CN104004100A - 猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明所述的猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichiapastoris的优点，其编码基因可以在Pichiapastoris中高效表达，降低了抗菌肽的生产成本，将此融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用，是一种优良的抗癌药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。

Description

猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用。 

背景技术

    到目前为止，癌症的发生率以及死亡率都在急剧攀升，虽然在癌症研究付出了巨大的代价，但是由于诸多的原因给癌症的治疗带来了巨大的困难。其中传统化疗药物的广泛使用导致的多重耐药性的问题是主要原因之一，另外，化疗药物也存在严重的副作用。近年研究发现，一些抗菌肽除了抗微生物的活性外，对肿瘤细胞也具有杀灭作用。抗菌肽是生物体内产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性及毒副作用等优点，由于抗菌肽特殊的作用机制，使得病原微生物和肿瘤细胞不容易对其产生耐药性。随着研究的不断深入，越来越显示出了其在医学、兽医学等相关领域的独特应用价值。NK-lysin由78个氨基酸残基组成，属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族，是由自然杀伤细胞和T淋巴细胞分泌表达的一种具有抗微生物和抗肿瘤活性的多肽。NK-lysin蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物寄生虫和肿瘤细胞都有溶解活性。将NK-lysin蛋白作为一种抗癌药物进行开发和利用将产生很高的经济价值和巨大的社会效益，但采用提取或合成的方法生产NK-lysin蛋白的工艺复杂，获取量少，且成本较高，无法满足市场需求，提高NK-lysin蛋白产量是一个急需解决的问题。 

发明内容

本发明利用猪抗菌肽NK-lysin和Pichiapastoris的优点，提供了一种猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的：猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。 

所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的编码基因是由编码猪NK-lysin成熟肽的cDNA序列、6个组氨酸cDNA序列和限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ位点的cDNA序列以及符合酵母表达偏好性的基因序列组成的。 

本发明所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的制备方法为： 

表达载体的构建：人工合成的NK-lysin的基因序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，将NK-lysin的基因序列和表达质粒pwPICZalpha用同样的限制性内切酶酶切后连接在一起，通过双酶切检测和筛选含有NK-lysin的基因序列的克隆；

酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶线性化重组表达质粒，通过电转化的方法，将NK-lysin的基因序列整合到酵母的基因组中；将转化后的菌体悬液涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养3-4d；挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，SDS-PAGE检测表达上清确认阳性克隆；

重组蛋白的纯化和活性检测：挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，表达上清采用ProteinPure Ni-NTA 树脂和强阳离子交换树脂纯化，通过SDS-PAGE和Western blot检测纯化的重组蛋白；利用BCA测定浓度，计算NK-lysin重组蛋白（融合蛋白）的产量。

本发明所述的猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白很好地利用了抗菌肽和Pichia pastoris的优点，其编码基因可以在Pichia pastoris中高效表达，降低了抗菌肽的生产成本，将此融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用，是一种优良的抗癌药物，具有很高的经济价值和巨大的社会效益。 

附图说明

图1 是ProteinPure Ni-NTA 树脂纯化NK-lysin的SDS-PAGE电泳图。 

图2 是强阳离子交换树脂纯化NK-lysin的SDS-PAGE电泳图。 

图3 是重组NK-lysin的Western blot分析图。 

图4 是重组NK-lysin的杀伤肿瘤细胞的分析图。 

具体实施方式

1、所用试剂及其配制 

（1）LB（Luria-Bertani）液体培养基：取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl5g，溶解于800mL ddH₂O中，10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌（121℃，1.034×10⁵Pa）20min，4℃保存。

（2）LB（Luria-Bertani）固体培养基：按每1000mL ddH₂O加15g琼脂粉，向LB液体培养基中加入琼脂粉，高压灭菌，4℃保存。 

（3）贮备液： 

10×YNB（13.4%，含硫酸铵而不含氨基酸）：将34g YNB和100g硫酸铵热溶于1000mL ddH₂O中，过滤除菌，4℃保存。

500×生物素（0.02%）：20mg生物素溶于100mL ddH₂O中，过滤除菌，4℃保存。 

10×葡萄糖（20%）：200g葡萄糖溶于1000mL ddH₂O中，高压灭菌，4℃保存。 

10×甲醇（5%甲醇）：5mL甲醇与95mL ddH₂O混匀，过滤除菌，4℃保存。 

10×甘油（10%甘油）：100mL甘油与900mL ddH₂O混匀，过滤除菌或高压灭菌，室温保存。 

1M磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0：132mL 1M K₂HPO₄与868mL 1M KH₂PO₄混合，高压灭菌，室温保存。 

