RU2810116C1 - Вагинальный гель и метод его изготовления - Google Patents
Вагинальный гель и метод его изготовления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810116C1 RU2810116C1 RU2022127028A RU2022127028A RU2810116C1 RU 2810116 C1 RU2810116 C1 RU 2810116C1 RU 2022127028 A RU2022127028 A RU 2022127028A RU 2022127028 A RU2022127028 A RU 2022127028A RU 2810116 C1 RU2810116 C1 RU 2810116C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gel preparation
- vaginal gel
- nanoparticles
- montmorillonite
- therapeutic gene
- Prior art date
Links
- 229940044950 vaginal gel Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 239000000029 vaginal gel Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 73
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 53
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical class O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 229910052901 montmorillonite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims abstract 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 7
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 235000019262 disodium citrate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002526 disodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- 229940079896 disodium hydrogen citrate Drugs 0.000 claims description 3
- CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxymethyl)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O CEYULKASIQJZGP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 19
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000881705 Porcine endogenous retrovirus Species 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 11
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- KWLMIXQRALPRBC-UHFFFAOYSA-L hectorite Chemical compound [Li+].[OH-].[OH-].[Na+].[Mg+2].O1[Si]2([O-])O[Si]1([O-])O[Si]([O-])(O1)O[Si]1([O-])O2 KWLMIXQRALPRBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 229910000271 hectorite Inorganic materials 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241001492360 Retroviral provirus Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 5
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 5
- JHWGFJBTMHEZME-UHFFFAOYSA-N 4-prop-2-enoyloxybutyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCCCCOC(=O)C=C JHWGFJBTMHEZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 229920000591 gum Polymers 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- RGUABPVONIGVAT-UHFFFAOYSA-N 3-(4-methylpiperazin-1-yl)propan-1-amine Chemical compound CN1CCN(CCCN)CC1 RGUABPVONIGVAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 2
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 2
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000004208 shellac Substances 0.000 description 2
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 description 2
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 description 2
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical compound COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000007313 Reproductive Tract Infections Diseases 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 125000000746 allylic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 1
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001465 metallisation Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009438 off-target cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 229940044953 vaginal ring Drugs 0.000 description 1
- 239000006213 vaginal ring Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к вагинальному гелевому препарату для доставки терапевтического гена во влагалище, содержащему носитель и указанный терапевтический ген, где носитель включает катионный полимер, при этом указанный вагинальный гелевый препарат отличается тем, что также содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, полученный путем модификации монтмориллонита производными целлюлозы, также относится к вагинальному гелевому препарату для доставки терапевтического гена во влагалище, причем препарат содержит матрицу и наночастицы, причем наночастицы содержат катионный полимер и указанный терапевтический ген, при этом вагинальный гелевый препарат отличается тем, что матрица содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, полученный путем модификации монтмориллонита производными целлюлозы, катионный полимер представляет собой поли (β-аминоэфир) со структурной общей формулой
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области генной терапии и, в частности, представляет собой описание вагинального геля и метода его изготовления.
Уровень техники
Геномное редактирование показало впечатляющие результаты в области лечения наследственных заболеваний. Однако одним из ключевых факторов успеха генной терапии является средство доставки генов в генной инженерии. Благодаря своему нанометрическому размеру, низкой токсичности, длительному циклу и достаточно хорошей гибкости полимерные наночастицы (NP) продемонстрировали свою высокую эффективность передачи в генной терапии.
В зависимости от конкретных терапевтических целей и фармакодинамики генная терапия может проводиться системно или локально. Некоторые особенности влагалища способствуют передаче таких оказывающих лечебное действие молекул, как ДНК, РНК и белки. Благодаря достаточному кровоснабжению влагалища, его большой площади контакта и оптимальной проницаемости для некоторых видов веществ возможен как системный, так и локальный прием препарата. Эти особенности также позволяют избежать эффекта первого прохождения через печень и контакта с жидкостью желудочно-кишечного тракта, возникающих при пероральном приеме. Кроме того, лечение некоторых локальных заболеваний, таких как вирус папилломы человека (HPV), вызванный инфекцией, и даже рак шейки матки, возможно путем локального введения препарата во влагалище. По сравнению с системным введением при лечении инфекций половых путей введение препарата во влагалище имеет особые преимущества. Например, при локальном использовании инструментов геномного редактирования для лечения вируса папилломы человека можно усилить эффект лечения и в значительной степени снизить риск возникновения побочных действий, вызванных нецелевым использованием. Однако прежде чем данная технология станет применяться в клинической медицине, необходимо преодолеть все еще существующие серьезные препятствия. Основной трудностью для разработки препаратов генной терапии влагалища является подверженность чужеродного генетического материала локальному микробиологическому разложению, из-за чего снижается его эффективность при прохождении через влагалище и слизистую шейки матки. Поэтому при разработке системы передачи генов во влагалище необходимо сначала решить важную проблему - защита генов от разложения и повышение их проникающей способности в слизистой. Кроме того, чтобы препарат не вытекал из открытых половых путей, он должен изготавливаться в форме суппозитория, геля, таблеток или влагалищного кольца, что позволит ему оставаться в половых путях и сделает возможным длительный период высвобождения. Однако возможность сохранения структуры наночастиц доставки генов в этих препаратах представляет серьезную сложность. Слизистая влагалища и шейки матки имеет сложный состав. Если наночастицы в препарате не могут сохранить стабильность своей структуры (например, распадаясь на катионные полимеры и гены), то после высвобождения они подвергаются воздействию белков/ферментов, бактериального секрета и минеральных солей и не могут больше самостоятельно образовывать структуру наночастиц - ген-катионный полимер с высоким коэффициентом трансфекции, - и тем самым влияют на генную трансфекцию и последующий терапевтический эффект. Ввиду этого разработка препарата со структурной устойчивостью наночастиц является важным звеном системы доставки генов во влагалище.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление вагинального геля, соответствующего требованиям вагинального приема и способного эффективно передавать чужеродные гены, а также способа его изготовления.
Для достижения упомянутой цели настоящим изобретением предлагается следующее техническое решение:
Один аспект настоящего изобретения предлагает вагинальный гель, включая носитель и терапевтические гены. Упомянутый гель также содержит монтмориллонит, модифицированный с помощью гидрофильного полимерного материала. Упомянутый носитель содержит катионный полимер.
Предпочтительно, чтобы упомянутый монтмориллонит, модифицированный с помощью гидрофильного полимерного материала, получали из монтмориллонита, модифицированного с применением одного или нескольких видов модифицирующих добавок, в том числе хитозана, хитоолигосахаридов, производных целлюлозы, производных крахмала, желатина, шеллака, трагантовой камеди, аравийской камеди, пектина, ксантовой камеди, поливидона, поливинилового спирта, полиоксиэтилена.
