CN115505595A - 代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用。本发明提供了编码α‑乙酰乳酸脱羧酶的基因过表达在燃料合成中的应用。本发明在产溶剂梭菌WK中搭建2,3‑丁二醇的生物合成途径，通过NADH补偿模块可以有效提升细胞内的还原力水平，也使丙酮和酸类等副产物产生水平显著降低，最终实现联合发酵2,3‑丁二醇、丁醇和乙醇的过程，进一步提升产物的高附加值性能。

Description

代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用。

背景技术

在现代化高速发展的今天，工业生产与人民生活所涉及的各方面均需要大量能源的支持，而现阶段面临的主要窘境就是化石能源物质的开采与实现“碳中和”目标之间的矛盾，因此如何寻找和建立一种绿色、可持续的开发新能源的方式，以此来平衡能源需求与环境污染之间的关系是急需解决的重要问题。利用生物炼制技术，通过将可再生的生物质资源作为原料，以生物转化的方式来获取生物能源物质如2,3-丁二醇、丁醇、乙醇等的过程，具有高效、低成本且污染小等诸多优于化石能源的特点，已逐渐受到国内外企业的关注和推崇。

燃料乙醇在全球实施低碳减排的大背景下，已经成为了最主要的生物燃料之一。车用乙醇汽通过在汽油中加入一定比例的乙醇而形成的一种混合燃料，乙醇既可作为一种燃料，也是一种良好的汽油增氧剂，可大大降低汽车尾气中的有毒物质，起到净化空气的效果，因此在世界很多国家均作为汽车燃料来使用；相较于乙醇，生物丁醇具有低腐蚀性和高热能等方面的特性，在近几年也成为另一种极具潜力的新型生物燃料，世界各国也逐渐关注其工业化生产的进程；2,3-丁二醇作为在化工、食品、燃料、航空航天等多个领域具有广泛应用的重要化工原料，一方面因其高热值(27.2kJ/g)可直接作为燃料，也以燃料添加剂来增加燃料辛烷值，另一方面加工后可进一步生产包括甲乙酮、γ-丁内酯和1,3-丁二烯等关键下游产品，这些产品在全球市场销售额可达430亿美元，具有广阔的市场价值和潜力。

2,3-丁二醇的合成可以通过化学或生物的方式进行，但前者因石化原料的高涨和环境污染等受限，而后者主要可以通过肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等微生物来进行，但由于这些菌株的致病性及其复杂的培养条件也限制其工业化应用的进程。因此，得益于现阶段基因大数据的爆发与合成生物学的发展，通过基因工程手段改造其他工业微生物可以实现2,3-丁二醇的生物合成，并进一步推进工业化应用。对于传统产溶剂梭菌而言，其发酵过程的主要副产物——丙酮不仅能占据总溶剂的20％～30％，也存在燃烧性能差且对发动机有腐蚀性等缺点。目前，已报道的大部分研究主要是通过抑制涉及丙酮合成基因(adc或ctfAB)的表达来降低或消除丙酮的产量，但是该过程容易引起其乙酸和丁酸积累并导致最终丁醇产量的降低。从另外的角度分析，通过碳代谢流的调控，将副产物进一步转化为其他高附加值的目标产物，以提升终端产品的价值，也是微生物代谢工程中一个非常重要的探索思路。目前现有技术存在的问题主要有：1)目前2,3-丁二醇的高产菌株主要是克雷伯氏菌、产气肠杆菌和粘质沙雷氏菌，这些菌株都具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求；2)丙酮丁醇梭菌是一种极具潜力与竞争力的工业菌，其分子操作系统比较完善和成熟，但针对拜氏梭菌(C.beijerinckii)的转化过程，利用现有的转化方法效率较低；3)丙酮作为产溶剂梭菌发酵过程中的主要副产物之一，影响着生物转化效率。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用，本发明涉及的野生型产溶剂梭菌WK具有丁醇转化率高、副产物低且无需pH调控等特点，是一株具有工业应用潜力且安全的微生物菌株。本发明建立的基于产醇梭菌WK(属于拜氏梭菌)的高效且易操作的重组外源DNA的方法，将为后续开展该菌株及其同源菌株的遗传操作提供技术保证。通过降低丙酮所占比例或者将其转化为更具附加值的产品，将有利于提升效益的同时进一步降低纯化成本，因此本发明在于通过代谢途径改造，建立能够同时生产丁二醇、丁醇和乙醇这三种清洁燃料的工程菌株，为将廉价底物转化为多种高附加值产品提供数据支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因过表达在燃料合成中的应用。

