CN107641631A

CN107641631A - 一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法

Info

Publication number: CN107641631A
Application number: CN201710800291.6A
Authority: CN
Inventors: 孙东昌; 裘娟萍; 王琳
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2018-01-30

Abstract

本发明公开了一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，本发明采用化学转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ‑Red同源重组系统和CRISPR系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本发明提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本发明提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。

Description

一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法

(一)技术领域

本发明涉及基因敲除技术领域，具体涉及由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统的特异性敲除大肠杆菌中染色体靶标基因的方法。

(二)背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)广泛应用于基因工程、遗传工程、发酵工程、代谢工程等领域，具广阔的应用前景。基因敲除涉及外源DNA导入及其与染色体DNA同源重组。Datsenko和Wanner通过导入λ-Red同源重组系统大幅提高大肠杆菌的重组效率，发明了一步敲除大肠杆菌染色体基因技术(Datsenko&Wanner，PNAS,2000,97:6640-6645)。CRISPR系统可导致靶标基因相应区域产生双链断裂，结合λ-Red同源重组系统可进一步提高大肠杆菌基因敲除的效率(Jiang et al.，Nat Biotechnol，2013，31:233-9；Jiang et al.，ApplEnviron Microbiol，2015，81:2506-2514；Zhao et al.，Microb Cell Fact，2016，15:205)。目前采用较广泛的外源DNA导入细菌的方法包括电转化和化学转化。前者转化效率高，但是依赖电转化仪、电击杯等装置，因此实验成本相对较高，操作相对较繁琐；后者虽然转化效率相对较低，但是不依赖特殊装置，实验成本低，操作简便。基于λ-Red同源重组系统或CRISPR系统的大肠杆菌基因敲除技术一般通过电转化的方法将外源DNA导入细胞。目前，尚没有文献报道化学转化方法结合λ-Red同源重组系统或CRISPR系统开展大肠杆菌基因敲除的成功案例。

利用λ-Red同源重组的基因敲除技术是一种常用基因打靶技术，是将一段携带与靶基因两翼同源序列的DNA片段导入宿主菌细胞，利用入噬菌体Red重组酶(Gam、Bel、Exo 3种蛋白)的作用，使线性DNA片段与染色体的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。该方法所需打靶同源臂短，可以直接设计在引物上，不需要DNA酶切和连接等程序，但是同源重组技术重组效率低，对突变体的筛选工作非常耗时和低效。

CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，系统中执行DNA识别和降解功能的复合物由Cas蛋白和crRNA组成。该系统有三种类型，其中第二类Cas9系统组成简单，已经被广泛应用于基因工程领域。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA和tracrRNA与靶序列互不识别来实现的。现在已经将这两种小RNA融合成一条链，简称sgRNA，能够识别特定的基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。

现有的CRISPR技术敲除大肠杆菌基因的体系结合Cas9蛋白和λ-Red同源重组系统实现靶标基因敲除工作，操作简单、筛选效率高，能够实现精确快速的靶向切割，但是需要通过电转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，对DNA片段的纯度以及感受态细胞的制备等方面要求较高。开展电转化操作需要较特殊的电转化设备(电转仪)和较昂贵的实验耗材(电击杯)，因此不适合同时开展大量单基因敲除工作。

本发明采用化学转化的方法开展大肠杆菌基因敲除工作，无需电转仪和电击杯即可实现快速、高效、准确的靶标基因敲除工作，且基因敲除操作成本低廉，可同时实现大肠杆菌多个单基因敲除，适合大规模高通量基因功能筛选和鉴定工作。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统的简便而快速敲除大肠杆菌染色体基因的方法，该方法扩增任一靶标基因缺失的大肠杆菌，得到携带选择性标记的同源臂DNA片段；采用化学转化的方法将该DNA片段和辅助质粒导入宿主细胞，可以对大肠杆菌中敲除效率相对较低的系列菌株中靶标基因快速、高效、准确敲除。此外本发明提供的技术为没有电转仪的实验室开展大肠杆菌基因敲除提供便捷的方法，为大肠杆菌的菌种研究和改良提供了有效手段并显著降低了成本。本发明采用化学转化的方法将外源DNA导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ-Red同源重组系统和CRISPR系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本发明提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本发明提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，所述方法为：

