CN102746389A - 一种链球菌粘附性抗原gapdh及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种链球菌粘附性抗原GAPDH及其制备方法。所述GAPDH为rGAPDH，具有高度的保守性和序列同源性，由319个氨基酸残基组成，分子量为32.4kDa，所述rGAPDH由gapdh基因编码，所述gapdh基因的正向引物在5’，反向引物在3’各有1个酶切位点。GAPDH的制备方法，包含以下步骤：PCR扩增，与载体连接，转化和诱导，纯化。rGAPDH和SEZ康复猪血清表现良好的免疫反应，rGAPDH可以局限性保护已感染SEZ的小鼠，rGAPDH免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度，anti-GAPDH抗体可以诱导高水平的杀菌能力，gapdh基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平比体外培养的转录水平高很高，并且高于体外培养的转录水平，rGAPDH可以明显削弱SEZ粘附细胞的能力，并且可以使得SEZ侵染细胞的能力也大大减弱。

Description

一种链球菌粘附性抗原GAPDH及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种链球菌的抗原，尤其涉及一种链球菌粘附性抗原GAPDH及其制备方法。

背景技术

链球菌是一种常见的致病菌，根据细胞壁多糖抗原不同，可分为A、B、C…、V（缺I和J）20个群，其中对人致病的主要为A群链球菌(Group A Streptococci，GAS),其他各群对动物致病。在家畜和家禽中发生的链球菌感染，主要为B链球菌(Group B Streptococci，GBS)和C群链球菌(Group C Streptococci，GCS)等群溶血性链球菌，如由B群引起的牛乳腺炎和猪脓疱症；由C群引起的马腺疫以及羊、猪败血型链球菌感染。

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus zooepidemicus，SEZ)是兰氏C群β溶血性链球菌，可以导致败血症、脑膜炎、化脓性关节炎、心内膜炎，还有马、猪、羊、牛等哺乳动物的乳房炎。SEZ还是一种传播人畜共患传染病病毒的重要介质，人们通过接触病患，挤牛奶或者其它日常工作而感染。由于对SEZ毒力因素和保护性抗原一直缺乏全面了解，从而很难有效控制SEZ的感染。因此，预防这种病菌的传播依赖于严格的控制措施。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是在糖酵解过程中催化甘油醛-3-磷酸转化成甘油酸-1，3-二磷酸的酶，也是大多数细菌表面的多功能蛋白。GAPDH通过与纤溶酶原、纤连蛋白、转移蛋白和粘蛋白等多种蛋白质的结合，从而与多种病原的致病性密切相关，有助于病原体对宿主组织的粘附和入侵。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种链球菌粘附性抗原GAPDH。

一种链球菌粘附性抗原GAPDH，为GAPDH重组蛋白(rGAPDH)，由319个氨基酸残基组成，分子量为32.4kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述马链球菌兽疫亚种粘附性抗原GAPDH具有高度的保守性和序列同源性。

所述GAPDH重组蛋白由gapdh基因编码，gapdh基因的正向引物有1个BamHI酶切位点，反向引物有1个EcoRI酶切位点。

所述链球菌粘附性抗原GAPDH的制备方法，包含以下步骤：

PCR扩增：使用链球菌基因组为模板，使用相应引物进行PCR扩增；

与载体连接：PCR产物使用限制性酶酶切后与经同样限制性酶酶切后的pET-28a载体连接；

转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌后，孵育到指数生长期，加入IPTG诱导；

纯化：收集菌液，离心，上清液的目标蛋白经过Ni-NTA色谱进行纯化，获得纯化的重组蛋白。

所述链球菌粘附性抗原GAPDH在制备链球菌疫苗中的应用。

应用所述链球菌粘附性抗原GAPDH制备链球菌疫苗的方法为：将成功表达并纯化的重组蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后作为疫苗，浓度为100μg/mL。

