KR20230142572A - 그램 음성 세균의 감염 치료에 효과적인 항균성 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

그램 음성 세균 관련 감염을 치료하기 위한 약제학적 조성물은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 항균성 단백질을 포함한다. 또한, 항균성 단백질을 제조하는 방법도 개시된다.

Description

그램 음성 세균의 감염 치료에 효과적인 항균성 조성물 및 이의 제조 방법

본 출원은 2021년 2월 25일자로 제출된 미국 최종 특허출원 제 17/185,251호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적으로 본원에 완전하게 기재된 것과 같이 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루노기사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)를 포함하는 그램 음성 세균에 대한 용해 활성을 갖는 항균성 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 외막 침투 효율을 강화시킴으로써 그램 음성 세균에 대해 효과적으로 작용하도록 단백질 공학을 이용하여 조작된 항균성 단백질, 이를 포함하여 그램 음성 세균 관련 감염을 치료하는데 효과적인 약제학적 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

그램 음성 세균은 그램 염색으로 불리는 화학 처치 이후에 이들이 변하는 색상에 의해 분류된다. 그램 음성 세균 염색은 이러한 처치를 하였을 때 적색으로 변한다. 다른 세균 염색은 청색으로 변하는데, 이들은 그램 양성 세균으로 불린다. 그램 음성 및 그램 양성 세균 염색은 세균의 세포벽이 다르기 때문에 상이한 성질을 갖는다. 또한, 이들은 서로 다른 유형의 감염을 유발시키고, 이들에 대응하여 상이한 유형의 항생제가 효과적이다. 그램 음성 감염은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루노기사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)뿐만 아니라 덜 보편적인 다른 많은 세균에 의해 유발된 감염을 포함한다. 그램 음성 세균은 폐렴, 복막염 (복강을 감싸는 막의 염증), 요로 감염, 혈류 감염, 상처 또는 수술 부위 감염 및 수막염과 같은 다양한 중증 감염을 야기한다.

그램 양성 세균, 예컨대 MRSA (메티실린 저항성 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)) 및 VRE (반코마이신 저항성 엔테로코커스 (Enterococci))에서의 항생제 저항성 문제와 더불어, 그램 음성 세균에서의 저항성 문제도 매우 심각하다. 항생제 저항성 그램 음성 세균의 전세계 유병율의 증가로 인해, 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염을 치료하는데 효과적인 새로운 살균제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 국제보건기구 (WHO)는 아시네토박터 바우마니 및 슈도모나스 애루노기사를 긴급한 신규 항생제의 개발이 요구되는 제 1 우선 병원체로 발표한 바 있다.

그램 음성 세균에 의해 유발된 감염은 일반적으로 항생제를 사용하여 치료된다. 그러나, 최근에 항생제에 대한 저항성을 갖는 그램 음성 세균이 점차로 증가되고, 이로써 항생제의 치료 효과가 감소되고 있다. 따라서, 기존의 항생제에 대해 저항성을 갖는 그램 음성 세균이 유발시킨 감염을 효과적으로 처치하기 위하여, 새로운 항생제/항균 물질의 개발이 요구된다. 특히, 신속한 치료 효과를 제공할 수 있는 약제를 개발하는 것이 시급하다.

따라서, 본 발명은 관련 기술분야에서 겪는 문제점을 명심하면서 이루어졌으며, 이러한 문제점을 해결하고자 한다.

일 구현예에서, 본 발명은 그램 음성 세균 관련 감염을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 개시하고 있다. 약제학적 조성물은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 항균성 단백질을 포함하였다.

또 다른 구현예에서, 항균성 단백질은 그램 음성 세균에 대한 항균 활성을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 항균성 단백질은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루노기사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 그램 음성 세균 관련 감염은 폐렴, 복막염, 요로 감염, 혈류 감염, 상처 또는 수술 부위 감염 및 수막염이다.