10×酸水解酪素（10%酸水解酪素）：100g酸水解酪素溶于1000mL ddH₂O中，高压灭菌，4℃保存。 

（4）YPD培养基（1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH₂O中，加入20g琼脂制YPD板，高压灭菌，再加100mL 10×葡萄糖，4℃保存备用。 

（5）YPG培养基（1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%甘油）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于900mL ddH₂O中，高压灭菌，再加100mL 10×甘油，4℃保存备用。 

（6）BMMYC培养基（1.34%YNB、4×10^-5%生物素、0.5%甲醇、1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%酸水解酪素）：10g酵母提取物、20g蛋白胨溶于600mL ddH₂O中，高压灭菌，冷却至室温，加100mL 1M磷酸氢二钾缓冲液，pH=7.0、100mL 10×YNB、2mL 500×生物素、100mL 10×甲醇、100mL 10×酸水解酪素混匀，4℃保存。 

（7）缓冲液： （50 mM磷酸钠，0.3 M氯化钠，10 mM咪唑和10 mM pH 8.0 Tris-HCl）；（50 mM磷酸钠，0.3 M氯化钠，500mM咪唑和10 mM pH 8.0 Tris-HCl）；（20 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，5% 甘油）；（20 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，5% 甘油，100 mM硼砂）；（20 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，5% 甘油，200 mM硼砂）。 

2、NK-lysin基因序列的优化和获得 

根据NCBI登陆的小鼠NK-lysin基因序列(GeneID:396869)和酵母菌密码子偏好性，对NK-lysin的基因序列进行优化，为了便于纯化，在C端加入6个组氨酸（6×His tag），在序列的5’和3’端引入XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点。优化后的NK-lysin基因序列由Invitrogen公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、表达载体的构建 

利用XhoⅠ和EcoRⅠ两个限制性内切酶对合成的NK-lysin和质粒pwPICZalpha进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖电泳并采用胶回收试剂盒回收DNA片段并进行连接。

在无菌Eppendorf管中7μL双酶切的目的基因片段，1μL双酶切的质粒，1μL T4连接酶，1μL连接酶缓冲液，混匀，4℃连接12h；将10μL连接产物加入到90μL感受态大肠杆菌TOP10中，混匀，42℃热激90s转化，加入400μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h，将菌液涂布在Zeocin抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒提取质粒。用XhoⅠ和EcoRⅠ对连接产物进行双酶切鉴定，验证基因片段正确插入，该重组质粒命名为pwPICZalpha-NK-lysin。 

4、融合蛋白的表达 

1）小剂量诱导表达

利用限制性内切酶SacⅠ将5-10μg重组质粒pwPICZalpha-NK-lysin进行线性化，采用PCR产物纯化试剂盒回收线性化的pwPICZalpha-NK-lysin，加入到90μL感受态毕赤酵母X-33中，混匀，冰浴5min后电击转化，加入1mL山梨醇后，30℃放置2h，将菌液涂布在Zeocin抗性的YPD固体培养基上，30℃培养3-4d。从转化的平板上挑取6个菌落接种到含Zeocin的5mL YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入5mL YPG液体培养基，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入2mL BMMYC液体培养基，27℃225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。

2）大剂量诱导表达 

挑取一个阳性菌落接种到YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h作为种子培养液，取13mL种子培养液接种到250mL YPD液体培养基中，30℃250rpm培养24h，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心，弃上清后加入250mL YPG液体培养基，30℃250rpm培养24h，3500rpm离心弃掉上清，加入125mL BMMYC液体培养基，27℃225rpm培养48h，每隔12h补充一次甲醇，使甲醇浓度维持在0.5%。3500rpm离心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。

5、融合蛋白的纯化 

1）ProteinPure Ni-NTA树脂纯化

在诱导表达的上清液中加入终浓度为50mM磷酸钠，0.3M氯化钠，10mM咪唑和10mM pH 8.0 Tris-HCl，用0.45μm滤器过滤。取10mL ProteinPure Ni-NTA树脂装入XK16/20层析柱中，柱子装好后与恒流泵相连，用10倍体积的平衡柱子，平衡好后上样，上样结束后用8倍体积的冲洗柱子，再用8倍体积的Buffer Ⅱ洗脱目的蛋白并收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，图1中的SDS-PAGE结果显示，目的蛋白集中在的2号和3号管中。将含有目的蛋白的Buffer Ⅱ混合，装入3.5kDa透析袋中，在4℃条件下用含有20mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA pH8.0，5%甘油的透析液透析8h，每隔4h换一次透析液。