Более предпочтительно, чтобы массовое отношение упомянутых гидрофильных материалов и упомянутого монтмориллонита в упомянутом монтмориллоните, модифицированном гидрофильным полимерным материалом, составляло 0,1-1:1, при этом оптимальный вариант - 0,1-5:1.
В качестве немодифицированного монтмориллонита, используемого в настоящем изобретении как сырье, применяется натуральный монтмориллонит, содержащий 16,54% Al2O3, 4,65% MgO, 50,95% SiO2. Он имеет структуру (Al, Mg)2 (SiO10) (OH)2·n H2O, которая представлена моноклинной сингонией.
Предпочтительно, чтобы упомянутый монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, также содержал натриевую соль.
Более предпочтительно, чтобы упомянутая натриевая соль была представлена одним или несколькими видами, в том числе гидрокарбонатом натрия, гидрофосфатом натрия, динатрием гидроцитрата, ацетатом натрия.
Более предпочтительно, чтобы массовое отношение упомянутой натриевой соли и упомянутого монтмориллонита составляло 0,001-0,05:1, оптимальный вариант - 0,005-0,05:1.
Предпочтительно, чтобы массовое отношение катионного полимера и упомянутого монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом, составляло 1:1-1000, более предпочтительно - 1:1-100, а еще лучше - 1:1-40.
Предпочтительно, чтобы метод изготовления вагинального геля включал в себя приготовление наночастиц с использованием упомянутого носителя и терапевтических генов, а также упомянутых наночастиц, упомянутого монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом, и этап смешивания с водой.
Более предпочтительно, чтобы массовое отношение носителя и терапевтических генов в наночастицах составляло 10-150:1, а лучше 10-100:1, а еще лучше - 10-80:1.
Более предпочтительно, чтобы наночастицы имели размер в пределах 10-1000 нм, а лучше - 200-400 нм.
Еще более предпочтительно, чтобы поверхность всех наночастиц была заряжена.
Предпочтительно, чтобы упомянутый катионный полимер был представлен одним или несколькими видами поли-бета-аминоэфира (PBAE), полилизина (PLL), полиэтиленамина (PEI), полиамид-амина (PAMAM).
Более предпочтительно, чтобы упомянутый поли-бета-аминоэфир получали из мономера 1, 4-бутандиол диакрилата, мономера 5-амино-1-амилового спирта и мономера 1-(3-аминопропил)-4-метилпепиразина.
Еще более предпочтительно, чтобы упомянутый поли-бета-аминоэфир имел следующую общую формулу структуры: , где m - это число от 5 до 200. Оптимальный выбор числа в диапазоне до 15 до 30.
Еще более предпочтительно, чтобы среднечисленная молекулярная масса упомянутого поли-бета-аминоэфира составляла от 1500 до 60000, оптимальный вариант - от 5000 до 8000.
Еще более предпочтительно, чтобы упомянутый поли-бета-аминоэфир был получен следующим способом: сначала проводят реакцию между 1, 4-бутандиол диакрилатом и 5-амино-1-амиловым спиртом при температуре 80-100°C в течение 30-40 часов. После завершающей обработки получают промежуточный продукт, который подвергается в течение 20-30 часов реакции с 1-(3-аминопропил)-4-метилпиперазином при температуре от 10°C до 40°C. После завершающей обработки получают упомянутый поли-бета-аминоэфир.
Еще более предпочтительно, чтобы молярное соотношение загружаемого сырья - 1, 4-бутандиол диакрилата и упомянутого 5-амино-1-амилового спирта составляло 1:0,8-1,2. Молярное соотношение загружаемых промежуточного продукта и упомянутого 1-(3-аминопропил)-4-метилпиперазина составляет 1:4-6.
Предпочтительно, чтобы упомянутые терапевтические гены были представлены одним или несколькими видами плазмид, ДНК и РНК.
Еще более предпочтительно, чтобы терапевтический ген представлял из себя плазмиду, состоящую из ДНК и SpCas9, транскрибированную в sgRNA и нацеленную на ген PERV-Pol.
Еще более предпочтительно, чтобы упомянутая последовательность ДНК, транскрибированная в sgRNA, обозначалась как SEQ ID №1 и/или SEQ ID №2.
Еще более предпочтительно, чтобы упомянутая SpCas9 была представлена как SpCas9-HF1 и/или eSpCas9.
В соответствии с конкретным и предпочтительным практическим методом упомянутый терапевтический ген представлен SpCas9-sgRNA-1 и/или SpCas9-sgRNA-3, в том числе упомянутая последовательность SpCas9-sgRNA-1 представлена как SEQ ID №3, а упомянутая последовательность SpCas9-sgRNA-1 представлена как SEQ ID №4.
Предпочтительно, чтобы уровень рН упомянутого вагинального геля составлял от 4 до 8, еще лучше - от 4,5 до 5,5.
В настоящем изобретении упомянутый вагинальный гель содержит наночастицы.
В настоящем изобретении вагинальный гель также содержит кислотный буферный раствор. Упомянутый кислотный буферный раствор представлен одним или несколькими видами буферного раствора лимонной кислоты, ацетатного буферного раствора и фосфатного буферного раствора.
Более предпочтительно, чтобы уровень рН кислотного буферного раствора составлял от 4 до 6.
В настоящем изобретении концентрация и количество упомянутого кислотного буферного раствора, а также количество воды регулируются в зависимости от необходимой степени вязкости геля.
Второй аспект настоящего изобретения предлагает вагинальный гель, включая матрицу и наночастицы. Упомянутая матрица также содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом. Упомянутые наночастицы содержат катионный полимер и терапевтический ген.
Монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, катионный полимер и терапевтический ген в настоящем решении аналогичны сырью вагинального геля, представленному в первом аспекте настоящего изобретения, и поэтому здесь подробно не описаны.
В соответствии с конкретным и предпочтительным практическим методом упомянутый монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, получают из монтмориллонита, модифицированного с применением одного или нескольких видов модифицирующих добавок, в том числе хитозана, хитоолигосахаридов, производных хитозана, производных целлюлозы, производных крахмала, желатина, шеллака, трагантовой камеди, аравийской камеди, пектина, ксантовой камеди, поливидона, поливинилового спирта, полиоксиэтилена. Упомянутый катионный полимер представлен поли-бета-аминоэфиром, его общая структурная формула: где m - это число от 5 до 200. Упомянутый терапевтический ген - это плазмида, образованная из SpCas9-HF1 и/или eSpCas9 и транскрибированная в sgRNA-1 ДНК и/или в sgRNA-3 ДНК. При этом последовательность ДНК, транскрибированной в sgRNA-1, представлена как TTCGAATGGAGAGATCCAGG; а последовательность ДНК, транскрибированной в sgRNA-3, представлена как GGTGACCCTCCTCCAGTACG.
