CN114457100B - 一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统及其应用。本发明的大肠杆菌基因编辑系统包括：质粒pEcCpf1和质粒pcrEG；或质粒pEcCpf1H和质粒pcrEG；质粒pEcCpf1通过将pEcCas载体上的Cas9蛋白替换为Cpf1蛋白，靶向基因pMB1的sgRNA替换为靶向基因pMB1的crRNA序列得到，其中，所述质粒pEcCpf1上连接有编码λ‑Red重组酶系的基因，质粒pcrEG通过将pTarget载体上的sgRNA插入区替换为crRNA插入区，并插入sfgfp基因得到；质粒pEcCpf1H通过将质粒pEcCpf1中的λ‑Red重组酶系替换成CspRecT蛋白得到。本发明应用该基因编辑系统进行基因整合、基因敲除以及基因修饰的简便方法，解决了传统基因编辑系统进行多位点编辑时需要多个启动子且大片段插入困难的问题。

Description

一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统及其应用。

背景技术

大肠杆菌作为一种重要的模式工业微生物，不仅被用于微生物机理研究，也被广泛用于生物燃料，重要的化学品，药品等的生产。为了防止噬菌体的入侵，微生物进化出了很多防御系统，而CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats and CRISPR-associated proteins)系统则是其中比较常见的一种获得性免疫系统。以目前研究最为广泛的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR/Cas9系统为例，其作用机制如下：当第一次受到新的噬菌体入侵时，其会将噬菌体基因组上的原间隔序列(postospacer)作为新的间隔序列插入到基因组上CRISPR序列的起始序列之后，作为第一个间隔序列；当再次受到该噬菌体入侵式，该CRISPR序列会转录产生一条长链RNA，即前体crRNA(pre-crRNA)，随后在Cas蛋白复合体和tracrRNA(trans-activating crRNA)的共同作用下，pre-crRNA被剪切产生成熟的crRNAs；tracrRNA与crRNA形成的复合体可以结合Cas9蛋白并引导其识别特定的噬菌体DNA并将其切割产生双链断裂(DSB)，从而将其破坏。

利用上述的作用机制，经过人为改造，可以使Cas9蛋白识别并切割细菌的基因组产生DSB；然后通过导入同源模板便可以在同源重组修复的过程中将特定的修饰引入到细菌的基因组上；由于没有成功修复的菌株会因为DSB而致死，因此只有成功修复并引入突变才会使得Cas9蛋白不再识别并切割细胞的基因组，细胞才能存活下来，这就是利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的基本原理。同时为了操作的方便性，常常将crRNA和tracrRNA构建成一个嵌合体即sgRNA(small guide RNA)进行表达，这样只需要表达sgRNA和Cas9蛋白便可进行基因编辑。目前除了CRISPR/Cas9系统以外，CRISPR/Cpf1系统也常被应用于基因编辑，与CRISPR/Cas9系统不同的是，CRISPR/Cpf1只需要crRNA便可发挥作用；而且Cpf1自身就具有RNA酶的活力，可以对pre-crRNA进行加工；因此可以设计一段由多个crRNA组成的crRNA阵列，当其被Cpf1处理成为多个成熟的crRNA之后便可以同时引导Cpf1在基因组多个位置进行切割，实现多个位点的同时编辑。

目前大肠杆菌中已经有多项CRISPR/Cas9的基因编辑系统以及应用研究，但是CRISPR/Cpf1系统的研究并不多。而且当利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统对大肠杆菌进行多位点编辑时，需要表达多个sgRNA，并且每个sgRNA都需要各自的启动子，所以也增加了构建质粒的难度，而且使用CRISPR/Cas9在大肠杆菌基因组上进行大片段的插入时也比较困难。因此，仍需要寻找一种新的大肠杆菌基因编辑方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了两种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统，其中一种为pEcCpf1/pcrEG基因编辑系统，运用该系统可以在大肠杆菌中实现基因整合以及基因敲除，该系统能以较高的效率在大肠杆菌基因组中插入不同长度的DNA片段(1000bp-9000bp)，解决了传统基因编辑系统大片段插入困难的问题；第二种为pEcCpf1H/pcrEG基因编辑系统，该系统可以使用90-nt的单链引物当作同源臂在大肠杆菌的基因组上方便快捷的实现单基因或多个基因的完整敲除以及修饰。

本发明的第一个目的是提供一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统，该大肠杆菌基因编辑系统包括：

质粒pEcCpf1和质粒pcrEG；

或质粒pEcCpf1H和质粒pcrEG；

质粒pEcCpf1通过将pEcCas载体上的Cas9蛋白替换为Cpf1蛋白，靶向基因pMB1的sgRNA替换为靶向基因pMB1的crRNA序列得到，其中，所述质粒pEcCpf1上连接有编码λ-Red重组酶系的基因，所述λ-Red重组酶系包括Gam蛋白、Bet蛋白和Exo蛋白；

质粒pcrEG通过将pTarget载体上的sgRNA插入区替换为crRNA插入区，并且插入sfgfp基因得到；

质粒pEcCpf1H通过将上述质粒pEcCpf1中的λ-Red重组酶系替换成CspRecT蛋白得到。

进一步地，质粒pEcCpf1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，质粒pEcCpf1H的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，质粒pcrEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，质粒pcrEG上的sfgfp基因可方便正确插入crRNA序列菌株的筛选，crRNA插入后，可以将其替换为所需编辑的同源臂，作为同源臂插入区；crRNA阵列中，多个crRNA可通过阵列的形式进行表达且crRNA阵列插入区上游含有P_j23119启动子，用于所需crRNA阵列的表达。

进一步地，质粒pEcCpf1或质粒pEcCpf1H含有pSC101复制子且具有第一抗生素抗性。如本发明的一个实施例中，第一抗生素为卡那霉素。

进一步地，质粒pcrEG含有pMB1复制子且具有第二抗生素抗性。如本发明的一个实施例中，第二抗生素为壮观霉素。

进一步地，编码Cpf1蛋白的fncpf1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，质粒pEcCpf1含有的λ-Red重组酶系中，编码Gam蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码Bet蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码Exo蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。该λ-Red重组酶系来源于大肠杆菌的λ噬菌体，用于促进大肠杆菌中的同源重组。

进一步地，质粒pEcCpf1H中，编码CspRecT蛋白的csprecT基因的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

进一步地，质粒pEcCpf1或质粒pEcCpf1H中，λ-Red重组酶系或CspRecT蛋白通过诱导型启动子P_araB调控表达。

进一步地，crRNA阵列插入区的两端含有Eco31I酶切位点，可以用于crRNA序列的快速组装。

本发明的第二个目的是提供上述基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统在大肠杆菌单基因编辑或多基因编辑中的应用。

进一步地，应用上述基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统pEcCpf1/pcrEG系统于大肠杆菌的基因敲除和基因整合。其中，该系统在进行基因编辑时，共转化同源臂和crRNA表达质粒只能进行基因敲除，不能实现基因整合，所以在后续的基因编辑中，我们都将同源臂连接在crRNA表达载体上。

进一步地，在使用pEcCpf1/pcrEG系统进行基因编辑时，电转法或化转法都可将质粒导入大肠杆菌中。优选为化转法，相比于电转，大肠杆菌的化转更稳定，能够获得更多的转化子从而具有更高的基因编辑效率。

进一步地，同源臂连接在质粒pcrEG上。由表1和表2的对比中可看出(其中，表1为pEcCpf1/pcrEG系统介导的基因编辑效率(共转化质粒和同源臂)表2pEcCpf1/pcrEG系统介导的基因编辑效率(同源臂连接在crRNA表达质粒上))，将同源臂连接在质粒pcrEG上而非共转化质粒和同源臂，其基因编辑效率大大提高。

进一步地，应用上述基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统pEcCpf1H/pcrEG系统于大肠杆菌中的基因敲除，碱基编辑以及多基因编辑。

进一步地，在使用pEcCpf1H/pcrEG系统进行基因编辑时，采用电转法将质粒导入大肠杆菌中。

进一步地，利用引物作为同源模板进行基因编辑时，由于DNA复制过程中有先导链和后随链之分，优选将作为同源臂的单链引物设置在后随链上，基因编辑效率会更高(区分大肠杆菌基因组上先导链和后随链如图4所示)。

进一步地，上述基因编辑中，crRNA阵列插入方法引用方法“SOMACA”，来源于文献CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation systemfor Bacillus subtilis。具体地，当表达单个crRNA时，此时crRNA可以直接通过设计带有重叠区的一对引物，经过变性退火形成带有粘性末端的引物二聚体(订购的引物浓度为10μM/μL，反应体系为20μL，即上下游引物各10μL。反应条件为：98℃2min，0.1℃/s降温至4℃后保温。)反应过后将其稀释10倍，取1μL与酶切后的载体连接即可。连接方式：10μL体系，其中酶切后的载体1μL，引物二聚体稀释液1μL，T4连接酶1μL，T4连接酶buffer1μL。配好的体系与22℃中反应3h，或16℃过夜。当设计多个crRNA阵列时，我们需要用DR2将不同的靶序列隔开构建一个crRNA阵列即可，这样当crRNA阵列作为一个转录单元变成前体crRNA后，Cpf1会在DR2前进行切割，从而形成成熟的crRNA。此时crRNA片段的构建过程和单片段不同，因为crRNA之间的连接液需要磷酸基团，若此时仍合成引物进行退火，后续则还需要进行磷酸化，不然无法连接。多个crRNA通过具有重叠区的引物进行PCR，从而形成平末端的二聚体(PrimerSTAR延伸5s，20个循环，结束后同样稀释10倍)，并通过引物在其5′端引入Eco31I这个酶切位点，便可以在酶切后形成任意的粘性末端。之后取多个crRNA的引物二聚体稀释液各1μL进行Golden gate组装即可。

进一步地，在导入质粒pEcCpf1或pEcCpf1H后，制备大肠杆菌感受态细胞时，向体系中加入终浓度为10mM的阿拉伯糖以诱导质粒pEcCpf1上λ-Red重组酶系或pEcCpf1H上CspRecT蛋白的表达。

进一步地，当基因编辑操作结束后，通过第一抗生素和第二抗生素筛选出同时转入质粒pEcCpf1和质粒pcrEG的阳性大肠杆菌。可再通过菌落PCR和Sanger测序验证基因编辑情况。

本发明的基因编辑系统中，质粒pEcCpf1和质粒pEcCpf1H中靶向基因pMB1的crRNA序列在受鼠李糖调控的诱导型启动子P_rhaB的调控下表达，从而可以切割消除质粒pcrEG。而且，质粒pEcCpf1和质粒pEcCpf1H中含有sacB基因，当培养基中存在蔗糖时会对细胞产生毒性，从而可以将质粒pEcCpf1或质粒pEcCpf1H消除。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明构建了Cpf1表达载体pEcCpf1和crRNA表达载体pcrEG，在大肠杆菌中可以完成1000-9000bp范围内DNA片段的高效整合(整合片段时同源臂和整合基因需放到crRNA表达载体上)；此外，本发明构建的Cpf1表达载体pEcCpf1H和crRNA表达载体pcrEG在大肠杆菌中可通过使用引物作为同源臂完成两个基因的完整敲除、两个基因的碱基修饰以及短序列(25bp左右均可)的插入。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明90-nt单链引物设计原则示意图；

