CN109554322B - 一种高产l-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产L‑苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术，替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为强启动子T7；敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，减少发酵过程苏氨酸的代谢消耗；替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，削弱赖氨酸的合成。最终得到积累L‑苏氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到30g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L‑苏氨酸奠定了基础。

Description

一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。
目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。广东肇庆星湖生物科技公司王焕章掣以大肠杆菌K12为出发菌株，利用Red重组敲除苏氨酸脱氨酶基因，筛选异亮氨酸营养缺陷型菌株，再过表达苏氨酸操纵子基因，成功构建大肠杆菌THR6，其发酵32h产L-苏氨酸可达75g/L。华东理工大学沈琼通过强化L-苏氨酸合成途径关键酶和L-苏氨酸分泌有关基因，构建基因工程菌E coli VNBKB.3507，其发酵48h产L-苏氨酸52.7g/L。Lee等运用系统生物学方法从E coli W3100(1acI-)出发，构建的工程菌株发酵50h产L一苏氨酸82.4g/L，糖酸转化率为39.3％。
大肠杆菌(Escherichia coli)已经被应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。然而利用表达质粒介导基因过表达必将在大肠杆菌细胞内引入抗生素抗性基因并在生长过程中添加一定的抗生素，引起人们对抗生素使用的疑虑。因此，提供一种安全高效的对大肠杆菌进行遗传改造的方法，对于氨基酸生产领域有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。
在本发明的一种实施方式中，是替换了高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。
在本发明的一种实施方式中，高丝氨酸激酶编码基因thrABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，二氢吡啶二羧酸合成酶编码基因dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。
本发明的第二个目的是提供上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1)构建T7启动子替换重组片段、苏氨酸脱氢酶敲除片段以及二氢吡啶二羧酸合成酶起始密码子替换重组片段：将大肠杆菌高丝氨酸激酶编码基因thrB起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T71；将苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB上下游同源臂序列融合后，得到片段TD2；将二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子上下游同源臂序列进行融合后，将起始密码子ATG替换为GTG，得到片段DA3；
2)构建重组质粒：分别将片段T71、TD2、DA3与含sgRNA的线性化载体PCR连接；分别得到含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含GA3的重组质粒；
3)构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，得到重组大肠杆菌CICC20905-cas9；随后将含T71的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-cas9，得到重组大肠杆菌CICC20905-thrT；将含TD2的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-thrT，得到重组大肠杆菌CICC20905-tdcD；将含GA3的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-tdcD，确认dapA基因起始密码子被替换为GTG并去除重组质粒pTDA后得到thrB基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失且dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR，所述外源质粒包括含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含GA3的重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。
在本发明的一种实施方式中，所述含有sgRNA的线性化载体包括pTT7、pTTD或pTDA。
在本发明的一种实施方式中，pCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，pTT7的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，pTTD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，pTDA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第三个目的是提供上述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种生产L-苏氨酸的方法，将上述的重组大肠杆菌于35-38℃、200-220rpm条件下培养5-8h，10-20％的接种量接种发酵培养基，35-38℃、200-220rpm条件下培养10-14h，0.05-0.1mM IPTG诱导45-50h。本发明的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品及食品工业中的应用。
本发明是以大肠杆菌CICC20905作为出发菌株，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为强启动子T7；敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，减少发酵过程苏氨酸的代谢消耗；替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，削弱赖氨酸的合成。最终得到积累L-苏氨酸的大肠杆菌基因工程菌，产量达到30g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产L-苏氨酸奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1：质粒图谱，A：pTT7；B：pTTD；C：pTDA。
图2：重组大肠杆菌CICC20905-THR以不同的碳源、氮源发酵生产L-苏氨酸。
图3：重组大肠杆菌CICC20905-THR在50L发酵罐中发酵生产L-苏氨酸。
图4：仅替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。
图5：敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。
图6：仅替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸。
具体实施方式
(一)摇瓶水平的种子培养基及发酵培养基：
平板培养基(g/L)：蔗糖1，Beef 10，peptone 10，NaCl 5，Agar 20，pH调至7.0。
