CN102405282A - 新的α-新琼脂二糖水解酶及使用其获得单糖类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)及使用其获得单糖类的方法。
Description
技术领域
本发明涉及新的α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)及使用其获得单糖类的方法。
背景技术
近年来，由于排放至大气中的二氧化碳量的增加所引起的地球变暖及在不久的将来可能发生的石油的枯竭和价格上升，因此迫切要求新的二氧化碳减少型替代能源的开发。多种替代能源中，使用可以再生且为丰富的地球资源之一的生物质来生产的生物能源作为满足前述要求的主要的再生能源，目前备受关注。特别地，已经考虑将生物乙醇作为目前需求大大增加的运输用燃料的代替方案，在以美国为代表的发达国家中已经用法律对生物乙醇的使用赋予了义务。目前，用于生产生物乙醇的原料物质局限于来自玉米或其他粮食资源的糖质、淀粉等(第1代生物燃料)，与人类的粮食资源竞争，从而存在引发国际粮食价格上升这样的问题。作为可以克服这种缺点的对策，不与粮食资源竞争的新的陆地木质系生物质(第2代生物燃料)、海洋海藻类生物质(第3代生物燃料)作为下一代生物能源的原料也备受关注，有效利用生物质来生产生物能源的技术目前正在活跃研究中。
海藻类生物质与木质系生物质相比，微生物可以利用的多糖类的含量多，且由于不含木质素，因此具有前处理较简单、每年可以收获多次等多个优点。特别是韩国三面被海包围，海藻类的生物资源化容易，海藻类的年产量在2006年为13754吨，与中国、日本、北朝鲜一起属于世界的海藻类生产国，但现状是：在其有效利用率方面，除了食用资源以外，是低迷的(渔业生产统计，2006，统计厅社会统计局农渔业生产统计科)。最近，由海藻类生产生物能源的研究在日本和韩国等进行了活跃的讨论。日本的水产业振兴财团以“Ocean Sunrise Project(海洋日出项目)”为主题，制定了在日本的专属经济水域和海洋带的未使用海域4.47百万km2中大量养殖海藻类以生产50亿升的燃料用乙醇的计划(Aizawa M et al.，Seaweedbioethanol production in Japan-The Ocean Sunrise Proj ect(海藻生物乙醇生产在日本-海洋日出项目)，OCEANS Conference，Sep.29-Oct.04，2007，Vancouver，Canada)。另外，韩国在2009年1月最终发表的作为政府的17个新生推进事业领域之一的新再生能源领域中包括海洋生物燃料，对海藻类的兴趣进一步提高。根据2009年的农林水产食品部的涉及海洋生物质的确保和有效利用技术的开发的研究规划发表，在四边71km的正四边形的海域中养殖海藻类来生产生物乙醇时，一年可以生产37.74亿升，这是相当于2030年韩国的汽油预期消耗量的31.4％的量。
目前已知的海藻类中，特别是使用红藻类生物质(例如，Gelidiumamansii)作为原料物质的研究目前正在活跃进行。红藻类的干重总体的70％以上为多糖类，能够转换为微生物可以利用的发酵性糖。特别地，来自红藻类生物质的多糖类的主要成分为琼脂(agar)，含有干重总体的60％左右，被认为作为用于生产生物能源的主要原料。琼脂多糖体是以半乳糖(D-galactose)和3，6-脱水半乳糖(3，6-anhydro-L-galactose；以下简称“AHG”)为单体单元，将它们分别通过α-1，3键(α-1，3-linkage)或β-1，4键(β-1，4-linkage)连结而成的聚合物(Duckworth，M.and W.Yaphe(1971)Carbohydrate Research(《碳水化合物研究》)16，435-445)(参照图1)。
已知将琼脂多糖体用作碳源的微生物的情况下，使用β琼脂糖酶(β-agarase)或α琼脂糖酶(α-agarase)将琼脂多糖体切成小尺寸的低聚糖后，最终在β琼脂糖酶的情况下分解成α-新琼脂二糖(α-neoagarobiose，α-1，3-D-半乳糖基-3，6-脱氢-L-半乳糖(α-1，3-D-galactosyl-3，6-anhydro-L-galactose))，在α琼脂糖酶的情况下分解成β-琼脂二糖(β-agarobiose，β-1，4-脱氢-L-半乳糖基-D-半乳糖(β-1，4-anhydro-L-galactosyl-D-galactose))。已知作为β琼脂糖酶的分解产物的新琼脂二糖的情况下，为了微生物进行代谢，需要转换为半乳糖，因此需要切断α-1，3键的酶(α-新琼脂二糖水解酶)(Ekborg，N.A.et al(2005)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.55，1545-1549；Ekborg，N.A.et al.，(2006)Appl.Environ.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)72，3396-3405)。但是，迄今为止，切断S.degradas中的新琼脂二糖的α-1，3键的酶尚未发现(Ekborg，N.A.et al.(2006)Appl.Environ.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)72，3396-3405)。
据报道，在微生物中由琼脂糖生产低聚琼脂糖的β琼脂糖酶可以通过许多微生物进行生产，例如假单胞菌(Pseudomonas)属菌株(Ha，J.C.etal.(1997)Biotechnol.Appl.Biochem.(《生物技术与应用生化学》)26：1-6)、交替单胞菌(Alteromonas)属菌株(Potin，P.，et al.(1993)Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学期刊》)214：599-607)、噬琼胶菌(Agarivorans)属菌株(Ohta，Y.et al.(2005)Biotechnol.Appl.Biochem.(《生物技术与应用生化学》)41：183-191)，交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)属菌株(Belas，R.(1989)J.Bacteriol.(《细菌学杂志》)171：602-605)，微颤菌(Microsilla)属菌株(Zhong，Z.et al.(2001)Appl.Environ.Microbiol.(《应用与环境微生物学》)67：5771-5779)和弧菌(Vibrio)属菌株(Aoki，T.et al.(1990)Eur.J.Biochem.(《欧洲生物化学期刊》)187：461-465)等。