图2为本发明大肠杆菌不同转化方式的转化效率；

图3为pEcCpf1/pcrEG系统介导的不同长度的DNA片段的敲除与整合效率；

图4为大肠杆菌中先导链和后随链的区分方式；

图5为本发明利用质粒pEcCpf1进行基因编辑时的基因编辑系统；

图6为本发明利用质粒pEcCpf1H进行基因编辑时的基因编辑系统；

图7为质粒pEcCpf1和质粒pEcCpf1H利用单链引物进行基因编辑时的效率对比图。

图8为pEcCpf1/pcrEG系统介导的不同转化方式的基因整合效率；

图9为pEcCpf1H/pcrEG系统介导的不同长度DNA片段的敲除效率；

图10为pEcCpf1H/pcrEG系统介导的单点突变以及短序列插入的编辑效率；

图11为pEcCpf1H/pcrEG系统介导的多基因编辑效率；

图12为pEcCpf1/pcrEG系统和pEcCpf1H/pcrEG系统进行基因编辑的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明下述实施例中涉及以下具体操作方法：

所述的大肠杆菌基因编辑系统pEcCpf1/pcrEG进行基因编辑时，包括如下步骤(后面所述的抗生素浓度为：卡那霉素：50μg/mL，壮观霉素：100μg/mL)：

(1)首先将Cpf1表达载体pEcCpf1转化到大肠杆菌中，涂布在含有卡那霉素的LB培养基平板上得到阳性菌落。

(2)设计靶向特异性的crRNA阵列，连接到载体pcrEG上。

(3)先将同源臂连接到含有crRNA序列的载体pcrEG中，然后再将其转化到(1)中所述的大肠杆菌中，这样不仅会更快的得到菌落，并且在基因插入时，编辑效率也会大幅度提升(此种方法使用化转即可)。另外，在制备含有质粒pEcCpf1的大肠杆菌感受态时，需要加入终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导质粒上同源重组酶的表达。(注：共转化crRNA表达质粒和同源模板时只能实现基因敲除，不能实现基因整合，结果见表1；所以后续在使用该系统时，将编辑所需的同源臂连接在crRNA表达载体上)。

表1

(4)转化第二个载体后，加入1mL的LB培养基后培养1.5-2h,然后5000g离心3分钟后弃去900μL培养基，留下100μL培养基将菌体重悬并涂布到含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上。

(5)长出单菌落后通过菌落PCR和Sanger测序验证基因编辑情况，阳性菌株可以只将第二个质粒(即crRNA表达质粒)消除，而将pEcCpf1质粒留在菌中，以方便后续的基因编辑操作。

(6)质粒消除的方法如下：首先将验证正确的阳性菌株接种到含有卡那霉素和终浓度为10mM的鼠李糖的LB培养基中(2mL培养基即可)，过夜培养后(12h左右即可)划线在含有卡那霉素的LB平板上，待平板上长出单菌落后，挑选菌落分别点在含有卡那霉素和含有壮观霉素的LB平板上，当单菌落在含有卡那霉素的平板上生长但是在含有壮观霉素的平板上不长时，可以确认crRNA表达质粒已被成功消除；然后将该单菌落接种在含有5g/L的葡萄糖的无抗LB培养基中过夜培养(12h左右即可)，然后将菌液划线在含有5g/L的葡萄糖和10g/L的蔗糖的LB平板上，待平板上长出单菌落后，挑选单菌落分别点在含有卡那霉素的平板和无抗的LB平板上，当单菌落在含有卡那霉素的平板上不生长但是在无抗的LB平板上生长时，可以确认消除pEcCpf1质粒。

所述的大肠杆菌多基因编辑系统pEcCpf1H/pcrEG基因编辑系统用于大肠杆菌基因编辑时，步骤如下：

(1)首先将Cpf1表达载体pEcCpf1H转化到大肠杆菌中，涂布在卡那霉素的LB培养基平板上得到阳性菌落；

(2)设计靶向特异性的crRNA阵列，连接到载体pcrEG上；若要进行多基因编辑，则设计多个靶向特异性的crRNA形成crRNA阵列连接到载体pcrEG上。

(3)设计90-nt的单链引物作为同源模板(设计原则如图1所示)，并将其与crRNA表达质粒同时转化到上述(1)中的含有pEcCpf1H的大肠杆菌中(此步骤使用电转，因为化转单链的引物和crRNA表达质粒不能实现基因编辑)；在制备含有质粒pEcCpf1H的大肠杆菌感受态时，需要加入终浓度为10mM的阿拉伯糖诱导质粒上同源重组酶的表达。

(4)转化第二个载体后，加入1mL的LB培养基后培养2h,然后5000g离心3分钟后弃去900μL培养基，留下100μL培养基将菌体冲悬并涂布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上。

(5)长出单菌落后用菌落PCR以及Sanger测序验证基因编辑情况，阳性菌株可续的基因编辑操作。

(6)质粒消除方法与上述步骤(6)相同。

实施例1构建Cpf1表达载体pEcCpf1

首先使用序列如下表中序列1和序列2所示的引物以质粒pEcCas为模板通过PCR扩增出片段1，然后使用序列如下表中3和4所示的引物以质粒pHT-XCR6为模板通过PCR扩增出片段2(载体pHT-XCR6可通过Molecular Cloud质粒共享平台获取，编号为MC_0068418)，接着使用序列如下表中5和6所示的引物以质粒pEcCas为模板通过PCR克隆出片段3。最后通过无缝克隆试剂盒将这三个片段构成质粒pEcCpf1(序列如SEQ ID NO.1所示)。

编号	引物序列
		1	5′-agagcgcagatacatctacaacagtagaaattatttaaagttcttagactacgaccagtctaaaaagcgc-3′
2	5′-aaattgacatttttgcctcctaaaataaaaagtttaaattaaatcc-3′
		3	5′-ggaggcaaaaatgtcaatttatcaagaatttgttaataaatatagtttaag-3′
4	5′-ctttagttattcctattctgcacgaact-3′
		5	5′-cgtgcagaataggaataactaaagtatattttagatgaagattatttcttaatctagacat-3′
6	5′-tgtagatgtatctgcgctctgctgaagccaaatttctactgttgtagatactatcgtcttgagtccaacc-3′

实施例2构建Cpf1表达载体pEcCpf1H

使用序列如下表中序列1和2所示的引物以质粒pEcCpf1为模板通过PCR扩增出片段1，然后使用序列如3和4所示的引物以质粒CspRecT为模板通过PCR扩增出片段2。最后通过无缝克隆试剂盒将这两个片段构成质粒pEcCpf1H(序列如SEQ ID NO.2所示)。

编号	引物序列
		1	5′-ggtgttttaaatgacaccggacattatcctgca-3′
2	5′-ttcacgatttggttcattcgttttatacctctgaatcaatatcaacctgg-3′
		3	5′-cgaatgaaccaaatcgtgaagttcactgac-3′
4	5′-ccggtgtcatttaaaacacctcgccttcgtcaac-3′

实施例3构建crRNA阵列表达载体pcrEG

首先使用序列如下表序列1和2所示的引物以质粒pTarget为模板通过PCR扩增出片段1，然后使用序列如3和4所示的引物以质粒pcrF19NM2为模板通过PCR扩增出片段2(质粒pcrF19NM2可通过Molecular Cloud质粒共享平台获取，编号为MC_0101256)。接着使用序列如5和6所示的引物以质粒pHT-P_grac100-sfGFP为模板通过PCR扩增出片段3。最后通过无缝克隆试剂盒将三个片段构成质粒pcrEG(序列如SEQ ID NO.3所示)。

编号	引物序列
		1	5′-ctacaaataacgaacggcagatcagaatt-3′
2	5′-cctcgcgtctctacctctactagtattatacctaggactgagct-3′
		3	5′-gtagaggtagagacgcgagg-3′
4	5′-acgttaataaggccaagctaactaagtttgaaa-3′
		5	5′-tagcttggccttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatg-3′
6	5′-ctgccgttcgttatttgtagagctcatccatgcca-3′

实施例4 pEcCpf1/pcrEG系统在大肠杆菌中介导的基因编辑

首先将质粒pEcCpf1转化到需要编辑的大肠杆菌宿主中。

利用质粒pEcCpf1进行基因编辑时，根据待编辑的基因设计其相应的crRNA阵列以及同源臂并将其分别连入质粒pcrEG中(见图5)。

实施例5大肠杆菌不同转化方式对转化效率的影响

利用质粒pEcCpf1进行基因编辑时，制备了化转感受态和电转感受态两种，并分别添加了终浓度为0mM和10mM的阿拉伯糖，然后在每种感受态中转化了相同浓度的壮观霉素抗性的质粒(无crRNA序列的pcrEG质粒)，通过统计转化子数量来比较转化效率(见图2)。

从图2中可以看出，相比于电转感受态，化转感受态具有更高的转化效率，且能够获得更多的转化子。若在制备感受态时添加10mM的阿拉伯糖，则会降低感受态的转化效率。

实施例6 pEcCpf1/pcrEG系统介导的不同转化方式的基因编辑效率利用质粒pEcCpf1进行基因编辑时，对于整合基因，同时采取了化转和电转两种方式，比较两种转化方式的基因编辑效率。并且在添加了阿拉伯糖的感受态中，还同时共转化了左右各50bp同源臂和目的基因的片段(见图8)。

尝试了6种不同的转化方式(电转和化转各3种)，最终发现，在制备含有pEcCpf1质粒的大肠杆菌化转感受态时添加终浓度为10mM的阿拉伯糖，然后利用化转的方式将crRNA表达质粒转入上述化转感受态中，基因编辑效率接近100％，并且能够获得较多的转化子。所以在后续的基因编辑中，pEcCpf1/pcrEG系统通过将同源臂连接在crRNA表达质粒上，采用化转的方式实施基因编辑。

实施例7 pEcCpf1/pcrEG系统介导的在大肠杆菌中不同PAM区的基因编辑效率以及不同转化方式的转化效率

选择基因xylR和基因ykgh作为目标基因，验证该系统的敲除效率。选择基因ykgh作为插入位点，插入prs基因；同时选取xylR基因作为插入位点，在其中插入gfp基因(结果见表2)。

表2

实施例8 pEcCpf1/pcrEG系统介导的在大肠杆菌中不同长度的DNA片段的敲除与整合效率

选择基因mutS作为插入位点，在其上插入了1000-9000bp长度的DNA片段(结果见图3A)；在基因xylR上设计一个crRNA，通过设计不同的同源臂在大肠杆菌中敲除不同长度的片段(结果见图3B)。

