CN111004795A - 一种提高d-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶异源表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明中D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的基因来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。通过密码子优化处理，将优化后的，编码DPE蛋白的基因序列(DPE(O))载入表达质粒pET22b，构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b‑DPE(O)。发明进一步优化基因工程菌诱导表达DPE蛋白的具体条件，从而确定了提高D‑阿洛酮糖‑3差向异构酶异源表达的具体方法，最后确定，在pH为8.5～9.0的LB培养基中，接种量为2％，装液量为50％时，BL21(DE3)/pET22b‑DPE(O)菌体培养3～4h后，加入0.3～0.5mM IPTG，30℃，180～200rpm条件下诱导5h，重组DPE蛋白的表达量最高,为2.1g/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术中的基因工程和发酵工程两个领域，具体涉及将根 癌农杆菌D-阿洛酮糖-3差向异构酶基因的密码子优化后，构建其表达载体和异 源表达宿主；对重组基因工程菌的表达条件进行优化，从而提高重组D-阿洛酮 糖-3差向异构酶蛋白的表达量；最终体外分离、纯化，获得高纯的重组D-阿洛 酮糖-3差向异构酶蛋白。
背景技术
稀有糖是指，在自然界中存在，但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀有糖 作为新型的功能型甜味剂，已被广泛应用于膳食、医药和保健等领域。
D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，是自然界中含量非常低的稀有糖。D- 阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％，但是能量只有蔗糖的10％，因此，有望成为蔗 糖的理想替代品。2011年，D-阿洛酮糖被美国FDA认证可在食品和膳食领域作 为添加剂使用。
在医药领域，D-阿洛酮糖可以显著抑制血糖浓度的上升，提高葡萄糖的耐受 性；还可以抑制脂肪酶和a-糖苷酶，从而降低体内脂肪的积累。此外，D-阿洛酮 糖还具有一定的抗氧化作用，能有效地清除活性氧自由基，在治疗神经退行性等 相关疾病中也具有潜在的应用前景。
但是，D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，外源转化是必经之路。化学途径法 由于副产物多，后续纯化及其复杂，因此，生物酶转化法是目前的研究热点。在 众多来源的酶中，来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖-3差向异构酶，能够将廉价 的D-果糖转化为D-阿洛酮糖，且转化率较高，约为33.5％，且反应条件温和、 副产物少、纯化步骤简单。
近几年，来源于不同微生物的D-阿洛酮糖-3差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)被逐渐发现，并在宿主中进行外源表达，从而获得大量的D- 阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白。
发明内容
针对现有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在大肠杆菌内表达、合成过程中所存在 的宿主密码子偏好性的限制，本发明针对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(At-D-psicose 3-epimerase,GenBank: KX098480.1)的密码子进行分析，设定优化方案，化学合成了D-阿洛酮糖-3-差 向异构酶的新的编码序列DPE(O)。将新合成的序列导入表达载体pET22b中， 成功构建了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶异源表达的重组宿主菌BL21(DE3)/ pET22b-DPE(O)。对基因工程菌的表达条件进行优化，从而确定了提高D-阿洛 酮糖-3差向异构酶异源表达的一种具体方法。
本发明的发明构思是：
发明人将利用大肠杆菌表达宿主异源高效表达D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋 白。首先，根据大肠杆菌密码子使用的偏好性，对D-阿洛酮糖-3差向异构酶基因 的密码子进行优化，构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)；进一步 优化其异源表达条件，从而确定了提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的具体 方法。
本发明第一个目的在于，为了降低目标蛋白在异源宿主表达过程中的限制作 用，对来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的密码子进行优化。
本发明的技术方案是：确定20种氨基酸其所对应密码子在大肠杆菌的使用频 率，在此基础上对根癌农杆菌的D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白的密码子进行优 化，并化学合成了D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白的新的编码序列。原始序列如SEQ ID NO.1所示，新的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应的D-阿洛酮糖-3差向异 构酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明第二个目的在于，提供一种能异源表达具有活性的D-阿洛酮糖3-差向 异构酶的重组基因工程菌。