Третий аспект настоящего изобретения предлагает метод изготовления упомянутого вагинального геля, который включает в себя следующие этапы:
упомянутый носитель и терапевтический ген в кислотном буферном растворе формируют наночастицы, в результате чего получается смесь, содержащая наночастицы;
упомянутую смесь, содержащую наночастицы, и упомянутый монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, непосредственно перемешивают для получения упомянутого вагинального геля; или монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, диспергируют в воде и/или в кислотном буферном растворе, после чего снова смешивают с упомянутой смесью, содержащей наночастицы.
Предпочтительно, чтобы упомянутый метод изготовления также включал в себя этапы приготовления монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом: монтмориллонит и гидрофильный полимерный материал добавляют в воду. Избирательно добавляют натриевую соль, перемешивают, после чего регулируют рН в диапазоне от 4 до 6, перемешивают и оставляют, после чего желатинообразную жидкость верхнего слоя высушивают и измельчают для получения упомянутого монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом.
Более предпочтительно, чтобы температура упомянутой смеси составляла от 50°C до 90°C, а время - от 1 до 10 часов.
Более предпочтительно, чтобы после регулирования рН смесь перемешивали в течение 0,5-2 часов при постоянной температуре от 50°C до 90°C. После охлаждения добавляют воду, равномерно перемешивают и оставляют в спокойном состоянии.
Более предпочтительно, чтобы для получения упомянутого уровня рН использовалась кислота. В качестве упомянутой кислоты выбирают один или несколько видов фосфорной кислоты, лимонной кислоты и уксусной кислоты.
В соответствии с конкретным оптимальным практическим методом упомянутый монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, готовят следующим способом: упомянутый монтмориллонит и упомянутую натриевую соль добавляют в воду. После перемешивания добавляют упомянутый гидрофильный полимерный материал, продолжают перемешивать. При перемешивании в условиях герметичности поднимают температуру до 50°C-90°C, поддерживая ее в течение 1-10 часов. С помощью кислоты регулируют уровень рН в диапазоне от 4 до 6. Перемешивают при постоянной температуре в течение 0,5-2 часов и охлаждают до уровня комнатной температуры. Добавляют воду и равномерно перемешивают. Оставляют в спокойном состоянии на 30-60 минут, после чего желатинообразную жидкость верхнего слоя высушивают и измельчают для получения упомянутого монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом.
Предпочтительно, чтобы конкретный метод выполнения шага (3) заключался в следующем: вышеупомянутый монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, смешивают с водой, затем добавляют кислотный буферный раствор, после чего добавляют упомянутые наночастицы и равномерно перемешивают.
Четвертый аспект настоящего изобретения предлагает метод доставки терапевтического гена во влагалище. Прежде всего из терапевтического гена и носителя формируют наночастицы, затем упомянутые наночастицы смешивают с монтмориллонитом, модифицированным гидрофильным полимерным материалом, для получения геля. Полученный гель вводят во влагалище.
Пятый аспект настоящего изобретения предлагает способ введения препарата. Для упомянутого вагинального геля используют локальный метод введения во влагалище.
Шестой аспект настоящего изобретения предлагает применение упомянутого вагинального геля в генной терапии заболеваний влагалища/шейки матки.
В частности, упомянутые заболевания включают в себя патологии шейки матки, связанные с инфекцией ВПЧ, рак шейки матки или вирус простого герпеса (HSV).
Вагинальный гель, описанный в настоящем изобретении, необходимо хранить только при температуре около 18°C-25°C, к тому же он может применяться самостоятельно, что обеспечивает удобство для пациента и врача.
Благодаря применению вышеописанного технического решения, настоящее изобретение имеет следующие преимущества по сравнению с существующей технологией:
Вагинальный гель, предложенный настоящим изобретением, имеет структуру, состоящую из наночастиц с высокой стабильностью, отличается высоким коэффициентом трансфекции, обладает хорошим терапевтическим эффектом и высоким уровнем безопасности, может применяться локально во влагалище.
Вагинальный гель, представленный в настоящем изобретении, характеризуется простотой изготовления с гибким составом реактивов.
Описание приложений
Фиг. 1 - признаки полимера PBAE и NP полимера PBAE-плазмиды;
фиг. 2 - изображения матрицы или геля, полученные растровым электронным микроскопом;
фиг. 3 - результат высвобождения NP из геля NPs-mMMT;
фиг. 4 - визуализация на мышах;
фиг. 5 - сопоставление результатов эффективности трансфекции при приготовлении геля с использованием разных катионовых полимеров;
фиг. 6 - сопоставление результатов эффективности трансфекции геля, приготовленного с использованием mMMT и HTT;
фиг. 7 - доля положительной реакции клеток GFP+ во влагалищном мазке;
фиг. 8 - экспериментальный результат реализации примера 4;
фиг. 9 - экспериментальный результат реализации примера 5;
фиг. 10 - результат иммунохимического исследования цитокинов воспаления IFN-γ и TNF-α.
Конкретные методы реализации
Ниже приводится дальнейшее описание настоящего изобретения с учетом примеров реализации, изображенных на прилагаемых фигурах. Настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами реализации. Практические условия, используемые в примерах реализации, могут корректироваться дополнительно в зависимости от различных требований конкретного применения. Неуказанные условия реализации относятся к стандартным условиям для данной отрасли.
В следующих примерах реализации используется следующее основное сырье:
1,4-бутандиол диакрилат (BDD) и 5-амино-1-амиловый спирт (АР), закупаются у компании TCI (Китай, г. Шанхай).
1-(3-аминопропил)-4-метилпепиразин (АМР), закупается у компании Alfa Aesar (L04876, США).
Полиэтиленамин 25kD (PEI 25kD) (кат. 28968), закупается у компании Polyscience (400 Valley Road, Warrington).
Полилизин, закупается у компании Aladdin Reagents.
PAMAM, закупается у компании Shandong Weihai Chenyuan.
pMAX-GFP(CAS №8603168), закупается у компании Bio Vector NTCC (Китай, г. Пекин).