本发明还提供了基因元件，包括编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因、强启动子和/或穿梭质粒骨架。

在本发明的一些具体实施方案中，上述基因元件中所述α-乙酰乳酸脱羧酶的GenBank登录号包括WP_010966250；和/或

所述强启动子包括梭菌特异性强启动子P_fdx；和/或

所述穿梭质粒骨架包括穿梭质粒pMTL83353。

本发明还提供了表达载体，包括上述基因元件。

在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体具有：

(I)、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或

(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或

(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，上述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个或150个。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的表达载体的核苷酸序列与上述(I)和/或(II)的核苷酸序列的同源性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

本发明还提供了重组菌株，包括上述基因元件，和/或上述表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述重组菌株其野生菌株的保藏编号为GDMCCNO:61493。

本发明还提供了上述的基因元件、上述表达载体和/或上述重组菌株在燃料合成中的应用。

本发明还提供了上述重组菌株的构建方法，包括将alsD基因、上述基因元件和/或上述表达载体导入保藏编号为GDMCC NO:61493的产溶剂梭菌(Clostridium sp.WK)，获得所述重组菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，上述构建方法中所述导入包括电转化，所述电转化包括如下步骤：

步骤(1)、用培养基将所述重组菌株培养至OD值为1.3～1.5，获得菌液；

步骤(2)、将质粒、甘油和步骤(1)所述菌液混合，获得混合菌液；

步骤(3)、对步骤(2)所述混合菌液进行电击，获得转化菌液；

步骤(4)、对步骤(3)所述转化菌液静置后与抗生素混合，培养，获得复苏菌液；

步骤(5)、将步骤(4)所述复苏菌液转移至含抗生素的筛选平板，完成电转化；

所述甘油浓度包括10％；

所述静置的时间包括8h；

所述质粒的用量包括4～8μg；

所述电击的电压包括1800V；

所述电击的脉冲时间包括3.5ms；

步骤(5)所述抗生素的浓度包括125～800μg/mL。

本发明还提供了上述重组菌株的发酵方法，包括：将所述重组菌株接种至梭菌基本培养基并与抗生素混合，恒温发酵，获得发酵液；

所述梭菌基本培养基含有30～60g/L葡萄糖。

本发明还提供了燃料的合成方法，包括取上述重组菌株进行发酵，收集发酵产物，获得燃料。

在本发明的一些具体实施方案中，上述的应用和/或上述合成方法中所述燃料包括醇。

在本发明的一些具体实施方案中，上述应用和/或合成方法中所述醇包括2,3-丁二醇、丁醇或乙醇中的一种或多种。

本发明具有如下效果：

本发明针对现有的梭菌特别是拜氏梭菌电转化方法效率低进行优化改进，改良后的方法相较于传统方法，增加操作可行性，大幅缩短了菌株细胞在空气中暴露的时间，增加电转化效果和克隆的阳性率。基于此方式，本发明进一步在产溶剂梭菌WK中搭建2,3-丁二醇的生物合成途径，通过NADH补偿模块可以有效提升细胞内的还原力水平，也使丙酮和酸类等副产物产生水平显著降低，最终实现联合发酵2,3-丁二醇、丁醇和乙醇的过程，进一步提升产物的高附加值性能。与之前的工艺相比具有如下的创新点：

1、本发明基于产溶剂梭菌设计组装了一个2,3-丁二醇生物合成模块，并将其导入实验室选育的新型高产丁醇梭菌Clostridium sp.WK中，通过外源alsD基因的过表达，从而构建出高效、持续、稳定的以葡萄糖为原料联产丁醇、丁二醇和乙醇生产的细胞工厂，在提高产量的同时也赋予产品更高的附加值。目前，工程菌株WK::alsD在以30g/L葡萄糖为底物的分批发酵条件下，可以转化丁醇、丁二醇和乙醇产量分别达到7.85g/L、0.74g/L和0.43g/L。另外，本发明采用的是优势新型产醇梭菌为底盘细胞，该菌株细胞具有耐丁酸且副产物水平低，发酵过程无需外加酸、碱等化学试剂，发酵条件温和，能耗低。整体的发酵代谢过程的控制简单易行，易于产业化，使得联合制备多醇物质相对于其他合成方法更显优越性。