(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；

(2)根据靶标基因设计一对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列(N20)，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；所述筛选是指PCR产物经纯化后回收，用DpnⅠ处理回收，导入大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒；

(3)以敲除靶标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除靶标基因位点上下游核苷酸序列设计引物，菌落PCR扩增含选择性标记基因(优选氯霉素抗性基因)和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化方法转入大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

进一步，步骤(4)辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10，优选1:4。

进一步，步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性的LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌；所述选择性LB琼脂培养基为含终浓度25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基。

进一步，当靶标基因为panD基因，所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21pCas9；

(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物pTargetF-panD1(含靶标基因20个核苷酸序列(N20)和pTargetF-panD2，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；

pTargetF-panD1:GTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

pTargetF-panD2:ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG；

(3)以敲除目标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除基因位点上下游核苷酸序列设计引物F和R，菌落PCR扩增筛选出含选择性标记基因和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；

F：5’-AGATAACCGGGATTGCCCT-3’；

R：5’-TGAGCCGCTATGCGTATCC-3’；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段以质量比1:4与(50μL)大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上放置1～2min，加入950μL经30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分(800μL)，剩余上清和沉淀混匀，取混合液涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

进一步，步骤(2)所述PCR扩增条件为：EasyTaq DNA聚合酶混合液5μL、dNTPs 4μL、1μL引物pTargetF-panD1、1μL引物pTargetF-panD 2、模板1μL、EasyTaq DNA聚合酶1μL、ddH₂O补足至50μL；反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2.5min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。

进一步，步骤(3)所述PCR条件为：EasyTaq DNA聚合酶混合液5μL、dNTPs4μL、引物F1μL、引物R1μL、模板1μL、EasyTaq DNA聚合酶1μL、ddH₂O补足至50μL；反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2min10s，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。

本发明步骤(1)中将pCas质粒钙转导入大肠杆菌，包括以下步骤：

(1)挑取大肠杆菌BL21单菌落接种于5mL LB液体试管中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液A(购自TaKaRa感受态细胞制备试剂盒)和溶液B(购自TaKaRa感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液B，即获得大肠杆菌BL21化学转化感受态细胞；

(2)转化：将5μL pCas9质粒(repA101(Ts)kan P_cas-cas9P_araB-red lacIq P_trc-sgRNA-pMB1)与50μL大肠杆菌BL21感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基表面，30℃过夜培养12h，挑取转化子，得到含pCas9质粒的大肠杆菌BL21，记为大肠杆菌BL21-pCas9。

本发明所述LB琼脂培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

目前主要通过电转化方法开展大肠杆菌基因敲除工作，实验依赖电转仪(单个电转仪价格1～10万元)及较昂贵的耗材电击杯(约50元/个)，因此单个基因敲除的成本在50元以上，且难以实现并行敲除多个单基因的工作。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：1.本发明利用化学转化进行基因敲除时不依赖特殊装置和昂贵的实验耗材，单个基因敲除的实验成本仅包括价格低廉的试剂和普通的耗材(总成本约0.5元)，且操作十分简便，适用于较高通量的基因敲除工作(如多基因形成的代谢调控网络研究)。此外，本发明采用化学转化敲除大肠杆菌基因的效率近100％，显著优于目前所有已知的大肠杆菌基因敲除方法。