Плазмиды с кодировкой Cas9 и sgRNA (плазмиды CRISPR/Cas9), закупаются у компании Addgene (#58778).
В соответствии с методом, предложенным Mali и др. (Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121):823-6), разработано 3 sgRNA, направленных/нацеленных на ген PERV-pol (учетный номер AJ279056.1), синтезированных компанией GENEWIZ (Китай, пров. Цзянсу). Конкретная последовательность маркеров двухцепочечного олигонуклеотида (Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature biotechnology. 2015;33(2):187-97): в прямом направлении 5' G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T 3'; в обратном направлении 5' A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C 3' (знак «*» означает фосфорилирование). Метод создания «маркера олигонуклеотида»: два олигонуклеотида растворяют в буферном растворе STE (10 ммоль Tris pH 8,0, 50 ммоль NaCl, 1 ммоль EDTA), получают эквимолярную смесь с концентрацией 2 OD/100 мкл, инкубируют при температуре 94°C в течение 5 минут, после чего охлаждают до комнатной температуры. Используемые в настоящем изобретении sgRNA см. в таблице 1.
Пример реализации 1. Приготовление геля
I. Синтез полимера PBAE
Из BDD, AP и AMP получают полимер PBAE следующим способом: сначала смешивают в молярном отношении 1:1 BDD (стабилизируется с помощью парагидроксибензол-метилового эфира) и АР. В течение 36 часов перемешивают магнитной мешалкой при температуре 90°C в азотной среде N2. После проведения вышеописанной реакции разбавляют диметилформамидом (ДМФ). Осаждения промывают холодным серным эфиром. После вакуумной сушки и удаления серного эфира промежуточный продукт (i-PBAE) высушивают при комнатной температуре. Затем i-PBAE растворяют в безводном растворе ДМФ. Затем он, перемешиваясь, при комнатной температуре в течение 24 часов подвергается реакции с АМР с пятикратной молярной массой. После этого продукт реакции осаждается в холодном безводном диэтиловом эфире. Наконец, финальный полимер (PBAE) промывают три раза диэтиловым эфиром, высушивают в вакууме в течение 48 часов и хранят при комнатной температуре.
Уравнение синтеза полимера PBAE см. на фиг. 1А.
Структура i-PBAE и PBAE характеризуется с помощью спектра 1H-NMR (спектрометр Bruker AVANCE III 400 МГц ЯМР, растворитель CDCl3), спектрограмма показана на фиг. 1В. Пик с величиной химического сдвига 4,062 ч/млн принадлежит пику водородного сигнала -COOCH2- на элементе BDD PABE и i-PABE. Область 1,32-1,53 ч/млн - это пик водородного сигнала метилен-CH2 на АР, а пики 2,42, 2,65 и 2,85 относятся к водородному сигналу -N (CH2)2-, -NCH2CH2OCO и -NCH2CH2OCO-. Область 5,80-6,40 ч/млн спектра i-PABE - это пик водородного сигнала концевой аллильной группы. Он не обнаруживается в спектре синтезированного PABE, что говорит об успешной реакции между двойной связью С-С и АМР.
Среднечисленная молекулярная масса (Mn) PBAE, полученного в ходе настоящего примера реализации, составляла 6980 Da. Проведены измерения методом гелевой осмотической хроматографии (GPC, система Waters-2410) и с применением детектора преломляемости Waters 2414 (подвижная фаза: ДМФ, стандартный раствор: узкохроматический полистирол). Образец растворили в диметилформамиде (ДМФ) с массовой концентрацией 0,3%. Результат измерений см. на фиг. 1С.
С помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR, PerkinElmer Spectrum Two, 32 раза повторяли настройки сканирования) характеризовали структуру i-PBAE и PBAE, спектрограмму см. на фиг. 1D. Пик 1730 см-1 происходит из жирного эфира -CH2-COO-CH2- на цепи BDD i-PABE и PBAE. Кроме того, пик шириной 3200-3500 см-1 свидетельствует о том, что на главной цепи существует -ОН, а отдельные пики 1639 и 1620 см-1 i-PBAE - это пики валентных колебаний водорода с двойной цепью С-С, который в спектре PBAE также исчезает. Вышеописанный результат совпадает с результатом 1H-NMR, что говорит об успешном синтезе PBAE.
II. Получение и характеристика полимерных NP PBAE-плазмиды
Для получения полимерных NP PBAE-плазмиды PBAE растворяют в буферном растворе лимонной кислоты со значением рН на уровне 5,0, после чего растворяют с помощью ультразвуковых волн и получают полимерный раствор (концентрация 20 мг/мл). Полимерный раствор смешивают с плазмидой в весовом отношении PBAE и плазмиды 75:1, подвергают вихревым колебаниям, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и получают полимерные NP PBAE-плазмиды.
Для характеризации полимерных NP PBAE-плазмиды используют динамическое рассеяние света (DLS, Zetaplus, Brookhaven, США) и трансмиссионный электронный микроскоп (Hitachi HT7700, Япония). Результаты измерений см. на фиг. 1E и 1F. Результаты измерений с помощью растрового электронного микроскопа (ТЕМ) см. на фиг. 1G.
В ходе исследований было обнаружено, что оптимальное соотношение PBAE и pDNA составляет 75:1. В этот момент, как показано на фиг. 1Е и 1F, средний диаметр составляет 317,1±5,3 нм, PDI равно 0,267 (фиг. 1Е), поверхностный заряд составляет 34,9 ± 6,5 мВ (фиг. 1F).
Материал носителя PBAE и pDNA сжимается за счет электростатического взаимодействия, поэтому NP также сжимаются и несут концентрированный заряд. С помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ) наблюдали форму сложных NP, как показано на фиг. 1G. На электронных микрофотографиях показано, что сложные NP, образованные PBAE, являются частицами сферической формы с распределением по размерам около 240 нм. Они обладают исключительной рассеивающей способностью, которая меньше, чем результат испытания DLS. Это явление вызвано дегидратацией и усадкой полимерных частиц NP.
Что касается полимерных частиц NP PEI-плазмид, полимерных NP полилизин-плазмид, полимерных NP PAMAM-плазмид и др., то необходимо использовать PEI, полилизин и PAMAM для замещения смеси PBAE и плазмид, при этом плазмида ДНК и линейный полиэтиленимин 25 kda смешиваются в массовом отношении 10:1, а отношение массы остальных катионных полимеров и плазмид по-прежнему составляет 75:1.