2、本发明提供了一整套基于拜氏梭菌(C.beijerinckii)的高效且重复性好的电转化体系。通过采用10％甘油作为感受态保护剂的前提下，利用优化后的电转条件并延长复苏时间等手段，最终使拜氏梭菌能够在高抗生素浓度筛选平板上得到较高的转化效率，且整个流程仅使用一种培养基即可，减少氧气或者液体剪切力对菌体细胞的破坏，实现在高成功率的同时还具备操作过程简单快速等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示在野生型菌株WK中搭建2,3-丁二醇生物合成模块的示意图；

图2示alsD基因的克隆及构建质粒pMTL83353-alsD的图谱；

图3示电转化后不同壮观霉素浓度平板的菌落图(a至d的浓度分别依次为125、250、500和800μg/mL)；

图4示野生型菌株WK与工程菌株WK::alsD以葡萄糖为碳源的发酵液气相分析色谱图，其中按出峰先后顺序依次为丙酮(1.954min)、乙醇(2.482min)、丁醇(4.412min)、乙酸(7.631min)、2,3-丁二醇(8.685min)、丁酸(9.141min)；

图5示野生型菌株WK(左图)与工程菌株WK::alsD(右图)以30g/L葡萄糖为底物下的分批发酵比较图。

具体实施方式

本发明公开了代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明属于基因工程技术领域，主要以合成生物学的思路，在建立针对拜氏梭菌的快速、可重复的遗传操作体系的同时，采用基因改造的方式构建获得一株具备同时合成丁醇、2,3-丁二醇和乙醇的重组工程菌株，实现了将副产物转化高附加值产物的过程。所涉及的野生型产溶剂梭菌WK具有丁醇转化率高、副产物低且无需pH调控等特点，是一株具有工业应用潜力且安全的微生物菌株。另外，本发明建立了一种基于产醇梭菌WK(属于拜氏梭菌)的高效且易操作的重组外源DNA的方法，将为后续开展该菌株及其同源菌株的遗传操作提供技术保证。

本发明通过降低丙酮所占比例或者将其转化为更具附加值的产品，将有利于提升效益的同时进一步降低纯化成本，因此本发明在于通过代谢途径改造，建立能够同时生产丁二醇、丁醇和乙醇这三种清洁燃料的工程菌株，为将廉价底物转化为多种高附加值产品提供数据支撑。具体而言，本发明采用基因改造的方式，通过引入2,3-丁二醇合成途径实现消除丙酮产量，在将碳通量重新分配于2,3-丁二醇的合成同时，减少产溶剂梭菌发酵丁醇的影响，最终提升产物的高值化过程。

前期通过对产溶剂梭菌的KEGG数据库分析，其合成2,3-丁二醇的代谢途径主要涉及：1)丙酮酸分子在乙酰乳酸合酶(ilvB，EC 2.2.1.6)的催化下偶联合成乙酰乳酸并伴随二氧化碳的释放；2)乙酰乳酸在乙酰乳酸脱羧酶(alsD，EC 4.1.1.5)的催化下脱去羧基生成乙偶姻；3)乙偶姻在丁二醇脱氢酶(butB，EC 1.1.1.4)的催化下最终生成2,3-丁二醇。经对本公司保存的产溶剂梭菌(Clostridium sp.WK(已于2021年2月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61493，专利申请号：202110179660.0)的基因组进行比对分析发现，该菌株的基因组中仅存在ilvB和butB基因，而在另一株产醇梭菌C.acetobutylicum WA的基因组中则存在菌株WK所缺失的alsD基因。因此，本发明将从菌株WA中通过克隆alsD基因，并在建立高效的目标基因重组和转化体系的同时，实现该基因在菌株WK的重组过表达，通过改变2,3-丁二醇的形成来维持氧化还原平衡，并对代谢通量重定向使丙酮酸的其他竞争途径弱化，最终在菌株WK中成功搭建合成代谢通路，以实现联产2,3-丁二醇、丁醇、乙醇的合成过程，该成果将为利用不同廉价底物转化为多种高附加值产品的生物合成过程提供理论基础和数据支持。