将来自红藻类的琼脂多糖体用作生产生物能源的原料时，必须经过多个阶段的前处理过程而转换为微生物可以实际利用的发酵性糖。琼脂多糖体向发酵性单糖类的转换可以大致通过化学前处理和生物学前处理2种工序来实现。首先是利用酸水解等的化学方法，是较简单的工序，但存在如下缺点：将由多糖类构成的生物质在高温下进行化学前处理，会大量生成糠醛(furfural)、HMF(羟甲基糠醛，hydroxymethylfurfural)等毒性副产物，得到随机切断而得到的单糖类和低聚物的混合物(Pickering et al.，1993，Journal of Applied Phycology(《应用藻类学杂志》)5：85-91；Armis’en，1995)。与此相对，使用琼脂糖酶这样的酶的生物学前处理和糖化方法具有可以在常温下通过环境友好的方法来得到作为发酵性糖的半乳糖的优点，但存在如下缺点：目前商业上可买到的酶局限于β琼脂糖酶，琼脂糖酶的产物也将通常的微生物难以使用的二糖类(新琼脂二糖、琼脂二糖)作为最终产物。
作为β琼脂糖酶反应的结果而生成的新琼脂二糖的情况下，为了用于生产生物能源，必须转换为作为发酵性单糖类的半乳糖，此时需要α-新琼脂二糖水解酶。因此，在用来将红藻类生物质用作生物乙醇这样的生物能源的生产原料的有效的生物质生物学的(酶的)前处理和糖化工序的最终阶段，α-新琼脂二糖水解酶是不可缺少的。另外，作为新琼脂二糖的水解产物而与半乳糖一起获得的AHG，即使在商业上也没有销售，是只能购入D型的AHG的状况，而且价格卖得很高(2009年，200磅(英国)/100mg，Dextra Laboratories)。因此，可以使用本酶，由琼脂糖大量生产作为高价的宝贵性单糖类的AHG。
发明内容
技术问题
为解决上述问题，根据上述必要性而想出本发明，其目的在于提供一种在向用于生物能源的生产等的作为发酵性单糖类的半乳糖的转换中所必须的酶。
本发明的其他目的在于提供一种使用新琼脂二糖作为基质，转换成作为单糖类糖的半乳糖和AHG的方法。
技术的解决方法
为了达成前述目的，本发明提供选自由序列号1～序列号11构成的组中的α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase；以下称为“α-NABH”)。
本发明的优选实施例中，就前述具有α-新琼脂二糖水解活性的酶而言，不仅包含序列号1～序列号11所公开的氨基酸序列，而且作为前述酶的1个以上进行了取代、缺失、易位、添加等的突变蛋白质而具有α-新琼脂二糖水解活性的蛋白质也包含在本发明的酶的权利要求范围中，优选包含与序列号1～序列号11所公开的氨基酸序列的序列一致性为80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上和99％以上的氨基酸序列。
本发明中，多肽相对于其他序列具有特定比率(例如，80％、85％、90％、95％或99％)的序列一致性是指，使前述2个序列比对时，比较前述序列时前述比率的氨基酸残基相同。前述比对以及百分率相同性或一致性可以使用本技术领域公知的任意的适当软件程序，例如文献CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(《最新分子生物学实验方法汇编》)(F.M.Ausubel等(eds)1987Supplement 30section 7.7.18)中所记载的软件程序来决定。作为优选的程序，有GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：2444-2448)、和BLAST (BLAST Manual(BLAST手册)，Altschul等，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，MD和Altschul等，1997NAR25：3389-3402)。其他优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)，优选使用基本媒介变量的程序。可以使用的其他的序列软件程序是可以在Sequence Software PackageVersion 6.0(Genetics Computer Group(遗传学计算机小组)，University ofWisconsin(威斯康辛大学)，Madison，WI)中利用的TFASTA Data SearchingProgram。
本发明的一个实施例中，前述酶优选从交替单胞菌saccharophagusdegradans等获得，但并不限定于此。
本发明的交替单胞菌saccharophagus degradans通常可以购入(saccharophagus degradans ATCC 43961)，但可以通过不受此限定的多种方法获得。
另外，本发明提供一种编码前述本发明的酶的基因。
在本发明的一个实施例中，前述基因优选是在序列号12中记载的基因，但并不限定于此。
另外，在本发明的一个实施例中，前述基因优选从交替单胞菌saccharophagus degradans获得，但并不限定于此。
另外，本发明提供一种制造本发明的酶的方法，包括培养交替单胞菌saccharophagus degradans、从培养液中提取本发明的酶。
另外，本发明提供一种制造半乳糖和脱水半乳糖的方法，包括用本发明的酶分解α-新琼脂二糖，从前述分解物中提取半乳糖和脱水半乳糖。
另外，本发明提供一种α-新琼脂二糖水解酶，其包含含有在选自由图8所示的模序(motif)1～50(共50个模序)所构成的组中的模序中的1、2、3、4、5、6、7、14、16、17、20、34、40的13个模序，更加优选提供必须包含图8所示的50个模序中的模序7和34的α-新琼脂二糖水解酶。
蛋白质模序如果可以用规则表示的模式表示，则通常模式的表达方式用正则表达式表示；
http://www.expasy.ch/prosite/prosuser.html；例如：
PA[AC]-x-V-x(4)-{ED}。
本模式解析如下：[Ala or Cys]-any-Val-any-any-any-any-{any but Glu orAsp}
PA＜A-x-[ST](2)-x(0，1)-V.