III. Приготовление вагинального геля
Приготовление геля NP-HTT: 66,65 мг гекторита (НТТ) смешивают с 1 мл воды в магнитной мешалке на скорости 1000-1500 об/мин. После диспергирования в течение 20-30 минут добавляют 0,11 мл буферного раствора лимонной кислоты × 10 раз (лимонная кислота: 1 моль/л, цитрат натрия: 1 моль/л, значение рН: 4,7). Добавляют 1 мл полимерных частиц NP PBAE-плазмиды (содержание плазмиды ДНК 250 мкг и маркера олигонуклеотида 100 мкг) и равномерно смешивают. Значение рН данного геля составляет 5,0.
Приготовление геля NP-mMMT:
1. Приготовление модифицированного монтмориллонита mMMT
100 мг натурального медицинского монтмориллонита смешивают с 1 мг гидроцитрата динатрия и 20 мг воды и равномерно перемешивают. Добавляют 10 мг метилцеллюлозной модифицирующей добавки, продолжая перемешивать. При перемешивании в условиях герметичности медленно повышают температуру до 70°C и поддерживают ее в течение 5 часов. Лимонной кислотой регулируют значение рН до 5, перемешивают в течение 1 часа при постоянной температуре и охлаждают до комнатной температуры, добавляют 250 мг воды и равномерно перемешивают, после чего оставляют в неподвижном состоянии на 40 минут, затем извлекают гелеобразную жидкость верхнего слоя, высушивают и измельчают для получения mMMT.
2. Приготовление геля NP-mMMT
В магнитной мешалке перемешивают 60 мг mMMT с 1 мл воды на скорости 1000-1500 об/мин, диспергируют в течение 20-30 минут. Добавляют 0,11 мл буферного раствора лимонной кислоты × 10 раз (лимонная кислота: 1 моль/л, цитрат натрия: 1 моль/л, значение рН: 4,7). Добавляют 1 мл полимерных частиц NP PBAE-плазмиды (содержание плазмиды ДНК 250 мкг и маркера олигонуклеотида 100 мкг), равномерно смешивают. Значение рН данного геля составляет 5,0.
Приготовление геля NPs-F127: этот способ приготовления геля аналогичен двум вышеописанным способам. Отличие заключается в использовании вместо НТТ или mMMT термочувствительного геля Pluronic F127. Значение рН равно 5,0.
Для остальных гелей с содержанием катионных полимеров требуется только применение соответствующих сложных наночастиц полимер-плазмида вместо сложных наночастиц PBAE-плазмиды. Например, используют сложные наночастицы PEI-плазмиды, сложные наночастицы полилизина-плазмиды, сложные наночастицы PAMAM-плазмиды вместо сложных наночастиц PBAE-плазмиды, которые далее по тексту именуются NP или сложные наночастицы.
С помощью растрового электронного микроскопа (SEM, Hitachi SU8010, Япония) при 2 кВ проводили наблюдения за сложными наночастицами PBAE-плазмиды (т.е. сложными наночастицами на фиг. 2), матрицей геля из модифицированного монтмориллоинта (т.е. матрицей, полученной при изготовлении вышеописанного геля NP-mMMT без добавления 1 мл полимерных NP PBAE-плазмид), гелем NP-mMMT (т.е. гелем из сложных наночастиц-модифицированного монтмориллоинта на фиг. 2), матрицей гекторитового геля (т.е. матрицей, полученной при изготовлении вышеописанного геля NP-HTT без добавления 1 мл полимерных NP PBAE-плазмид), гелем NP-HTT (т.е. гелем из сложных наночастиц-гекторита на фиг. 2), матрицей геля F127 (т.е. матрицей, полученной при изготовлении вышеописанного геля NP-F127, без добавления 1 мл полимерных NP PBAE-плазмид), а также гелем NP-F127 (т.е. композитными наночастицами-матрицей геля F127 на фиг. 2), результаты измерений см. на фиг. 2. Перед испытанием образец наносили на кремниевую пластину, а затем производили напыление металлом. Для наблюдения за стабильностью состава гель выдерживали при комнатной температуре в течение 3 дней, а затем исследовали с помощью SEM.
Гель NP-mMMT разбавляли 4-кратными объемами буферного раствора лимонной кислоты и фильтровали через фильтр 0,45 мкм для определения высвобождения NP из геля. Раствор анализировали с помощью DLS для измерения диаметра высвобождения NP из геля. После хранения в течение разных периодов времени (1 день и 3 дня) при комнатной температуре размер NP измеряли тем же методом, результаты измерений см. на фиг. 3.
На фиг. 2 и 3 видно, что NP в геле mMMТ не изменились, что позволило сохранить стабильность структуры NP, а также они могли быть непосредственны высвобождены в виде наночастиц из матрицы геля после разбавления и обладали хорошей стабильностью при хранении: высвобожденные наночастицы не изменились по диаметру после трех дней хранения при комнатной температуре. Однако в геле HTT и в термочувствительном геле Pluronic F127 на NP сильно влияла матрица, и было невозможно сохранить структуру наночастиц.
Пример реализации 2. Испытания in vivo на мышах
Была проведена оценка удерживающей способности геля NP-mMMT во влагалище на модели куньминских мышей с помощью методов визуализации in vivo. Флуоресцентный краситель Ce-6 смешивали со сложными наночастицами в массовом соотношении 1% от общей массы сложных наночастиц для получения NP, маркированных Ce-6, а затем готовили гель из сложных наночастиц PBAE-плазмида, маркированных Ce-6, по схеме примера реализации 1 (гель NP-mMMT). Затем во влагалище мышей вводили гели со свободным флуоресцентным красителем Ce-6 и гелем из сложных частиц PBAE-плазмид, маркированным Ce-6. Результаты испытаний см. на фиг. 4. Сигнал свободного флуоресцентного красителя (Ce-6) исчез в течение одного дня. Для геля mMMT можно наблюдать сильную флуоресценцию на 3-й день. Эти результаты показывают, что гель mMMT обладает хорошей удерживающей способностью во влагалище, и время действия генного препарата во влагалище можно увеличить.
Пример реализации 3. Испытания in vivo на свиньях
(I) Сравнение эффекта трансфекции разных катионных полимеров
Для оценки эффективности трансфекции вагинального геля в процессе приготовления сложных наночастиц PBAE-плазмиды, сложных наночастиц PEI-плазмиды и сложных наночастиц PAMAM-плазмиды, описанных в примере реализации 1, в соответствии с методом в примере реализации 2 при приготовлении сложных наночастиц упомянутые плазмиды (репортерный ген) представляли собой зеленые флуоресцентные белковые плазмиды (GFP).