进一步地，本发明利用代谢工程思路，基于对优势产溶剂梭菌菌株WK代谢通路的重构分析，设计构建了一个合成2,3-丁二醇的载体，其基本元件包括来源于菌株WA的α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因(alsD)、梭菌特异性强启动子(Pfdx)及pMTL83353穿梭质粒骨架，通过将该载体经优化后的电转体系导入菌株WK中，并在实现从无到有生产2,3-丁二醇这类高附加值产物的同时，进一步降低发酵产物中丙酮等副产物的水平。具体技术方案包括：(1)基因alsD的获取。通过设计内外两对引物，采用巢式PCR法从菌株WA的基因组中快速准确扩增获得alsD基因片段。(2)阳性工程菌株WK::alsD的筛选与鉴定。提取成功构建并测序正确的pMTL83353-alsD质粒，并通过经实验优化后的基于拜氏梭菌的高效且易操作的外源DNA电转化体系导入野生型菌株，并利用优化后的壮观霉素筛选平台进行目标菌株的筛选。(3)重组菌株WK::alsD的发酵分析。在获得稳定的工程菌株并优化发酵条件后，以30g/L葡萄糖作为底物，对工程改造菌株进行分批发酵，并同时以野生菌株WK作为对照，以气相色谱法分析发酵过程中包括丁二醇在内的生物溶剂产生情况。

本发明的关键点是：

(1)本发明基于野生型菌株WK天然代谢通路的优势，利用工程改造手段导入外源alsD基因，构建工程菌株WK::alsD，实现联产2,3-丁二醇和丁醇、乙醇三种生物燃料的过程，赋予产品更高的添加值。

(2)本发明建立了基于拜氏梭菌的高效且重复性好的电转化体系，简化操作过程并提升阳性克隆率，其电转化效率是目前已报道的产丁醇梭菌的质粒电转化效率最高。

如无特殊说明，本发明所用原料、试剂、耗材以及采用的仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的获取

为准确获取乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)，本发明采用从具有该基因(GenBank登录号为：WP_010966250)的菌株WA基因组中利用巢式PCR法获得(也可以通过基因合成方式直接获取)。首先培养菌株WA到对数生长期(一般为8～12h)，取5～6mL菌液于无菌离心管中，4000g室温离心10min后弃除上层培养基，随后参考Omega基因组提取试剂盒说明书提取菌株的总基因组，经DNA浓度检测后可于-20℃保存备用。来源于菌株WA的alsD基因全长预测为681bp，为了提高克隆基因的高效与准确性，使用Primer Premier 5软件设计内外两对引物，分别为alsD-1-F/R和alsD-2-F/R，如下：

alsD-1-F(SEQ ID No.1)：

5’-GTCTCTGGCAAGGTTTCTTA-3’

alsD-1-R(SEQ ID No.2)：

5’-TAAACTCTCTAGTTAAATCAACCAC-3’

alsD-2-F(SEQ ID No.3)：

5’-CGAGCTCATGTCTACAATAAACGCTCTTG-3’

alsD-2-R(SEQ ID No.4)：

5’-CTCGAGTTATTTCTCAACTTTACTTATTTCA-3’

基于巢式PCR的方式，首先采用外引物alsD-1-F/R对基因组DNA进行第一轮扩增，经琼脂糖凝胶电泳可检测到一条接近1.5kb的条带(与预测值接近)，后续采用

PCR Purification Kit进行纯化回收并适当稀释作为第二轮扩增的DNA模板；随后采用内引物alsD-2-F/R进行下一轮特异性扩增，通过琼脂糖凝胶电泳可以检测到一条间于500bp和750bp的条带(见图2)，由此可初步判断已获得目的基因alsD。本阶段的PCR反应体系为：模板DNA 1μL、正反向引物(10μM)各1μL、dNTP 4μL、5×高保真酶反应缓冲液10μL、高保真DNA聚合酶1μL，补足ddH₂O至50μL；其中PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃10s，47～50℃15s，72℃1～2min，30个循环，最后72℃延伸5min。

实施例2：重组质粒pMTL83353-alsD的构建

将实施例1中所获得alsD基因与梭菌特异性表达穿梭质粒pMTL83353分别按双酶切反应体系(PCR产物/质粒1μL、限制性内切酶缓冲液5μL、Sac I限制酶1μL、Xho I限制酶1μL，补足ddH₂O至50μL)添加完成后，置于37℃水浴12h后使用Omega胶回收试剂盒分别进行片段回收并检测浓度。随后，将酶切纯化后的alsD基因和pMTL83353质粒片段按酶连反应体系(10×连接酶缓冲液1μL、质粒pMTL83353 2μL、基因alsD 1μL、T4连接酶1μL，补足ddH₂O至10μL)添加完成后，置于16℃反应16h。连接反应完成后，将连接产物(10μL)加入至100μL大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行转化(冰中放置15min，42℃加热90s后，再在冰中放置2min)后，加入900μL LB培养基，37℃振荡培养1h后，涂布于在含有壮观霉素的LB琼脂平板培养基上，于37℃培养12～16h待单菌落形成。挑选单菌落采用通用引物M13F/R进行PCR验证并测序验证，最终获得构建成功的质粒pMTL83353-alsD(见图2)。质粒的完整核苷酸序列如下所示(SEQ ID No.5)：