该模式必须在序列的N-末端(“＜”)，解析如下：
Ala-any-[Ser or Thr]-[Ser or Thr]-(any or none)-Val；Sigrist C.J.A.，Cerutti L.，Hulo N.，Gattiker A.，Falquet L.，Pagni M.，Bairoch A.，Bucher P.PROSITE：adocumented database using patterns and profiles as motif descriptors.BriefBioinform.(《生物信息简报》)3：265-274(2002)；Sigrist C.J.A.，De Castro E.，Langendijk-Genevaux P.S.，Le Saux V.，Bairoch A.，Hulo N.ProRule：a newdatabase containing functional and structural information on PROSITE profiles.Bioinformatics(《生物信息学》).2005Nov 1；21(21)：4060-6.Epub 2005Aug 9；Timothy L. Bailey，Nadya Williams，Chris Misleh，and Wilfred W. Li，MEME：discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs，Nucleic AcidsResearch(《核酸研究》)，Vol.34，pp.W369-W373，2006)。
本发明中，与细胞、核酸、蛋白质或载体关联而使用时，用语“重组”是指前述细胞、核酸、蛋白质或载体由于异种核酸或蛋白质的导入或者原来的核酸或蛋白质的变更而变形、或者前述细胞来自这样变形后的细胞。即，例如，重组细胞表达在前述细胞原来的(非重组)形态内未表达的基因、或者表达由于不同而在表达时异常地表达、或者完全未表达的原来的基因。
用语“蛋白质”和“多肽”在本发明中可以互换使用。本发明中对于氨基酸残基，使用通常的1个字或3个字的编码。
本发明中，“基因”不仅指本发明的酶的编码区域之前或之后的区域，也指包含各自的编码片段间的插入序列的、与生产多肽有关的DNA片段。
本发明中，用语“核酸”包括单链或双链的DNA、RNA及它们的化学变异体。用语“核酸”和“多核苷酸”在本发明中可以能够互换地使用。由于遗传密码简并，因此为了编码特定氨基酸，可以使用1个以上的密码子，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。本发明中，“载体”是指为了在1个以上细胞类型内导入核酸而设计的多核苷酸序列。就载体而言，有克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体粒子、盒子(cassette)等。
本发明中使用的“表达载体”是指具有可工作地与可以使目标DNA在适当的宿主内表达的适当的控制序列连结的DNA序列的DNA结构物。这种控制序列可以包含引起转录的启动子、调节转录的任意的操纵子(operator)序列、编码mRNA上的适当的核糖体结合部位的序列、增强子以及调节转录和翻译终止的序列。
本发明中，“启动子”是涉及为了开始基因的转录而使RNA聚合酶结合的调节序列。前述启动子可以是诱导性启动子或构成型(constitutive)启动子。
本发明中的用语“来自”包括用语“源自”、“可得到”或“可以从...得到”、以及“可从...离析出”，在本发明中使用时，它是指被前述核苷酸序列编码的多肽由原本存在前述核苷酸、或者插入有前述核苷酸序列的细胞产生。
用语“培养”是指在适当的条件下，使微生物细胞群体在液体或固体培养基中生长。在优选的实施例中，培养是指(典型地在容器或反应器内)将含有琼脂糖的基质生物转换为最终生成物。发酵是指通过使用微生物将有机物质以酶方式和厌氧方式进行分解而产生更单纯的有机化合物。发酵在厌氧条件下发生，但由于发酵还可以在氧的存在下发生，因此不用将前述用语仅限定于严格的厌氧条件。
本发明中使用的用语“回收”、“离析”和“分离”是指从自发结合的1个以上的成分中除去的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。
与本发明中使用的细胞关联使用的用语“转化”、“稳定的转化”和“基因导入(transgenic)”是指具有作为细胞通过数代维持的附加体质粒的、或整合到其基因组内的非原来(例如，异种)的核酸序列。
本发明中使用的用语“表达”是指基于基因的核酸序列而生产多肽的方法。前述方法包括转录和翻译。
将核酸序列插入细胞内的用语“导入”是指“转染(transfection)”、或者“转化”或“转导(transduction)”，包括言及涉及核酸序列整合到真核或原核细胞内，此时，前述核酸序列被整合到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、色素体或线粒体DNA)内，转换成自主复制子、或者暂时表达。
以下，关于本发明进行说明。
1.含有红藻类的海洋生物质的前处理工序过程中，由α-新琼脂二糖生成 作为发酵性糖的半乳糖的酶处理工序
为了从琼脂多糖体生成发酵性糖，作为分解为单糖类的前处理过程，可以利用大致化学方法和酶方法2种方法。首先，化学方法由于随机地分解复合多糖类，因此不仅非常难以选择性地生产所希望的发酵性单糖类，而且还有时生成阻碍所生成的糖的发酵的副产物。另外，在碱处理或酸处理的情况下，排放相当数量的污染物质，为了净化这些污染物质要花费高额费用，作为微生物可以利用的发酵性糖的生产方法是不适合的。作为酶方法，可以使用微生物生成的琼脂糖酶来使琼脂多糖体分解。作为可以用于这种方法的酶，可举出α琼脂糖酶或β琼脂糖酶。作为分解琼脂多糖体的酶，α琼脂糖酶将琼脂多糖体中存在的α-1，3和β-1，4键中的α键水解，从而最终生成β-琼脂二糖二糖体，β琼脂糖酶切断β键而生成α-新琼脂二糖二糖体。在这种酶的前处理的过程中使用β琼脂糖酶的情况下，最终产物是α-新琼脂二糖，这是通常的微生物无法使用的非发酵性糖。为了将其最终转换为作为发酵性糖的半乳糖的前处理工序，α-新琼脂二糖水解酶是不可缺少的。
