的免疫系统得益于它们机体中多种抗菌肽的适时表达。因此，水产生物来源的抗菌肽是水产养殖中饲用抗生素替代品的最佳候选者。

防御素是一类可杀死细菌、真菌或者病毒等微生物并有抗肿瘤活性的多肽，是抗菌肽家族的重要成员。关于防御素基因工程制备的研究报道主要集中在人类来源和畜禽来源的防御素，目前已经有人α-防御素5、人α-防御素2、猪β-防御素2等在毕赤酵母中表达的报道或专利。近几年随着对鱼类功能性基因的研究，逐渐发现了一些鱼类来源的防御素基因，如团头鲂β-防御素、虹鳟鱼β-防御素、红鳍东方鲀β-防御素等。鱼类来源的β-防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸的碱性小分子肽，大部分含6个半胱氨酸残基，可形成3对二硫键以维持其稳定性。迄今为止，采用基因工程技术制备鱼类来源防御素的研究报道和专利很少，即便有，几乎都是通过RT-PCR或从cDNA文库获得编码抗菌肽的天然cDNA，金俊琰等(金俊琰，周莉，桂建芳。石斑鱼β－防御素的酵母表达及其产物抗菌活性分析，水生生物学报，2011，35(5)：739-743)从石斑鱼cDNA文库获得编码β－防御素的天然cDNA，在酵母菌中表达了重组β－防御素成熟肽，具有一定体外抑菌活性，但表达量非常低。张涓(团头鲂β－防御素基因的克隆、重组表达及抗菌活性研究。华中农业大学硕士学位论文，2014年6月，条形码Y2567756)通过RT-PCR从团头鲂中克隆到天然的编码β－防御素的cDNA，实现了在毕赤酵母中的表达，表达上清的体外抑菌活性测定结果显示具有一定的活性，但SDS-PAGE电泳始终未能获得表达产物重组蛋白的条带，他们分析认为可能是表达量非常低以致无法检测到。除了β－防御素，还有关于鱼类来源其他抗菌肽的酵母表达研究的一些报道，如汪玉华等(汪玉华，敖敬群，陈新华。大黄鱼抗菌肽hepcidin在巴斯德毕赤酵母中的表达及其产物的抑菌活性，应用海洋学学报，2013，32(3)：383-389)从cDNA文库获得编码hepcidin的天然cDNA，在毕赤酵母中表达了重组hepcidin，表达产物显示了一定的抑菌活性，但他们并未提供纯化的重组hepcidin的实验结果，其原因可能就是表达产量过低不易纯化所致。迄今为止，报道的鱼类抗菌肽的重组表达较少，一般在实验室水平进行的鱼类抗菌肽在酵母中的表达研究方面，因为目的蛋白的表达量很低或拿不到纯品，都不太提及具体的表达量。对于其他来源的抗菌肽，虽然有文献报道了其具体的表达量，但是表达也不理想。例如蔡晶晶等(蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚。黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达，厦门大学学报，2009，48(5)：738-743)在毕赤酵母中表达黑鲷抗菌肽hepcidin，其表达量在120h达到最高为1.1mg/L。Feng-liangJin等人(Feng-liangJin,Xiao-xiaXu,Xiao-qiangYu,Shun-xiangRen.ExpressionandcharacterizationofantimicrobialpeptideCecropinADinthemethylotrophicyeastPichiapastoris.ProcessBiochemistry2009；44:11-16)利用密码子优化后的基因在毕赤酵母中表达家蝇和天蚕抗菌肽，他们从100ml培养液中得到1.8mg纯肽(即表达量约18mg/L)。VasilikiKoliaraki等人(VasilikiKoliaraki,MarthaMarinou,MartinaSamiotaki,GeorgePanayotou,KostasPantopoulos,AvgiMamalaki.IronregulatoryandbactericidalpropertiesofhumanrecombinanthepcidinexpressedinPichiapastoris.Biochimie2008；90:726-735)在毕赤酵母中表达得到人hepcidin，其在培养液中的表达量为5-7mg/L。