种子培养基(g/L)：蔗糖20，酵母浸膏4，蛋白胨5，硫酸铵3，七水硫酸镁1，磷酸二氢钾2。
发酵培养基(g/L)：蔗糖30，磷酸二氢钾1.7，甜菜碱1.5，氯化钾0.5，硫酸铵5，七水硫酸镁1，玉米浆干粉3。
(二)发酵罐条件下的发酵方法：
种子培养基(50L罐装13L，13L是0小时体积，含冷凝水体积、种子体积)配方如表1所示。
表1种子培养基配方
配料 浓度(g/L)
蔗糖(分消) 30
硫酸铵 5
磷酸二氢钾 2
七水硫酸镁 1
玉米浆干粉 3
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.1
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.1
备注：121℃，13min灭菌，灭菌完毕调pH至7.0。
种子培养过程控制：
a)37℃，8～10h；
b)风量：0.4m3/h；
c)溶氧：前期20～40％，每次提转速20～50rpm；
d)转速：200～700rpm；
e)罐压：0.05～0.08MPa；
f)pH：氨水控制pH7.0；
g)接种量：10％，13L接种1.2L；
h)残糖控制在10g/L，约15g/L时开始补糖，一般7h开始补糖；
i)50L罐种子装量13L，溶氧100％，校正条件：600rpm，0.05MPa，0.4m3/h。
结束标准：约培养8～10h。
2发酵
培养基配方如表2所示。
表2发酵培养基配方
Figure BDA0001889660160000041
Figure BDA0001889660160000051
灭菌完毕用调pH至7.0。灭菌：121℃，3min。过程控制：
发酵初始体积20L，培养条件：
a)37℃；
b)风量：0.55～1.1m3/h；
c)溶氧：控制发酵过程DO在30％-40％；
d)转速：300～700rpm，每次提转速30～50rpm；
e)罐压：0.05～0.08MPa；
f)pH：氨水控制pH6.9，分析纯氨水不再用水稀释，大生产用液氨调节。
g)接种量：20％，20L接种4L
h)残糖(总糖):低于5g/L，开始补糖，以测定总糖含量控制补糖：目标5-8g/L，后期14小时之后：在5-10g/L时水解法滴定测总糖。
i)50L罐发酵底料20L，溶氧100％校正条件：600rpm，0.08MPa，1.1m3/h。
(三)L-苏氨酸的测定方法：
1)样品处理：取1mL发酵液，离心去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液适当稀释后12000rpm，离心10min，然后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。
2)分析方法：OPA硼酸柱前衍生化，9.478min洗脱峰为苏氨酸
3)色谱条件：
(1)色谱柱：色谱柱C18(250×4.6)mm
(2)柱温：40℃
(3)流动相A：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1L，然后加入200μL三乙胺，用5％的醋酸将PH调到7.20±0.05；抽滤后加入5mL四氢呋喃，混合后备用。流动相B：称取3.01g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200mL；用5％醋酸将pH调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400mL乙腈和400mL甲醇，混合后备用。
(4)流速：1.0ml/min；
(5)紫外检测器：338nm；
(6)柱温：40℃；
下述实施例中，没有多作说明的都是采用常规的分子生物学实验方法。
实施例1重组片段的构建
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-thrB-1R和pT-thrB-2F(见表3)，根据大肠杆菌CICC20905基因组序列信息，设计含T7启动子序列的引物pT-thrB-1F、pT-thrB-2R，使用上述四种引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增带有T7启动子的thrABC同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段T71；
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-tdc-1F、pT-tdc-1R、pT-tdc-2F和pT-tdc-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增tdcB基因两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TD2。
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-GTG-1F、pT-GTG-1R、pT-GTG-2F和pT-GTG-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增dapA基因起始密码子两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段DA3。
表3引物表
Figure BDA0001889660160000061
Figure BDA0001889660160000071
实施例2重组质粒的构建
根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-thrB-F、pT-thrB-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTT7(序列信息如SEQ ID NO.5所示)；设计引物pT-tdc-F和pT-tdc-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTTD(序列信息如SEQ ID NO.6所示)；设计引物pTGTG-F和pT-GTG-R进行PCR得到含有sgRNA的线性化载体pTDA(序列信息如SEQ ID NO.7所示)，分别与重组片段T71、TD2、DA3连接构建重组质粒pTT7、pTTD、pTDA，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。pTT7、pTTD、pTDA的质粒图谱如图1所示。
实施例3重组T71片段大肠杆菌的构建
将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC20905。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CGC9，随后将重组质粒pTT7转化大肠杆菌CICC20905-cas9，筛选确认T7启动子整合成功，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTT7，选用引物pT-thrB-2F与pT-thrB-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现600bp左右条带，测序正确后，得到thrABC基因簇启动子为T7的重组大肠杆菌CICC20905-thrT。
实施例4重组TD2片段大肠杆菌的构建
将重组质粒pTTD转化大肠杆菌CICC20905-thrT，选用引物pT-tdc-1F和pT-tdc-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条带，测序正确后得到thrABC基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失的重组大肠杆菌CICC20905-tdcD
实施例5重组GA3片段大肠杆菌的构建
将重组质粒pTDA转化大肠杆菌CICC20905-tdcD，选用引物pT-GTG-1F和pT-GTG-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现1200bp左右条，测序带确认dapA基因起始密码子被替换为GTG，加0.05mM IPTG在30℃下诱导12h，去除重组质粒pTDA后得到thrABC基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失且dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG；在37℃下培养12h，去除质粒pCas9后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR。