实施例3：基于拜氏梭菌的电转化体系优化

由于梭菌特别是拜氏梭菌的厌氧特性与复杂的培养条件，其转化效率较低始终是制约着对其进行遗传操作的关键因素，建立一套通用、简便的电转化方法以提高其工程改造的效率是十分必要的。因此，本发明不仅通过对梭菌电转化参数进行优化，也同时完善整个电转化流程，相关结果对后期梭菌特别是拜氏梭菌的基因工程改造有着积极作用。首先，将已活化好菌株WK用梭菌基本培养基(含酵母提取物10g/L、NaHCO₃ 2.52g/L、2-(N-吗啉基)乙磺酸2.132g/L、100×盐溶液10mL/L、1000×微量元素溶液1mL/L、二硫苏糖醇0.077g/L、半胱氨酸0.0242g/L、Na₂S·9H₂O 0.0156g/L及刃天青0.001g/L，其中100×盐溶液含(g/L)：NaCl 1.0；MgCl₂·6H₂O 0.5；KH₂PO₄ 0.2；NH₄Cl 0.3；KCl 0.3；CaCl₂·2H₂O 0.015；1000×微量元素溶液含(g/L)：FeCl₂·4H₂O 1.5；CoCl₂·6H₂O 0.19；MnCl₂·4H₂O 0.1；ZnCl₂0.07；H₃BO₃ 0.006；Na₂MoO₄·2H₂O0.036；NiCl₂·6H₂O 0.024；CuCl₂·2H₂O 0.002)活化至OD值约为1.3～1.5，此时细胞生长最为旺盛，细胞壁相对较薄，可为外源质粒经电穿孔进入胞内提供必要条件。此时将菌液分装10mL至充满N₂的血清瓶中，并将其置于冰上预冷30min，随后注入无氧10％甘油2.5mL洗涤菌体2～3次，每次都以4℃，3000g离心10min收集菌体，最后将液体彻底吸出，所得菌体沉淀即为待用的感受态细胞。

将实施例2中所得质粒pMTL83353-alsD(4～8μg)与300μL无氧10％甘油充分混匀后注入至上述感受态细胞充分混合后置于冰上预冷30min，随后将液体彻底吸出并迅速转移至已预冷的0.2cm电击杯中，采用BIO-RED Gene Pulser Xcell型电转仪进行电击，电击条件设置为：电压1800V、脉冲时间3.5ms。电击完成后立即使用注射器将菌液从电击杯中完全吸出并直接转移至含10mL梭菌基本培养基的血清瓶中，37℃静置复苏8h后加入壮观霉素溶液至终浓度100μg/mL，在37℃和150rpm条件下培养12h，此时监测菌株的排气量以确认菌株的活力。待菌株完全复苏后于4000g离心10min，并吸取血清瓶中9.8mL上清，后放入厌氧工作站中将剩余培养基与菌体充分混合均匀，吸出所有菌液涂布至含有不同壮观霉素抗性(125、250、500和800μg/mL)的筛选平板上(如图3所示)；随后置于37℃厌氧培养2～4天等待阳性克隆长出，经分析在高抗生素浓度筛选平板上(800μg/mL)转化效率仍可高达125cfu/μg质粒DNA。表1示：分别采用传统电转与本发明方法对工程菌株WK::alsD进行电转。

表1拜氏梭菌基因操作电转化方案的提升

*由于不同菌株感受态水平高低程度不同，采用传统方法对本发明工程菌株WK::alsD进行电转后，菌株无法生长，传统方法只能降低抗生素浓度，导致出现阳性率低的现象。

在厌氧工作站中使用无菌注射器挑取阳性克隆，并在含有1.0mL的30g/L葡萄糖的梭菌基本培养的EP管中充分混合，取用800μL注入至含有100μg/mL壮观霉素的发酵培养基中，于37℃和150rpm下培养12h待用。而剩余菌液抽取25μL至新的PCR管中，加入25μL蛋白酶K溶液混匀后放入PCR仪中，分别于55℃和80℃各加热15和30min以获得阳性克隆菌体裂解液。随后，吸取1μL菌体裂解液，依据实施例1所使用的引物和步骤进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳检测与阳性条带一致并测序正确，即可以确定获得阳性工程菌株WK::alsD。