또 다른 구현예에서, 항균성 단백질은 0.01 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 L-히스티딘, 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 20 및 소비톨 또는 만니톨을 추가로 포함한다.

또 다른 구현예에서, L-히스티딘은 0.1 mM 내지 50 mM, 바람직하게 1 mM 내지 25 mM, 더욱 바람직하게 5 mM 내지 15 mM의 농도를 갖고, 폴록사머 188는 0.01% 내지 10%, 바람직하게 0.05% 내지 5%, 더욱 바람직하게 0.25% 내지 0.75%의 농도를 갖고, 폴리소르베이트 20는 0.01% 내지 10%, 바람직하게 0.02% 내지 2%, 더욱 바람직하게 0.05% 내지 0.2%의 농도를 갖고, 소비톨은 0.1% 내지 20%, 바람직하게 1% 내지 15%, 더욱 바람직하게 2.5% 내지 7.5%의 농도를 갖고, 만니톨은 0.1% 내지 20%, 바람직하게 1% 내지 15%, 더욱 바람직하게 2.5% 내지 7.5%의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, L-히스티딘은 10 mM의 농도를 갖고, 폴록사머 188는 0.5%의 농도를 갖고, 폴리소르베이트 20는 0.1%의 농도를 갖고, 소비톨은 5%의 농도를 갖고, 만니톨은 5%의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 pH 5.0 내지 pH 7.5의 값을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 pH 6.5의 값을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료용 약물로서 사용된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 항균성 단백질을 제조하는 방법으로서, 항균성 단백질이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법을 제공한다. 본 방법은 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24에 기재된 서열을 포함하는 플라스미드를 포함한 대장균 세포를 배양하는 단계; 항균성 단백질의 발현을 유도하는 단계; 봉합체를 회수하는 단계; 봉합체를 용해시키는 단계; 항균성 단백질을 정제하는 단계; 및 항균성 단백질을 재접힘 (refolding)하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 항균성 단백질은 90% 내지 99.99%의 순도를 갖는다.

전술한 일반적 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시하고, 해석하는 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가의 설명을 제공하고자 함으로 이해되어야 한다.

첨부된 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서에 통합되어 이의 일부를 구성하며, 본 발명의 구현예를 제시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 있다.
도 1은 재조합으로 생산된 항균성 단백질을 보여주는 전기영동 사진을 나타낸다. 레인 M: 단백질 크기 마커; 레인 1: 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 2: 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 3: 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 4: 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 5: 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 6: 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 7: 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질; 레인 8: 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
도 2는 항생제 저항성 세균에 대한 항균성 단백질의 항균 활성 (세균 용해 활성)의 결과를 내타내고, 여기서 투명한 부분 (화살표로 표시됨)은 항균성 단백질의 항균 활성 (세균 용해 활성)에 의해 생성된다. NC: 음성 대조군.

본 발명의 구현예가 이제 자세하게 언급될 것이고, 이의 예시는 첨부된 도면에 제시되어 있다.

따라서 본 발명의 일 양태에 따르면, 항균성 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-1), 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-2), 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-3), 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-4), 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-5), 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-6), 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-7) 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 (AP-8)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.

단백질 AP-1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 기재되고, 단백질 AP-2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 기재되고, 단백질 AP-3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 11에 기재되고, 단백질 AP-4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 기재되고, 단백질 AP-5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 기재되고, 단백질 AP-6을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14에 기재되고, 단백질 AP-7을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 15에 기재되고, 단백질 AP-8을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16에 기재된다.

단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8은 명시적으로 및 부분적으로 개시된 내용을 사용하여 당업자에 의해 변형될 수 있다. 상기 변형은 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부분적 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 상기에 언급된 바와 같이, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 상응하게 적용하는 것은, 본 발명에 제공된 서열이 출원인의 전문 식견 및 경험을 기반으로 하여 증진된 외막 침투 효율을 갖도록 설계되었기 때문에 가장 바람직하다. 구체적으로, 본 발명에 제공된 서열은 바람직한 크기, 소수성, 표면 전하, 삼차원 구조, 면역원성 등을 고려하여 설계되었다.