目前，很多文献报道了蛋白质的异源表达，表达量在原始菌株基础上得到了很大的提高，特别是利用毕赤酵母异源分泌表达蛋白质，具有高细胞密度发酵，蛋白质可分泌到胞外表达且杂蛋白少；遗传和表达稳定性好等诸多优点(Macauley-PatrickS,FazendaM,McNeilB,etal.,HeterologousproteinproductionusingthePichiapastorisexpressionsystem,Yeast,2005,22:249-270)。但毕赤酵母作为一种异源蛋白质表达宿主，对于外源基因的表达具有相当的局限性，提高外源基因在毕赤酵母中的表达量通常有密码子优化、mRNA二级结构改造、GC含量调整等策略。密码子优化是一种重要的高效重组表达手段，它是根据宿主的密码子偏爱性优化异源基因的密码子以提高重组蛋白表达效率，这在一些原核生物和真核生物中均有报道。研究结果认为密码子优化提高了翻译效率从而提高了蛋白表达水平，进一步的研究发现密码子优化能够提高异源基因在真菌中的转录活性即mRNA水平。HugoGMenzella(HugoGMenzella.ComparisionoftwocodonoptimizationstrategiestoenhancerecombinantproteinproductioninEscherichiacoli.MenzellaMicrobialCellFactories,2011,10:15)对小牛前凝乳酶(calfprochymosin)基因进行密码子的优化，其采用的随机密码子优化策略获得了5条优化序列。在大肠杆菌中的表达结果表明，经随机密码子策略优化后的序列的表达水平都较原始序列有明显提高，其中一条优化序列更是提高了70％。JiangkeYang等(JiangkeYang,LiyingLiu.Codonoptimizationthroughatwo-stepgenesynthesisleadstoahigh-levelexpressionofAspergillusnigerlip2geneinPichiapastoris.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic.2010,63:164-169)将黑曲霉lip2基因进行密码子优化后在毕赤酵母中表达，新的优化序列在酶活和蛋白表达量方面都有明显提高，分别提高了11.6和5.3倍。因此，密码子优化是提高外源基因高效转录和表达的途径之一。

另外，通常在实验室水平上通过毕赤酵母表达系统制备重组蛋白都是采用传统的含酵母膏和蛋白冻的培养基，这是因为考虑到是在摇瓶中表达，其供氧量等培养条件都不如发酵罐有优势，所以更注重营养条件的优化。值得注意的是金俊琰、张涓和汪玉华的报道中采用的培养基均是含有酵母膏和蛋白冻的实验室用的传统培养基，而这种培养基成本高、发酵液的后期处理较麻烦，一般在生产上用发酵罐发酵时是不用的。因此从培养基方面来说，这些文献中提供的方法也不具有实际生产应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种经过优化改造的斑马鱼防御素defbl3基因。该基因是根据毕赤酵母的密码子偏爱性对斑马鱼防御素defbl3基因进行了优化改造，以期提高重组蛋白的表达量。

本发明的第二个目的是提供斑马鱼防御素defbl3的优化基因编码的重组蛋白，含有该优化基因的重组表达载体，以及含有该优化基因或重组表达载体的酵母宿主细胞。

本发明的第三个目的是提供一种制备该优化基因编码的重组蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种斑马鱼防御素defbl3的优化基因，其具有核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，或者，该优化基因具有与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同源性且编码相同功能蛋白。