实施例4：工程菌株WK::alsD的分批发酵

待工程菌株WK::alsD传代至稳定生长后，按接种量4％(v/v)的比例接种至50mL含30g/L梭菌基本培养基，并加入无氧壮观霉素溶液至终浓度为100μg/mL；与此同时设置野生型菌株WK作为阴性对照组。接种完成后，将培养基置于30℃和150rpm条件下恒温厌氧培养120h，每隔12～24h进行取样分析，每组发酵设置三个平行。测定生物溶剂过程采用气相色谱法，其型号为岛津的GC-2010Plus气相色谱仪，检测器为火焰离子检测器(FID)，色谱柱采用Innowax column(30m×0.25nm×0.25μm I.D.)。程序设置如下：进样口气化室温度230℃，载气为N₂，吹扫流量3mL/min，分流比1:99；色谱柱起始温度50℃，保留6min，升温程序为15℃/min，至230℃保留5min，色谱柱线速控制流量1.5mL/min；检测器温度250℃，检测器氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹气流量30mL/min。

从图5的发酵图可看出，以30g/L葡萄糖底物进行发酵，工程菌株WK::alsD在发酵终点120h时可产生了0.74g/L的2,3-丁二醇。与野生型菌株相比，工程菌株WK::alsD的副产物均降低了，其中丙酮产量明显下降了20.5％，乙醇产量略有升高，而丁醇产量没有受到显着影响。氧化产物(例如丙酮和乙酸等)水平的降低表明菌株WK::alsD在转化2,3-丁二醇过程中产生的多余NADH可有效用于将代谢中间体乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A还原为醇类物质(见图1)；与转化为丙酮相比，这些中间体转化为醇类不会发生脱羧反应，从而增加醇类物质的产率。与预期结果一致，工程菌株WK::alsD不但能够实现拜氏梭菌“从无到有”生产2,3-丁二醇的过程(见图4)，而且也将总醇物质(含丁二醇、丁醇和乙醇)的产量提升到9.02g/L，产率提升到0.3g/g。为进一步提高2,3-丁二醇的产量，分别观察以45和60g/L葡萄糖为底物时，工程菌株WK::alsD的分批发酵过程，结果显示2,3-丁二醇的产量可分别达到0.81g/L和0.87g/L，且总醇溶剂分别提升至10.77和11.59g/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州市乾相生物科技有限公司

<120> 代谢工程改造产溶剂梭菌及其应用

<130> MP22006885

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctctggca aggtttctta 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaactctct agttaaatca accac 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagctcatg tctacaataa acgctcttg 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgagttat ttctcaactt tacttatttc a 31