本发明采用的技术方案是：
S1.将优化的D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白的编码序列连接至表达载体 pET22b上，构建重组表达质粒pET22b-DPE(O)；并转化大肠杆菌表达宿主，制备 重组表达宿主BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)，用于表达来源于根癌农杆菌的D-阿 洛酮糖3-差向异构酶。
S2.重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)诱导表达D-阿洛酮糖-3差 向异构酶后，利用静息细胞法转化D-阿洛酮糖，通过高效液相色谱测定，从而 确定重组基因工程菌表达的D-阿洛酮糖-3差向异构酶具有活性。
本发明第三个目的在于，优化重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O) 诱导表达D-阿洛酮糖-3差向异构酶的发酵条件，提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶 的异源表达。
为实现上述目的，采用的技术方案是：分别优化诱导剂浓度及其加入时间、 诱导时间、诱导温度、培养基pH、接种量、装液量及转数，检测其对重组基因 工程菌异源表达的D-阿洛酮糖-3差向异构酶产量的影响。最终确定，一种利用 重组表达宿主BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表 达的方法。即，在pH为8.5～9.0的LB培养基中，接种量为2％，装液量为50％ 时，BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)菌体培养3～4h后，加入0.3～0.5mM IPTG， 30℃，180～200rpm条件下诱导5h，重组DPE蛋白的表达量最高，可以达到2.1 g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明克服了现有D-阿洛酮糖-3- 差向异构酶在大肠杆菌内表达、合成过程中所存在的宿主密码子偏好性的限制， 构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)，优化后的诱导表达DPE蛋白， 目的蛋白含量是未优化前的2.4倍，效果显著。
附图说明
图1pET 22b-At-DPEase(O)重组质粒图。
图2SDS-PAGE检测重组蛋白At-DPEase预表达的情况；其中，M：蛋白 marker(10，15，25，35，60，180KDa)；1：未加IPTG上清；2：未加IPTG 沉淀；3：16℃，1mmol/L IPTG上清；4：16℃，1mmol/L IPTG沉淀。
图3HPLC鉴定重组基因工程菌表达的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活情 况；其中，a：D-阿洛酮糖标品；b：D-果糖标品；c：静息细胞转换液。
图4SDS-PAGE检测诱导时间影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，图 a-M：蛋白marker(15，25，35，45，60，80，80Kda)；1：0h上清；2：2h 上清；3：3h上清；4：4h上清：5：5h上清；6：6h上清。
图b-M：蛋白marker(15，25，35，45，80，180Kda)；1：0h上清；2： 5h上清；3：8h上清；4：10h上清；5：12h上清；6：16h上清；7：18h上 清。
图5 SDS-PAGE检测IPTG浓度影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M： 蛋白marker(10，15，25，35，45，60，80，10，140，180Kda)；1：0mmol/L 上清；2：0.1mmol/L上清；3：0.3mmol/L上清；4：0.5mmol/L上清；5：1mmol/L 上清；6：1.5mmol/L上清；7：2mmol/L上清。
图6SDS-PAGE检测不同时期加入IPTG影响At-DPEase蛋白表达的情况；其 中，M：蛋白marker(15，25，35，45，80，180KDa)；1：0h；2：0.5h；3： 1h；4：1.5h；5：2h；6：3h；7：4h；8：5h；9：6h；10：7h；11：8h； 12：9h；13：10h；14：11h；15：12h；16：13h；17:14h。
图7SDS-PAGE检测初始培养pH影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M： 蛋白marker(15，25，35，45，60，100，180Kda)；1：pH＝6.0；2：pH＝6.5；3： pH＝7.0；4：pH＝7.4；5：pH＝8.0；6：pH＝8.5；7：pH＝9.0；8：pH＝9.5；9：pH＝10。
图8SDS-PAGE检测温度影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M：蛋 白marker(15，25，35，45，60，80，140Kda)；1：16℃上清；2：20℃上清； 3：25℃上清；4：30℃上清；5：35℃上清；6：37℃上清；7：42℃上清。