实施例6葡萄糖与糖蜜作碳源发酵生产L-苏氨酸
将重组大肠杆菌CICC20905-THR在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，上述摇瓶发酵培养基中去除蔗糖与甜菜碱，添加葡萄糖25g/L，甜菜糖蜜20g/L。37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导42h菌体不再耗糖。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸18g/L。
实施例7葡萄糖与甜菜碱作碳源发酵生产L-苏氨酸
将重组大肠杆菌CICC20905-THR在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，上述摇瓶发酵培养基中去除蔗糖，改为葡萄糖25g/L；37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导48h至糖耗尽。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸26g/L。
实施例8蔗糖与甜菜碱作碳源发酵生产L-苏氨酸
将重组大肠杆菌CICC20905-THR在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，摇瓶发酵培养基配方如上表述；于37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导48h至糖耗尽。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸30g/L，如图2所示。
将重组大肠杆菌CICC20905-THR在50L罐分批补料42-48h发酵，L-苏氨酸产量达130g/L，糖酸转化率55％，如图3所示。
对比例1仅替换高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸
根据pET28a(+)序列信息，设计引物pT-thrB-1R和pT-thrB-2F(见表1)，根据大肠杆菌CICC20905基因组序列信息，设计含T7启动子序列的引物pT-thrB-1F、pT-thrB-2R，使用上述四种引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增带有T7启动子的thrB同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段T71；
根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-thrB-F、pT-thrB-R线性化含有sgRNA1的pTT7；与重组片段T71连接构建重组质粒pTT7，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC20905。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CGC9，随后将重组质粒pTT7转化大肠杆菌CICC20905-cas9，筛选确认T7启动子整合成功并去除重组质粒pTT7，选用引物pT-thrB-2F与pT-thrB-2R挑选转化子进行菌落PCR，出现600bp左右条带，测序正确后，得到thrABC基因簇启动子为T7的重组大肠杆菌CICC20905-thrT，去除质粒pCas9后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR1。
将重组大肠杆菌CICC20905-THR1在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落至种子培养基，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种至摇瓶发酵培养基，摇瓶发酵培养基配方如上表述；37℃、220rpm条件下培养12h加入0.1mM IPTG诱导，24h停止生长。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸12g/L，结果如图4所示。
对比例2敲除苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-tdc-1F、pT-tdc-1R、pT-tdc-2F和pT-tdc-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增tdcB基因两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段TD2。
根据载体pTarget序列信息，设计引物pT-tdc-F和pT-tdc-R线性化含有sgRNA2的pTTD；与重组片段TD2连接构建重组质粒pTTD，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC20905。采用Kana抗性板筛选转化重组大肠杆菌CGC9，随后将重组质粒pTT7转化大肠杆菌CICC20905-cas9成功的重组大肠杆菌CGC9，随后将重组质粒pTTD转化大肠杆菌CICC20905-cas9，筛选确认tdcB基因敲除成功并去除重组质粒pTTD，设计引物，挑选转化子进行菌落PCR验证，测序结果正确后，得到tdcB基因缺失的重组大肠杆菌CICC20905-tdcD；去除质粒pCas9后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR2。
将重组大肠杆菌CICC20905-THR2在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导48h至糖耗尽。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸17g/L，结果如图5所示。
对比例3：仅替换赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG，蔗糖与甜菜碱作碳源发酵获得的重组菌生产L-苏氨酸
根据大肠杆菌序列信息，设计引物pT-GTG-1F、pT-GTG-1R、pT-GTG-2F和pT-GTG-2R，使用上述引物从大肠杆菌CICC20905基因组中扩增dapA基因起始密码子两侧同源臂基因序列各600bp，将所得2段扩增片段通过融合PCR技术融合得到重组片段DA3。
根据载体pTarget序列信息，设计引物pTGTG-F和pT-GTG-R线性化含有sgRNA3的pTDA，分别与重组片段GA3连接构建重组质粒pTDA，BamHI、BsgI双酶切验证及测序，确认重组质粒构建成功。
将含有cas9蛋白的pCas9质粒转化大肠杆菌CICC20905。采用Kana抗性板筛选转化成功的重组大肠杆菌CGC9，随后将重组质粒pTDA转化大肠杆菌CICC20905，设计引挑选转化子进行菌落PCR验证，测序确认dapA基因起始密码子被替换为GTG并去除重组质粒pTDA后得到dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG1；去除质粒pCas9后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR3。
将重组大肠杆菌CICC20905-THR3在平板培养基中37℃下培养24h，接种单菌落，于37℃、220rpm条件下培养6h，20％的接种量接种摇瓶发酵培养基，37℃、220rpm条件下培养12h，0.1mM IPTG诱导48h至糖耗尽。利用HPLC高效液相色谱测定发酵液上清中含有L-苏氨酸16g/L，结果如图6所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
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tgtgtttttt ttgtttatat tcaagtggtt ataatttata gaataaagaa agaataaaaa 2880