또한, 본 발명은 단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8의 발현 플라스미드를 제공한다. 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24에 기재된 서열을 포함하는 발현 플라스미드는 단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8의 생산 숙주의 제작에 사용가능하다.

또한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물의 약학적 유효 성분은 단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 항균성 단백질이고, 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 약학적 유효 성분으로서, 항균성 단백질은 그램 음성 세균을 특이적으로 용해시킬 수 있으며, 그램 음성 세균에 의해 유발된 질환 범위를 치료하는데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 그램 음성 세균에 의해 유발된 질환을 치료할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료용 약물로서 사용되어, 그램 음성 세균에 의해 유발된 질환을 치료할 수 있다.

또한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 그램 음성 세균에 의해 유발된 다양한 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 항균성 단백질을 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함한다.

본원에서 "그램 음성 세균에 의해 유발된 질환"은 종합적으로 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염에 의한 증상을 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "예방" 및 "억제"는 (i) 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염을 예방하는 것; 및 (ii) 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염이 질환으로 진행하지 못하도록 억제하는 것을 말한다. 또한 용어 "치료" 또는 "처치"는 그램 음성 세균에 의해 유발된 질환을 억제하고 병리학적 상태를 경감시키기 위한 모든 활동을 말한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 약제학적으로 허용가능한 담체는 제조 시 일반적으로 사용될 수 있으며, 이는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전술한 성분에 추가하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 활택제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비-경구로 투여될 수 있다. 비-경구 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국소 투여, 뿐만 아니라 감염 부위 상의 도포 또는 분사를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 기술분야에서 당업자에 의해 용이하게 구현될 수 있는 방법을 참조하면서 약제학적으로 허용가능한 담체/증량제를 사용하여 단위 부피, 또는 다중 부피 용기에 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 오일 또는 수성 매질 내 용액의 형태, 현탁액 또는 에멀전, 또는 추출물, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있으며, 추가적으로 분산제 또는 안정화제를 포함할 수도 있다.

또한, 전술한 약제학적 조성물을 도포하고, 분사하고, 투여하기 위한 적절한 용량은 제형화, 투여, 연령, 체중, 증상의 중증도, 식품, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도 및 반응의 감수성과 같은 요인에 따라 달라진다. 보통, 전문의 또는 수의사가 원하는 치료에 효과적인 용량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명의 실제적인 현재 바람직한 구현예는 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 설명된다.

그러나, 당업자라면 본 발명을 고려하여, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 변형 및 개선을 이룰 수 있는 것으로 이해할 것이다.

실시예 1: 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 제조

단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8은 동일한 제조 공정에 따라 제조할 수 있다.

단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8은 하기와 같이 제조하였다. 본 실시예에서, 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 발현 플라스미드를 포함하는 대장균 (Escherichia coli)을 생산 균주로서 사용하였다.

20 μL의 대장균 생산 균주를 카나마이신 (50 μg/mL)이 포함된 10 mL의 LB 배지 (트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 첨가한 이후에 37℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 다음 날, 밤샘 배양액을 카나마이신 (50 μg/mL)이 포함된 1 L의 LB 배지에 첨가하였다. 다음으로, 37℃에서 220 rpm의 교반으로 호기성 조건 하에서 배양하였다. 일단 600 nm에서의 흡광도를 기준으로 세포 농도가 0.6에 도달하면, L-아라비노스를 최종 농도 0.2%가 되게 첨가하여 항균성 단백질의 발현을 유도한 이후에 4시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 완료 시, 세포 배양액은 4℃에서 6,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 회수하였다. 회수한 세포 펠렛을 1 mM EDTA를 포함하는 20 mL의 PBS (pH 7.2)에 현탁하였다. 제조된 현탁액에 있는 세포는 초음파로 파쇄하였으며, 얼음 수조에 10초 켜기/10초 끄기 펄스를 10분 동안 교대로 주어 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 이후에, 파쇄액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 봉입체를 획득하였다. 획득된 봉입체를 1 mM EDTA를 포함하는 20 mL의 PBS (pH 7.2)에 재현탁한 다음 상기 파쇄 및 원심분리 단계를 2회 반복하였다.