图9SDS-PAGE检测接种量影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M： 蛋白marker(15，25，35，45，60，80，180KDa)；1：0.5％上清；2：1％上 清；3：2％上清；4：3％上清；5：4％上清；5：5％上清。
图10SDS-PAGE检测装液量影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M： 蛋白marker(15，25，35，45，60，80，180Kda)；1：10％上清；2：20％上清； 3：30％上清；4：40％上清；5：50％上清；6：60％上清；7：70％上清。
图11SDS-PAGE检测转速影响At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M：蛋 白marker(10，15，25，35，45，60，80，180KDa)；1：120r/mim上清；2： 150r/mim上清；3：180r/mim上清；4：200r/mim上清；5：220r/mim上清。
图12SDS-PAGE检测优化前后At-DPEase蛋白表达的情况；其中，M：蛋 白marker(10，15，25，35，45，60，180KDa)；1：优化后上清；2：未优化上 清。
图13密码子使用频率分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说 明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可 从化学公司购买。
实施例1
对来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的密码子进行优化。
本发明对大肠杆菌(E.coli)中各个氨基酸的密码子进行分析，如图13所示 为密码子使用频率分析图，在不改变氨基酸序列的前提下，将在大肠杆菌中使用 频率低于40％的D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白的密码子同义替换，改为偏好性 为100％的密码子。优化后的基因序列进行合成，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过密码子优化后，D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列与原始 氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.3所示。
表1原始序列与优化序列对照表
注：表格中
为优化后基因
实施例2
构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组表达质粒pET22b--DPE(O)及其异源表 达的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)，用于外源表达根癌农杆菌属的D- 阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白。
2.1构建重组表达载体pET22b-DPE(O)
以质粒pET22b(+)为载体，利用内切酶NdeI、Xho I对其进行双酶切，获得线 性化载体。再将合成的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的新的编码序列，通过T4连接 酶，插入质粒的NdeI、Xho I酶切位点之间，构建重组表达载体pET22b-DPE(O)。 pET 22b-DPEase(O)重组质粒构架详见图1。
2.2构建重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)
利用氯化钙法，制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞。将构建好的重组表 达质粒pET22b-DPE(O)，在45℃水浴条件下，热激90s，转化大肠杆菌 BL21(DE3)。将热激后的菌体，加入LB液体培养基，37℃，220rpm摇床孵育1 h。将转化后的重组子，涂布于含有50mg/mLAmp+的LB固体平板上，过夜培 养，筛选阳性菌落。将筛选出的阳性菌落，进行测序鉴定。通过序列比对，得到 重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)。
2.3重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)预表达D-阿洛酮糖-3差向异 构酶
在诱导重组菌表达D-阿洛酮糖-3差向异构酶的前一天，对基因工程菌 BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)进行过夜活化，37℃，200rpm，活化12～16h；将 1％的种子液接种于100mL LB液体培养基(50μg/mL Amp+)中，37℃、200r/min 培养至OD 600＝0.6～0.8时，加入1mM IPTG，16℃，200r/mim下诱导10h。
用13.5％的SDS-PAGE凝胶电泳检测BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)表达D-阿 洛酮糖-3差向异构酶蛋白的情况。蛋白电泳显示，与未经诱导的菌株比较，经过 IPTG诱导后，重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)的破碎上清液和沉淀 中，都在25-35kDa之间处有一条与D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白理论分子量 (32kDa)接近的一条蛋白条带(图2)。
这个结果表明，重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)能够成功表达 融溶的D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白。