如图3所示，将同源臂放在crRNA表达质粒上，采用化转的方式将质粒转入含有pEcCpf1质粒的大肠杆菌宿主中，可成功插入长达9000bp的DNA片段；并且该系统还可以在大肠杆菌中以很高的效率完成不同长度片段的敲除。

实施例9 pEcCpf1H/pcrEG系统在大肠杆菌中介导的基因编辑

首先将质粒pEcCpf1H转化到需要编辑的大肠杆菌宿主中。

利用质粒pEcCpf1H进行基因编辑时，设计90-nt的单链引物作为同源臂，并将所需的crRNA阵列连入质粒pcrEG中(见图6)。

实施例10质粒pEcCpf1和质粒pEcCpf1H利用单链引物进行单基因敲除的效率对比

选取基因xylR和基因ykgh，利用引物做同源臂，质粒pEcCpf1和质粒pEcCpf1H分别做单基因的敲除(见图7)。

从图7中可看出，当利用单链引物作为同源臂进行基因敲除时，表达质粒pEcCpf1H具有更高的编辑效率并且能够获得更多的转化子。

实施例11 pEcCpf1H/pcrEG系统介导的大肠杆菌中不同长度DNA片段的敲除效率

在大肠杆菌基因组上的yjiR基因上设计一个crRNA，通过设计不同的90-nt的单链引物，实现不同长度的DNA片段的敲除，结果如图9所示。

从图9中可以看出，该系统可以以超过40％的效率，利用引物作为同源臂，在大肠杆菌上敲除10kb长度的DNA片段。

实施例12 pEcCpf1H/pcrEG系统介导的大肠杆菌中的单碱基突变，短序列插入的效率

选取大肠杆菌上的xylR，ykgh，mlc，hisG基因为突变位点，利用该系统对上述基因上的一个碱基进行突变；选取大肠杆菌基因组上的flDh基因的启动子区为位点，利用该系统在此区域插入一段25bp的序列。结果如图10所示。

该系统可以以接近100％的效率在大肠杆菌基因组上实现单碱基突变，可以以70％左右的编辑效率在大肠杆菌基因组上插入一段25bp的序列。

实施例13 pEcCpf1H/pcrEG系统介导的大肠杆菌中的多基因编辑

选取大肠杆菌基因组上的xylR，ykgh基因以及hisG，mlc基因为靶点，利用该系统同时对xylR，ykgh基因进行敲除以及碱基修饰，同时利用该系统对hisG，mlc基因进行敲除以及碱基修饰。

结果如图11所示，该系统可以以60％的效率同时对大肠杆菌基因组上两个基因进行碱基修饰，但是同时敲除两个基因的效率比较低，只有10％左右。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14479

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

catgggtatg gacagttttc cctttgatat gtaacggtga acagttgttc tacttttgtt 60

tgttagtctt gatgcttcac tgatagatac aagagccata agaacctcag atccttccgt 120

atttagccag tatgttctct agtgtggttc gttgtttttg cgtgagccat gagaacgaac 180

cattgagatc atgcttactt tgcatgtcac tcaaaaattt tgcctcaaaa ctggtgagct 240

gaatttttgc agttaaagca tcgtgtagtg tttttcttag tccgttacgt aggtaggaat 300

ctgatgtaat ggttgttggt attttgtcac cattcatttt tatctggttg ttctcaagtt 360

cggttacgag atccatttgt ctatctagtt caacttggaa aatcaacgta tcagtcgggc 420

ggcctcgctt atcaaccacc aatttcatat tgctgtaagt gtttaaatct ttacttattg 480

gtttcaaaac ccattggtta agccttttaa actcatggta gttattttca agcattaaca 540

tgaacttaaa ttcatcaagg ctaatctcta tatttgcctt gtgagttttc ttttgtgtta 600

gttcttttaa taaccactca taaatcctca tagagtattt gttttcaaaa gacttaacat 660

gttccagatt atattttatg aattttttta actggaaaag ataaggcaat atctcttcac 720

taaaaactaa ttctaatttt tcgcttgaga acttggcata gtttgtccac tggaaaatct 780

caaagccttt aaccaaagga ttcctgattt ccacagttct cgtcatcagc tctctggttg 840

ctttagctaa tacaccataa gcattttccc tactgatgtt catcatctga gcgtattggt 900

tataagtgaa cgataccgtc cgttctttcc ttgtagggtt ttcaatcgtg gggttgagta 960

gtgccacaca gcataaaatt agcttggttt catgctccgt taagtcatag cgactaatcg 1020

ctagttcatt tgctttgaaa acaactaatt cagacataca tctcaattgg tctaggtgat 1080

tttaatcact ataccaattg agatgggcta gtcaatgata attactagtc cttttccttt 1140

gagttgtggg tatctgtaaa ttctgctaga cctttgctgg aaaacttgta aattctgcta 1200

gaccctctgt aaattccgct agacctttgt gtgttttttt tgtttatatt caagtggtta 1260

taatttatag aataaagaaa gaataaaaaa agataaaaag aatagatccc agccctgtgt 1320

ataactcact actttagtca gttccgcagt attacaaaag gatgtcgcaa acgctgtttg 1380

ctcctctaca aaacagacct taaaacccta aaggcttaag tagcaccctc gcaagctcgg 1440

ttgcggccgc aatcgggcaa atcgctgaat attccttttg tctccgacca tcaggcacct 1500

gagtcgctgt ctttttcgtg acattcagtt cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg 1560