획득된 봉입체는 순서대로 통상적인 가용화 및 투석에 의한 재접힘 과정을 실시한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 두 단계 크로마토그래피를 시행하였다.

간략하게, 정제 공정은 하기와 같이 시행하였다. 본 실시예에서, 제조된 봉입체는 가용화 완충액 (6 M 구아니딘 HCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2)에 용해시켰다. 봉입체 가용화 이후에, 용해된 봉입체는 재접힘 염기 완충액 (880 mM L-아르기닌, 55 mM Tris-HCl, 22 mM NaCl, 0.88 mM KCl, pH 8.2)을 사용하여 10배 희석시키고, 1% (v/v) 재접힘 첨가제 스톡 (100 mM EDTA, 200 mM GSH (환원된 글루타치온), 100 mM GSSG (산화된 글루타치온))을 첨가하였다. 봉입체 재접힘 이후에, 재접힘된 단백질 용액으로 투석 완충액 (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, pH 7.0)을 사용하여 염 제거를 위한 투석을 수행하였다. 다음으로 투석시킨 상청액을 회수하고, 5 mL의 HiTrapTM SP HP (GE 헬스케어사)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피 및 1 mL의 HiTrapTM 부틸 HP (GE 헬스케어사)를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 두 단계 크로마토그래피를 시행하였다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 컬럼을 시료 로딩 이전에 완충액 A (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, pH 7.0)로 미리 안정화시켜 주었다. 안정화 이후에, 시료 로딩을 수행하였다. 일단 시료가 컬럼에 로딩되면, 완충액 C (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 7.0, 10배 컬럼 부피)를 세척을 위해 5 mL/분의 유속으로 통과시켰다. 세척 이후에, 완충액 A부터 완충액 B (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.0, 20배 컬럼 부피)까지의 농도 구배가 10% 내지 100%로 변화하는 조건 하에서 크로마토그래피를 수행하였다. 이 공정에서 항균성 단백질을 포함하는 용출 분획을 획득하였다. 두 번째 소수성 상호작용 크로마토그래피에서, 이온 교환 크로마토그래피로부터 획득된 용출 분획을 로딩하기 이전에 컬럼을 완충액 A (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, 3 M NaCl, pH 7.0)로 미리 안정화시켰다. 일단 이온 교환 크로마토그래피로부터 획득된 용출 분획이 컬럼에 로딩되면, 완충액 A (10배 컬럼 부피)를 1 mL/분의 유속으로 통과시켜 세척하였다. 세척 이후에, 완충액 A부터 완충액 B (50 mM 소듐 포스페이트, 1 mM EDTA, pH 7.0, 30배 컬럼 부피)까지의 농도 구배가 0% 내지 100%로 변화하는 조건 하에서 크로마토그래피를 수행하였다. 이 공정에서 항균성 단백질을 포함하는 용출 분획을 획득하였다. 또한, 순도 90% 이상의 항균성 단백질을 이 공정을 통해 획득하였다. 도 1은 정제된 항균성 단백질의 전기영동 결과를 나타낸다.

실시예 2: 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 제조

본 실시예에서, 본 발명자들은 약학적 유효 성분으로서 실시예 1에서 제조된 단백질 AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-6, AP-7 및 AP-8을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하였다. 본 실시예에 제안된 조성물은 단지 하나의 적용가능한 조성물의 예시이고, 모두를 제시할 수는 없다.