2.由作为琼脂多糖体的酶分解产物的α-新琼脂二糖生产半乳糖或AHG
目前，由新琼脂二糖的水解得到的3，6-脱水-L-半乳糖(3，6-Anhydro-L-galactose)即使在商业上也没有销售，是只能购入D型的AHG的状况，而且价格卖得很高(2009年，200磅(英国)/100mg，DextraLaboratories)。因此，可以使用本酶、由琼脂糖大量生产高价的AHG。
本发明的发明人等确认了海洋细菌saccharophagus degradans中的α-新琼脂二糖水解酶的活性，并首次确认了该基因。另外，转化到大肠杆菌来大量生产蛋白质，从而确认了α-新琼脂二糖水解酶的活性。使用新的α-新琼脂二糖水解酶基因的酶活性来适用于含有琼脂多糖体的海洋生物质的前处理工序中，并用于由前处理工序所得的α-新琼脂二糖获得包含半乳糖的发酵性糖。
近年来，发现可以使用琼脂多糖体作为碳源来进行生长的作为海洋细菌的saccharophagus degradans，且其染色体的序列已确定。
为了发掘α-新琼脂二糖水解酶的基因，首先确认交替单胞菌saccharophagus degradans中的α-新琼脂二糖水解酶的活性。其次，通过染色体序列信息的分析，预测将交替单胞菌saccharophagus degradans的基因中属于糖基水解酶家族32的基因(蛋白质数据库Uniprot database ID：Q21HB2)作为α-新琼脂二糖水解酶。实际上，为了确认蛋白质是否具有α-新琼脂二糖水解酶的活性，在表达用载体中进行复制，在大肠杆菌中进行过表达，并分离精制蛋白质后，最终确认酶的活性。
发明效果
本发明中，报道了新的α-新琼脂二糖水解酶的碱基序列和蛋白质序列。特别地，如上所述，近年来，在使用海藻类生物质的生物能源的生产中生物质向发酵性糖的酶转化工序中，为了由琼脂多糖体生产脱水半乳糖和半乳糖，必须使用α-新琼脂二糖水解酶，因此会起到可以期待生物质前处理的成本削减和产量提高效果这样的效果。另外，在生产生物燃料的酵母或细菌等中导入α-NABH基因，从而还可以期待由琼脂(agar)或新琼脂二糖直接生产生物燃料。进一步地，在由海洋生物质生产作为高附加价值的单糖类的半乳糖和AHG的工序中也使用α-新琼脂二糖水解酶，也可以进行有用物质的生产。
附图说明
图1为表示琼脂多糖体的结构的图。
图2为表示由S. degradans 2-40得到的细胞内助酶得到的反应生成物的薄膜色谱(Thin layer chromatography)的照片。条带A：半乳糖的标样；条带B：与细胞内酶一起培养0.25％(w/v)琼脂糖而得的培养液；条带C：与细胞内酶一起培养0.3％(w/v)石花菜(红藻类)而得的培养液。酶反应在30℃、20mM Tris-HCl(pH6.8)中进行12小时。
图3表示本发明所发掘的基因的碱基序列和蛋白质序列。
图4表示在大肠杆菌中表达并进行了精制的琼脂糖酶；12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；A：分子尺寸标识物、B：α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiosehydrolase)。
图5表示α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)和β琼脂糖酶引起的琼脂糖水解的产物的薄膜色谱照片。在30℃、20mM Tris-HCl(pH6.8)中进行酶反应，其基质浓度为0.25(w/v)。(a)半乳糖(b-c)反应混合物。A：半乳糖标准物质；B：α-新琼脂二糖水解酶反应产物(反应2小时)；C：新琼脂二糖。
图6表示α-新琼脂二糖水解酶和β琼脂糖酶引起的琼脂糖水解的产物通过液相色谱-质谱分析(Mass Spectrometry)来确认反应产物。使用质量分析仪的反应产物的质量分析结果(阴离子化而形成甲酸盐(HCOO-，分子量：45))，如图6所示，确认到半乳糖的质量为225.1(180+45)，脱水半乳糖为207.1(162+45)。因此，确认到水解酶的产物是半乳糖和脱水半乳糖。即，依靠来自基础科学支援中心首尔分所的质量分析所得的结果是图6所示的质量分析图谱，解析其结果，结果确认了酶的水解产物。
图7表示含有α-新琼脂二糖水解酶的同源(homolog)蛋白质的模序(motif)分析结果。
图8表示α-新琼脂二糖水解酶的特异的模序。
图9和图10表示包含所有由图8确认的α-新琼脂二糖水解酶的特异的模序的蛋白质的序列。
图11表示使用由图9和图10所得的10个序列和α-新琼脂二糖水解酶的氨基酸序列的多重序列比对。
图12表示在大肠杆菌中表达并进行了精制的来自大西洋假交替单胞菌的琼脂糖酶；12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；条带A：分子尺寸标识物；条带B：α-新琼脂二糖水解酶。
图13表示在大肠杆菌中表达并进行了精制的天蓝色链霉菌；12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；条带A：α-新琼脂二糖水解酶；条带B：分子尺寸标识物。
图14是α-新琼脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)和β琼脂糖酶引起的琼脂糖水解的产物的薄膜色谱照片。使酶反应在30℃、20mMTris-HCl(pH6.8)中进行2小时，其基质浓度为0.25(w/v)。(A)半乳糖(B-D)反应混合物。条带A：半乳糖标准物质；条带B：来自交替单胞菌saccharophagusdegradans(saccharophagus degradans 2-40)的α-新琼脂二糖水解酶反应产物；条带C：来自大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)的α-新琼脂二糖水解酶反应产物；条带D：来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorA3)的α-新琼脂二糖水解酶反应产物。