gggtaaatgg cactacaggc gccttttatg gattcatgca aggaaactac ccataataca 1620

agaaaagccc gtcacgggct tctcagggcg ttttatggcg ggtctgctat gtggtgctat 1680

ctgacttttt gctgttcagc agttcctgcc ctctgatttt ccagtctgac cacttcggat 1740

tatcccgtga caggtcattc agactggcta atgcacccag taaggcagcg gtatcatcaa 1800

cccactgcag caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1860

actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1920

atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1980

cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 2040

tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 2100

gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 2160

catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 2220

tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 2280

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 2340

cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 2400

tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 2460

tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 2520

atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 2580

aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 2640

ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 2700

atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc 2760

tgcagctgaa caatacttaa tactatagaa tgataacaaa ataaactact ttttaaaaga 2820

attttgtgtt ataatctatt tattattaag tattgggtaa tattttttga agagatattt 2880

tgaaaaagaa aaattaaagc atattaaact aatttcggag gtcattaaaa ctattattga 2940

aatcatcaaa ctcattatgg atttaattta aactttttat tttaggaggc aaaaatgtca 3000

atttatcaag aatttgttaa taaatatagt ttaagtaaaa ctctaagatt tgagttaatc 3060

ccacagggta aaacacttga aaacataaaa gcaagaggtt tgattttaga tgatgagaaa 3120

agagctaaag actacaaaaa ggctaaacaa ataattgata aatatcatca gttttttata 3180

gaggagatat taagttcggt ttgtattagc gaagatttat tacaaaacta ttctgatgtt 3240

tattttaaac ttaaaaagag tgatgatgat aatctacaaa aagattttaa aagtgcaaaa 3300

gatacgataa agaaacaaat atctgaatat ataaaggact cagagaaatt taagaatttg 3360

tttaatcaaa accttatcga tgctaaaaaa gggcaagagt cagatttaat tctatggcta 3420

aagcaatcta aggataatgg tatagaacta tttaaagcca atagtgatat cacagatata 3480

gatgaggcgt tagaaataat caaatctttt aaaggttgga caacttattt taagggtttt 3540

catgaaaata gaaaaaatgt ttatagtagc aatgatattc ctacatctat tatttatagg 3600

atagtagatg ataatttgcc taaatttcta gaaaataaag ctaagtatga gagtttaaaa 3660

gacaaagctc cagaagctat aaactatgaa caaattaaaa aagatttggc agaagagcta 3720

acctttgata ttgactacaa aacatctgaa gttaatcaaa gagttttttc acttgatgaa 3780

gtttttgaga tagcaaactt taataattat ctaaatcaaa gtggtattac taaatttaat 3840

actattattg gtggtaaatt tgtaaatggt gaaaatacaa agagaaaagg tataaatgaa 3900

tatataaatc tatactcaca gcaaataaat gataaaacac tcaaaaaata taaaatgagt 3960

gttttattta agcaaatttt aagtgataca gaatctaaat cttttgtaat tgataagtta 4020

gaagatgata gtgatgtagt tacaacgatg caaagttttt atgagcaaat agcagctttt 4080

aaaacagtag aagaaaaatc tattaaagaa acactatctt tattatttga tgatttaaaa 4140

gctcaaaaac ttgatttgag taaaatttat tttaaaaatg ataaatctct tactgatcta 4200

tcacaacaag tttttgatga ttatagtgtt attggtacag cggtactaga atatataact 4260

caacaaatag cacctaaaaa tcttgataac cctagtaaga aagagcaaga attaatagcc 4320

aaaaaaactg aaaaagcaaa atacttatct ctagaaacta taaagcttgc cttagaagaa 4380

tttaataagc atagagatat agataaacag tgtaggtttg aagaaatact tgcaaacttt 4440

gcggctattc cgatgatatt tgatgaaata gctcaaaaca aagacaattt ggcacagata 4500

tctatcaaat atcaaaatca aggtaaaaaa gacctacttc aagctagtgc ggaagatgat 4560

gttaaagcta tcaaggatct tttagatcaa actaataatc tcttacataa actaaaaata 4620

tttcatatta gtcagtcaga agataaggca aatattttag acaaggatga gcatttttat 4680

ctagtatttg aggagtgcta ctttgagcta gcgaatatag tgcctcttta taacaaaatt 4740

agaaactata taactcaaaa gccatatagt gatgagaaat ttaagctcaa ttttgagaac 4800

tcgactttgg ctaatggttg ggataaaaat aaagagcctg acaatacggc aattttattt 4860

atcaaagatg ataaatatta tctgggtgtg atgaataaga aaaataacaa aatatttgat 4920

gataaagcta tcaaagaaaa taaaggcgag ggttataaaa aaattgttta taaactttta 4980

cctggcgcaa ataaaatgtt acctaaggtt ttcttttctg ctaaatctat aaaattttat 5040

aatcctagtg aagatatact tagaataaga aatcattcca cacatacaaa aaatggtagt 5100

cctcaaaaag gatatgaaaa atttgagttt aatattgaag attgccgaaa atttatagat 5160

ttttataaac agtctataag taagcatccg gagtggaaag attttggatt tagattttct 5220

gatactcaaa gatataattc tatagatgaa ttttatagag aagttgaaaa tcaaggctac 5280

aaactaactt ttgaaaatat atcagagagc tatattgata gcgtagttaa tcagggtaaa 5340

ttgtacctat tccaaatcta taataaagat ttttcagctt atagcaaagg gcgaccaaat 5400

ctacatactt tatattggaa agcgctgttt gatgagagaa atcttcaaga tgtggtttat 5460

aagctaaatg gtgaggcaga gcttttttat cgtaaacaat caatacctaa aaaaatcact 5520

cacccagcta aagaggcaat agctaataaa aacaaagata atcctaaaaa agagagtgtt 5580

tttgaatatg atttaatcaa agataaacgc tttactgaag ataagttttt ctttcactgt 5640

cctattacaa tcaattttaa atctagtgga gctaataagt ttaatgatga aatcaattta 5700

ttgctaaaag aaaaagcaaa tgatgttcat atattaagta tagatagagg tgaaagacat 5760

ttagcttact atactttggt agatggtaaa ggcaatatca tcaaacaaga tactttcaac 5820

atcattggta atgatagaat gaaaacaaac taccatgata agcttgctgc aatagagaaa 5880

gatagggatt cagctaggaa agactggaaa aagataaata acatcaaaga gatgaaagag 5940

ggctatctat ctcaggtagt tcatgaaata gctaagctag ttatagagta taatgctatt 6000

gtggtttttg aggatttaaa ttttggattt aaaagagggc gtttcaaggt agagaagcag 6060

gtctatcaaa agttagaaaa aatgctaatt gagaaactaa actatctagt tttcaaagat 6120

aatgagtttg ataaaactgg gggagtgctt agagcttatc agctaacagc accttttgag 6180

acttttaaaa agatgggtaa acaaacaggt attatctact atgtaccagc tggttttact 6240

tcaaaaattt gtcctgtaac tggttttgta aatcagttat atcctaagta tgaaagtgtc 6300

agcaaatctc aagagttctt tagtaagttt gacaagattt gttataacct tgataagggc 6360

tattttgagt ttagttttga ttataaaaac tttggtgaca aggctgccaa aggcaagtgg 6420

actatagcta gctttgggag tagattgatt aactttagaa attcagataa aaatcataat 6480

tgggatactc gagaagttta tccaactaaa gagttggaga aattgctaaa agattattct 6540

atcgaatatg ggcatggcga atgtatcaaa gcagctattt gcggtgagag cgacaaaaag 6600

ttttttgcta agctaactag tgtcctaaat actatcttac aaatgcgtaa ctcaaaaaca 6660

ggtactgagt tagattatct aatttcacca gtagcagatg taaatggcaa tttctttgat 6720

tcgcgacagg cgccaaaaaa tatgcctcaa gatgctgatg ccaatggtgc ttatcatatt 6780

gggctaaaag gtctgatgct actaggtagg atcaaaaata atcaagaggg caaaaaactc 6840

aatttggtta tcaaaaatga agagtatttt gagttcgtgc agaataggaa taactaaagt 6900

atattttaga tgaagattat ttcttaatct agacatgagc ggatacatat ttgaatgtat 6960

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgcatc 7020

gatttattat gacaacttga cggctacatc attcactttt tcttcacaac cggcacggaa 7080

ctcgctcggg ctggccccgg tgcatttttt aaatacccgc gagaagtaga gttgatcgtc 7140

aaaaccaaca ttgcgaccga cggtggcgat aggcatccgg gtggtgctca aaagcagctt 7200

cgcctggctg atacgttggt cctcgcgcca gcttaagacg ctaatcccta actgctggcg 7260

gaaaagatgt gacagacgcg acggcgacaa gcaaacatgc tgtgcgacgc tggcgatatc 7320

aaaattgctg tctgccaggt gatcgctgat gtactgacaa gcctcgcgta cccgattatc 7380

catcggtgga tggagcgact cgttaatcgc ttccatgcgc cgcagtaaca attgctcaag 7440

cagatttatc gccagcagct ccgaatagcg cccttcccct tgcccggcgt taatgatttg 7500

cccaaacagg tcgctgaaat gcggctggtg cgcttcatcc gggcgaaaga accccgtatt 7560

ggcaaatatt gacggccagt taagccattc atgccagtag gcgcgcggac gaaagtaaac 7620

ccactggtga taccattcgc gagcctccgg atgacgaccg tagtgatgaa tctctcctgg 7680

cgggaacagc aaaatatcac ccggtcggca aacaaattct cgtccctgat ttttcaccac 7740

cccctgaccg cgaatggtga gattgagaat ataacctttc attcccagcg gtcggtcgat 7800

aaaaaaatcg agataaccgt tggcctcaat cggcgttaaa cccgccacca gatgggcatt 7860

aaacgagtat cccggcagca ggggatcatt ttgcgcttca gccatacttt tcatactccc 7920

gccattcaga gaagaaacca attgtccata ttgcatcaga cattgccgtc actgcgtctt 7980

ttactggctc ttctcgctaa ccaaaccggt aaccccgctt attaaaagca ttctgtaaca 8040

aagcgggacc aaagccatga caaaaacgcg taacaaaagt gtctataatc acggcagaaa 8100

agtccacatt gattatttgc acggcgtcac actttgctat gccatagcat ttttatccat 8160

aagattagcg gatcctacct gacgcttttt atcgcaactc tctactgttt ctccataccc 8220

gtttttttgg gaattcgagc tctaaggagg ttataaaaaa tggatattaa tactgaaact 8280

gagatcaagc aaaagcattc actaaccccc tttcctgttt tcctaatcag cccggcattt 8340

cgcgggcgat attttcacag ctatttcagg agttcagcca tgaacgctta ttacattcag 8400

gatcgtcttg aggctcagag ctgggcgcgt cactaccagc agctcgcccg tgaagagaaa 8460

gaggcagaac tggcagacga catggaaaaa ggcctgcccc agcacctgtt tgaatcgcta 8520

tgcatcgatc atttgcaacg ccacggggcc agcaaaaaat ccattacccg tgcgtttgat 8580

gacgatgttg agtttcagga gcgcatggca gaacacatcc ggtacatggt tgaaaccatt 8640

gctcaccacc aggttgatat tgattcagag gtataaaacg aatgagtact gcactcgcaa 8700

cgctggctgg gaagctggct gaacgtgtcg gcatggattc tgtcgaccca caggaactga 8760

tcaccactct tcgccagacg gcatttaaag gtgatgccag cgatgcgcag ttcatcgcat 8820

tactgatcgt tgccaaccag tacggcctta atccgtggac gaaagaaatt tacgcctttc 8880

ctgataagca gaatggcatc gttccggtgg tgggcgttga tggctggtcc cgcatcatca 8940

atgaaaacca gcagtttgat ggcatggact ttgagcagga caatgaatcc tgtacatgcc 9000

ggatttaccg caaggaccgt aatcatccga tctgcgttac cgaatggatg gatgaatgcc 9060

gccgcgaacc attcaaaact cgcgaaggca gagaaatcac ggggccgtgg cagtcgcatc 9120

ccaaacggat gttacgtcat aaagccatga ttcagtgtgc ccgtctggcc ttcggatttg 9180

ctggtatcta tgacaaggat gaagccgagc gcattgtcga aaatactgca tacactgcag 9240

aacgtcagcc ggaacgcgac atcactccgg ttaacgatga aaccatgcag gagattaaca 9300

ctctgctgat cgccctggat aaaacatggg atgacgactt attgccgctc tgttcccaga 9360

tatttcgccg cgacattcgt gcatcgtcag aactgacaca ggccgaagca gtaaaagctc 9420

ttggattcct gaaacagaaa gccgcagagc agaaggtggc agcatgacac cggacattat 9480

cctgcagcgt accgggatcg atgtgagagc tgtcgaacag ggggatgatg cgtggcacaa 9540

attacggctc ggcgtcatca ccgcttcaga agttcacaac gtgatagcaa aaccccgctc 9600

cggaaagaag tggcctgaca tgaaaatgtc ctacttccac accctgcttg ctgaggtttg 9660

caccggtgtg gctccggaag ttaacgctaa agcactggcc tggggaaaac agtacgagaa 9720

cgacgccaga accctgtttg aattcacttc cggcgtgaat gttactgaat ccccgatcat 9780

ctatcgcgac gaaagtatgc gtaccgcctg ctctcccgat ggtttatgca gtgacggcaa 9840

cggccttgaa ctgaaatgcc cgtttacctc ccgggatttc atgaagttcc ggctcggtgg 9900

tttcgaggcc ataaagtcag cttacatggc ccaggtgcag tacagcatgt gggtgacgcg 9960

aaaaaatgcc tggtactttg ccaactatga cccgcgtatg aagcgtgaag gcctgcatta 10020

tgtcgtgatt gagcgggatg aaaagtacat ggcgagtttt gacgagatcg tgccggagtt 10080

catcgaaaaa atggacgagg cactggctga aattggtttt gtatttgggg agcaatggcg 10140

atgacgcatc ctcacgataa tatccgggta ggcgcaatca ctttcgtcta ctccgttaca 10200

aagcgaggct gggtatttcc cggcctttct gttatccgaa atccactgaa agcacagcgg 10260

ctggctgagg agataaataa taaacgaggg gctgtatgca caaagcatct tctgttgagt 10320

taagaacgag tatcgagatg gcacatagcc ttgctcaaat tggaatcagg tttgtgccaa 10380

taccagtaga aacagacgaa gaatccatgg gtatggacag atcctcttta ggcccgtagt 10440

ctgcaaatcc ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc 10500

aaacgagagt ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa 10560

gcaggcaaga cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat 10620

attttaggtc tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga 10680

agaagcagac cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag 10740

tttgcaaaac aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact 10800

caagcgtttg cgaaagaaac gaaccaaaag ccatataagg aaacatacgg catttcccat 10860

attacacgcc atgatatgct gcaaatccct gaacagcaaa aaaatgaaaa atatcaagtt 10920

cctgaattcg attcgtccac aattaaaaat atctcttctg caaaaggcct ggacgtttgg 10980

gacagctggc cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg ctaccacatc 11040

gtctttgcat tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta catgttctat 11100

caaaaagtcg gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt ctttaaagac 11160

agcgacaaat tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga atggtcaggt 11220

tcagccacat ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt ctccggtaaa 11280

cattacggca aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc agacagctct 11340

ttgaacatca acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg aaaaacgtat 11400

caaaatgtac agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa ccatacgctg 11460

agagatcctc actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga agcaaacact 11520

ggaactgaag atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata ctatggcaaa 11580

agcacatcat tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa aaaacgcacg 11640

gctgagttag caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta cacactgaaa 11700

aaagtgatga aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga acgcgcgaac 11760

gtctttaaaa tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc aaaaatgacg 11820

attgacggca ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa ttctttaact 11880

ggcccataca agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct tgatcctaac 11940

gatgtaacct ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa caatgtcgtg 12000

attacaagct atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac gtttgcgcca 12060

agcttcctgc tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag catccttgaa 12120