(四)附图说明

图1为实施例1pTargetF-panD质粒载体图谱。

图2为实施例1质粒pTargetF经PCR扩增后的凝胶电泳图，M为DL2000Marker，泳道1-10代表平行的10个相同的质粒pTargetF PCR产物。

图3为实施例1菌落PCR扩增携带长同源臂和氯霉素抗性基因的DNA片段凝胶电泳图，M为DL2000Marker，泳道1-4分别代表平行的4个相同的扩增长同源臂和氯霉素抗性基因片段的PCR产物。

图4为实施例1大肠杆菌BL21△panD敲除株的菌落PCR验证凝胶电泳图，M为1kbLadder Marker，泳道1-2代表2个大肠杆菌BL21野生菌平行对照，泳道3-8代表随机挑取6个转化子进行的菌落PCR验证，结果显示都为大肠杆菌BL21△panD敲除株。

图5为实施例1大肠杆菌BL21野生菌和大肠杆菌BL21△panD敲除株在基本盐培养基中的生长曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1大肠杆菌BL21中panD基因的敲除

1、将pCas9质粒钙转导入大肠杆菌BL21，记为大肠杆菌BL21pCas9，包括以下步骤：

(1)大肠杆菌BL21感受态制备：挑取大肠杆菌BL21单菌落接种于5mL LB液体试管中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液A(购自TaKaRa感受态细胞制备试剂盒)和溶液B(购自TaKaRa感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液B，即获得大肠杆菌BL21化学转化感受态细胞。

(2)转化：将5μL pCas9质粒与50μL大肠杆菌BL21感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基表面，30℃过夜培养12h，挑取转化子，得到含pCas9质粒的大肠杆菌BL21，记为大肠杆菌BL21pCas9。

2、辅助质粒pTargetF-panD的构建

(1)以pTargetF质粒(源自Jiang et al.，Appl Environ Microbiol，2015，81:2506-2514)为模板，通过引物pTargetF-panD1(含有panD20个核苷酸，即N20)和pTargetF-panD2进行PCR，扩增得到线性化pTargetF-panD PCR产物。

pTargetF-panD1:GTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ ID NO.1)；

pTargetF-panD2:ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG(SEQ ID NO.2)。

PCR的具体条件为：

EasyTaq DNA Polymerase Buffer	5μL
		dNTPs	4μL
引物pTargetF-panD1	1μL
		引物pTargetF-panD2	1μL
模板(质粒pTargetF)	1μL
		EasyTaq DNA Polymerase	1μL
ddH₂O	37μL
		Total	50μL

反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2.5min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。

PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用DNA Fragment Purification Kit(购于TaKaRa公司)对其进行纯化回收。

(2)用DpnⅠ处理纯化的PCR产物降解模板质粒，具体反应体系为：

PCR产物	0.5μg
		QuickCut DpnⅠ	0.5μL
10×QuickCut Buffer	2.5μL

将反应液37℃水浴15min，反应结束后，用DNA Fragment Purification Kit对其进行纯化回收。

(3)取两步纯化得到的PCR纯化产物(即步骤2回收的产物)转化50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、37℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含有100μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12h，挑取阳性转化菌落，进行测序分析(睿迪)检测重组质粒pTargetF-panD是否含有N20部分，并附带送测引物。

送测引物如下：

PTF-panD:GTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACG(SEQ ID NO.3)

序列分析结果，得到含有正确N20部分的pTargetF-panD，质粒图谱如图1所示。测得序列如下(SEQ ID NO.4)：

TCGAGTTCATGTGCAGCTCCATAAGCAAAAGGGGATGATAAGTTTATCACCACCGACTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCGTGCTATGATCGACTGATGTCATCAGCGGTGGAGTGCAATGTCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAAGATGCCGCTCGCCAGTCGATTGGCTGAGCTCATGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCGCGAACGCGTAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCCTAC

3.通过PCR扩增获得携带拟敲除靶标基因两侧同源DNA片段和氯霉素抗性基因的PCR产物

(1)以大肠杆菌BW25113△panD(源自Tomoya Baba et al.，Molecular SystemsBiology，2006，2:2006.0008)为模板，进行菌落PCR扩增出两端与panD上下游同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段，所采用的引物如下：

