CN112375132A

CN112375132A - 太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用

Info

Publication number: CN112375132A
Application number: CN202011302943.1A
Authority: CN
Inventors: 卫林; 陈悦; 程洪兰
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: WO2022104863A1; CN112375132B; US20220363727A1

Abstract

本发明涉及一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用。本发明的抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述抗菌肽在制备水产养殖动物的抗水产菌的药物中的应用。本发明提供了一种新型抗菌肽，并公开了其具有抵抗水产菌的功能，为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。

Description

太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽，尤其涉及一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用。

背景技术

太湖白鱼，学名为翘嘴红鲌(topmouthculter：Erythroculter ilishaeformis)，属于鲤形目、鲤科、鲌亚科、红鲌属。太湖白鱼具有生长速度快和个体大的特点，在红鲌属鱼类当中，生长速度最快，个体最大。由于太湖白鱼肌肉营养价值高，人们对太湖白鱼的需求越来越多，目前太湖流域已开发了大规模的太湖白鱼养殖基地。

然而，高密度的养殖，也给鱼类带来了大量的养殖病害，例如，细菌感染性疾病。目前，针对养殖鱼类细菌感染性疾病的防治，主要采用的是化学药物治疗为主，生物防治为辅。“药物治疗”虽然见效快，但药物残留现象严重，影响太湖白鱼食用的安全性，还会造成环境污染，限制了养殖业的发展。同时，反复的使用“药物治疗”，特别是抗生素，会加剧细菌耐药性的发生，存在巨大的潜在危害。

因此，亟待探索太湖白鱼的免疫系统组成特点，抗菌肽的结构、功能与作用机制，以期为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用，本发明提供了一种新型抗菌肽，并公开了其具有抵抗水产菌的功能，为太湖白鱼养殖过程中的细菌性疾病的防治提供候选分子。

本发明的第一个目的是提供一种抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为抗菌肽的成熟肽序列。

进一步地，编码抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列为抗菌肽的前体。前体属于抗菌肽LEAP-2家族，前体包括了一个信号肽序列(SEQ ID NO.5)、一个前导肽序列(SEQ ID NO.6)和一个成熟肽序列(SEQ IDNO.1)。

进一步地，编码抗菌肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列为抗菌肽的全长cDNA序列，其包含522个碱基，编码了含有92个氨基酸的前体。其全长cDNA序列中还包括聚腺苷酸化位点(aataa)。

本发明的第二个目的是公开上述抗菌肽在制备水产养殖动物的抗水产菌的药物中的应用。

进一步地，水产养殖动物包括太湖白鱼(Erythroculter ilishaeformis)。

进一步地，水产菌包括温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和霍乱弧菌中的一种或几种。

进一步地，抗水产菌的药物中还包括氨苄青霉素。

进一步地，抗水产菌的药物中抗菌肽和氨苄青霉素的质量比为1:1-4:1。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明开发了基于太湖白鱼自身免疫系统来源的抗菌肽，明确了其结构、功能与抗水产菌感染机制，为太湖白鱼的养殖过程中细菌性疾病的防治提供有效的候选分子。

本发明的抗菌肽分子量小，一方面可以通过化学合成，另一方面，可以将其编码基因构建到原核或真核表达载体中，通过大规模发酵获得。本发明的抗菌肽对水产养殖病原菌，包括耐药菌，具有直接的杀灭作用，且杀菌速度快，而且是致死性的。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是太湖白鱼抗菌肽LEAP-2的分离纯化过程在Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析结果和Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析后的抗菌活性峰的反相液相色谱层析结果；

图2是太湖白鱼LEAP-2的前体与鲤科鱼类来源的几种LEAP-2的前体比对分析图；

图3是SEM观察到的PBS和太湖白鱼LEAP-2对嗜水气单胞菌细胞膜形态影响结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：太湖白鱼抗菌肽的分离纯化

新鲜的太湖白鱼采捕自太湖，体长15～20cm。冰上保鲜，并解剖采集头肾、脾脏、肝脏等免疫相关淋巴组织和器官，加入含有1％(v/v)蛋白酶抑制剂的20mM的PBS(1mL/100mg组织)，并冰上匀浆，加入液氮，反复研磨三次，5000g离心30min，收集上清，低温冻干备用。下一步用Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析。将冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH6.0的磷酸盐缓冲液中，上样于已平衡好的Sephadex G-50(Superfine，GE healthcare)葡聚糖凝胶过滤柱(100cm×2.6cm)，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3mL/管/10分钟，监测收集液280nm处的光吸收，合并各峰冻干，进行抗菌活性检测。抗菌活性峰进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)层析。以水(含0.1％三氟乙酸)：乙腈(含0.1％三氟乙酸)组成的洗脱系统，0.7mL/min进行梯度洗脱，用紫外监测280nm处的光吸收，收集各峰，浓缩冻干，跟踪检测抗菌活性。纯化后的抗菌活性峰，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)UltraFlex I质谱仪(Bruker Daltonics)对纯化到的抗菌多肽的纯度和分子量进行分析。并用Edman降解法对纯化得到的抗菌肽进行N端测序(model 491，ABI，USA)。