caaggacaat taacagttaa caaataaaaa cgcaaaagaa aatgccgata tcctattggc 12180

attttctttt atttcttatc aacataaagg tgaatcccat atgaactata taaaagcagg 12240

caaatggcta accgtattcc tcaaaaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga 12300

taacggacta gccttatttt aacttgctat ttctagctct aaaacggttg gactcaagac 12360

gatagtatct acaacagtag aaatttggct tcagcagagc gcagatacat ctacaacagt 12420

agaaattatt taaagttctt agactacgac cagtctaaaa agcgcctgaa ttcgcgacct 12480

tctcgttact gacaggaaaa tgggccattg gcaaccaggg aaagatgaac gtgatgatgt 12540

tcacaatttg ctgaattgtg gtgatgtgat gctcaccgca tttcctgaaa attcacgctg 12600

tatcttgaaa aatcgacgtt ttttacgtgg ttttccgtcg aaaatttaag gtaagaacct 12660

gacctcgtga ttactatttc gccgtgttga cgacatcagg aggccagtat gaccgtatta 12720

catagtgtgg atttttttcc gtctggtaac gcgtccgtgg cgatagaacc ccggctcccg 12780

caggcggatt ttcctgaaca tcatcatgat tttcatgaaa ttgtgattgt cgaacatggc 12840

acgggtattc atgtgtttaa tgggcagccc tataccatca ccggtggcac ggtctgtttc 12900

gtacgcgatc atgatcggca tctgtatgaa cataccgata atctgtgtct gaccaatgtg 12960

ctgtatcgct cgccggatcg atttcagttt ctcgccgggc tgaatcagtt gctgccacaa 13020

gagctggatg ggcagtatcc gtctcactgg cgcgttaacc acagcgtatt gcagcaggtg 13080

cgacagctgg ttgcacagat ggaacagcag gaaggggaaa atgatttacc ctcgaccgcc 13140

agtcgcgaga tcttgtttat gcaattactg ctcttgctgc gtaaaagcag tttgcaggag 13200

aacctggaaa acagcgcatc acgtctcaac ttgcttctgg cctggctgga ggaccatttt 13260

gccgatgagg tgaattggga tgccgtggcg gatcaatttt ctctttcact gcgtacgcta 13320

catcggcagc ttaagcagca aacgggactg acgcctcagc gatacctgaa ccgcctgcga 13380

ctgatgaaag cccgacatct gctacgccac agcgaggcca gcgttactga catcgcctat 13440

cgctgtggat tcagcgacag taaccacttt tcgacgcttt ttcgccgaga gtttaactgg 13500

tcaccgcgtg atattcgcca gggacgggat ggctttctgc aataacgcga atcttctcaa 13560

cgtatttgta cgccatattg cgaataatca acttcgttct ctggccgagg tagccacggt 13620

ggcgcatcag ttaaaacttc tcaaagatga tttttttgcc agcgaccagc aggcagtcgc 13680

tgtggctgac cgttatccgc aagatgtctt tgctgaacat acacatgatt tttgtgagct 13740

ggtgattgtc tggcgcggta atggcctgca tgtactcaac gatcgccctt atcgcattac 13800

ccgtggcgat ctcttttaca ttcatgctga cgataaacac tcctacgctt ccgttaacga 13860

tctggttttg cagaatatta tttattgccc ggagcgtctg aagctgaatc ttgactggca 13920

gggggcgatt ccgggattta acgccagcgc agggcaacca cactggcgct taggtagcat 13980

ggggatggcg caggcgcggc aggttatcgg tcagcttgag catgaaagta gtcagcatgt 14040

gccgtttgct aacgaaatgg ctgagttgct gttcgggcag ttggtgatgt tgctgaatcg 14100

ccatcgttac accagtgatt cgttgccgcc aacatccagc gaaacgttgc tggataagct 14160

gattacccgg ctggcggcta gcctgaaaag tccctttgcg ctggataaat tttgtgatga 14220

ggcatcgtgc agtgagcgcg ttttgcgtca gcaatttcgc cagcagactg gaatgaccat 14280

caatcaatat ctgcgacagg tcagagtgtg tcatgcgcaa tatcttctcc agcatagccg 14340

cctgttaatc agtgatattt cgaccgaatg tggctttgaa gatagtaact atttttcggt 14400

ggtgtttacc cgggaaaccg ggatgacgcc cagccagtgg cgtcatctca attcgcagaa 14460

agattaattc gccatgccc 14479

<210> 2

<211> 14510

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

catgggtatg gacagttttc cctttgatat gtaacggtga acagttgttc tacttttgtt 60

tgttagtctt gatgcttcac tgatagatac aagagccata agaacctcag atccttccgt 120

atttagccag tatgttctct agtgtggttc gttgtttttg cgtgagccat gagaacgaac 180

cattgagatc atgcttactt tgcatgtcac tcaaaaattt tgcctcaaaa ctggtgagct 240

gaatttttgc agttaaagca tcgtgtagtg tttttcttag tccgttacgt aggtaggaat 300

ctgatgtaat ggttgttggt attttgtcac cattcatttt tatctggttg ttctcaagtt 360

cggttacgag atccatttgt ctatctagtt caacttggaa aatcaacgta tcagtcgggc 420

ggcctcgctt atcaaccacc aatttcatat tgctgtaagt gtttaaatct ttacttattg 480

gtttcaaaac ccattggtta agccttttaa actcatggta gttattttca agcattaaca 540

tgaacttaaa ttcatcaagg ctaatctcta tatttgcctt gtgagttttc ttttgtgtta 600

gttcttttaa taaccactca taaatcctca tagagtattt gttttcaaaa gacttaacat 660

gttccagatt atattttatg aattttttta actggaaaag ataaggcaat atctcttcac 720

taaaaactaa ttctaatttt tcgcttgaga acttggcata gtttgtccac tggaaaatct 780

caaagccttt aaccaaagga ttcctgattt ccacagttct cgtcatcagc tctctggttg 840

ctttagctaa tacaccataa gcattttccc tactgatgtt catcatctga gcgtattggt 900

tataagtgaa cgataccgtc cgttctttcc ttgtagggtt ttcaatcgtg gggttgagta 960

gtgccacaca gcataaaatt agcttggttt catgctccgt taagtcatag cgactaatcg 1020

ctagttcatt tgctttgaaa acaactaatt cagacataca tctcaattgg tctaggtgat 1080

tttaatcact ataccaattg agatgggcta gtcaatgata attactagtc cttttccttt 1140

gagttgtggg tatctgtaaa ttctgctaga cctttgctgg aaaacttgta aattctgcta 1200

gaccctctgt aaattccgct agacctttgt gtgttttttt tgtttatatt caagtggtta 1260

taatttatag aataaagaaa gaataaaaaa agataaaaag aatagatccc agccctgtgt 1320

ataactcact actttagtca gttccgcagt attacaaaag gatgtcgcaa acgctgtttg 1380

ctcctctaca aaacagacct taaaacccta aaggcttaag tagcaccctc gcaagctcgg 1440

ttgcggccgc aatcgggcaa atcgctgaat attccttttg tctccgacca tcaggcacct 1500

gagtcgctgt ctttttcgtg acattcagtt cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg 1560