В качестве объекта испытаний были выбраны крупные млекопитающие - свиньи, - потому что геном свиней очень близок к человеческому. Были выбраны обычные домашние свиньи в возрасте одного месяца.
Каждой свинье вводили один из видов сложных наночастиц PBAE-плазмиды, маркированных GFP, сложных наночастиц PEI-плазмиды и сложных наночастиц PAMAM-плазмиды. Объем введения составлял 2 мл. Вагинальный гель равномерно распределялся по поверхности влагалища, шейки матки и заднего свода влагалища свиней. Введение проводили на 1-й и 4-й дни, после чего на 7-й день собирали клетки шейки матки с помощью щетки (аналогично мазку Папаниколау). Полученные клетки шейки матки сохранили в консервационном растворе шейки матки и собирали их путем центрифугирования при 715 g в течение 5 минут. Затем ресуспендированные клетки PBS такого же объема окрасили DAPI, непосредственно после чего провели анализ, с помощью цитометра в определенном объеме выполнили подсчет количества клеток, что позволило вычислить общее количество собранных клеток. Для каждой группы взяли около 2,5 × 104 клеток для проведения испытания с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, а затем определили эффект трансфекции каждой группы с помощью флуоресцентной микроскопии (Leica DMI8) и проточной цитометрии (C6, BD, США), результаты испытаний см. на фиг. 5. Клетки в чистой контрольной группе были почти без зеленой флуоресценции, GFP-mMMT без катионного полимера почти не имели экспрессии GFP, в то время как группы GFP-PBAE mMMT, GFP-PEI mMMT и GFP-PAMAM mMMT демонстрировали очевидную экспрессию GFP, которая составляла 57,0%, 41,5% и 24,9% соответственно. Очевидно, что при использовании mMMT + катионный материал PBAE для изготовления вагинального геля можно получить более высокую долю GFP-позитивных клеток, тем самым реализуя эффективную доставку генов внутри влагалища.
(II) Сравнение эффекта трансфекции mMMT и HTT
В процессе приготовления полимерных NP PBAE-плазмиды из примера реализации 1 зеленый флуоресцентный белок (GFP) в соответствии с методом из примера реализации 2 смешивали со сложными наночастицами в массовом соотношении 1% от общей массы сложных наночастиц, затем в соответствии со схемой примера реализации 1 с помощью отдельных mMMT и HTT в качестве матрицы были приготовлены PBAE-GFP NP-mMMT и PBAE-GFP NP-HTT.
Приготовление GFP-HTT и GFP-mMMT было по существу таким же, как приготовление PBAE-GFP NP-mMMT и PBAE-GFP NPs-HTT, описанное выше, разница заключалась в том, что PBAE был опущен.
Затем эффективность трансфекции определялась тем же способом, что и в первой части этого примера реализации, результаты испытаний см. на фиг. 6.
Шейку матки и половые органы (яичник, уретру, влагалище и матку) промыли с использованием PBS, чтобы удалить прилипший жир или любую другую ткань, затем зафиксировали в 4% параформальдегиде и разрезали на лоскуты толщиной 3-5 мкм. Их использовали для окрашивания H&E и IHC. Результаты испытаний см. на фиг. 7. Этот процесс одновременно повторили для трех групп и подсчитали долю клеток GFP+ в вагинальном мазке. Результат в чистой контрольной группе составил 0,30% ± 0,05%; в группе GFP-HTT - 1,41% ± 0,28%; в группе GFP-mMMT - 1,80% ± 0,24%; в группе PBAE-GFP NP-HTT - 25,79% ± 1,56%; в группе PBAE-GFP NP-mMMT - 51,12% ± 1,23% соответственно.
Очевидно, что полученная доля GFP-положительных клеток была гораздо больше в случаях, когда для приготовления вагинального геля использовался материал mMMT (значение pН < 0,0001). Вместе с тем, доставка без PBAE показала низкую эффективность трансфекции; это говорит о том, что катионный полимер PBAE необходим в качестве носителя для доставки генов. Обобщая все вышеизложенное, данные свидетельствуют о том, что для доставки ДНК внутри влагалища гель PBAE-GFP NP-mMMT более эффективен, чем гель PBAE-GFP NP-HTT.
Пример реализации 4. Удаление вагинальных вирусов с помощью гелевой системы
Эндогенные ретровирусы свиней (PERV) интегрируются в геном всех свиней и высвобождаются в виде инфекционных частиц. При определенных условиях они могут инфицировать клетки человека и имеют сходство с вирусами, передающимися половым путем. Поэтому в настоящем исследовании в качестве терапевтических мишеней были выбраны PERV для проверки способности гелевой системы в удалении интегрированных фрагментов вируса у крупных млекопитающих - свиней.
PERV - это ретровирус, который может интегрировать свою ДНК в геном свиньи, образуя провирус. Его геном в основном состоит из трех генов PERV-gag, pol и env, которые могут реплицироваться вместе с геномом хозяина. Предыдущие исследования подтверждают, что количество копий гена pol в тканях выше, чем у генов gag и env, поэтому были разработаны sgRNA, нацеленные на ген PERV-pol. Согласно сайту лаборатории Zhang (Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91) были выбраны 3 sgRNA с наивысшим баллом и сконструированы плазмиды SpCas9-sgRNA (SpCas9-sgRNA-1, SpCas9-sgRNA-2, SpCas9-sgRNA-3). Затем приготовили вагинальный гель mMMT, содержащий соответствующие NP PBAE-плазмид (метод приготовления такой же, как в примере реализации 1). Предыдущие эксперименты показали, что мутация мишени оказывает влияние на эффективность редактирования системы CRISPR/Cas9. Поэтому перед экспериментами на животных обычно проводилось секвенирование ДНК PERV по Сэнгеру для определения, мутировала ли последовательность PERV (результаты испытания см. на фиг. 8A). Результаты показали, что целевая ДНК sgRNA-2 имеет базовую мутацию, которая может повлиять на эффективность редактирования системы CRISPR/Cas9 (результаты испытания см. на фиг. 8B). Поэтому для дальнейших испытаний были выбраны sgRNA-1 и sgRNA-3.
Каждой свинье ввели 2 мл геля плазмиды PBAE-CRISPR/Cas9 mMMT (содержащего 250 мкг плазмиды системы редактирования генов CRISPR/Cas9) (то есть геля NP-mMMT, приготовленного в примере 1), который равномерно распределялся по поверхности влагалища, шейки матки и заднего свода влагалища одномесячных свиней. Гель вводился на 1-й и 4-й дни. На 7-й день собирались клетки. Щетку вращали 3 раза вокруг шейки матки свиньи для получения клеток (очень похоже на метод сбора мазка Папаниколау у людей). Полученные клетки шейки матки сохранили в консервационном растворе шейки матки и собирали их путем центрифугирования при 715 g в течение 5 минут. Затем использовали ресуспендированные клетки PBS такого же объема и с помощью цитометра в определенном объеме провели подсчет количества клеток, что позволило вычислить общее количество собранных клеток. Из каждой группы для анализа брали около 2,5×104 клеток.