具体实施方式
以下，通过非限定的实施例来进一步详细说明本发明。但下述实施例以说明本发明的目的而记载，本发明的范围不受下述实施例限制。
实施例1：来自saccharophagus degradan粗提取液的α-新琼脂二糖水解酶
的酶活性的确认
为了确认saccharophagus degradan是否具有通过α-新琼脂二糖水解生成作为单糖类的半乳糖和AHG的酶活性，按以下方法得到粗提取液并确认活性。使saccharophagus degradan在含有海水盐的培养基中培养直至对数增殖期的中期后，对40ml的培养液进行离心分离，然后利用超声波将细胞粉碎，得到粗提取液后，将利用β琼脂糖酶分解琼脂多糖体而得到的琼脂糖作为基质，通过TLC观察反应分解产物。A条带是半乳糖标准物、B条带是使0.25％(w/v)的琼脂糖与saccharophagus degradan的细胞内助酶液反应而成的产物、C条带是使0.3％(w/v)作为红藻类的干燥的琼脂粉与saccharophagus degradan的细胞内助酶液反应后，通过TLC分析产物的结果。通过与saccharophagus degradan的细胞内助酶液的反应，从琼脂糖和琼脂获得的均是作为单糖类的AHG和半乳糖，而且确认到生成两种糖类。因此得知，saccharophagus degradan具有在细胞内通过α-新琼脂二糖水解而生成作为单糖类的半乳糖和AHG的酶。
本发明中发掘的基因的碱基序列和蛋白质的氨基酸序列如图3所示。
实施例2：α-新琼脂二糖水解酶的生化活性和特征调查
经精制的α-新琼脂二糖水解酶的活性如下所述进行确认。首先，用β琼脂糖酶处理琼脂多糖体而生成作为酶处理的最终产物的新琼脂二糖后，将其作为基质，通过TLC确认α-新琼脂二糖水解酶的反应产物(图5的TLC结果)。确认到用α-新琼脂二糖水解酶在TLC溶剂条件(正丁醇∶乙醇∶水＝3∶2∶2)下处理过的基质被分解为推断是半乳糖和脱水半乳糖的物质。在TLC上确认到半乳糖Rf值约为0.46、α-新琼脂二糖的Rf值约为0.58。
为了测定通过α-新琼脂二糖水解酶生成的产物的分子量，通过液相色谱-质谱分析仪(liquid chromatography-mass spectrometry)确认了分子量。由LC-MS分析结果显示脱水半乳糖(AHG)的分子量为162、半乳糖分子量为180。207.1m/z是甲酸(formic acid)与脱水半乳糖结合的状态的分子量，可知脱水半乳糖被检测出，179.1m/z和225.1m/z是半乳糖以及与半乳糖结合的甲酸的分子量，可以确认半乳糖被检测出。因此，如LC-MS所示，可以确认作为新琼脂二糖水解酶的反应产物的2种单糖类、即半乳糖和脱水半乳糖为反应产物(参照图6)。
实施例3：α-新琼脂二糖水解酶的特异的肽模序序列
通常，蛋白质模序是指在具有相同的分子功能的蛋白质中以一种模式表达的短的肽序列。这种蛋白质模序被大致进化地、正常地保存在蛋白质的全体序列中，并以模式化的氨基酸序列表示，所述模式化的氨基酸序列以包含活性部位的、代表分子功能的区域表示(Sigrist C.J.A.，Cerutti L.，Hulo N.，Gattiker A.，Falquet L.，Pagni M.，Bairoch A.，Bucher P.PROSITE：a documented databaseusing patterns and profiles as motif descriptors.Brief Bioinform(《生物信息简报》).3：265-274(2002)；Sigrist C.J.A.，De Castro E.，Langendijk-Genevaux P.S.，LeSaux V.，Bairoch A.，Hulo N.ProRule：a new database containing functional andstructural information on PROSITE profiles.Bioinformatics(《生物信息学》).2005Nov 1；21(21)：4060-6.Epub 2005Aug 9；Timothy L. Bailey，Nadya Williams，ChrisMisleh，and Wilfred W. Li，MEME：discovering and analyzing DNA and proteinsequence motifs，Nucleic Acids Research(《核酸研究》)，Vol.34，pp.W369-W373，2006)。
为了确认可以规定α-新琼脂二糖水解酶的蛋白质模序的序列，首先，使用α-新琼脂二糖水解酶的氨基酸序列作为模板，使用NCBI碱基局部对准检索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)来检索公共数据库，收集具有统计显著性(E-value＜0.001)的60个(包含α-新琼脂二糖水解酶的)蛋白质的氨基酸序列。使用这些序列，使用作为蛋白质模序检索程序的MEME(http://meme.sdsc.edu/meme4_1/intro.html；使用参数：mode＝zero or oneoccurrence&nsites＝50，mwin＝8，除此以外的条件使用default parameters；Timothy L.Bailey，Nadya Williams，Chris Misleh，and Wilfred W. Li，MEME：discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs，Nucleic AcidsResearch，Vol.34，pp.W369-W373，2006)来检索针对α-新琼脂二糖水解酶的特异的模序。其结果如图7所示，确认到saccharophagus degradan的α-新琼脂二糖水解酶具有在从具有相同性的蛋白质的分析所得的共50个模序中的13个特异的模序(1、2、3、4、5、6、7、14、16、17、20、34、40)。因此，可以确认该13个特异的模序是代表α-新琼脂二糖水解酶的活性的模序。