实施例3
重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)诱导表达D-阿洛酮糖-3差向异 构酶后，利用静息细胞法转化D-阿洛酮糖，通过高效液相色谱测定，从而确定 重组基因工程菌表达的D-阿洛酮糖-3差向异构酶具有活性。
①利用重组基因工程菌的静息细胞将D-果糖转化D-阿洛酮糖：收集发酵 结束后的菌体全细胞，以Tris-HCl(50mmol/L，pH 7.5)缓冲液配置的的D-果 糖(36g/L)溶液重悬100mg/mL静息细胞(细胞湿重)，45℃，150r/mim，5h。 反应液10000g离心15min后，取上清进行检测。
②高效液相色谱分析、检测。取静息细胞转化上清液，利用微孔滤膜(0.22 μm)对上清液进行过滤，滤液进入HPLC检测系统进行分析。HPLC条件：Waters 2690高效液相色谱仪，Sugarpak-1钙型阳离子交换柱，Waters 2414示差折光检 测器。以纯水作为流动相，柱温设置为80℃，流速控制在0.5mL/min，进样量 为10μL。D-果糖与D-阿洛酮糖标样浓度为5mg/mL。
③HPLC结果发现，D-果糖标准品的特征峰为11.5min(如图3a)，D-阿洛 酮糖特征峰出现时间为16min(图3b)。反应液在相同条件下检测，发现在11.5 min和16min左右的时间均有特征峰的出现(图3c)。
④上述结果表明，基因工程菌BL21(DE3/pET 22b-At-DPEase(O)经过IPTG 诱导后，能够表达出融溶的，具有差向异构酶活性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
实施例4
分别优化诱导剂浓度及其加入时间、诱导时间、诱导温度、培养基pH、接 种量、装液量及转数，检测其对重组基因工程菌异源表达的D-阿洛酮糖-3差向 异构酶产量的影响。最终确定，一种利用重组表达宿主BL21(DE3)/ pET22b-DPE(O)提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的方法。
4.1诱导时间对D-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达的影响
4.1.1测定菌体生长曲线
取过夜活化的新鲜种子液，按1％接种量于三个500mL装有200mL的 LB/Amp+液体培养基中，在37℃，200r/mim的摇床内培养，在0-2h时，在0， 0.5，1，1.5h分别取一次样品，而在2-14h时，每隔1h取一次样品，用紫外分 光光度计分别检测菌体在600nm下的吸光值。以OD600nm对培养时间作图， 得到BL21(DE3)/pET 22b-At-DPEase(O)的生长曲线。
4.1.2诱导时间对D-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达的影响
基于前期实验，按照1％的接种量将过夜活化的新鲜种子液接种至100mL 的LB/Amp+液体培养基中(250mL摇瓶)，于37℃、200r/min条件下培养4h。 加入1mL IPTG至终浓度为1mmol/L，于16℃，200r/mim条件下诱导0、2、3、 4、5、6、8、10、12、16、18h，分别取1mL样品，SDS-PAGE电泳测定目的 蛋白含量。
结果如图4所示，在0-4h间，At-DPEase蛋白条带的灰度逐渐增加，5-6h 时达到最值。然而，随着诱导时间的加长，At-DPEase的条带灰度开始降低，诱 导时间超过6h后，基本保持不变。由此确定，在IPTG加入后诱导在5h，此时， 目的蛋白的含量达到最高。
4.2 IPTG浓度对发酵产At-DPEase的影响
本发明随后研究了IPTG浓度对D-阿洛酮糖3差向异构酶异源表达的影响。 使发酵液中IPTG终浓度分别达到0.1、0.3、0.5、1、1.5和2mmol/L，进行目的 蛋白的异源诱导表达。
结果如图5所示。添加不同浓度的IPTG进行诱导，均有目的蛋白的产生。 在3，4泳道的目的蛋白宽度与灰度明显较高，而5-7泳道的宽度与灰度开始逐 渐降低，且均低于2泳道。由此可以看出，目的蛋白的表达量在IPTG在发酵液 中为0.3～0.5mmol/L时可能最高。
4.3菌株诱导时机对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确IPTG浓度后，分别选择加入IPTG的诱导时机为0、0.5、1、 1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14h进行发酵及诱导实验， 判定最佳加入IPTC的时机。
由图6的实验结果表明，在重组基因工程菌BL21(DE3)/pET 22b-At-DPEase (O)生长过程中的不同阶段的各个时间点加入IPTG进行诱导，均可诱导目的 蛋白的表达。泳道1-7为菌体生长时间为0-4h时加入IPTG的情况，目的蛋白 的宽度与灰度整体呈现递增的趋势。其中，泳道7所示的目的蛋白的宽度为最高， 灰度为最深。随后，开始逐渐降低，虽在7-9h(10-12泳道)有小幅度的提高， 但其蛋白宽度与灰度值仍然低于4h的程度。所以，选择发酵4h，OD600nm为 1.4时，加入IPTG进行诱导为最佳，此时，生长速率最快，代谢旺盛，酶系活跃，目的蛋白的表达量最高
4.4 pH对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确菌株最佳诱导时机后，分别选择pH为6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0、8.5、9.0、9.5、10进行发酵及诱导实验，判定重组基因工程菌的最适ph。 结果表明，该重组基因工程在碱性条件下的蛋白表达量要相对高于酸性条件下， 1-9泳道目的蛋白的宽度与灰度是逐渐增加的，在ph为9.0时，为最优。图7中 明显可以看出，插入pET 22b-At-DPEase(O)质粒后的基因工程菌在偏碱性的 条件下，目的蛋白的表达量更高。