本发明参考GenBank中公布的斑马鱼防御素defbl3(GenBank:NM_001081555)的cDNA序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，预测其成熟肽的氨基酸序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的ACA、GTG、CAG、ACA、TGC、GGA、CGA、GGA、CTA、TGC、AGG、TGC、TAT、GCA、CGG、GAG、TAT、ATT、TAT、CGT、GGC、TGC、CCT、CGC、AGG、TGC、CGA、TTT等密码子进行了优化，优化后的对应密码子分别为ACT、GTT、CAA、ACT、TGT、GGT、AGA、GGT、TTG、TGT、AGA、TGT、TAC、GCT、AGA、GAA、TAC、ATC、TAC、TTC、GGT、TGT、CCA、AGA、AGA、TGT、AGA、AGA。

本发明另一方面提供了一种重组蛋白，其具有该优化基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，还提供了一种包含该优化基因的重组表达载体，以及含有该优化基因或重组表达载体的酵母宿主细胞。

本发明的酵母包括能够表达编码防御素defbl3的优化基因的常用酵母的任一种。选择用于表达斑马鱼防御素defbl3的合适酵母是所述领域的普通技术人员的能力范围之内。在选择用于表达的酵母宿主中，合适的宿主可以包括展示具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白产生和总体稳定的酵母。这些酵母包括但不限于产子囊酵母(内胞霉目(Endomycetales))、担孢子酵母和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。上述产子囊酵母分为两科，即蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，Schizosaccharomycoideae(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和酵母属(Saccharomyces))。担孢子酵母包括Leucosporidium属、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、Filobasidium属和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两科，即掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假丝酵母属(Candida)。优选地，本发明的酵母为毕赤酵母(Pichiapastoris)。更优选地，本发明的酵母为毕赤酵母X-33。

本发明再一方面提供了一种制备该优化基因编码的重组蛋白的方法，该方法包括在酵母宿主细胞中表达该优化基因或该重组表达载体。优选地，该酵母是毕赤酵母，更优选地，该毕赤酵母是毕赤酵母X-33。

将重组斑马鱼防御素defbl3的优化基因引入到酵母宿主中的方法对所属领域的普通技术人员是众所周知的。举例而言，酵母转化可根据以下文献中描述的方法进行：Hsiaoetal.，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和VanSolingenetal.，J.BACT.(1977)130:946。然而，也可如通常在SAMBROOKetal.，MolecularCloning,ALabManual(2001)中所述，使用诸如通过核注射、电穿孔或原生质体融合等方式，将外源DNA引入细胞。一旦建立重组宿主细胞菌株(即将重组酵母表达载体引入酵母细胞中并分离具有合适表达载体的重组酵母宿主细胞)，则在适于产生重组斑马鱼防御素defbl3的条件下培养重组宿主细胞菌株。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不希望的微生物生长和/或含有包括但不限于抗生素的化合物以选择含有表达载体的宿主细胞。本发明制备重组蛋白过程中使用包含无氨基酵母氮源的培养基。

本发明的重组蛋白于重组系统中表达之后进行纯化，可以采用多种所属领域中已知的方法从宿主细胞中纯化。任何以下方法或手段都可用于纯化本发明重组斑马鱼防御素defbl3，例如：亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱(使用包括但不限于DEAESEPHAROSE)、硅胶色谱、反相HPLC、凝胶过滤(使用包括但不限于SEPHADEXG-75)、疏水相互作用色谱、大小排除色谱、金属螯合色谱、超滤/透滤、乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、色谱聚焦、置换色谱、电泳程序(包括但不限于制备型等电聚焦)、差别溶解性(包括但不限于硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。

本发明还提供了重组斑马鱼防御素defbl3的优化基因在生产斑马鱼防御素defbl3中的应用。

本发明还提供了重组斑马鱼防御素defbl3的优化基因编码的重组蛋白在制备抗单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌ATCC25922、副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的药物中的应用。