Экстракция ДНК и PCR
ДНК экстрагировали с помощью набора реагентов DNeasy Blood & Tissue Kit 69506, Qiagen, Германия. Реакцию PCR проводили с использованием Q5 Hot Start High Fidelity 2X Master Mix (M0494S, NEW ENGLAND BioLabs, США). Используемые праймеры см. в таблице 1. qPCR проводили на приборе Bio-Rad CFX96 с использованием PowerUpSYBR Green Master Mix (A25742, Applied Biosystems, США). Испытания повторяли три раза, ген GAPDH свиньи использовали в качестве внутреннего эталонного гена, для расчета относительных изменений экспрессии числа копий PERV использовался метод 2-ΔΔCT. Используемые праймеры см. в таблице 1.
| Таблица 1. PCR и праймер qPCR | ||
| Название | Прямое | Обратное |
| PERV-PCR | aatactcccctgctaccggt | aatctgggccttcttagcgg |
| PERV-RTPCR | gagactacatcccactagccaac | tagggcttcgtcaaagatggtc |
| GAPDH-pig | ccgcgatctaatgttctctttc | ttcactccgaccttcaccat |
Нами доказано, что гели mMMT на основе PBAE NP могут эффективно вводить систему CRISPR/Cas9 в вагинальный эпителий свиней, нацеливаться на PERV в данной области и значительно снижать количество копий вируса. После введения вагинального геля PBAE-SpCas9/sgRNA-1 NPs-mMMT во влагалище свиней количество вирусных копий PERV было успешно снижено (фиг. 8E).
Если SpCas9 отсекает ДНК PERV во влагалище in vivo, oligo встраивается в место отсечения. Для группы генов в части вставки и oligo ДНК проводилась реакция PCR (один праймер на oligo, а другой на геномном локусе, близком к мишени), в результате которой был получен правильный размер около 200 bp (см. результаты испытания на фиг. 8C). Как и ожидалось, секвенирование по Сэнгеру продемонстрировало, что плазмида sgRNA SpCas9-PERV эффективно отсекает последовательность ДНК PERV в эпителиальных клетках шейки матки свиньи in vivo, oligo были вставлены правильно (фиг. 8C). Последующая qPCR также показала снижение количества копий PERV в группе, обработанной гелем PBAE-SpCas9 NP. По сравнению с состоянием до лечения количество копий PERV в группе sgRNA-1 уменьшилось на 34%, количество копий PERV в группе sgRNA-3 уменьшилось на 17%, это говорит о том, что эффективность отсечения у sgRNA-1 лучше, чем у sgRNA-3 (фиг. 8E).
В целях сокращения промаха мимо целевого локуса без ущерба для эффективности редактирования генома, специфичность нуклеазы SpCas9 была повышена двумя вариантами: eSpCas9 и SpCas9-HF1. Поэтому в настоящем исследовании была дополнительно проверена эффективность eSpCas9 и SpCas9-HF1, а также sgRNA-1 в геле mMMT. По сравнению с контрольной группой количество копий PERV было снижено примерно на 42% в группе SpCas9-HF1 и на 34% в группе eSpCas9, что свидетельствует о большей эффективности вагинального геля на основе SpCas9-HF1 (P<0,05, фиг. 8F). Поскольку доставка плазмиды может вызвать воспалительную реакцию, которая влияет на количество копий PBAE, была добавлена экспериментальная группа - гель PBAEspcas9-HF1 (без sgRNA) NP-mMMT, - в качестве еще одной контрольной группы для наблюдения за этим явлением. Было обнаружено, что количество копий PERV в группе SpCas9-HF1 без обработки sgRNA не изменилось по сравнению с состоянием до лечения (фиг. 8F), что свидетельствует о том, что доставка плазмиды не вызывала иммунного ответа, отражающегося на количестве копий PERV.
Резюмируя вышеописанное, эти данные демонстрируют, что доставка ДНК in vivo на основе вагинального геля PBAE-Cas9 NP-mMMT обеспечивает эффективное локальное редактирование генома.
Пример реализации 5. Оценка безопасности геля
После эвтаназии у свиней отделяли и фиксировали шейку матки, яичники, уретру, влагалище и матку (4% параформальдегид). Залитые парафином срезы (5 мм) окрашивали с использованием IHC в соответствии с протоколом Proteintech (http://www.ptgcn.com/support/protocols).
Сначала мы оценили биораспределение системы транспортировки. Поскольку плазмида CRISPR/Cas9 в системе содержит маркер Flag, то когда плазмида доставляется в определенное место в органе свиньи и успешно трансфицируется, Flag экспрессируется. Маркеры Flag окрашивали в экспрессии в различных органах, таких как влагалище, уретра, шейка матки, яичники и матка, с применением иммуногистохимии (IHC). Очевидно, что только ткани влагалища и шейки матки демонстрируют маркеры, причем влагалище больше всего. Маркеры не экспрессировались в тканях других органов, что позволяет предположить, что наша система работает локально во влагалище и в шейке матки и не распространяется на близлежащие органы (фиг. 9А). Далее свиньям, получавшим гель NP-mMMT, были проведены обычный и биохимический анализ крови для оценки токсичности. Анализ крови показал нормальный метаболизм многих систем организма, включая кроветворную и иммунную системы. Среди биохимических показателей крови аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (AST) и щелочная фосфатаза (ALP) связаны с функцией печени, а аланинаминотрансфераза (BUN) является важным показателем функции почек. Обычный гель mMMT вводили в 1-й и 4-й дни, накануне и на 7-й день лечения собирали кровь и сыворотку для проведения анализа крови и биохимического анализа. Существенной разницы в уровнях лейкоцитов, эритроцитов и в других показателях крови в общем анализе по сравнению с показателями до введения выявлено не было (P<0,05, фиг. 9B). Биохимический анализ крови дал аналогичные результаты (фиг. 9С). Дальнейшее окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) было выполнено на шейке матки, яичниках, уретре, влагалище и матке для оценки токсичности препарата, результаты не показали аномальной морфологии, патологического отека, воспалительного некроза и апоптотических телец (фиг. 9D).