F：5’-AGATAACCGGGATTGCCCT-3’。(SEQ ID NO.5)

R：5’-TGAGCCGCTATGCGTATCC-3’。(SEQ ID NO.6)

PCR扩增获得的两端与panD上下游同源中间为氯霉素抗性基因的序列(SEQ IDNO.7)：

AGATAACCGGGATTGCCCTGCATTTGCACGGAATAGAGCACGTCCGTGCTGTGTCCTTTCAGGCTCTCTTCAATGAAACTCCCCGACTCTAAATGAAGCGTGTTGAGGTCACAAAGTTCGCGTAATTCCACTGGCAAATGTATCTCCAGAAAGTCGCGAGCCGTCTCCGCATGCATTAAAAATTGTTTAAATACCGCGTCATGCGGTGTGGTACTCGGTGCATCCATCTTCCCTGTCTTCCGTGTGGCTTTGCGTGAAGGCAGTATCCAGTCAAGGCGCGCTATCGTCAGCCACCTCTTTATTGTTTACCGAGCAGCGTTCAGAGAAATATCAATTCGTTACAGGCGATACATGGCACGCTTCGGCGCGGTACGCAAACTGCTGACGCAAATGCCGTCAGATGAGTAGACACTAAACAAAAATCGGGCAATACTGCGTGAGAATTTCCTCAAAG CAGGCATCGCCTGCTTCGTTAACGACAGGGTAGAAAGGTAGAAGTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATTTGTTATCCCTGCGGCTGGTTACTCACCAGCCGCGACATCGTCTCCAGCGAATCCGTTCTTAAGATATAAAGTCGTTTTAGTAACAACGGATTATCCCCCGGTTTTACTTTGCCTTTCATGGTTGTCACCGCCAGGTGAAATCCGGCATCGTTTGCTGCCTTCACGGCGTTGTCATTAAATCCGCCAAACGGATACGAAAGATACCAGACATGCGGATTAAATTGCGCCAGAGCGCGGCGTGAACGTGCAAAATCAAACAGAATATTGTGCTCACTACGGCTCAGTAATATGGGTCGGCGATAACCATCTACCCGATGCAAAAAATGGGTATGTGACTGGAAATCAAATACATCGCGAATTTCGTTAAGCTCAGAAACGCTCATAAATTGCAGCGATTTTGGGTTCCACTTCTGCGGGTGACGTTTGATGCGTGAGGTAACAATAAACGCCGTCGCCTTCATGCCATATTGTTTCAACACAGGATACGCATAGCGGCTCA

PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示。电泳结果在预期位置上出现了单一的特异性条带，大小为2012bp。用乙醇沉淀对其进行纯化回收备用(>1μg/μL)。

PCR的具体条件为：

EasyTaq DNA Polymerase Buffer	5μL
		dNTPs	4μL
引物F	1μL
		引物R	1μL
模板	1μL
		EasyTaq DNA Polymerase	1μL
ddH₂O	37μL
		Total	50μL

反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。

乙醇沉淀PCR产物的具体步骤：

(1)按比例加入试剂：

PCR产物	100μL
		无水乙醇	385μL
NaCl(3M)	54μL

(2)混匀后-20℃放置2h以上或过夜；

(3)将混合物4℃8000r/min离心30min，弃上清；

(4)300μl 70％乙醇加入沉淀中，4℃8000r/min离心5min，弃上清；

(5)沉淀于37℃或50～60℃烘箱中烘至乙醇完全挥发(≧30min)；

(6)加5～10μL ddH₂O溶解DNA，若不溶，37℃水浴加热几分钟；

(7)用ND5000检测DNA浓度，取0.5μL加4.5μLddH₂O中稀释10倍后测浓度。

4、大肠杆菌BL21pCas9感受态制备

挑取步骤1制备的大肠杆菌BL21pCas单菌落接种于5mL LB液体试管中，30℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液A和溶液B(购自TaKaRa感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液B，即获得大肠杆菌BL21pCas9化学转化感受态细胞。