结果如图1所示，太湖白鱼头肾匀浆液上清浓缩后，经Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析后，分为5个洗脱峰，经抗菌检测后，第3个洗脱峰(用箭头指示)具有抗菌活性(图1A)。进一步将Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析的第3个洗脱峰用反相液相色谱法层析，分为约20个洗脱峰，经抗菌检测后，第10个洗脱峰(用箭头指示)具有抗菌活性(图1B)。接着，用质谱鉴定了图1B中纯化的第10个洗脱峰中含有的抗菌肽LEAP-2的分子量，结果如表1所示，其分子量为4652.17道尔顿。进一步用Edman降解法测序，获得多肽N端的氨基酸序列为MTPLWRIMLLFKPHALCQNNY。

表1.太湖白鱼LEAP-2的理化性质参数

^a等电点；^b分子量(Da)

实施例2：太湖白鱼抗菌肽的基因克隆与序列分析

用Trizol提取太湖白鱼头肾的总RNA，用Clontech公司SMART^TM cDNA LibraryConstruction Kit构建太湖白鱼头肾的cDNA文库。先用5’PCR引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，由cDNA文库构建试剂盒提供)和简并引物S1(5’-A(A/G)CAT(G/A/T)ATIC(G/T)CCA(A/G/C/T)A(A/G)(A/G/C/T)GG-3’)，根据Edman降解测序的氨基酸序列设计)，克隆到了编码太湖白鱼LEAP-2的5’端片段。然后，再用一个正向引物(5’-ATGCAGACCCACCCCAACAG-3’，根据克隆到的5’端片段设计的引物)和3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’，由cDNA文库构建试剂盒提供)，克隆到了编码太湖白鱼LEAP-2的全长cDNA序列。

如SEQ ID NO.3-4所示，太湖白鱼LEAP-2的全长cDNA序列包含了522个碱基，编码了含有92个氨基酸的前体。BLAST比对证实，该前体属于抗菌肽LEAP-2家族，前体包括了一个信号肽序列(SEQ ID NO.5)、一个前导肽序列(SEQ ID NO.6)和一个成熟肽序列(SEQ IDNO.1)。该cDNA编码的成熟肽序列包含了41个氨基酸，编码的成熟肽N端序列与Edman测序获得的N端序列完全相同。编码的成熟肽的理论分子量为4652.56道尔顿，净正电荷为+3，理论等电点为8.91(表1)。

接着将太湖白鱼LEAP-2的前体与鲤科的一些LEAP-2的前体进行了比对，如图2所示，图2为太湖白鱼LEAP-2的前体与鲤科鱼类来源的几种LEAP-2的前体比对分析。图2中，“*”为一致的位点、“:”为保守的位点，“.”为相对保守的位点，箭头指示处为预测的信号肽、成熟肽剪切位点，方框处分别为“RXXR”、“MTPLWR”和“RXGH”保守性序列，四个保守的半胱氨酸用粗体标出，两个半胱氨酸之间的连线为分子内二硫键。从图2可看出，太湖白鱼LEAP-2与这些已知的鲤科鱼类的LEAP-2具有如下共同特征：(1)在成熟肽剪切位点前具有一个保守的“RXXR”(氨基酸残基XX＝TA或SA)氨基酸序列，将成熟肽和前导肽区分开；(2)在成熟肽的N端，具有一个保守的“MTPLWR”氨基酸序列；(3)在成熟肽的C端，具有一个保守的“RXGH”(氨基酸残基X＝T或S)氨基酸序列；(4)这些鲤科的LEAP-2，都具有4个保守的半胱氨酸残基(Cys)，根据文献，这四个半胱氨酸残基将形成2对分子内二硫键，连接方式为Cys1-Cys2和Cys2-Cys4。