gggtaaatgg cactacaggc gccttttatg gattcatgca aggaaactac ccataataca 1620

agaaaagccc gtcacgggct tctcagggcg ttttatggcg ggtctgctat gtggtgctat 1680

ctgacttttt gctgttcagc agttcctgcc ctctgatttt ccagtctgac cacttcggat 1740

tatcccgtga caggtcattc agactggcta atgcacccag taaggcagcg gtatcatcaa 1800

cccactgcag caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 1860

actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 1920

atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 1980

cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 2040

tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat 2100

gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 2160

catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 2220

tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 2280

catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 2340

cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 2400

tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 2460

tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 2520

atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 2580

aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat 2640

ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg 2700

atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacaacg tggctttccc 2760

tgcagctgaa caatacttaa tactatagaa tgataacaaa ataaactact ttttaaaaga 2820

attttgtgtt ataatctatt tattattaag tattgggtaa tattttttga agagatattt 2880

tgaaaaagaa aaattaaagc atattaaact aatttcggag gtcattaaaa ctattattga 2940

aatcatcaaa ctcattatgg atttaattta aactttttat tttaggaggc aaaaatgtca 3000

atttatcaag aatttgttaa taaatatagt ttaagtaaaa ctctaagatt tgagttaatc 3060

ccacagggta aaacacttga aaacataaaa gcaagaggtt tgattttaga tgatgagaaa 3120

agagctaaag actacaaaaa ggctaaacaa ataattgata aatatcatca gttttttata 3180

gaggagatat taagttcggt ttgtattagc gaagatttat tacaaaacta ttctgatgtt 3240

tattttaaac ttaaaaagag tgatgatgat aatctacaaa aagattttaa aagtgcaaaa 3300

gatacgataa agaaacaaat atctgaatat ataaaggact cagagaaatt taagaatttg 3360

tttaatcaaa accttatcga tgctaaaaaa gggcaagagt cagatttaat tctatggcta 3420

aagcaatcta aggataatgg tatagaacta tttaaagcca atagtgatat cacagatata 3480

gatgaggcgt tagaaataat caaatctttt aaaggttgga caacttattt taagggtttt 3540

catgaaaata gaaaaaatgt ttatagtagc aatgatattc ctacatctat tatttatagg 3600

atagtagatg ataatttgcc taaatttcta gaaaataaag ctaagtatga gagtttaaaa 3660

gacaaagctc cagaagctat aaactatgaa caaattaaaa aagatttggc agaagagcta 3720

acctttgata ttgactacaa aacatctgaa gttaatcaaa gagttttttc acttgatgaa 3780

gtttttgaga tagcaaactt taataattat ctaaatcaaa gtggtattac taaatttaat 3840

actattattg gtggtaaatt tgtaaatggt gaaaatacaa agagaaaagg tataaatgaa 3900

tatataaatc tatactcaca gcaaataaat gataaaacac tcaaaaaata taaaatgagt 3960

gttttattta agcaaatttt aagtgataca gaatctaaat cttttgtaat tgataagtta 4020

gaagatgata gtgatgtagt tacaacgatg caaagttttt atgagcaaat agcagctttt 4080

aaaacagtag aagaaaaatc tattaaagaa acactatctt tattatttga tgatttaaaa 4140

gctcaaaaac ttgatttgag taaaatttat tttaaaaatg ataaatctct tactgatcta 4200

tcacaacaag tttttgatga ttatagtgtt attggtacag cggtactaga atatataact 4260

caacaaatag cacctaaaaa tcttgataac cctagtaaga aagagcaaga attaatagcc 4320

aaaaaaactg aaaaagcaaa atacttatct ctagaaacta taaagcttgc cttagaagaa 4380

tttaataagc atagagatat agataaacag tgtaggtttg aagaaatact tgcaaacttt 4440

gcggctattc cgatgatatt tgatgaaata gctcaaaaca aagacaattt ggcacagata 4500

tctatcaaat atcaaaatca aggtaaaaaa gacctacttc aagctagtgc ggaagatgat 4560

gttaaagcta tcaaggatct tttagatcaa actaataatc tcttacataa actaaaaata 4620

tttcatatta gtcagtcaga agataaggca aatattttag acaaggatga gcatttttat 4680

ctagtatttg aggagtgcta ctttgagcta gcgaatatag tgcctcttta taacaaaatt 4740

agaaactata taactcaaaa gccatatagt gatgagaaat ttaagctcaa ttttgagaac 4800

tcgactttgg ctaatggttg ggataaaaat aaagagcctg acaatacggc aattttattt 4860

atcaaagatg ataaatatta tctgggtgtg atgaataaga aaaataacaa aatatttgat 4920

gataaagcta tcaaagaaaa taaaggcgag ggttataaaa aaattgttta taaactttta 4980

cctggcgcaa ataaaatgtt acctaaggtt ttcttttctg ctaaatctat aaaattttat 5040

aatcctagtg aagatatact tagaataaga aatcattcca cacatacaaa aaatggtagt 5100

cctcaaaaag gatatgaaaa atttgagttt aatattgaag attgccgaaa atttatagat 5160

ttttataaac agtctataag taagcatccg gagtggaaag attttggatt tagattttct 5220

gatactcaaa gatataattc tatagatgaa ttttatagag aagttgaaaa tcaaggctac 5280

aaactaactt ttgaaaatat atcagagagc tatattgata gcgtagttaa tcagggtaaa 5340

ttgtacctat tccaaatcta taataaagat ttttcagctt atagcaaagg gcgaccaaat 5400

ctacatactt tatattggaa agcgctgttt gatgagagaa atcttcaaga tgtggtttat 5460

aagctaaatg gtgaggcaga gcttttttat cgtaaacaat caatacctaa aaaaatcact 5520

cacccagcta aagaggcaat agctaataaa aacaaagata atcctaaaaa agagagtgtt 5580

tttgaatatg atttaatcaa agataaacgc tttactgaag ataagttttt ctttcactgt 5640

cctattacaa tcaattttaa atctagtgga gctaataagt ttaatgatga aatcaattta 5700

ttgctaaaag aaaaagcaaa tgatgttcat atattaagta tagatagagg tgaaagacat 5760

ttagcttact atactttggt agatggtaaa ggcaatatca tcaaacaaga tactttcaac 5820

atcattggta atgatagaat gaaaacaaac taccatgata agcttgctgc aatagagaaa 5880

gatagggatt cagctaggaa agactggaaa aagataaata acatcaaaga gatgaaagag 5940

ggctatctat ctcaggtagt tcatgaaata gctaagctag ttatagagta taatgctatt 6000

gtggtttttg aggatttaaa ttttggattt aaaagagggc gtttcaaggt agagaagcag 6060

gtctatcaaa agttagaaaa aatgctaatt gagaaactaa actatctagt tttcaaagat 6120

aatgagtttg ataaaactgg gggagtgctt agagcttatc agctaacagc accttttgag 6180

acttttaaaa agatgggtaa acaaacaggt attatctact atgtaccagc tggttttact 6240

tcaaaaattt gtcctgtaac tggttttgta aatcagttat atcctaagta tgaaagtgtc 6300

agcaaatctc aagagttctt tagtaagttt gacaagattt gttataacct tgataagggc 6360

tattttgagt ttagttttga ttataaaaac tttggtgaca aggctgccaa aggcaagtgg 6420

actatagcta gctttgggag tagattgatt aactttagaa attcagataa aaatcataat 6480

tgggatactc gagaagttta tccaactaaa gagttggaga aattgctaaa agattattct 6540

atcgaatatg ggcatggcga atgtatcaaa gcagctattt gcggtgagag cgacaaaaag 6600

ttttttgcta agctaactag tgtcctaaat actatcttac aaatgcgtaa ctcaaaaaca 6660

ggtactgagt tagattatct aatttcacca gtagcagatg taaatggcaa tttctttgat 6720

tcgcgacagg cgccaaaaaa tatgcctcaa gatgctgatg ccaatggtgc ttatcatatt 6780

gggctaaaag gtctgatgct actaggtagg atcaaaaata atcaagaggg caaaaaactc 6840

aatttggtta tcaaaaatga agagtatttt gagttcgtgc agaataggaa taactaaagt 6900

atattttaga tgaagattat ttcttaatct agacatgagc ggatacatat ttgaatgtat 6960

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgcatc 7020

gatttattat gacaacttga cggctacatc attcactttt tcttcacaac cggcacggaa 7080

ctcgctcggg ctggccccgg tgcatttttt aaatacccgc gagaagtaga gttgatcgtc 7140

aaaaccaaca ttgcgaccga cggtggcgat aggcatccgg gtggtgctca aaagcagctt 7200

cgcctggctg atacgttggt cctcgcgcca gcttaagacg ctaatcccta actgctggcg 7260

gaaaagatgt gacagacgcg acggcgacaa gcaaacatgc tgtgcgacgc tggcgatatc 7320

aaaattgctg tctgccaggt gatcgctgat gtactgacaa gcctcgcgta cccgattatc 7380

catcggtgga tggagcgact cgttaatcgc ttccatgcgc cgcagtaaca attgctcaag 7440

cagatttatc gccagcagct ccgaatagcg cccttcccct tgcccggcgt taatgatttg 7500

cccaaacagg tcgctgaaat gcggctggtg cgcttcatcc gggcgaaaga accccgtatt 7560

ggcaaatatt gacggccagt taagccattc atgccagtag gcgcgcggac gaaagtaaac 7620

ccactggtga taccattcgc gagcctccgg atgacgaccg tagtgatgaa tctctcctgg 7680

cgggaacagc aaaatatcac ccggtcggca aacaaattct cgtccctgat ttttcaccac 7740

cccctgaccg cgaatggtga gattgagaat ataacctttc attcccagcg gtcggtcgat 7800

aaaaaaatcg agataaccgt tggcctcaat cggcgttaaa cccgccacca gatgggcatt 7860

aaacgagtat cccggcagca ggggatcatt ttgcgcttca gccatacttt tcatactccc 7920

gccattcaga gaagaaacca attgtccata ttgcatcaga cattgccgtc actgcgtctt 7980

ttactggctc ttctcgctaa ccaaaccggt aaccccgctt attaaaagca ttctgtaaca 8040

aagcgggacc aaagccatga caaaaacgcg taacaaaagt gtctataatc acggcagaaa 8100

agtccacatt gattatttgc acggcgtcac actttgctat gccatagcat ttttatccat 8160

aagattagcg gatcctacct gacgcttttt atcgcaactc tctactgttt ctccataccc 8220

gtttttttgg gaattcgagc tctaaggagg ttataaaaaa tggatattaa tactgaaact 8280

gagatcaagc aaaagcattc actaaccccc tttcctgttt tcctaatcag cccggcattt 8340

cgcgggcgat attttcacag ctatttcagg agttcagcca tgaacgctta ttacattcag 8400

gatcgtcttg aggctcagag ctgggcgcgt cactaccagc agctcgcccg tgaagagaaa 8460

gaggcagaac tggcagacga catggaaaaa ggcctgcccc agcacctgtt tgaatcgcta 8520

tgcatcgatc atttgcaacg ccacggggcc agcaaaaaat ccattacccg tgcgtttgat 8580

gacgatgttg agtttcagga gcgcatggca gaacacatcc ggtacatggt tgaaaccatt 8640

gctcaccacc aggttgatat tgattcagag gtataaaacg aatgaaccaa atcgtgaagt 8700

tcactgacga ctctggcctg gcggttcaag ttactccaga cgatgttcgc cgttatatct 8760

gtgagaacgc tactgaaaaa gaggtgggcc tctttctgca actctgtcag actcaacgtc 8820

tgaatccgtt tgtgaaagac gcttacctgg tgaaatacgg cggtgctcca gcttctatga 8880

ttacttccta tcaagttttt aaccgtcgcg cgtgtcgtga tgctaactat gatggtatca 8940

aatctggtgt ggttgttctg cgtgacggtg atgttgtgca taaacgtggt gctgcgtgct 9000

acaaaaaggc gggtgaggag ctcatcggtg gttgggcgga agttcgcttt aaggatggcc 9060

gcgagactgc gtatgctgag gtggcgctcg acgactattc caccggcaaa tctaattggg 9120

cgaaaatgcc gggtgttatg atcgaaaaat gcgcgaaggc tgctgcttgg cgcctcgcgt 9180

tcccggacac ttttcagggc atgtacgctg cggaggaaat ggatcaagcg caacagccag 9240

aacaggtgcg cgctcaggcg gagcaaccag tggatctcca gccaatccgc gaactcttca 9300

agccatattg cgaacacttc ggcatcactc cggctgaggg tatgactgct gtttgtggtg 9360

cggtgggcgc tgaaggcatg cactctatga ccgagcagca agctcgccgt gctcgcgctt 9420

ggatggagga agaaatggct gcgccagctg tggaagcgga gtatgaggtt gttgacgaag 9480

gcgaggtgtt ttaaatgaca ccggacatta tcctgcagcg taccgggatc gatgtgagag 9540

ctgtcgaaca gggggatgat gcgtggcaca aattacggct cggcgtcatc accgcttcag 9600

aagttcacaa cgtgatagca aaaccccgct ccggaaagaa gtggcctgac atgaaaatgt 9660

cctacttcca caccctgctt gctgaggttt gcaccggtgt ggctccggaa gttaacgcta 9720

aagcactggc ctggggaaaa cagtacgaga acgacgccag aaccctgttt gaattcactt 9780

ccggcgtgaa tgttactgaa tccccgatca tctatcgcga cgaaagtatg cgtaccgcct 9840

gctctcccga tggtttatgc agtgacggca acggccttga actgaaatgc ccgtttacct 9900

cccgggattt catgaagttc cggctcggtg gtttcgaggc cataaagtca gcttacatgg 9960

cccaggtgca gtacagcatg tgggtgacgc gaaaaaatgc ctggtacttt gccaactatg 10020

acccgcgtat gaagcgtgaa ggcctgcatt atgtcgtgat tgagcgggat gaaaagtaca 10080

tggcgagttt tgacgagatc gtgccggagt tcatcgaaaa aatggacgag gcactggctg 10140

aaattggttt tgtatttggg gagcaatggc gatgacgcat cctcacgata atatccgggt 10200

aggcgcaatc actttcgtct actccgttac aaagcgaggc tgggtatttc ccggcctttc 10260

tgttatccga aatccactga aagcacagcg gctggctgag gagataaata ataaacgagg 10320

ggctgtatgc acaaagcatc ttctgttgag ttaagaacga gtatcgagat ggcacatagc 10380

cttgctcaaa ttggaatcag gtttgtgcca ataccagtag aaacagacga agaatccatg 10440

ggtatggaca gatcctcttt aggcccgtag tctgcaaatc cttttatgat tttctatcaa 10500

acaaaagagg aaaatagacc agttgcaatc caaacgagag tctaatagaa tgaggtcgaa 10560

aagtaaatcg cgcgggtttg ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc 10620