상이한 유형의 완충액뿐만 아니라 약제학적 조성물에 적용가능한 다른 종류의 안정화제 및 첨가제를 사용하여 다수의 조성물을 제조하였고, 항균성 단백질 AP-6 (예시로서 사용됨)를 첨가하여 산업적으로 유용한 안정성을 제공할 수 있는 조성물을 탐색하였다. 본원에서는 완충액, 안정화제 및 첨가제를 선택할 시, 하기와 같은 성분들이 의약 물질에 대한 허용 판정기준을 준수하여 약제학적으로 허용되는지 여부 및 항균성 단백질 AP-6의 등전점을 우선적으로 고려하였다.

보다 구체적으로, 안정성 테스트에서 25,000 rpm에서 2시간 교반 및 40℃에서 16시간 가열을 포함하는 물리적 스트레스에 대한 저항성 정도를 2주 단기 보관 안정성에 더하여 조성물 간에 비교하였다. 안정성 평가는 흡광도 측정 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)의 분석으로 수행하였다. 결과적으로, 하기 표 1에 나타낸 조성물이 항균성 단백질 AP-6에 적절한 제형물로서 선택되었다.

다음으로, 나머지 항균성 단백질에도 개발된 제형물의 적합성을 흡광도 측정 및 고성능 HPLC 분석 방식으로 조사하였다. 그 결과로, 개발된 3가지 제형물이 나머지 항균성 단백질 (AP-1, AP-2, AP-3, AP-4, AP-5, AP-7 및 AP-8)에도 적합한 것으로 검증되었다.

최종 약제학적 조성물을 얻기 위하여, 실시예 1에서 획득된 항균성 단백질 시료의 완충액 교환을 표 1에 나타낸 조성물 1에 따른 완충액으로 수행한 다음 항균성 단백질의 최종 농도를 5 mg/mL로 조정하였다.

실시예 3: 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 항균 활성의 평가

실시예 2에서 제조된 약제학적 조성물 (5 mg/mL)을 사용하여, 본 발명자들은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루노기사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성의 평가에 사용된 세균 균주는 하기 표 2에 개략된 바와 같이 다양한 수집기관으로부터 획득하였다.

한편으로, 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 애루노기사 및 클렙시엘라 뉴모니애에 추가하여 다른 세균 종에 대한 항균 활성도 평가하기 위하여, 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 2가지 균주, 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)의 3가지 균주 및 스테필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 2가지 균주를 실험에 포함시켰다.

항균 활성 평가는 세포 용해 검정 (cell lysis assay)법을 사용하였다. 세포 용해 검정의 실험적 방법은 하기에 설명되어 있다. 세균은 대략 1× 10⁶ cfu/mL에 도달하도록 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 현탁시켰다. 다음으로, 0.1 mL의 실시예 2에서 제조된 약제학적 조성물의 희석된 용액 (항균성 단백질 농도: 25 μg/mL)을 현탁액 (0.9 mL)에 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 35℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 배양 이후에, 세포 계수 검정을 수행하였다.

이러한 실험적 결과에 따르면, 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질은 예상된 바와 같이 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 애루노기사 및 클렙시엘라 뉴모니애 세균에 대한 항균 활성만을 나타내었으며, 테스트된 다른 세균에는 항균 활성이 전혀 없었다. 이러한 결과로부터 본 발명의 단백질의 그램 음성 세균에 특이적인 항균 활성을 검증하였다. 아시네토박터 바우마니, 슈도모나스 애루노기사 및 클렙시엘라 뉴모니애 세균의 실험적 결과는 표 3에 나타낸다.

이들 결과는 본 발명의 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질이 그램 음성 세균을 용해시켜 궁극적으로 사멸에 이르게 할 수 있음을 증명한다. 이러한 항균 성질은 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염에서 그램 음성 세균을 사멸시키고 통상적인 항생제와 동일한 방식으로 이러한 감염을 치료하는데 적용가능한 점을 시사한다.

실시예 4: 항생제 저항성 균주에 대한 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 항균 활성의 평가

실시예 2에서 제조된 약제학적 조성물 (5 mg/mL)을 사용하여, 본 발명자들은 항생제 저항성 균주를 대상으로 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 항균 활성을 평가하였다.