本发明与现有技术相比，首先通过PCR技术获得目的基因gapdh，使用大肠杆菌诱导表达rGAPDH，rGAPDH和SEZ康复猪血清表现良好的免疫反应，rGAPDH可以局限性保护已感染SEZ的小鼠，anti-rGAPDH小鼠二免血清对小鼠有明显的被动免疫保护，此外，rGAPDH免疫后的小鼠血清中表现高水平的抗体滴度，anti-GAPDH抗体可以诱导高水平的杀菌能力，gapdh基因在SEZ感染的小鼠体内的转录水平高于体外培养的转录水平，rGAPDH可以明显削弱SEZ粘附细胞的能力，并且可以使得SEZ侵染细胞的能力也大大减弱。

附图说明

图1.SEZ C55138菌株gapdh基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中，左边第1泳道为Mark，其余泳道为SEZ C55138菌株的gapdh基因。

图2.rGAPDH的SDS-PAGE和免疫印迹分析结果图。泳道1-3分别是大肠杆菌非诱导、诱导表达的rGAPDH蛋白和Ni-NTA纯化的rGAPDH蛋白。泳道4是rGAPDH蛋白与SEZ康复猪血清的免疫印迹分析结果，最左边为分子Marker。

图3.表示rGAPDH在小鼠体内诱导产生的免疫反应。（A）免疫组的GAPDH/IgG水平显著高于阴性对照组的抗体水平。（B）GAPDH可以诱导一个起主导地位的IgG1反应类型。

图4.表示GAPDH免疫组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠，经SEZ攻毒后，小鼠的存活率。GAPDH抗原免疫和SEZ灭活疫苗（阳性对照）对小鼠表现显著的保护能力，而正常血清（阴性对照）不能保护小鼠。

图5.是小鼠全血杀菌能力分析，SEZ灭活疫苗血清（阳性对照）的杀菌能力最强，而重组蛋白GAPDH血清的杀菌能力高于正常血清（阴性对照）。

图6.显示了定量PCR分析结果，结果显示，gapdh基因在小鼠体内有较高的转录水平，并且该转录水平量高于体外培养的转录水平。

图7.表示流式细胞分析GAPDH粘附Hep-2细胞的结果。（A）表示未标记的细胞量。（B）使用GAPDH处理后细胞的荧光信号强度。

图8.rGAPDH对SEZ侵染Hep-2细胞的抑制作用。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例和附图做进一步说明。

实施例一、菌株与生长条件

菌株采用SEZ C55138菌株；培养基为TSB培养基中或者含5％胎牛血清的TSA培养基；在37℃振荡培养约8h，或OD600达到0.6-1.0。

载体为大肠杆菌pET-28a，感受态细胞为大肠杆菌BL21。

SEZ C55138菌株、pET-28a载体和大肠杆菌BL21感受态细胞三者均为市购产品。

实施例二、制备方法

GAPDH重组蛋白由gapdh基因编码，所述gapdh基因正向引物有1个BamHI酶切位点，反向引物有1个EcoRI酶切位点。所述正向和反向游引物由NCBI数据库基因组序列(GenbankCP001129.1)设计而来。

马链球菌兽疫亚种保护性抗原GAPDH的制备方法，包含以下步骤：

PCR扩增：使用C55138的基因组为模板，使用下述引物进行PCR扩增；

正向引物(SEQ ID NO.3)：5’-TCTTGGATCCCGTCTTATCC-3’（下划线部分为BamHI酶切位点），

反向引物(SEQ ID NO.4)：5’-CATTTCGTTGAATTCCCAT-3’（下划线部分为EcoRI酶切位点）；

与载体连接：PCR产物使用限制性酶酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pET-28a载体连接；

转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21后，在37°C环境孵育到指数生长期，加入1mM IPTG诱导，在37°C环境孵化3h；同时做非诱导对照试验。