aaagtgtata ctttggcgtc accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac 10680

taacttgcca tcttcaaaca ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa 10740

aaaggagaca tgaacgatga acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt 10800

tactaccgca ctgctggcag gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa 10860

gccatataag gaaacatacg gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc 10920

tgaacagcaa aaaaatgaaa aatatcaagt tcctgaattc gattcgtcca caattaaaaa 10980

tatctcttct gcaaaaggcc tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg 11040

cactgtcgca aactatcacg gctaccacat cgtctttgca ttagccggag atcctaaaaa 11100

tgcggatgac acatcgattt acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt ctattgacag 11160

ctggaaaaac gctggccgcg tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa atgattctat 11220

cctaaaagac caaacacaag aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg acggaaaaat 11280

ccgtttattc tacactgatt tctccggtaa acattacggc aaacaaacac tgacaactgc 11340

acaagttaac gtatcagcat cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag aggattataa 11400

atcaatcttt gacggtgacg gaaaaacgta tcaaaatgta cagcagttca tcgatgaagg 11460

caactacagc tcaggcgaca accatacgct gagagatcct cactacgtag aagataaagg 11520

ccacaaatac ttagtatttg aagcaaacac tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga 11580

atctttattt aacaaagcat actatggcaa aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca 11640

aaaacttctg caaagcgata aaaaacgcac ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat 11700

gattgagcta aacgatgatt acacactgaa aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa 11760

cacagtaaca gatgaaattg aacgcgcgaa cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct 11820

gttcactgac tcccgcggat caaaaatgac gattgacggc attacgtcta acgatattta 11880

catgcttggt tatgtttcta attctttaac tggcccatac aagccgctga acaaaactgg 11940

ccttgtgtta aaaatggatc ttgatcctaa cgatgtaacc tttacttact cacacttcgc 12000

tgtacctcaa gcgaaaggaa acaatgtcgt gattacaagc tatatgacaa acagaggatt 12060

ctacgcagac aaacaatcaa cgtttgcgcc aagcttcctg ctgaacatca aaggcaagaa 12120

aacatctgtt gtcaaagaca gcatccttga acaaggacaa ttaacagtta acaaataaaa 12180

acgcaaaaga aaatgccgat atcctattgg cattttcttt tatttcttat caacataaag 12240

gtgaatccca tatgaactat ataaaagcag gcaaatggct aaccgtattc ctcaaaaaaa 12300

gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact agccttattt taacttgcta 12360

tttctagctc taaaacggtt ggactcaaga cgatagtatc tacaacagta gaaatttggc 12420

ttcagcagag cgcagataca tctacaacag tagaaattat ttaaagttct tagactacga 12480

ccagtctaaa aagcgcctga attcgcgacc ttctcgttac tgacaggaaa atgggccatt 12540

ggcaaccagg gaaagatgaa cgtgatgatg ttcacaattt gctgaattgt ggtgatgtga 12600

tgctcaccgc atttcctgaa aattcacgct gtatcttgaa aaatcgacgt tttttacgtg 12660

gttttccgtc gaaaatttaa ggtaagaacc tgacctcgtg attactattt cgccgtgttg 12720

acgacatcag gaggccagta tgaccgtatt acatagtgtg gatttttttc cgtctggtaa 12780

cgcgtccgtg gcgatagaac cccggctccc gcaggcggat tttcctgaac atcatcatga 12840

ttttcatgaa attgtgattg tcgaacatgg cacgggtatt catgtgttta atgggcagcc 12900

ctataccatc accggtggca cggtctgttt cgtacgcgat catgatcggc atctgtatga 12960

acataccgat aatctgtgtc tgaccaatgt gctgtatcgc tcgccggatc gatttcagtt 13020

tctcgccggg ctgaatcagt tgctgccaca agagctggat gggcagtatc cgtctcactg 13080

gcgcgttaac cacagcgtat tgcagcaggt gcgacagctg gttgcacaga tggaacagca 13140

ggaaggggaa aatgatttac cctcgaccgc cagtcgcgag atcttgttta tgcaattact 13200

gctcttgctg cgtaaaagca gtttgcagga gaacctggaa aacagcgcat cacgtctcaa 13260

cttgcttctg gcctggctgg aggaccattt tgccgatgag gtgaattggg atgccgtggc 13320

ggatcaattt tctctttcac tgcgtacgct acatcggcag cttaagcagc aaacgggact 13380

gacgcctcag cgatacctga accgcctgcg actgatgaaa gcccgacatc tgctacgcca 13440

cagcgaggcc agcgttactg acatcgccta tcgctgtgga ttcagcgaca gtaaccactt 13500

ttcgacgctt tttcgccgag agtttaactg gtcaccgcgt gatattcgcc agggacggga 13560

tggctttctg caataacgcg aatcttctca acgtatttgt acgccatatt gcgaataatc 13620

aacttcgttc tctggccgag gtagccacgg tggcgcatca gttaaaactt ctcaaagatg 13680

atttttttgc cagcgaccag caggcagtcg ctgtggctga ccgttatccg caagatgtct 13740

ttgctgaaca tacacatgat ttttgtgagc tggtgattgt ctggcgcggt aatggcctgc 13800

atgtactcaa cgatcgccct tatcgcatta cccgtggcga tctcttttac attcatgctg 13860

acgataaaca ctcctacgct tccgttaacg atctggtttt gcagaatatt atttattgcc 13920

cggagcgtct gaagctgaat cttgactggc agggggcgat tccgggattt aacgccagcg 13980

cagggcaacc acactggcgc ttaggtagca tggggatggc gcaggcgcgg caggttatcg 14040

gtcagcttga gcatgaaagt agtcagcatg tgccgtttgc taacgaaatg gctgagttgc 14100

tgttcgggca gttggtgatg ttgctgaatc gccatcgtta caccagtgat tcgttgccgc 14160

caacatccag cgaaacgttg ctggataagc tgattacccg gctggcggct agcctgaaaa 14220

gtccctttgc gctggataaa ttttgtgatg aggcatcgtg cagtgagcgc gttttgcgtc 14280

agcaatttcg ccagcagact ggaatgacca tcaatcaata tctgcgacag gtcagagtgt 14340

gtcatgcgca atatcttctc cagcatagcc gcctgttaat cagtgatatt tcgaccgaat 14400

gtggctttga agatagtaac tatttttcgg tggtgtttac ccgggaaacc gggatgacgc 14460

ccagccagtg gcgtcatctc aattcgcaga aagattaatt cgccatgccc 14510

<210> 3

<211> 3181

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tcgagttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat 60

ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 120

gtcatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc 180

atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat 240

ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat 300

gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag 360

agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg 420

cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca 480

ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga 540

gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa 600

caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg 660

gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc 720

ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag 780

tatcagcccg tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg 840

gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag 900

gtagtcggca aataagatgc cgctcgccag tcgattggct gagctcatga agttcctatt 960

ccgaagttcc gcgaacgcgt aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1020

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1080

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1140

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1200

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1260

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1320

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1380

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1440

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 1500

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 1560

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 1620

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 1680

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 1740

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 1800

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 1860

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatgctg 1920

gatccttgac agctagctca gtcctaggta taatactagt agaggtagag acgcgaggtc 1980

taagaacttt aaataatttc tactgttgta gatagagacc gtgaagttaa taaggtctca 2040

aatttctact gttgtagatc gtctctgaac tgattcaagc aagcttaaac ccagctcaat 2100

gagctgggtt ttttgtttgt tttttcaaac ttagttagct tggccttatt aacgttgata 2160

taatttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta caataaatgt agtgatagcg 2220

gtaccctcga agctgtcacc ggatgtgctt tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac 2280

agcctctaca aataattttg tttaatagag ggtaagtaaa agaaaggagg tttattttat 2340

gagcaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 2400

tgttaatggg cacaaatttt ctgtccgtgg agagggtgaa ggtgatgcta caaacggaaa 2460

actcaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccgtggc caacacttgt 2520