<210> 5

<211> 5576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60

atcaggaaac agctatgacc gcggccgcgt gtagtagcct gtgaaataag taaggaaaaa 120

aaagaagtaa gtgttatata tgatgattat tttgtagatg tagataggat aatagaatcc 180

atagaaaata taggttatac agttatataa aaattacttt aaaaattaat aaaaacatgg 240

taaaatataa atcgtataaa gttgtgtaat ttttaaggag gtgtgttaca tatgaccatg 300

attacgaatt cgagctcatg tctacaataa acgctcttgt ttctggcttg tatgatgggt 360

gtgcatcttt aaagaagctt ttaacaaaag gtgattttgg tataggtaca tttaaggact 420

tggatggaga gctaacactt ttagatggaa tattttatag aactaaaccg gacggaagta 480

tctatgtatg ctctgaaaat gattcagttc cttttgctgt gattactaaa cttgaaaatt 540

ataatacaga aaatattgaa gcttgtaatt catatgaggc tttaaaggaa acattagatg 600

gatttattga tagcaagaat atattttatg ctttttacat aaaaggcagc tttaattatg 660

ttaaaactag aactgttgtg aagcaaagca tgccttataa gccaatggct gaggttgtaa 720

agaatcaacc tgtgtttaat tatgaaaatg ttaagggaca tatagttggg tttaggtgtc 780

cggattatgt ggaaggtctt aatgttccag gatatcactt ccattttttg agtgatgata 840

agaaatttgg tggacacgta agtgatattt ctgtaaaaaa tgcagaggtt tttattcaaa 900

attgtttgtg ctttagaatg gaattgccac aaagtgaaag tttttatagt atgaaggttg 960

aaaatagaaa tgatgaaata agtaaagttg agaaataact cgaggcctgc agacatgcaa 1020

gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 1080

ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 1140

ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgctag cataaaaata 1200

agaagcctgc atttgcaggc ttcttatttt tatggcgcgc cgccattatt tttttgaaca 1260

attgacaatt catttcttat tttttattaa gtgatagtca aaaggcataa cagtgctgaa 1320

tagaaagaaa tttacagaaa agaaaattat agaatttagt atgattaatt atactcattt 1380

atgaatgttt aattgaatac aaaaaaaaat acttgttatg tattcaatta cgggttaaaa 1440

tatagacaag ttgaaaaatt taataaaaaa ataagtcctc agctcttata tattaagcta 1500

ccaacttagt atataagcca aaacttaaat gtgctaccaa cacatcaagc cgttagagaa 1560

ctctatctat agcaatattt caaatgtacc gacatacaag agaaacatta actatatata 1620

ttcaatttat gagattatct taacagatat aaatgtaaat tgcaataagt aagatttaga 1680

agtttatagc ctttgtgtat tggaagcagt acgcaaaggc ttttttattt gataaaaatt 1740

agaagtatat ttattttttc ataattaatt tatgaaaatg aaagggggtg agcaaagtga 1800

cagaggaaag cagtatctta tcaaataaca aggtattagc aatatcatta ttgactttag 1860

cagtaaacat tatgactttt atagtgcttg tagctaagta gtacgaaagg gggagcttta 1920

aaaagctcct tggaatacat agaattcata aattaattta tgaaaagaag ggcgtatatg 1980

aaaacttgta aaaattgcaa agagtttatt aaagatactg aaatatgcaa aatacattcg 2040

ttgatgattc atgataaaac agtagcaacc tattgcagta aatacaatga gtcaagatgt 2100

ttacataaag ggaaagtcca atgtattaat tgttcaaaga tgaaccgata tggatggtgt 2160

gccataaaaa tgagatgttt tacagaggaa gaacagaaaa aagaacgtac atgcattaaa 2220

tattatgcaa ggagctttaa aaaagctcat gtaaagaaga gtaaaaagaa aaaataattt 2280

atttattaat ttaatattga gagtgccgac acagtatgca ctaaaaaata tatctgtggt 2340

gtagtgagcc gatacaaaag gatagtcact cgcattttca taatacatct tatgttatga 2400

ttatgtgtcg gtgggacttc acgacgaaaa cccacaataa aaaaagagtt cggggtaggg 2460

ttaagcatag ttgaggcaac taaacaatca agctaggata tgcagtagca gaccgtaagg 2520

tcgttgttta ggtgtgttgt aatacatacg ctattaagat gtaaaaatac ggataccaat 2580

gaagggaaaa gtataatttt tggatgtagt ttgtttgttc atctatgggc aaactacgtc 2640

caaagccgtt tccaaatctg ctaaaaagta tatcctttct aaaatcaaag tcaagtatga 2700

aatcataaat aaagtttaat tttgaagtta ttatgatatt atgtttttct attaaaataa 2760

attaagtata tagaatagtt taataatagt atatacttaa tgtgataagt gtctgacagt 2820

gtcacagaaa ggatgattgt tatggattat aagcggccgg cccaatgaat aggtttacac 2880

ttactttagt tttatggaaa tgaaagatca tatcatatat aatctagaat aaaattaact 2940

aaaataatta ttatctagat aaaaaattta gaagccaatg aaatctataa ataaactaaa 3000

ttaagtttat ttaattaaca actatggata taaaataggt actaatcaaa atagtgagga 3060

ggatatattt gaatacatac gaacaaatta ataaagtgaa aaaaatactt cggaaacatt 3120

taaaaaataa ccttattggt acttacatgt ttggatcagg agttgagagt ggactaaaac 3180

caaatagtga tcttgacttt ttagtcgtcg tatctgaacc attgacagat caaagtaaag 3240

aaatacttat acaaaaaatt agacctattt caaagaaaat aggagataaa agcaacttac 3300

gatatattga attaacaatt attattcagc aagaaatggt accgtggaat catcctccca 3360

aacaagaatt tatttatgga gaatggttac aagagcttta tgaacaagga tacattcctc 3420

agaaggaatt aaattcagat ttaaccataa tgctttacca agcaaaacga aaaaataaaa 3480

gaatatacgg aaattatgac ttagaggaat tactacctga tattccattt tctgatgtga 3540

gaagagccat tatggattcg tcagaggaat taatagataa ttatcaggat gatgaaacca 3600

actctatatt aactttatgc cgtatgattt taactatgga cacgggtaaa atcataccaa 3660

aagatattgc gggaaatgca gtggctgaat cttctccatt agaacatagg gagagaattt 3720

tgttagcagt tcgtagttat cttggagaga atattgaatg gactaatgaa aatgtaaatt 3780

taactataaa ctatttaaat aacagattaa aaaaattata aaaaaattga aaaaatggtg 3840

gaaacacttt tttcaatttt tttgttttat tatttaatat ttgggaaata ttcattctaa 3900

ttggtaatca gattttagaa gtttaaactc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 3960