그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질로서, AP-4 및 AP-6을 사용하고, 항생제 저항성 그램 음성 세균의 모델 균주로서 아시네토박터 바우마니 균주 (CCARM 12208)를 사용하였다.

항균성 단백질의 항균 활성은 통상적인 스폿 검정 (스폿-온-로운 검정) 방식으로 조사하였다. TSB 배양 배지에 밤새 배양된 50 μL의 세균 및 4 mL 탑 아가 (0.5% 아가를 포함한 TSB를 가열하여 녹인 다음 50℃로 냉각시킴)를 혼합하고, TSA 플레이트에 분배한다. 건조시킨 이후에, 각 20 μL의 항균성 단백질 용액 (0.5 mg/mL)을 각 플레이트 위에 점적하였다. 항균성 단백질을 포함하지 않는 완충액 (PBS)을 음성 대조군으로서 점적하였다. 점적 이후에, 배양은 37℃의 항온기에서 밤새 수행하였으며, 세균의 세균 용해 정도를 관찰하였다.

그 결과로, 항균성 단백질은 테스트된 항생제 저항성 그램 음성 세균에 대해 강한 항균 (세균 용해) 활성을 나타내었다. 스폿 검정의 실험적 결과는 도 2에 나타낸다.

이들 결과로부터, 항균성 단백질이 항생제 저항성 그램 음성 세균에 대응하여 탁월한 세균 용해 능력을 제공할 수 있고, 항생제 감수성 및 메로페넴 저항성 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음이 검증되었다.

실시예 5: 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 그램 음성 세균 관련 감염에 미치는 치료 효과의 평가

실시예 2에서 제조된 약제학적 조성물 (AP-6; 5 mg/mL)을 사용하여, 본 발명자들은 감염된 동물 모델에서 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질의 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염에 미치는 치료 효과를 평가하였다.

본 실시예에서는, 그램 음성 세균의 모델 병원균으로서 아시네토박터 바우마니 균주 (CCARM 12226)를 사용하였다. 대략 20 g의 체중을 갖는 각 5주령 ICR 마우스 [특이 병원체가 없는 (SPF) 등급]를 시험 동물로서 사용하였다. 총 20마리 마우스를 2가지 실험군 (각 실험군 당 10마리 마우스)으로 할당하였다. 다음으로 1× 10⁸ cfu의 세균을 각 마우스에게 정맥내 투여하여 (즉, 1× 10⁸ cfu/마우스) 감염을 유발시켰다. 하나의 실험군 (치료군)에게 실시예 2에서 제조된 약제학적 조성물 (AP-6; 5 mg/mL)을 세균 접종 이후 30분, 12시간 및 24시간의 시점에 투여하였다. 이 때 투여 용량은 25 mg/kg으로 설정하였다. 나머지 실험군 (대조군)에게는 제형물 완충액만을 투여하였으며, 여기서 각 동물에게 투여된 제형물 완충액의 부피는 치료군에게 투여된 약제학적 조성물의 평균 부피와 동등하였다. 약제학적 조성물의 투여와 동일하게, 제형물 완충액을 세균 접종 이후 30분, 12시간 및 24시간의 시점에 투여하였다. 세균 접종에 이어진 5일 동안 매일 사망 개체를 계수하고, 특이적 반응을 매일 2회 아침 및 오후에 관찰하였다.

상기와 같이 얻은 실험적 결과는 명백한 치료 효과를 증명하였다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 사망 개체 계수 결과는 본 발명의 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 투여가 생존율 개선에 확실한 효과가 있음을 뒷받침한다. 또한, 안검 주변의 부종 및 활동성 감소를 포함한 다양한 특이적 반응이 관찰되는 대조군과 비교하여, 치료군에서는 이러한 특이적 반응이 거의 관찰되지 않았다.