纯化：收集菌液，离心，上清液中的目标蛋白经过Ni-NTA色谱纯化后获得纯化的重组蛋白。

免疫印迹分析：纯化后的重组蛋白，使用感染过SEZ的康复猪血清作为一抗，羊抗猪IgG(H+L)-HRP作为二抗进行免疫印迹分析。

所述的C55138的基因组由常规方法从C55138中提取获得。

引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所述限制性内切酶为BamHI和EcoRI。

IPTG即异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，带有lacZ基因载体DNA以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。

实验结果1：从SEZ C55138菌株中提取的gapdh基因(SEQ ID NO.1)，由1054个碱基组成，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。将SEZ C55138菌株的gapdh基因与马链球菌种属中其他菌株的基因序列比对，结果显示GAPDH在马链球菌种属中有高度保守性和高度的序列同源性（见表1）。其中，SEZ C55138菌株gapdh基因和SEZ MGCS10565菌株gapdh基因序列同源率为100％。SEZ C55138菌株gapdh基因克隆到表达载体上表达出了319个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO.2)，分子量为32.4kDa。

表1不同SEZ菌株间GAPDH序列同源性

实验结果2：比较诱导和非诱导培养的细菌，可以证明蛋白表达成功，诱导蛋白的条带与预测的大小相一致。通过Ni-NTA亲和层析的方式获得纯化重组蛋白，该蛋白与感染SEZ的康复猪血清表现良好的免疫反应（见图2）。

实施例三、小鼠免疫接种与攻毒试验

1、20只4周龄BALB/c雌鼠，随机分成2组，每组10只；

2、实验组：50μg纯化的rGAPDH用弗氏完全佐剂乳化后，腹腔注射免疫第1组小鼠，14天后，以弗氏不完全佐剂乳化相同抗原，以同样的方式第二次注射免疫小鼠；

3、对照组：向第2组小鼠注射经弗氏完全佐剂和不完全佐剂乳化的PBS做对照；

4、所有小鼠免疫10天后，尾静脉取血获得血清，然后使用SEZ C55138菌株（2×10⁵CFU/mL）攻毒；

5、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：在二免rGAPDH 10天后采集小鼠血清，检测抗体滴度实验组GAPDH特异性IgG的水平（p<0.001）明显比阴性对照组（图3A）要高。

为了揭示免疫反应的类型，利用酶联免疫吸附特异鼠IgG1和IgG2a对亚类反应进行了评估。IgG1与Th2类反应相关，而IgG2a与Th1类反应相关。这些实验结果在一定程度上反映了免疫反应的类型，rGAPDH可诱导高浓度IgG1和IgG2a（IgG1>IgG2a）的表达（图3B）。

结果表明rGAPDH可以引起特异的免疫反应，并产生相应的抗体。

实施例四、被动保护试验分析

为了证实保护是归功于GAPDH特殊的刺激免疫反应，用anti-rGAPDH小鼠二免血清被动免疫小鼠，然后再实行攻毒试验。

1、30只6周龄BALB/c雌鼠，随机分成3组，每组10只；

2、实验组：用100μl anti-rGAPDH二免血清静脉注射免疫第1组小鼠；

3、阳性对照组：用SEZ灭活疫苗的二免血清静脉注射免疫第2组小鼠；

4、阴性对照组：用正常血清静脉注射免疫第3组小鼠；

5、免疫24h后，所有小鼠用SEZ C55138攻毒（2×105CFU/mL）；

6、观察并记录所有小鼠的生长情况。

实验结果：1）阳性对照组小鼠在攻毒试验中存活下来；

2）实验组小鼠在攻毒后表现一些临床症状，例如被毛粗乱、精神萎靡、对刺激反应迟缓等，但小鼠的存活率达90％。

3）阴性对照组小鼠，3天后全部死亡（见图3）。

结果表明GAPDH对小鼠有明显的被动免疫保护能力。

实施例五、抗体滴度测定

血清IgG滴度用ELISA测定，将纯化的重组蛋白包被在酶联板上，将二免10天后的小鼠采血分离血清，连续倍比稀释后，各个稀释度取100μl加入酶联板，37°C反应后加入兔抗鼠IgG，用酶标仪读取OD值，取OD值大于对照血清平均OD值+3倍方差SD（标准差）的血清最大稀释倍数作为血清抗体。为了推断免疫类型，IgG1和IgG2a分别进一步作为对照用于测定Th2和Th1的免疫反应。