其中模序7和34是一定出现在代表α-新琼脂二糖水解酶的活性的蛋白质中的必须的2个模序，分别示于图8和图9(通常，蛋白质模序使用正则表达式(regularexpression)来表示，因此附图上也以相同的方式来表现；Sigrist C.J.A.，CeruttiL.，Hulo N.，Gattiker A.，Falquet L.，Pagni M.，Bairoch A.，Bucher P. PROSITE：adocumented database using patterns and profiles as motif descriptors.BriefBioinform(《生物信息简报》).3：265-274(2002))。因此可以说，包含13个特异模序中的一部分、其中一定含有模序7和34的蛋白质具有α-新琼脂二糖水解活性(参照图8)。确认了：在与α-新琼脂二糖水解酶显示出序列相同性的蛋白质中，含有这13个特异模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白质是10个(参照图9和10)。
前述含有在α-新琼脂二糖水解酶中发现的13个特异模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白质在现有公共数据库上发现了10个。这些起源分别是大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)，微颤菌(Microscilla sp.PRE1)，拟杆菌(Bacteroides plebeius DSM17135)，革兰菌(Gramella forsetii)(菌株KT0803)，黄杆菌(Flavobacteriales bacterium HTCC2170)，类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.oral taxon 786str.D14)，瘤胃球菌(Rum inococcus sp.5139BFAA)，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor A3)。各自的氨基酸序列示于图10。
图11所示的序列是如上所述地在与α-新琼脂二糖水解酶具有序列相同性的蛋白质中，选择含有13个特异模序的一部分且一定含有模序7和34的10个蛋白质进行多重比对而成的序列，这些10个蛋白质的序列示于图9和图10。
实施例4：α-新琼脂二糖水解酶基因的蛋白质序列的相同性的确认
通过检索来自saccharophagus degradan的水解酶的蛋白质序列的相同性来确认预计具有类似功能的候选基因。虽然候选基因的具体功能未知，但根据作为碳水化合物关联的酶/蛋白质数据库的CAZy(http://www.cazy.org)，可以确认它们均属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase family 32，GH32)。属于GH32家族的蛋白质所具有的已知功能是：转化酶(invertase)(EC 3.2.1.26)；内切菊粉酶(endo-inulinase)(EC 3.2.1.7)；β-2，6-果聚糖6-左聚糖生物水解酶(β-2，6-fructan 6-levanbiohydrolase)(EC 3.2.1.64)；内切左聚糖酶(endo-levanase)(EC 3.2.1.65)；外切菊粉酶(exo-inulinase)(EC 3.2.1.80)；果聚糖β-(2，1)-果糖苷酶/1-外水解酶(fructan β-(2，1)-fructosidase/1-exohydrolase)(EC 3.2.1.153)；果聚糖β-(2，6)-果糖苷酶/6-外水解酶(frctanβ-(2，6)-fructosidase/6-exohydrolase)(EC 3.2.1.154)；蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(sucrose：sucrose 1-fructosyltransferase)(EC 2.4.1.99)；果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶(fructan：fructan 1-fructosyltransferase)(EC2.4.1.100)；蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶(sucrose：fructan 6-fructosyltransferase)(EC 2.4.1.10)；果聚糖：果聚糖6G-果糖基转移酶(fructan：fructan 6G-fructosyltransferase)(EC2.4.1.243)；左聚糖果糖基转移酶(levan ffrctosyltransferase)(EC 2.4.1.-)。因此，属于GH32家族的一部分蛋白质具有与α-新琼脂二糖水解酶相同的分子功能，这在本发明开始已报道。
从来自saccharophagus degradan(saccharophagus degradan 2-40)的α-新琼脂二糖水解酶(以下称为α-NABH)的氨基酸序列的相同性的检索(BLAST检索-参照附件)获得的序列中，如果通过BLAST的E-value罗列具有50％以上的相同性的蛋白质序列，则如下所示(以下使用Uniprot数据库序号，括弧内是来源微生物和％相同性)。
1.Q15UF2(大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株T6c/BAA-1087)，70％)，
2.Q93PB3(微颤菌(Microscilla sp.PRE 1.)，59％)，
3.B4CY74(拟杆菌(Bacteroidesplebeius DSM17135.)，60％)，
4.A0M245(革兰菌(Gramella forsetii)(菌株KT0803).，56％)，
5.A4AR39(黄杆菌(Flavobacteriales bacterium HTCC2170.)，57％)，