5、转化：将1μg步骤2制备pTargetF-panD质粒(SEQ ID NO.4)和4μg步骤3制备的携带panD上下游同源序列和氯霉素抗性基因的DNA片段(SEQ ID NO.7)与50μL大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h。

注：pTargetF-panD质粒与携带长同源臂和抗性基因的PCR产物质量比为1:1～1:10，优选1:4。

6、将步骤5菌液离心弃上清800μL后，剩余部分混匀，取50μL菌液涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上复筛，获得大肠杆菌BL21△panD。

7、用鉴定引物F(SEQ ID NO.5)和R(SEQ ID NO.6)进行菌落PCR验证转化子，结果如图4。鉴定引物在靶标基因外侧，鉴定引物靶定的序列在野生株中长度为1381bp(泳道1～2)，在敲除株中因氯霉素抗性基因替换原靶标基因导致其序列长度为2012bp(泳道3～8)，实验结果与预期相符，表明该方法能够成功获得大肠杆菌BL21△panD缺陷株。

所有经检测的转化子(6/6)中靶标基因均被氯霉素抗性基因替换，因此采用本方法敲除大肠杆菌的阳性率可达100％。

8、检测大肠杆菌BL21△panD在基本盐培养基中的生长状况，结果如图5。图中野生菌(大肠杆菌BL21)在基本盐培养基中生长正常，而大肠杆菌BL21△panD基本不长，与文献报道结果一致(源自Changshui Liu et al.，Metabolic Engineering，2016，34:104-111)。

基本盐培养基成分：三水合磷酸氢二钾14g/L、磷酸二氢钾5.2g/L、氯化铵1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母膏0.2g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠1g/L、溶剂为去离子水，pH值自然。

培养条件：挑大肠杆菌BL21△panD单菌落到5mL LB液体培养基，37℃培养过夜后离心，沉淀用基本盐培养基洗三次，弃上清，加入500μL的基本盐培养基混匀后加入到50mL基本盐摇瓶培养并监测菌株的生长曲线。同样条件下以大肠杆菌BL21为对照测试生长曲线。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtcctaggta taatactagt gatatctgga atgtcaccaa gttttagagc tagaaatagc 60

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

actagtatta tacctaggac tgag 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gtcttaccgg gttggactca agacg 25

<210> 4

<211> 2118

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

tcgagttcat gtgcagctcc ataagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat 60

ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 120

gtcatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc 180

atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat 240

ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat 300

gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag 360

agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg 420

cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca 480

ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga 540

gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa 600

caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg 660

gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc 720

ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag 780

tatcagcccg tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg 840

gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag 900

gtagtcggca aataagatgc cgctcgccag tcgattggct gagctcatga agttcctatt 960

ccgaagttcc gcgaacgcgt aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1020

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1080

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1140

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1200

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1260

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1320

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1380

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1440

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 1500

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 1560

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 1620

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 1680

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 1740

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 1800

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 1860

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatgctg 1920

gatccttgac agctagctca gtcctaggta taatactagt gatatctgga atgtcaccaa 1980

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 2040

ggcaccgagt cggtgctttt tttgaattct ctagagtcga cctgcagaag cttagatcta 2100

ttaccctgtt atccctac 2118

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

agataaccgg gattgccct 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tgagccgcta tgcgtatcc 19