实验结果1：免疫组的IgG滴度GAPDH抗体水平显著高于阴性对照组的抗体水平(p<0.001)（见图3A）。

结果表明GAPDH可以诱导显著的Th1-/Th2免疫反应，并且IgG1与IgG2在小鼠体内的反应，IgG1占主导地位（见图3B）。

实施例六、全血致死量分析

为了测定anti-rGAPDH抗体的杀菌活性，将小鼠肝素抗凝全血、SEZ细菌与GAPDH抗体或对照血清共孵育，评价SEZ的生存能力。

1、SEZ菌培养到指数生长中期，PBS调整细菌浓度为10⁴CFU/mL；

2、实验组：900μl健康小鼠血液加入肝素钠后，与100μl小鼠anti-rGAPDH血清混合；

3、阳性对照组：900μl健康小鼠血液加入肝素钠后，与100μl SEZ灭活疫苗免疫血清混合作为阳性对照；

4、阴性对照组：900μl健康小鼠血液加入肝素钠后，与100μl SEZ灭活疫苗免疫前的血清混合作为阴性对照；

5、分别向各混合液中加入100μl SEZ菌液，37°C旋转培养90min；

6、每个血液样品取3份，每份100μl，涂布于TSA平板中，计算孵育前和孵育后存活的细菌量；

7、存活率计算为剩下细菌量相对于开始时细菌量的百分比。

实验结果：阴性对照组的SEZ存活率达92.27±2.2％；阳性对照的SEZ存活率仅为9.49±2.58％；实验组的细菌存活量为37.22±6.97％（见图5）。

结果表明anti-rGAPDH抗体可以诱发高水平的杀菌能力。

实施例七、定量PCR检测体内与体外诱导基因的表达水平

为了评估小鼠体内分离细菌与体外培养细菌中gapdh基因的表达水平，使用定量PCR技术定量的测定gapdh基因的转录水平。

1、细菌从SEZ感染的小鼠体内重新获得，脾组织样品4°C，850×g，离心5min，取上清液4°C，15500×g，离心5min；

2、收获的SEZ用于提取总RNA；

3、逆转录获得cDNAs，以cDNA样品为模板做定量PCR(系统中显示绿色荧光)，所有反应一式三份；

在Real-time PCR中，使用下述引物来定量分析gapdh基因：

正向引物(SEQ ID NO.5)：5’-GCTCCTGGTGGAAACG-3’，

反向引物(SEQ ID NO.6)：5’-GCCATTGGTGCAAGACA-3’；

在Real-time PCR中，使用下述引物来定量分析16S rRNA基因：

正向引物(SEQ ID NO.7):5’-ATCCGAACTGAGATTGGC-3’，

反向引物(SEQ ID NO.8):5’-CCCTTATGACCTGGGCTA-3’。

实验结果：gapdh基因在SEZ感染的小鼠体内的表达水平比体外培养的表达水平高很多（见图6）。

结果表明gapdh基因在小鼠体内的转录水平得到提高，并且高于体外培养的转录水平。

实施例八、Hep-2细胞粘附试验分析

为了确定GAPDH是否与细菌粘附Hep-2细胞有关，我们运用细胞流式分析技术进行分析。10⁵CFU/mL的SEZ与2μg重组蛋白GAPDH孵育，然后再与SCPZ免疫过的小鼠血清孵育，IgG-FITC染色后，使用流式细胞仪进行分析。