2）强阳离子交换树脂纯化 

取10mL强阳离子交换树脂装入XK16/20层析柱中，柱子装好后与恒流泵连接，用10倍体积的Buffer Ⅲ平衡柱子，将透析好的样品上样，上样结束后用8倍体积的Buffer Ⅲ冲洗柱子，再分别用8倍体积的和洗脱目的蛋白，并将洗脱液收集到8个不同的管中，整个过程的流速为5mL/min。用SDS-PAGE对纯化的蛋白进行分析，由图2可知目的蛋白集中在的3、4、5、6、7和8管中，将含有目的蛋白的混合，采用超滤浓缩的方法对目的蛋白进行浓缩，然后装入3.5kDa的透析袋中，在4℃条件下用含有5%甘油的PBS透析8 h，每隔4 h换一次PBS。用BCA试剂盒测定目的蛋白浓度，蛋白浓度为0.6mg/mL，1L培养液产量约为12mg，为说明该蛋白基因在毕赤酵母中得到高效表达。利用抗His标签抗体对该蛋白进行western blot分析，由图3结果确证其为所要表达的蛋白。

4、MTT法检测NK-lysin抑制肿瘤细胞生长的活性 

用2.5g/L胰蛋白酶消化并收集处于对数生长期的SMMC-7721细胞，调整细胞密度，接种至96孔培养皿中，每孔100μl，置于5%CO₂培养箱37℃培养12h后弃去培养液，每孔加入100μl不同浓度的NK-lysin，每一浓度设3个复孔，再加入等体积的新鲜培养基，置于5%CO₂培养箱37℃培养24h，同时设细胞对照（只加200 μl培养基），弃上清，每孔加入20 μl MTT，继续培养4 h后，弃MTT，每孔加入150 μl DMSO，震荡5～10 min，待结晶完全溶解后，酶标仪测490nm处的OD值（同时以630 nm作为参比波长）。按以下公式计算对细胞生长的抑制率：

  图4的结果表明，，NK-lysin能够抑制肝癌细胞SMMC-7721的生长，随着培养时间的延长，抑制率逐渐升高，在72 h抑制率可达到70%，且呈现浓度依赖性，通过计算得出NK-lysin对SMMC-7721细胞的IC₅₀值为22.6 μM。

〈110〉山西农业大学   太原师范学院

〈120〉猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白及其编码基因与应用

〈160〉2

〈210〉1

〈211〉285

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉

〈222〉(1)…(285)

〈400〉1

CTCGAGAAGA GAGAGGCTGA AGCTGGTTTG ATTTGTGAGT CTTGTAGAAA GATTATCCAA    60

AAGTTGGAGG ACATGGTTGG TCCACAACCA AACGAGGACA CTGTTACTCA AGCTGCTTCT    120

AGAGTTTGTG ACAAGATGAA GATTTTGAGA GGTGTTTGTA AGAAGATTAT GAGAACTTTC    180

TTGAGAAGAA TTTCTAAGGA CATTTTGACT GGTAAGAAGC CACAAGCTAT TTGTGTTGAC    240

ATTAAGATTT GTAAGGAGCA CCACCACCAC  CACCACTAAG   AATTC                     285

 

〈210〉2

〈211〉68

〈212〉PRT

〈213〉人工序列

〈400〉2

Met  Val  Gly  Pro  Gln  Pro  Asn  Glu  Asp  Thr  Val  Thr  Gln  Ala  Ala  Ser  Arg  Val  Cys  Asp   Lys  Met   Lys  Ile   Leu   25

Arg  Gly Val   Cys  Lys   Lys   Ile   Met   Arg  Thr   Phe  Leu  Arg  Arg Ile  Ser Lys Asp  Ile  Leu  Thr   Gly  Lys   Lys  Pro  50

Gln  Ala  Ile  Cys   Val   Asp  Ile   Lys   Ile  Cys   Lys  Glu  His  His  His  His His  His   68

Claims (3)

1.猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。

3.权利要求1所述猪抗菌肽NK-lysin融合蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。