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<210> 5
<211> 3386
<212> DNA
<213> 人工合成
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caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1080
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<211> 3300
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
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caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1080
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
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<212> DNA
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<400> 9
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<212> DNA
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<400> 11
agggtaatag atctaagctt caccagttcg cctttttcat taccg 45
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
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<212> DNA
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<400> 13
aattcaaaaa aagcaccgac tcgg 24
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<212> DNA
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<400> 17
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<400> 18
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<400> 19
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<212> DNA
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<400> 20
tcggtgcttt ttttgaattc acgcgctgcg acg 33
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<400> 21
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<400> 22
cttttcatcc atcggagtaa caatcgcgac aatact 36
<210> 23
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<400> 23
agggtaatag atctaagctt tgcgcagccc gttcat 36
<210> 24
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<212> DNA
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<400> 24
aagcttagat ctattaccct gttatcccta ct 32
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gaattcaaaa aaagcaccga ctcgg 25

Claims (9)

1.一种产L-苏氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，替换了高丝氨酸激酶编码基因thrB启动子为T7启动子，敲除了苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB并替换了赖氨酸合成途径二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子ATG为GTG。
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，是对大肠杆菌CICC20905进行基因组编辑得到的。
3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因组编辑是利用CRISPR-Cas9技术进行的。
4.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）构建T7启动子替换重组片段、苏氨酸脱氢酶敲除片段以及二氢吡啶二羧酸合成酶起始密码子替换重组片段：将大肠杆菌高丝氨酸激酶编码基因thrB起始密码子上下游同源臂序列融合后，引入T7启动子，得到重组片段T71；将苏氨酸脱氢酶编码基因tdcB上下游同源臂序列融合后，得到片段TD2；将二氢吡啶二羧酸合成酶DHDPS编码基因dapA的起始密码子上下游同源臂序列进行融合后，将起始密码子ATG替换为GTG，得到片段DA3；
2）构建重组质粒：分别将片段T71、TD2、DA3与含sgRNA的线性化载体连接；分别得到含T71的重组质粒、含TD2的重组质粒和含DA3的重组质粒；
3）构建高产L-苏氨酸重组大肠杆菌：将含有cas9蛋白的质粒转化大肠杆菌CICC20905，得到重组大肠杆菌CICC20905-cas9；随后将含T71的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-cas9，得到重组大肠杆菌CICC20905-thrT；将含TD2的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-thrT，得到重组大肠杆菌CICC20905-tdcD；将含DA3的重组质粒转化大肠杆菌CICC20905-tdcD，确认dapA基因起始密码子被替换为GTG并去除重组质粒pTDA后得到thrB基因簇启动子为T7、tdcB基因缺失且dapA基因起始密码子为GTG的重组大肠杆菌CICC20905-dapG；去除外源质粒后，得到重组大肠杆菌CICC20905-THR。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有cas9蛋白的质粒包括pCas9。
6.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述含T71的重组质粒序列如SEQ IDNO.5所示，所述含TD2的重组质粒序列如SEQ ID NO.6所示，所述含DA3的重组质粒SEQ IDNO.7所示。
7.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用。
8.一种生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌于35-38 ℃、220 rpm条件下培养5-8 h，10-20 %的接种量接种发酵培养基，35-38 ℃、200-220 rpm条件下培养10-14 h，0.05-0.1mM IPTG诱导45-50 h。
9.权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌在饲料、制药、保健品或 食品工业中的应用。
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