1、使用含1％BSA的PBS 200μl（PBS-BSA）重悬Hep-2细胞，加入2μg纯化rGAPDH，冰上孵育45min；同时使用2μg的BSA代替rGAPDH作对照实验；

2、冰上预冷的PBS-BSA洗涤两次；

3、加入100μl小鼠SCPZ免疫血清，冰上孵育45min；

4、冰上预冷的PBS-BSA洗涤后，细胞与IgG-FITC冰上孵育45min；

5、冰上预冷的PBS-BSA洗涤一次，经流式细胞仪分析；

6、最后使用Beckton-Dickinson FACS-Calibur进行分析。

实验结果：rGAPDH孵育过的Hep-2细胞表面检测出显著的荧光信号，然而阴性对照没有检测出荧光信号（见图7）。

结果表明rGAPDH可以粘附Hep-2细胞。

实施例九、Hep-2细胞黏附抑制试验为了判定rGAPDH在抑制SEZ侵染Hep-2细胞过程中扮演的角色，使用单层细胞分析rGAPDH抑制细菌黏附细胞的能力，BSA作为阴性对照，10μg重组蛋白与Hep-2孵育1h，再与细菌在室温孵育1h。黏附率=（实验组黏附细菌数/对照组黏附细菌数）×100。

1、Hep-2细胞使用24孔板培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养；

2、单层细胞使用PBS洗涤3次后，与10μg/ml rGAPDH于37℃培养箱孵育2h，同样的细胞使用10μg/ml BSA处理后作对照组；

3、所有细胞使用PBS洗涤3次，使用DMEM溶解SEZ使得浓度为5×10⁷CFU/mL，取1ml菌液分别加入到每孔板中，37℃，5％CO₂条件下孵育2h；

然后，根据下面的方法对细菌的侵染能力进行评估：

4、前面孵育后的细胞，PBS冲洗多次，使未粘附的细菌尽量冲洗掉；

5、用含100μg庆大霉素和5μg青霉素的DMEM处理细胞，杀死未冲洗干净的细菌或粘附于细胞上的细菌，再用PBS冲洗细胞；

6、用0.2％Triton X-100的PBS降解细胞，琼脂糖铺板，细菌计数；

实验结果：与BSA相比，rGAPDH可以抑制41.8％的SEZ细菌量进入Hep-2细胞(p<0.05)（见图8）。

结果表明GAPDH则抑制SEZ粘附宿主细胞。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

本发明中的各实验采用常规实验方法和条件，未在本发明中条件是本领域的技术人员所熟知的，本领域的技术人员可以结合现有技术实现本发明。

Claims (7)

1.一种链球菌粘附性抗原GAPDH，其特征在于：为GAPDH重组蛋白，由319个氨基酸残基组成，分子量为32.4kDa。

2.根据权利要求1所述的链球菌粘附性抗原GAPDH，其特征在于：所述GAPDH重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的链球菌粘附性抗原GAPDH，其特征在于：具有高度的保守性和序列同源性。

4.根据权利要求1所述的链球菌粘附性抗原GAPDH，其特征在于：所述GAPDH重组蛋白由gapdh基因编码，所述gapdh基因的正向引物和反向引物各有1个酶切位点。

5.链球菌粘附性抗原GAPDH的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

PCR扩增：使用链球菌基因组为模板，使用相应引物进行PCR扩增；

与载体连接：PCR产物和pET-28a载体经限制性酶酶切后连接；

转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌后，孵育到指数生长期，加入IPTG诱导；

纯化：收集细菌，离心，来自上清液的目标蛋白经过Ni-NTA色谱进行纯化，获得纯化的重组蛋白。

6.一种链球菌粘附性抗原GAPDH在制备链球菌疫苗中的应用。

7.权利要求5所述链球菌疫苗的制备方法，其特征在于：将成功表达并纯化的重组蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化后作为疫苗，浓度为100μg/mL。

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