6.C6J3P3(类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.oral taxon 786str.D14.)，58％)，
7.C6JDD4(瘤胃球菌(Ruminococcus sp.5_1_39BFAA.)，58％)，
8.C6J313(类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.oral taxon 786str.D14.)，57％)，
9.Q15XP8(大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株T6c/BAA-1087)，55％)，
10.Q9RKF6(天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，56％)
实施例5：大肠杆菌中的表达和大小的确认
分别复制前述获得的具有50％相同性以上的序列相同性的蛋白质中具有最高序列相同性的来自大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)的蛋白质(Q15UF2)和最低的来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorA3)的蛋白质(Q9RKF6)，确认是否具有α-NABH活性。首先，将使它们密码化的基因的碱基序列分别插入作为大肠杆菌表达载体的pET21a(Novagen，美国)中(以下，将含有来自大西洋假交替单胞菌的α-NABH基因的表达载体称为“pPsAGAJ”、将含有来自天蓝色链霉菌的α-NABH基因的表达载体称为pScAGAJ)。为了确认重组α-NABH在大肠杆菌中成功表达，使pPsAGAJ和pScAGAJ转化为作为表达用大肠杆菌的E.coli BL21(DE3)后，涂抹在含有50mg/L浓度的安匹西林抗生素的固体培养基上。将通过前述转化所得的菌落接种在添加有50mg/L浓度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基上后，在37℃振荡培养一天，确保菌体。之后，为了确认表达，将转化体接种在添加有50mg/L浓度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基上后，在37℃振荡培养直至OD600＝0.5～1.0，以0.5mM/L的浓度添加IPTG，在180rpm下诱导表达4小时。培养液经离心分离(12000rpm、4℃、10分钟)回收菌体，回收的菌体在20mM的Tris缓冲液(Tris-HCl，pH 7.4)中进行悬浮，利用超声波粉碎机进行粉碎后，通过12％的SDS-PAGE来确认大小。将确认了大小的已粉碎的悬浮液进行15分钟离心分离，使用上清液作为助酶液。
实施例6：α-新琼脂二糖水解酶的生化活性的确认
经精制的α-NABH的活性如下所述进行确认。首先，用β琼脂糖酶处理琼脂多糖体，生成作为酶处理的最终产物的新琼脂二糖后，将其作为基质，通过TLC确认α-NABH的反应产物。通过TLC的确认是在硅胶60TLC平板上滴下1μl反应液，并在TLC溶剂条件(正丁醇∶乙醇∶水＝3∶2∶2)下展开。展开的TLC平板用作为处理溶液的硫酸(乙醇中有10％(v/v)硫酸)处理1次后，进行干燥，经1次处理的平板再用作为2次处理溶液的间萘二酚(乙醇中有0.2％(w/v)间萘二酚)处理。这样处理的TLC平板干燥后，进行加热。
前述实施例4～6的结果如下所述。
来自使用作为表达用菌株的E.coli BL21(DE3)进行了转化的大西洋假交替单胞菌和天蓝色链霉菌的α-NABH的表达和大小的确认是通过12％的SDS-PAGE进行确认的。来自大西洋假交替单胞菌和天蓝色链霉菌的α-NABH的预期分子量分别为40.7kDa和41.1kDa左右，确认与预期分子量相同(图12、图13)。
另外，为了确认分解产物，使用作为标准物质的D-半乳糖来确认预期分解产物。确认到：作为用α-NABH处理过的二糖类的新琼脂二糖被分解为推断是已确认具有与D-半乳糖相同的Rf值的半乳糖和脱水半乳糖的物质(图14)。
Claims (10)
1.一种α-新琼脂二糖水解酶，其选自由序列号1～序列号11构成的组。
2.如权利要求1所述的α-新琼脂二糖水解酶，其特征在于，所述α-新琼脂二糖水解酶包含序列号4的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的酶，其特征在于，所述酶从saccharophagusdegradans获得。
4.一种编码权利要求2所述的α-新琼脂二糖水解酶的基因。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因记载在序列号12中。
6.如权利要求4或5所述的基因，其特征在于，所述基因从saccharophagusdegradans获得。
7.一种制造权利要求2所述的α-新琼脂二糖水解酶的方法，包括培养微生物saccharophagus degradans，从培养液中提取权利要求2的α-新琼脂二糖水解酶。
8.一种制造半乳糖或脱水半乳糖的方法，包括用权利要求1或2所述的α-新琼脂二糖水解酶分解α-新琼脂二糖，并从所述分解物中提取半乳糖或脱水半乳糖。
9.如权利要求8所述的制造半乳糖或脱水半乳糖的方法，所述α-新琼脂二糖水解酶从sacharophagus degradans获得。
10.一种α-新琼脂二糖水解酶，其必须包含图8所示的模序7和34。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103357888A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-10-23 | 淮阴工学院 | 一维核壳型纳米银/凹土复合材料的绿色合成方法 |
| CN103468661A (zh) * | 2013-10-08 | 2013-12-25 | 中国海洋大学 | 一种新琼二糖水解酶及其应用 |