이들 결과는 본 발명의 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질이 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염의 치료에 효과적인 점을 나타낸다. 이러한 치료 효과는 그램 음성 세균에 특이적인 항균성 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염을 치료하는데 적용가능하고, 통상적인 항생제와 동일한 방식으로 그램 음성 세균에 의해 유발된 감염의 치료에도 사용될 수 있음을 시사한다.

당업자라면 전술한 상세한 설명에 개시된 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구현예를 변형하거나 설계하기 위한 근거로서 쉽게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 이러한 동등한 구현예가 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않음도 이해할 것이다.

당업자에게 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음은 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 단 첨부된 청구범위 및 이들의 동등물의 범주 내에 속하면 본 발명의 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다.

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acgaaaaagc gtaatagcgg cgataagtgg cggggctatt 60 gccatagcat ctgtgttaat cactggcccc ggtggtaacg atggtctgga aggtgtcaga 120 cacaaaccat acaaggacgt agttggtgtg ttgactgtgt gtcatggcca cgtcggaaaa 180 gacatcatgc tcggtaaaac gtataccgaa gcagaatgca aagccctcct gaataaagac 240 cttgccacgg tcgccagaca aattaacccg tacatcaaag tcaaaatacc ggaaacaacg 300 cgcggcgctc tttattcgtt cgtctataac gtgggcgcag gcaatttcag aacatcgacg 360 cttcttcgca aaatcaacca gggcgatatc aagggcgcat gtgaccagct acgtcgctgg 420 acatacgctg gcggtaagca atggaaaggg ctgatgactc gccgtgagat tgagcgtgaa 480 gtctgtttgt gggggcagca aggcggaggg ggctcgctga tggatctggc ggattaa 537 <210> 17 <211> 4602 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Expression plasmid for antibacterial protein AP-1 <400> 17 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120 aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180 attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata 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Claims (13)

1. 그램 음성 세균 관련 감염을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 항균성 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 항균성 단백질은 그램 음성 세균에 대한 항균 활성을 갖는, 약제학적 조성물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 항균성 단백질은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루노기사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 갖는, 약제학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 그램 음성 세균 관련 감염은 폐렴, 복막염, 요로 감염, 혈류 감염, 상처 또는 수술 부위 감염 및 수막염인, 약제학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 항균성 단백질은 0.01 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   L-히스티딘, 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 20 및 소비톨 또는 만니톨을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서,
   L-히스티딘은 0.1 mM 내지 50 mM의 농도를 갖고, 폴록사머 188는 0.01% 내지 10%의 농도를 갖고, 폴리소르베이트 20는 0.01% 내지 10%의 농도를 갖고, 소비톨은 0.1% 내지 20%의 농도를 갖고, 만니톨은 0.1% 내지 20%의 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서,
   L-히스티딘은 10 mM의 농도를 갖고, 폴록사머 188는 0.5%의 농도를 갖고, 폴리소르베이트 20는 0.1%의 농도를 갖고, 소비톨은 5%의 농도를 갖고, 만니톨은 5%의 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
9. 제 6항에 있어서,
   상기 약제학적 조성물은 pH 5.0 내지 pH 7.5의 값을 갖는, 약제학적 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 pH 6.5의 값을 갖는, 약제학적 조성물.
11. 제 1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 항생제, 소독제, 살균제 또는 치료용 약물로서 사용되는, 약제학적 조성물.
12. 항균성 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 항균성 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하고,
    서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24에 기재된 서열을 포함하는 플라스미드를 갖는 대장균 세포를 배양하는 단계;
    상기 항균성 단백질의 발현을 유도하는 단계;
    봉합체를 회수하는 단계;
    상기 봉합체를 용해시키는 단계;
    상기 항균성 단백질을 정제하는 단계; 및
    상기 항균성 단백질을 재접힘하는 단계
    를 포함하는, 방법.
13. 제 12항에 있어서,
    상기 항균성 단백질은 90% 내지 99.99%의 순도를 갖는, 방법.