实施例3：太湖白鱼LEAP-2的抗菌活性分析

采用二倍稀释法，检测了太湖白鱼LEAP-2(SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列)对鱼类病原菌的抗菌活性。在96孔板中，制备一系列的二倍稀释梯度的LEAP-2稀释液，体积为50μL/孔，用PBS和氨苄青霉素分别作为阴性对照和阳性对照。温和气单胞菌(Aeromonassobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)在营养肉汤培养基中培养至对数期，然后用新鲜的营养肉汤培养基稀释至10⁵CFU/mL。然后将制备好的二倍稀释的太湖白鱼LEAP-2的96孔板中，每孔加入稀释好的50μL的菌液。37℃培养18小时后，测最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

结果如表2所示，在检测的8个菌株中，对太湖白鱼抗菌肽LEAP-2均敏感，MIC值的浓度范围为18.75-150μg/mL。在检测的菌株当中，温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌和霍乱弧菌对阳性对照氨苄青霉素是具有耐药性的，MIC值高于200μg/mL。但是这些对氨苄青霉素耐药的菌株，都对太湖白鱼LEAP-2敏感。

表2.太湖白鱼LEAP-2的抗菌活性

^aMIC：最小抑制浓度，以上表格中的浓度为三个独立实验的平均值。

实施例4：太湖白鱼LEAP-2的杀菌动力学分析

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，青霉素耐药株)培养至对数期，并用新鲜的营养肉汤培养基稀释至10⁵CFU/mL。将太湖白鱼LEAP-2(5×MIC,93.75μg/mL)、氨苄青霉素(ampicillin，1mg/mL)和等体积的PBS加入到稀释后的菌液中，37℃孵育分别0、10、20、30、45、60、90、120、180分钟。在每个时间点，取50μL菌液，用营养肉汤培养基稀释1000倍，再取50μL涂布到营养肉汤琼脂糖平板上，37℃培养12小时后，计算CFU。

结果如表3所示，与PBS处理组相比，太湖白鱼LEAP-2很好的抑制了嗜水气单胞菌的生长，太湖白鱼LEAP-2(5×MIC,93.75μg/mL,即20.2μM)在60分钟以内就杀死了所有的细菌，并且随着时间的延长，嗜水气单胞菌并没有再次生长，表明其对嗜水气单胞菌的杀菌作用是致死性的。然而，氨苄青霉素(1mg/mL,即2862.0μM)处理180分钟后，并没有抑制完全抑制嗜水气单胞菌的生长，相反，孵育180分钟以后，嗜水气单胞菌的CFU从6.7×10⁴CFUs/mL剧烈地增加到9.6×10⁵CFUs/mL。

表3.太湖白鱼LEAP-2对嗜水气单胞菌的杀菌动力学分析

实施例5:太湖白鱼LEAP-2对细菌细胞膜形态的影响

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，青霉素耐药株)培养至对数期，用PBS洗涤并重悬为5×10⁶CFU/mL。太湖白鱼LEAP-2(5×MIC,93.75μg/mL)加入到菌悬液中，37℃孵育30分钟后，1,000g离心10分钟，将菌体用2.5％的戊二醛固定，按照扫描电镜的标准操作制备样本，再用Hitachi SU8010进行观察。

结果如图3所示，PBS(阴性对照)处理的嗜水气单胞菌的呈现出规则的、平滑的和完整的表面(图3A)，而太湖白鱼LEAP-2处理组的嗜水气单胞菌的膜表面发生显著的变化，表面形成许多突起的囊泡甚至穿孔，有的细菌表面还覆盖了一些不规则的细菌碎片(图3B)。

实施例6:太湖白鱼LEAP-2与氨苄青霉素具有协同效应

进一步地，用棋盘检测的方法，评价了太湖白鱼LEAP-2与氨苄青霉素是否具有协同作用。在96孔板中，同时加入太湖白鱼LEAP-2和氨苄青霉素稀释的二倍稀释液，两者的浓度均为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0.78125μg/mL、0.390625μg/mL、0.1953125μg/mL或0.09765625μg/mL，每孔各加入50μL，加入后混匀。哈维氏弧菌(V.harveyi)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)培养至对数期，用新鲜的营养肉汤培养基稀释至10⁵CFU/mL，然后在加LEAP-2和氨苄青霉素的96孔板中，每孔加入100μL的菌液，37℃培养18小时后，测OD600 nm的光吸收值，检测细菌的生长情况，并计算太湖白鱼LEAP-2和氨苄青霉素之间的分级抑制浓度指数(fractionalinhibitory concentration index，FICI)。