cactactctg acctatggtg ttcaatgctt ttcccgttat ccggatcaca tgaaacggca 2580

tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaacgcacta tatctttcaa 2640

agatgacggg acctacaaga cgcgtgctga agtcaagttt gaaggtgata cccttgttaa 2700

tcgtatcgag ttaaagggta ttgattttaa agaagatgga aacattcttg gacacaaact 2760

cgagtacaac tttaactcac acaatgtata catcacggca gacaaacaaa agaatggaat 2820

caaagctaac ttcaaaattc gccacaacgt tgaagatggt tccgttcaac tagcagacca 2880

ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca accattacct 2940

gtcgacacaa tctgtccttt cgaaagatcc caacgaaaag cgtgaccaca tggtccttct 3000

tgagtttgta actgctgctg ggattacaca tggcatggat gagctctaca aataacgaac 3060

ggcagatcag aattttgtaa taaaaaaaga gcctgctcat tacactgcgg gctctttttc 3120

atggtcagaa gacgggtaac caagataaca aagcttagat ctattaccct gttatcccta 3180

c 3181

<210> 4

<211> 3903

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

atgtcaattt atcaagaatt tgttaataaa tatagtttaa gtaaaactct aagatttgag 60

ttaatcccac agggtaaaac acttgaaaac ataaaagcaa gaggtttgat tttagatgat 120

gagaaaagag ctaaagacta caaaaaggct aaacaaataa ttgataaata tcatcagttt 180

tttatagagg agatattaag ttcggtttgt attagcgaag atttattaca aaactattct 240

gatgtttatt ttaaacttaa aaagagtgat gatgataatc tacaaaaaga ttttaaaagt 300

gcaaaagata cgataaagaa acaaatatct gaatatataa aggactcaga gaaatttaag 360

aatttgttta atcaaaacct tatcgatgct aaaaaagggc aagagtcaga tttaattcta 420

tggctaaagc aatctaagga taatggtata gaactattta aagccaatag tgatatcaca 480

gatatagatg aggcgttaga aataatcaaa tcttttaaag gttggacaac ttattttaag 540

ggttttcatg aaaatagaaa aaatgtttat agtagcaatg atattcctac atctattatt 600

tataggatag tagatgataa tttgcctaaa tttctagaaa ataaagctaa gtatgagagt 660

ttaaaagaca aagctccaga agctataaac tatgaacaaa ttaaaaaaga tttggcagaa 720

gagctaacct ttgatattga ctacaaaaca tctgaagtta atcaaagagt tttttcactt 780

gatgaagttt ttgagatagc aaactttaat aattatctaa atcaaagtgg tattactaaa 840

tttaatacta ttattggtgg taaatttgta aatggtgaaa atacaaagag aaaaggtata 900

aatgaatata taaatctata ctcacagcaa ataaatgata aaacactcaa aaaatataaa 960

atgagtgttt tatttaagca aattttaagt gatacagaat ctaaatcttt tgtaattgat 1020

aagttagaag atgatagtga tgtagttaca acgatgcaaa gtttttatga gcaaatagca 1080

gcttttaaaa cagtagaaga aaaatctatt aaagaaacac tatctttatt atttgatgat 1140

ttaaaagctc aaaaacttga tttgagtaaa atttatttta aaaatgataa atctcttact 1200

gatctatcac aacaagtttt tgatgattat agtgttattg gtacagcggt actagaatat 1260

ataactcaac aaatagcacc taaaaatctt gataacccta gtaagaaaga gcaagaatta 1320

atagccaaaa aaactgaaaa agcaaaatac ttatctctag aaactataaa gcttgcctta 1380

gaagaattta ataagcatag agatatagat aaacagtgta ggtttgaaga aatacttgca 1440

aactttgcgg ctattccgat gatatttgat gaaatagctc aaaacaaaga caatttggca 1500

cagatatcta tcaaatatca aaatcaaggt aaaaaagacc tacttcaagc tagtgcggaa 1560

gatgatgtta aagctatcaa ggatctttta gatcaaacta ataatctctt acataaacta 1620

aaaatatttc atattagtca gtcagaagat aaggcaaata ttttagacaa ggatgagcat 1680

ttttatctag tatttgagga gtgctacttt gagctagcga atatagtgcc tctttataac 1740

aaaattagaa actatataac tcaaaagcca tatagtgatg agaaatttaa gctcaatttt 1800

gagaactcga ctttggctaa tggttgggat aaaaataaag agcctgacaa tacggcaatt 1860

ttatttatca aagatgataa atattatctg ggtgtgatga ataagaaaaa taacaaaata 1920

tttgatgata aagctatcaa agaaaataaa ggcgagggtt ataaaaaaat tgtttataaa 1980

cttttacctg gcgcaaataa aatgttacct aaggttttct tttctgctaa atctataaaa 2040

ttttataatc ctagtgaaga tatacttaga ataagaaatc attccacaca tacaaaaaat 2100

ggtagtcctc aaaaaggata tgaaaaattt gagtttaata ttgaagattg ccgaaaattt 2160

atagattttt ataaacagtc tataagtaag catccggagt ggaaagattt tggatttaga 2220

ttttctgata ctcaaagata taattctata gatgaatttt atagagaagt tgaaaatcaa 2280

ggctacaaac taacttttga aaatatatca gagagctata ttgatagcgt agttaatcag 2340

ggtaaattgt acctattcca aatctataat aaagattttt cagcttatag caaagggcga 2400

ccaaatctac atactttata ttggaaagcg ctgtttgatg agagaaatct tcaagatgtg 2460

gtttataagc taaatggtga ggcagagctt ttttatcgta aacaatcaat acctaaaaaa 2520

atcactcacc cagctaaaga ggcaatagct aataaaaaca aagataatcc taaaaaagag 2580

agtgtttttg aatatgattt aatcaaagat aaacgcttta ctgaagataa gtttttcttt 2640

cactgtccta ttacaatcaa ttttaaatct agtggagcta ataagtttaa tgatgaaatc 2700

aatttattgc taaaagaaaa agcaaatgat gttcatatat taagtataga tagaggtgaa 2760

agacatttag cttactatac tttggtagat ggtaaaggca atatcatcaa acaagatact 2820

ttcaacatca ttggtaatga tagaatgaaa acaaactacc atgataagct tgctgcaata 2880

gagaaagata gggattcagc taggaaagac tggaaaaaga taaataacat caaagagatg 2940

aaagagggct atctatctca ggtagttcat gaaatagcta agctagttat agagtataat 3000

gctattgtgg tttttgagga tttaaatttt ggatttaaaa gagggcgttt caaggtagag 3060

aagcaggtct atcaaaagtt agaaaaaatg ctaattgaga aactaaacta tctagttttc 3120

aaagataatg agtttgataa aactggggga gtgcttagag cttatcagct aacagcacct 3180

tttgagactt ttaaaaagat gggtaaacaa acaggtatta tctactatgt accagctggt 3240

tttacttcaa aaatttgtcc tgtaactggt tttgtaaatc agttatatcc taagtatgaa 3300

agtgtcagca aatctcaaga gttctttagt aagtttgaca agatttgtta taaccttgat 3360

aagggctatt ttgagtttag ttttgattat aaaaactttg gtgacaaggc tgccaaaggc 3420

aagtggacta tagctagctt tgggagtaga ttgattaact ttagaaattc agataaaaat 3480

cataattggg atactcgaga agtttatcca actaaagagt tggagaaatt gctaaaagat 3540

tattctatcg aatatgggca tggcgaatgt atcaaagcag ctatttgcgg tgagagcgac 3600

aaaaagtttt ttgctaagct aactagtgtc ctaaatacta tcttacaaat gcgtaactca 3660

aaaacaggta ctgagttaga ttatctaatt tcaccagtag cagatgtaaa tggcaatttc 3720

tttgattcgc gacaggcgcc aaaaaatatg cctcaagatg ctgatgccaa tggtgcttat 3780

catattgggc taaaaggtct gatgctacta ggtaggatca aaaataatca agagggcaaa 3840

aaactcaatt tggttatcaa aaatgaagag tattttgagt tcgtgcagaa taggaataac 3900

taa 3903

<210> 5

<211> 417

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

atggatatta atactgaaac tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt 60

ttcctaatca gcccggcatt tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc 120

atgaacgctt attacattca ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag 180

cagctcgccc gtgaagagaa agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc 240

cagcacctgt ttgaatcgct atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa 300

tccattaccc gtgcgtttga tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc 360

cggtacatgg ttgaaaccat tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataa 417

<210> 6

<211> 786

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

atgagtactg cactcgcaac gctggctggg aagctggctg aacgtgtcgg catggattct 60

gtcgacccac aggaactgat caccactctt cgccagacgg catttaaagg tgatgccagc 120

gatgcgcagt tcatcgcatt actgatcgtt gccaaccagt acggccttaa tccgtggacg 180

aaagaaattt acgcctttcc tgataagcag aatggcatcg ttccggtggt gggcgttgat 240

ggctggtccc gcatcatcaa tgaaaaccag cagtttgatg gcatggactt tgagcaggac 300

aatgaatcct gtacatgccg gatttaccgc aaggaccgta atcatccgat ctgcgttacc 360

gaatggatgg atgaatgccg ccgcgaacca ttcaaaactc gcgaaggcag agaaatcacg 420

gggccgtggc agtcgcatcc caaacggatg ttacgtcata aagccatgat tcagtgtgcc 480

cgtctggcct tcggatttgc tggtatctat gacaaggatg aagccgagcg cattgtcgaa 540

aatactgcat acactgcaga acgtcagccg gaacgcgaca tcactccggt taacgatgaa 600

accatgcagg agattaacac tctgctgatc gccctggata aaacatggga tgacgactta 660

ttgccgctct gttcccagat atttcgccgc gacattcgtg catcgtcaga actgacacag 720

gccgaagcag taaaagctct tggattcctg aaacagaaag ccgcagagca gaaggtggca 780

gcatga 786

<210> 7

<211> 681

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg 60

gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg 120

atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg cctgacatga aaatgtccta cttccacacc 180

ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg 240

ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt 300

actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa agtatgcgta ccgcctgctc tcccgatggt 360

ttatgcagtg acggcaacgg ccttgaactg aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg 420

aagttccggc tcggtggttt cgaggccata aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac 480

agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag 540

cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac 600

gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta 660

tttggggagc aatggcgatg a 681

<210> 8

<211> 813

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

atgaaccaaa tcgtgaagtt cactgacgac tctggcctgg cggttcaagt tactccagac 60

gatgttcgcc gttatatctg tgagaacgct actgaaaaag aggtgggcct ctttctgcaa 120

ctctgtcaga ctcaacgtct gaatccgttt gtgaaagacg cttacctggt gaaatacggc 180

ggtgctccag cttctatgat tacttcctat caagttttta accgtcgcgc gtgtcgtgat 240

gctaactatg atggtatcaa atctggtgtg gttgttctgc gtgacggtga tgttgtgcat 300

aaacgtggtg ctgcgtgcta caaaaaggcg ggtgaggagc tcatcggtgg ttgggcggaa 360

gttcgcttta aggatggccg cgagactgcg tatgctgagg tggcgctcga cgactattcc 420

accggcaaat ctaattgggc gaaaatgccg ggtgttatga tcgaaaaatg cgcgaaggct 480

gctgcttggc gcctcgcgtt cccggacact tttcagggca tgtacgctgc ggaggaaatg 540

gatcaagcgc aacagccaga acaggtgcgc gctcaggcgg agcaaccagt ggatctccag 600

ccaatccgcg aactcttcaa gccatattgc gaacacttcg gcatcactcc ggctgagggt 660

atgactgctg tttgtggtgc ggtgggcgct gaaggcatgc actctatgac cgagcagcaa 720

gctcgccgtg ctcgcgcttg gatggaggaa gaaatggctg cgccagctgt ggaagcggag 780

tatgaggttg ttgacgaagg cgaggtgttt taa 813

Claims (6)

1.一种基于CRISPR/Cpf1的大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，所述大肠杆菌基因编辑系统包括：

质粒pEcCpf1和质粒pcrEG；

或质粒pEcCpf1H和质粒pcrEG；

质粒pEcCpf1通过将pEcCas载体上的Cas9蛋白替换为Cpf1蛋白，靶向基因pMB1的sgRNA替换为靶向基因pMB1的crRNA序列得到，其中，所述质粒pEcCpf1上连接有编码λ-Red重组酶系的基因，所述λ-Red重组酶系包括Gam蛋白、Bet蛋白和Exo蛋白；

质粒pcrEG通过将pTarget载体上的sgRNA插入区替换为crRNA插入区，并插入sfgfp基因得到；

所述质粒pEcCpf1H通过将质粒pEcCpf1中的λ-Red重组酶系替换成CspRecT蛋白得到；

其中，质粒pEcCpf1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，质粒pEcCpf1H的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，质粒pcrEG的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的大肠杆菌基因编辑系统在大肠杆菌基因编辑中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：质粒pEcCpf1和质粒pcrEG构成的基因编辑系统用于大肠杆菌的基因敲除和基因整合。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：质粒pEcCpf1H和质粒pcrEG构成的基因编辑系统用于大肠杆菌的基因敲除、碱基编辑或多基因编辑。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：同源臂连接在质粒pcrEG上。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：采用化转法将质粒pEcCpf1和质粒pcrEG转化入大肠杆菌中，采用电转法将质粒pEcCpf1H和质粒pcrEG转化入大肠杆菌中。

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