本发明首次通过构建毕赤酵母真核表达系统实现重组斑马鱼防御素defbl3基因的表达，并进一步对获得的重组蛋白的抗菌活性进行验证，对其应用提供了依据。发明人通过密码子优化，在毕赤酵母中以较高的量(30mg/L)表达了重组斑马鱼防御素defbl3，从而非常容易地从表达产物中纯化到了该肽，(参见图6，其中很清晰地显示了目的蛋白条带)。该表达量明显高于背景技术中述及的黑鲷hepcidin、人hepcidin、家蝇和天蚕抗菌肽在毕赤酵母中的表达量。另外本发明得到的重组蛋白的抑菌活性良好(参见图9，其显示很清晰的抑菌圈)，该活性大大地优于背景技术提到的金俊琰、张涓和汪玉华报道的抑菌活性，且比他们直观得多。此外，本发明还对表达产物做了质谱鉴定，从而证明了本发明得到的是预期目的蛋白且纯度高。

另外，本发明的重组斑马鱼防御素defbl3的制备方法，相比于现有技术，考虑到生产实际中培养基的情况，对于传统培养基进行了简化，舍去了酵母膏和蛋白冻，只使用无机氮源，即节省了成本，又方便了后期操作，且与生产实际更贴近，缩短了到达产业化的路径。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或者已经用作重组载体或其他转移DNA的接受体的酵母。所述术语包括已经接收重组载体或其他转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶然或有意的突变，单个亲本细胞的后代可不必在形态上或与原始亲本互补的基因组或总DNA上完全一致。

术语“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1是编码斑马鱼defbl3成熟肽的优化的cDNA序列及其推断的氨基酸序列。其中，CTCGAG为XhoⅠ的酶切位点，TCTAGA为XbaⅠ的酶切位点，TGATAA为2个终止密码子。单下划线为信号肽酶切位点，双下划线处为6×His标签。阴影部分为人工优化的密码子。

图2是重组表达载体pPICZαA-defbl3构建图。

图3是双酶切重组表达载体pPICZαA-defbl3鉴定图。泳道M为DNA分子量标准，泳道1为限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pPICZαA-defbl3后的产物。

图4是酵母转化子的PCR鉴定图。泳道M为DNA分子量标准；泳道1为含pPICZαA的酵母转化子；泳道2～7为含PICZαA-defbl3的酵母转化子。

图5是经甲醇诱导表达不同时间后的酵母菌液经离心后上清的Tricine-SDS-PAGE分析图。泳道M为蛋白质分子量标准；泳道0～144h为每隔24h的诱导表达上清。

图6是上清经Ni-IDA亲和层析纯化后的斑马鱼重组defbl3成熟肽的Tricine-SDS-PAGE分析图。泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为纯化后的重组defbl3成熟肽。

图7是Westernblot检测和亲和层析纯化后的斑马鱼重组defbl3成熟肽。泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为Westernblot检测斑马鱼重组defbl3成熟肽的条带。

图8是斑马鱼重组defbl3成熟肽的MALDI-TOF-TOF鉴定图谱。箭头指示为匹配成功的目的蛋白信号。

图9是通过琼脂糖扩散法检测含重组defbl3成熟肽的表达上清的抑菌活性结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

斑马鱼重组defbl3成熟肽在毕赤酵母X-33中的表达与纯化

1.1培养基配方：

MGY(MinimalGlycerolMedium)培养基：YNB13.4g/L、生物素4×10^-4g/L、甘油10mL/L；MM(MinimalMethanolMedium)培养基：YNB13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇10mL/L。