结果如表4所示，在对哈维氏弧菌(V.harveyi)的抗菌检测时，联合使用太湖白鱼LEAP-2和氨苄青霉素的FICI值为0.375，具有协同效应；在对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的抗菌检测时，联合使用太湖白鱼LEAP-2和氨苄青霉素的FICI值为0.5，也具有协同效应。表明太湖白鱼LEAP-2与氨苄青霉素具有协同抗菌效应。

表4.太湖白鱼LEAP-2与氨苄青霉素具有协同效应

a使用以下公式计算分级抑制浓度指数(FICI)：FICI＝FIC(氨苄青霉素)+FIC(LEAP-2)，其中氨苄青霉素的FI＝组合使用氨苄青霉素的MIC/单独使用氨苄青霉素的MIC，LEAP-2的FIC＝组合使用LEAP-2的MIC/单独使用LEAP-2的MIC。FICI≤0.5时，表示氨苄青霉素和LEAP-2具有协同效应，0.5≤FICI≤1.0时，表示氨苄青霉素和LEAP-2具有累加效应，1.0≤FICI≤4.0时，表示氨苄青霉素和LEAP-2不具有相互作用，而FICI＞4.0时，表示氨苄青霉素和LEAP-2具有拮抗效应。以上表格中的浓度为重复进行的三个独立实验的平均值。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 太湖白鱼来源的抗菌肽及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 1

Met Thr Pro Leu Trp Arg Ile Met Leu Leu Phe Lys Pro His Ala Leu

1 5 10 15

Cys Gln Asn Asn Tyr Ala Cys Ser Thr Gly Leu Cys Arg Tyr Gly His

20 25 30

Cys Ser Ala Leu Gln Thr Ile Leu Ser

35 40

<210> 2

<211> 123

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 2

atgaccccct tatggcggat catgttactc tttaaacctc acgccctttg ccagaacaat 60

tatgcttgct caacaggact gtgcaggtat ggccactgtt ccgctctgca aacaatacta 120

tct 123

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 3

Met Gln Thr His Pro Asn Arg Gly Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Val Ile Val Gln Gln Val Thr Cys Asn Pro Val Pro Trp Ser

20 25 30

Asp Thr Pro Ser Ala Glu Ile Val Ser Val Gln Thr Glu Leu Lys Arg

35 40 45

Ser Ala Arg Met Thr Pro Leu Trp Arg Ile Met Leu Leu Phe Lys Pro

50 55 60

His Ala Leu Cys Gln Asn Asn Tyr Ala Cys Ser Thr Gly Leu Cys Arg

65 70 75 80

Tyr Gly His Cys Ser Ala Leu Gln Thr Ile Leu Ser

85 90

<210> 4

<211> 522

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 4

atgcagaccc accccaacag aggtgctctt ctagccctgt gcctggtgtt tttggtgatc 60

gtccagcagg taacctgcaa cccagtgcct tggtcggaca caccatcagc cgaaatcgtg 120

tcagttcaaa ccgaactgaa gagatctgct aggatgaccc ccttatggcg gatcatgtta 180

ctctttaaac ctcacgccct ttgccagaac aattatgctt gctcaacagg actgtgcagg 240

tatggccact gttccgctct gcaaacaata ctatcttaaa acgaagactc cgtctttgct 300

ctctgatctg acgtttttac atcatgcatg acaagagctt aattcagtga acaacagggg 360

caactgaatg tgcaatgcag ttaataatca gttagacata tagtcaaggc tagggctgac 420

tcctctaaag ccacagagga ggcaatatgt aatcttcaga gtattgggct tatcataagg 480

tacataacgt gtactctttt gtgagtgtac aaaaaaaaaa aa 522

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 5

Met Gln Thr His Pro Asn Arg Gly Ala Leu Leu Ala Leu Cys Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Val Ile Val Gln Gln Val Thr Cys Asn Pro

20 25

<210> 6

<211> 23

<212> PRT

<213> (人工序列)

<400> 6

Val Pro Trp Ser Asp Thr Pro Ser Ala Glu Ile Val Ser Val Gln Thr

1 5 10 15

Glu Leu Lys Arg Ser Ala Arg

20

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：编码所述抗菌肽的核苷酸序列包括SEQID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的抗菌肽，其特征在于：编码所述抗菌肽的核苷酸序列包括SEQID NO.4所示的核苷酸序列。

5.权利要求1-4中任一项所述的抗菌肽在制备水产养殖动物的抗水产菌的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述水产养殖动物包括太湖白鱼。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：水产菌包括温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌和霍乱弧菌中的一种或几种。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抗水产菌的药物中还包括氨苄青霉素。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗水产菌的药物中抗菌肽和氨苄青霉素的质量比为1:1-4:1。