| CN106179436A (zh) * | 2014-10-17 | 2016-12-07 | 现代自动车株式会社 | 制备单糖的固体酸催化剂及使用其从海藻制备单糖的方法 |
| CN106414728A (zh) * | 2013-10-14 | 2017-02-15 | 高丽大学校产学协力团 | 琼胶寡糖水解酶及通过使用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-l-半乳糖和半乳糖的方法 |
| CN107109447A (zh) * | 2014-10-01 | 2017-08-29 | 高丽大学校产学协力团 | 通过使用缓冲液预处理提高琼脂中单糖生产产率的方法 |
| CN110291203A (zh) * | 2016-12-07 | 2019-09-27 | 高丽大学校产学协力团 | 生产源自海藻的无水半乳糖的方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101327248B1 (ko) | 2011-07-26 | 2013-11-13 | 고려대학교 산학협력단 | 3,6-안하이드로-ｌ-갈락토오스를 대사하는 신규한 해양미생물 및 이 균주의 용도 |
| KR101894703B1 (ko) * | 2011-11-23 | 2018-09-05 | 고려대학교 산학협력단 | 홍조류 한천의 효소적 당화 및 이를 이용한 에탄올 발효 |
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| WO2013109096A1 (ko) * | 2012-01-18 | 2013-07-25 | 고려대학교 산학협력단 | 3,6-안하이드로-l-갈락토오스의 제조방법 및 이의 용도 |
| KR101743421B1 (ko) * | 2015-10-16 | 2017-06-05 | 고려대학교 산학협력단 | ３，６―안하이드로―ｌ―갈락토오스의 항충치 용도 |
| KR101787331B1 (ko) * | 2016-01-19 | 2017-10-19 | 고려대학교 산학협력단 | 내열성 한천분해효소 및 이를 이용한 단당류의 생산방법 |
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Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| US5418156A (en) * | 1991-04-15 | 1995-05-23 | University Of Maryland | Agarase enzyme system from alteromonas strain 2-40 |
| US8795989B2 (en) * | 2007-04-30 | 2014-08-05 | University Of Maryland | Enzymic production of neoagarobiose |
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2011
- 2011-09-14 US US13/232,535 patent/US9297000B2/en active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RONALD M. ET AL.: "Complete Genome Sequence of the Complex Carbohydrate-Degrading Marine Bacterium,Saccharophagus degradans Strain 2-40T", 《PLOSGENETICS》 * |
| WEINER,R.M. ET AL.: "CP000282.1", 《GENEBANK》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103357888A (zh) * | 2013-07-05 | 2013-10-23 | 淮阴工学院 | 一维核壳型纳米银/凹土复合材料的绿色合成方法 |
| CN103468661A (zh) * | 2013-10-08 | 2013-12-25 | 中国海洋大学 | 一种新琼二糖水解酶及其应用 |
| CN106414728A (zh) * | 2013-10-14 | 2017-02-15 | 高丽大学校产学协力团 | 琼胶寡糖水解酶及通过使用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-l-半乳糖和半乳糖的方法 |
| CN106414728B (zh) * | 2013-10-14 | 2020-02-07 | 高丽大学校产学协力团 | 琼胶寡糖水解酶及通过使用该琼胶寡糖水解酶从琼脂糖中生成3,6-脱水-l-半乳糖和半乳糖的方法 |
| CN107109447A (zh) * | 2014-10-01 | 2017-08-29 | 高丽大学校产学协力团 | 通过使用缓冲液预处理提高琼脂中单糖生产产率的方法 |
| CN106179436A (zh) * | 2014-10-17 | 2016-12-07 | 现代自动车株式会社 | 制备单糖的固体酸催化剂及使用其从海藻制备单糖的方法 |
| CN106179436B (zh) * | 2014-10-17 | 2020-04-21 | 现代自动车株式会社 | 制备单糖的固体酸催化剂及使用其从海藻制备单糖的方法 |
| CN110291203A (zh) * | 2016-12-07 | 2019-09-27 | 高丽大学校产学协力团 | 生产源自海藻的无水半乳糖的方法 |
| CN110291203B (zh) * | 2016-12-07 | 2024-01-09 | 高丽大学校产学协力团 | 生产琼脂二糖及3,6-无水-l-半乳糖的方法 |
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