1.2对斑马鱼defbl3成熟肽的cDNA进行优化合成及酶切位点的添加

参考GenBank中公布的斑马鱼防御素defbl3(GenBank:NM_001081555)的cDNA序列，预测其成熟肽的cDNA序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对原来的ACA、GTG、CAG、ACA、TGC、GGA、CGA、GGA、CTA、TGC、AGG、TGC、TAT、GCA、CGG、GAG、TAT、ATT、TAT、CGT、GGC、TGC、CCT、CGC、AGG、TGC、CGA、TTT等密码子进行了优化，优化后的对应密码子分别为ACT、GTT、CAA、ACT、TGT、GGT、AGA、GGT、TTG、TGT、AGA、TGT、TAC、GCT、AGA、GAA、TAC、ATC、TAC、TTC、GGT、TGT、CCA、AGA、AGA、TGT、AGA、AGA，得到优化后的核苷酸序列SEQIDNO:2，在其5′端添加XhoⅠ酶切位点、α因子信号肽酶切位点Kex2对应的核苷酸序列以及在3′端添加6×His编码基因、XbaⅠ酶切位点和终止密码子，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因。图1为优化的斑马鱼defbl3成熟肽的cDNA序列及推断的氨基酸序列。

1.3重组表达载体pPICZαA-defbl3的构建及鉴定

将上述基因与经XhoⅠ和XbaⅠ消化的pPICZαA载体相连(图2)，连接条件：目的片段defbl37.0μL、载体pPICZαA1.0μL、10×T₄DNALigaseBuffer1.0μL、T₄DNALigase(350U/μL)，终体积10μL，16℃反应12h。重组表达载体pPICZαA-defbl3构建完成后，转化至大肠杆菌中进行增殖，收集菌体分离纯化pPICZαA-defbl3后，对其进行双酶切处理(重组表达载体pPICZαA-defbl314.4μL、10×MBuffer2.0μL、0.1％BSA2.0μL、XhoⅠ(15U/μL)0.8μL、XbaⅠ(10U/μL)0.8μL，终体积20μL，37℃反应5h。结果见图3，其中左边泳道为DNA分子量标准，右边泳道165bp处为XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后获得的目的片段defbl3，由此看出重组表达载体pPICZαA-defbl3已成功构建。

1.4pPICZαA-defbl3转化毕赤酵母X-33及酵母转化子的鉴定

采用SacⅠ对pPICZαA-defbl3进行线性化处理(pPICZαA-defbl384μL、10×LBuffer10μL、SacⅠ(10U/μL)6μL，37℃8h)后，转化至感受态的毕赤酵母X-33(感受态细胞80μL、线性pPICZαA-defbl310μL，2000V、25μF、200Ω、5ms)。通过Zeocin筛选阳性酵母转化子，对其基因组DNA提取纯化后，以酵母基因组DNA为模板，使用载体pPICZαA上的通用引物5′AOX1(5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和3′AOX1(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)进行目的基因的PCR鉴定(无菌水14.1μL、10×TaqBuffer2.0μL、dNTP(2.5mmol/L)1.6μL、5′AOX1(10μmol/L)0.8μL、3′AOX1(10μmol/L)0.8μL、酵母基因组DNA0.5μL、TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)0.2μL，终体积20μL；反应条件：94℃预变性3min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、30个循环，最终72℃延伸5min)。PCR产物的电泳结果见图4，其中666bp处为扩增的含目的基因的条带，2200bp处为毕赤酵母X-33中因存在醇氧化酶基因AOX1自身的引物结合位点而扩增的条带；泳道1为含空质粒pPICZαA酵母转化子的扩增结果(阴性对照)。由此看出重组表达载体pPICZαA-defbl3已成功嵌合进毕赤酵母染色体。