<210> 7

<211> 2012

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

agataaccgg gattgccctg catttgcacg gaatagagca cgtccgtgct gtgtcctttc 60

aggctctctt caatgaaact ccccgactct aaatgaagcg tgttgaggtc acaaagttcg 120

cgtaattcca ctggcaaatg tatctccaga aagtcgcgag ccgtctccgc atgcattaaa 180

aattgtttaa ataccgcgtc atgcggtgtg gtactcggtg catccatctt ccctgtcttc 240

cgtgtggctt tgcgtgaagg cagtatccag tcaaggcgcg ctatcgtcag ccacctcttt 300

attgtttacc gagcagcgtt cagagaaata tcaattcgtt acaggcgata catggcacgc 360

ttcggcgcgg tacgcaaact gctgacgcaa atgccgtcag atgagtagac actaaacaaa 420

aatcgggcaa tactgcgtga gaatttcctc aaagcaggca tcgcctgctt cgttaacgac 480

agggtagaaa ggtagaagtt tgtaggctgg agctgcttcg aagttcctat actttctaga 540

gaataggaac ttcggaatag gaacttcatt taaatggcgc gccttacgcc ccgccctgcc 600

actcatcgca gtactgttgt attcattaag catctgccga catggaagcc atcacaaacg 660

gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt cgccttgcgt ataatatttg 720

cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg 780

gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg 840

aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc 900

cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg tttcagtttg ctcatggaaa 960

acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct caccgtcttt cattgccata 1020

cgtaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt gaataaaggc cggataaaac 1080

ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa tatccagctg aacggtctgg 1140

ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg 1200

gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca ttttagcttc cttagctcct 1260

gaaaatctcg acaactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc ttatttcatt atggtgaaag 1320

ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc 1380

ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga agtgatcttc cgtcacaggt 1440

aggcgcgccg aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaactaagga 1500

ggatattcat atttgttatc cctgcggctg gttactcacc agccgcgaca tcgtctccag 1560

cgaatccgtt cttaagatat aaagtcgttt tagtaacaac ggattatccc ccggttttac 1620

tttgcctttc atggttgtca ccgccaggtg aaatccggca tcgtttgctg ccttcacggc 1680

gttgtcatta aatccgccaa acggatacga aagataccag acatgcggat taaattgcgc 1740

cagagcgcgg cgtgaacgtg caaaatcaaa cagaatattg tgctcactac ggctcagtaa 1800

tatgggtcgg cgataaccat ctacccgatg caaaaaatgg gtatgtgact ggaaatcaaa 1860

tacatcgcga atttcgttaa gctcagaaac gctcataaat tgcagcgatt ttgggttcca 1920

cttctgcggg tgacgtttga tgcgtgaggt aacaataaac gccgtcgcct tcatgccata 1980

ttgtttcaac acaggatacg catagcggct ca 2012

Claims

1.一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于所述方法为：

(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；

(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTargetF质粒，即为辅助质粒pTargetF；

(3)构建携带选择性标记和待敲除基因上下游同源序列的DNA片段；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

2.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)中辅助质粒pTargetF和DNA片段质量比为1:1～1:10。

3.如权利要求1所述由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于步骤(4)转入方法为：将辅助质粒pTargetF和DNA片段与大肠杆菌BL21pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。

4.如权利要求1所述基于由化学转化介导的CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，其特征在于靶标基因为panD基因，所述方法为：(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌BL21，获得大肠杆菌BL21 pCas9；

(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物pTargetF-panD1和pTargetF-panD2，所述引物pTargetF-panD1含靶标基因20个核苷酸序列，以pTargetF质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的辅助质粒pTargetF；

pTargetF-panD1:GTCCTAGGTATAATACTAGTGATATCTGGAATGTCACCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

pTargetF-panD2:ACTAGTATTATACCTAGGACTGAG；

(3)以敲除目标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除靶标基因位点上下游核苷酸序列设计引物F和R，菌落PCR扩增筛选含选择性标记基因和拟敲除靶标基因上下游同源DNA序列的DNA片段；

F：5’-AGATAACCGGGATTGCCCT-3’；

R：5’-TGAGCCGCTATGCGTATCC-3’；

(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTargetF和步骤(3)获得的DNA片段以质量比1:4与大肠杆菌BL21 pCas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上，30℃过夜培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。