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 4020

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 4080

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 4140

agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 4200

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 4260

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 4320

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 4380

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 4440

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 4500

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 4560

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 4620

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 4680

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 4740

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 4800

cgcagggccc cctgcttcgg ggtcattata gcgatttttt cggtatatcc atcctttttc 4860

gcacgatata caggattttg ccaaagggtt cgtgtagact ttccttggtg tatccaacgg 4920

cgtcagccgg gcaggatagg tgaagtaggc ccacccgcga gcgggtgttc cttcttcact 4980

gtcccttatt cgcacctggc ggtgctcaac gggaatcctg ctctgcgagg ctggccggct 5040

accgccggcg taacagatga gggcaagcgg atggctgatg aaaccaagcc aaccaggaag 5100

ggcagcccac ctatcaaggt gtactgcctt ccagacgaac gaagagcgat tgaggaaaag 5160

gcggcggcgg ccggcatgag cctgtcggcc tacctgctgg ccgtcggcca gggctacaaa 5220

atcacgggcg tcgtggacta tgagcacgtc cgcgagctgg cccgcatcaa tggcgacctg 5280

ggccgcctgg gcggcctgct gaaactctgg ctcaccgacg acccgcgcac ggcgcggttc 5340

ggtgatgcca cgatcctcgc cctgctggcg aagatcgaag agaagcagga cgagcttggc 5400

aaggtcatga tgggcgtggt ccgcccgagg gcagagccat gactttttta gccgctaaaa 5460

cggccggggg gtgcgcgtga ttgccaagca cgtccccatg cgctccatca agaagagcga 5520

cttcgcggag ctggtgaagt acatcaccga cgagcaaggc aagaccgatc gggccc 5576

Claims (10)

1.编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因过表达在燃料合成中的应用。

2.基因元件，其特征在于，包括编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因、强启动子和/或穿梭质粒骨架；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的GenBank登录号包括WP_010966250；和/或

所述强启动子包括梭菌特异性强启动子P_fdx；和/或

所述穿梭质粒骨架包括穿梭质粒pMTL83353。

3.表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的基因元件；和/或具有：

(I)、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或

(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(I)的相同或相似；或

(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至150个。

4.重组菌株，其特征在于，包括如权利要求2所述的基因元件，和/或如权利要求3所述的表达载体。

5.如权利要求2所述的基因元件、如权利要求3所述的表达载体和/或如权利要求4所述的重组菌株在燃料合成中的应用。

6.如权利要求4所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，将alsD基因、如权利要求2所述的基因元件和/或如权利要求3所述的表达载体导入保藏编号为GDMCC NO:61493的产溶剂梭菌(Clostridium sp.WK)，获得所述重组菌株。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述导入包括电转化，所述电转化包括如下步骤：

步骤(1)、用培养基将所述重组菌株培养至OD值为1.3～1.5，获得菌液；

步骤(2)、将质粒、甘油和步骤(1)所述菌液混合，获得混合菌液；

步骤(3)、对步骤(2)所述混合菌液进行电击，获得转化菌液；

步骤(4)、对步骤(3)所述转化菌液静置后与抗生素混合，培养，获得复苏菌液；

步骤(5)、将步骤(4)所述复苏菌液转移至含抗生素的筛选平板，完成电转化；

所述甘油浓度包括10％；

所述静置的时间包括8h；

所述质粒的用量包括4～8μg；

所述电击的电压包括1800V；

所述电击的脉冲时间包括3.5ms；

步骤(5)所述抗生素的浓度包括125～800μg/mL。

8.如权利要求4所述的重组菌株的发酵方法，其特征在于，包括：将所述重组菌株接种至梭菌基本培养基并与抗生素混合，恒温发酵，获得发酵液；

所述梭菌基本培养基含有30～60g/L葡萄糖。

9.燃料的合成方法，其特征在于，取如权利要求4所述的重组菌株进行发酵，收集发酵产物，获得燃料。

10.如权利要求1或5所述的应用和/或如权利要求9所述的合成方法，其特征在于，所述燃料包括醇；

所述醇包括2,3-丁二醇、丁醇或乙醇中的一种或多种。

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