1.5甲醇诱导表达重组体defbl3成熟肽及其分离纯化

阳性酵母转化子接种至100mLMGY培养基中，8层纱布封口，29℃、250r/min摇床振荡培养至OD₆₀₀4.0左右；将菌体从MGY培养基中转移至相同体积的MM培养基中，1mL甲醇、29℃、250r/min诱导表达目的蛋白；每隔24h补加甲醇至终体积的1.0％。每隔24h补加甲醇至终浓度的1.0％并取样用于电泳分析。图5为不同时间段表达的产物的Tricine-SDS-PAGE分析，选取表达时间为96h。由于重组体defbl3成熟肽的C-端带有6×His标签，故采用Ni-IDA亲和层析的方法纯化目的蛋白，具体方法：表达96h的上清经截留分子量为1000D的透析袋透析6h后(透析液：50mmol/LPB、300mmol/LNaCl、5mmol/Limidazole、pH8.0)，过0.22μm滤膜；纯化过程按照Bio-Rad公司(美国)说明书进行，大致过程如下：将5mL的预装柱连入Profinia蛋白质纯化仪，首先用预平衡液(同透析液)平衡柱子，接着以5mL/min的流速上样，上样完成后用漂洗液(50mmol/LPB、300mmol/LNaCl、10mmol/Limidazole、pH8.0)漂洗，之后用洗脱液(50mmol/LPB、300mmol/LNaCl、500mmol/Limidazole、pH8.0)将目的蛋白洗脱下来，经福林-酚法测定蛋白质浓度为0.24mg/mL，推算出表达量约为30mg/L。(推算过程：200mL的发酵液经纯化得到25mL纯品，纯品的蛋白质浓度0.24mg/mL，200mL的发酵液中的蛋白质总量为6mg，所以1L样品的蛋白浓度为30mg/L)。该结果明显高于背景技术中述及的黑鲷hepcidin、人hepcidin、家蝇和天蚕抗菌肽在毕赤酵母中的表达量。图6是对纯化的重组defbl3成熟肽的Tricine-SDS-PAGE分析结果，其中左边泳道为蛋白质分子量标准，右边泳道的5.9kDa处为亲和层析纯化后的重组defbl3成熟肽。

1.6重组体defbl3成熟肽的Westernblot分析和MALDI-TOF-TOF质谱鉴定

根据试剂盒的说明，采用抗6×His标签鼠单克隆抗体对纯化的重组体defbl3成熟肽进行Westernblot分析，结果如图7所示，其中左边为彩虹蛋白质分子量标准，右边箭头处为纯化的重组defbl3成熟肽经抗体捕获的单一条带。纯化的电泳带切下后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行MALDITOF-TOF质谱分析，结果见图8，其中重组defbl3成熟肽的第22-28位的肽段EYMIGYR和第41-47位的肽段FHHHHHH被捕获，证明获得了预期蛋白。

实施例2

琼脂糖扩散法检测重组体防御素defbl3成熟肽的抑菌活性

选取的革兰氏阳性细菌为单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，革兰氏阴性细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌ATCC25922、副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。LB液体培养基培养上述细菌过夜，再用新鲜的LB液体培养基将菌体的OD₆₀₀调至0.4，按照1:1000的稀释比例加入至尚未凝固的营养琼脂中，摇匀后倒平板，待平板凝固后，用打孔机打6mm的孔，加入50μL表达上清，以pPICZαA空质粒的表达上清作为对照，30℃恒温箱培养12h，观察抑菌圈。如图9所示，重组体防御素defbl3成熟肽对这些革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都表现出明显的抑菌活性，其中对革兰氏阳性的单增李斯特菌(L.monocytogenes)和蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的抑菌效果优于金黄色葡萄球菌(S.aureus)；对革兰氏阴性的3种大肠杆菌(E.coli)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的抑菌效果优于副溶血弧菌(V.Parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种重组斑马鱼防御素defbl3的优化基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

2.一种重组蛋白，其具有权利要求1所述的优化基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

3.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的优化基因。

4.一种酵母宿主细胞，其含有1所述的优化基因或权利要求3所述的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的酵母宿主细胞，其中所述酵母是毕赤酵母。

6.一种制备权利要求2所述的重组蛋白的方法，其包括在酵母宿主细胞中表达权利要求1所述的基因或权利要求2所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述酵母是毕赤酵母。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中发酵培养基包含无氨基酵母氮源。

9.权利要求1所述的优化基因在生产斑马鱼防御素defbl3中的应用。

10.权利要求2所述重组蛋白在制备抗单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌ATCC25922、副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、沙门氏菌(Salmonella)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的药物中的应用。