当培养基的初始pH值是酸性时，目的蛋白的表达情况和酶活受到一定的抑 制。pH偏碱性时，蛋白表达量和酶活相应提高，在pH为8.5时，均达到最高值。 而大肠杆菌可能是因为重组质粒的导入提高了大肠杆菌对碱性条件的耐受性，是 此时的目的蛋白含量与酶活达到最高。因此确定发酵培养基的初始pH为8.5。
4.5温度对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确pH后，分别选择温度为16、20、25、30、35、42℃的环境 中进行发酵及诱导实验培养，判定重组基因工程菌的最适诱导蛋白表达时的温 度。
图8结果表明，从2-7泳道目的蛋白的宽度与灰度情况，可以明显看出 At-DPEase蛋白的表达量是呈现先增加后降低的趋势。其中4泳道的目的条带宽 度最大，灰度最深。而1泳道与5泳道目的蛋白宽度与灰度几乎相同。由此可以 判定，在30℃时，At-DPEase蛋白的表达量为最高。
4.6接种量对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确诱导蛋白表达温度后，分别选择新鲜制备的种子液的接种量 为0.5、1、2、3、4、5％进行发酵及诱导实验，判定发酵时最佳的接种量。
由图9结果表明，在1-5泳道中目的蛋白宽度与灰度呈现先升高在下降的趋 势，在3泳道达到最值，此时的接种量为1％。
4.7装液量对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确接种量后，分别选择250mL摇瓶中装液量为10、20、30、 40、50、60、70％进行发酵及诱导实验，判定发酵时最适的装液量。
由图10结果表明，图中的目的蛋白At-DPEase的条带宽度与灰度从左往右 为依次递增，在5泳道时，达到最值。随后开始减少。由此可以判定，装液量为 50％时，目的蛋白的表达量为最高。
4.8转速对发酵产At-DPEase的影响
在上述实验明确装液量后，分别选择诱导蛋白表达时的转速为120、150、 180、200、220r/mim进行发酵及诱导实验，判定诱导表达时的最佳转速。
如图11可知，在转速为200r/mim时，目的蛋白浓度与酶活为最高，而其他 条件下的浓度与酶活相差不大。因此，可以判定：随着转速的增加，摇瓶溶氧量 的提高，At-DPEase表达量和酶活也随之增加，当转速达到200r/mim时达到最 值。所以，选择200r/mim作为最佳转速。
4.9比对通过发酵条件优化后的菌体上清液与未优化的At-DPEase蛋白表达情况和酶活大小，整体分析优化情况。
由图12所知，未优化前每36g/L的D-果糖溶液与100mg/mL静息细胞， 在45℃，pH为7.5条件下，反应5h生成6.94g/L的D-阿洛酮糖，转化率为 19.26％。而经发酵条件的优化，上清中可溶性蛋白量明显提高，其目的蛋白含 量是未优化前的2.4倍。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围 并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围 内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在 本发明创造的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示序列。
2.一种能异源表达具有活性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组基因工程菌，其特征在于，采用权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白编码序列连接至表达载体pET22b，构建重组表达质粒pET22b-DPE(O)；并转化大肠杆菌表达宿主，制备重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)。
3.提高D-阿洛酮糖-3差向异构酶异源表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对根癌农杆菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码序列进行了密码子优化处理，得到SEQ ID NO.2优化序列；
(2)将优化的D-阿洛酮糖-3差向异构酶蛋白的编码序列导入表达载体pET22b的Nde I、Xho I之间，构建重组表达质粒pET22b-DPE(O)；并转化大肠杆菌表达宿主，制备重组表达宿主BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)，用于表达来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶；
(3)采用步骤(2)所得优化重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)诱导表达D-阿洛酮糖-3差向异构酶；
具体发酵条件为：在于BL21(DE3)/pET22b-DPE(O)在菌体培养3～4h时加入0.3～0.5mMIPTG，在30℃，180～200rpm条件下诱导5～6h，在pH为8.5～9.0的LB培养基中，接种量为2％，装液量为50％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为pET22b-DPE(O)转化大肠杆菌BL21(DE3)，获重组基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-At-DPE(O)。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200414 |