Для подтверждения результатов в группах, получавших PBAE-SpCas9/sgRNA NP-mMMT, и в контрольной группе также провели иммунохимическое определение воспалительных цитокинов IFN-γ и TNF-α в просвете влагалища, шейки матки и уретры. Явного окрашивания воспалительных цитокинов не наблюдалось (фиг. 10). Данные показывают относительную безопасность состава, он имеет такие особенности, как локальное биораспределение во влагалище и низкая токсичность, что также способствует последующему применению гелевой системы в клинических испытаниях.
Все количественные данные вышеприведенного статистического анализа представлены как среднее значение ±SD по меньшей мере из трех повторов. Статистический анализ был проведен с использованием однофакторного дисперсионного метода анализа, расчет контрольной суммы постфактум и Т-критерия проводился с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Prism 8), при этом значимое различие P<0,05.
Вышеупомянутые примеры реализации предназначены только для пояснения технической концепции и характеристик настоящего изобретения. Их цель заключается в том, чтобы дать возможность тем, кто знаком с данной областью техники, понять содержание настоящего изобретения и реализовать его соответствующим образом, и этим объем защиты настоящего изобретения не ограничивается. Все эквивалентные изменения или модификации, выполненные в соответствии с сущностью настоящего изобретения, должны быть включены в объем защиты настоящего изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
--->
<110> ZHUHAI SHUTONG MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
<120> VAGINAL GEL PREPARATION AND PREPARATION METHOD THEREFOR
<130> P2233220081ZM
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 1
ttcgaatgga gagatccagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 2
ggtgaccctc ctccagtacg 20
<210> 3
<211> 9429
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60
gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120
gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300
tggaaaggac gaaacaccgt tcgaatggag agatccaggg ttttagagct agaaatagca 360
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420
ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattagttt tagagctaga aatagcaagt 480
taaaataagg ctagtccgtt tttagcgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggctctaga 540
ggtacccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 600
cccattgacg tcaatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 660
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 720
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattgt gcccagtaca tgaccttatg 780
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt 840
gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta 900
tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc 960
gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc 1020
agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 1080
gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgacgctgc cttcgccccg 1140
tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 1200
cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagctg agcaagaggt 1260
aagggtttaa gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt taattacctg gagcacctgc 1320
ctgaaatcac tttttttcag gttggaccgg tgccaccatg gactataagg accacgacgg 1380
agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac gataagatgg ccccaaagaa 1440
gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac aagaagtaca gcatcggcct 1500
ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc gacgagtaca aggtgcccag 1560
caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc atcaagaaga acctgatcgg 1620
agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc cggctgaaga gaaccgccag 1680
aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg caagagatct tcagcaacga 1740
gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa gagtccttcc tggtggaaga 1800
ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc gtggacgagg tggcctacca 1860
cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg gtggacagca ccgacaaggc 1920
cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc aagttccggg gccacttcct 1980
gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac aagctgttca tccagctggt 2040
gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac gccagcggcg tggacgccaa 2100
ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg gaaaatctga tcgcccagct 2160
gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg aaacctgatt gccctgagcc tgggcctgac 2220
ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc aaactgcagc tgagcaagga 2280
cacctacgac gacgacctgg acaacctgct ggcccagatc ggcgaccagt acgccgacct 2340
gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg agcgacatcc tgagagtgaa 2400
caccgagatc accaaggccc ccctgagcgc ctctatgatc aagagatacg acgagcacca 2460
ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag ctgcctgaga agtacaaaga 2520
gattttcttc gaccagagca agaacggcta cgccggctac attgacggcg gagccagcca 2580
ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag atggacggca ccgaggaact 2640
gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag cggaccttcg acaacggcag 2700
catcccccac cagatccacc tgggagagct gcacgccatt ctgcggcggc aggaagattt 2760
ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag atcctgacct tccgcatccc 2820
ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc gcctggatga ccagaaagag 2880
cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg gacaagggcg cttccgccca 2940
gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg cccaacgaga aggtgctgcc 3000
caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac gagctgacca aagtgaaata 3060
cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc gagcagaaaa aggccatcgt 3120
ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag cagctgaaag aggactactt 3180
caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc gtggaagatc ggttcaacgc 3240
ctccctgggc acataccacg atctgctgaa aattatcaag gacaaggact tcctggacaa 3300
tgaggaaaac gaggacattc tggaagatat cgtgctgacc ctgacactgt ttgaggacag 3360
agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg ttcgacgaca aagtgatgaa 3420
gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg agccggaagc tgatcaacgg 3480
catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc ctgaagtccg acggcttcgc 3540
caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg acctttaaag aggacatcca 3600
gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag cacattgcca atctggccgg 3660
cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag gtggtggacg agctcgtgaa 3720
agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggccagag agaaccagac 3780
cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag cggatcgaag agggcatcaa 3840
agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa aacacccagc tgcagaacga 3900
gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg tacgtggacc aggaactgga 3960
catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccatatcgtg cctcagagct ttctgaagga 4020
cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag aaccggggca agagcgacaa 4080
cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctgaacgc 4140
caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag gccgagagag gcggcctgag 4200
cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg gaaacccggc agatcacaaa 4260
gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag tacgacgaga atgacaagct 4320
gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg gtgtccgatt tccggaagga 4380
tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct 4440
gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct aagctggaaa gcgagttcgt 4500
gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc gccaagagcg agcaggaaat 4560
cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc atgaactttt tcaagaccga 4620
gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg atcgagacaa acggcgaaac 4680
cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc gtgcggaaag tgctgagcat 4740
gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca ggcggcttca gcaaagagtc 4800
tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga aagaaggact gggaccctaa 4860
gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct gtgctggtgg tggccaaagt 4920
ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag ctgctgggga tcaccatcat 4980
ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg gaagccaagg gctacaaaga 5040
agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc ctgttcgagc tggaaaacgg 5100
ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag ggaaacgaac tggccctgcc 5160
ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat gagaagctga agggctcccc 5220
cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac aagcactacc tggacgagat 5280
catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg gccgacgcta atctggacaa 5340
agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc agagagcagg ccgagaatat 5400
catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc gccttcaagt actttgacac 5460
caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg ctggacgcca ccctgatcca 5520
ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg tctcagctgg gaggcgacaa 5580
aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat ccgagggcag 5640
aggaagcctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatgg agagcgacga 5700
gagcggcctg cccgccatgg agatcgagtg ccgcatcacc ggcaccctga acggcgtgga 5760
gttcgagctg gtgggcggcg gagagggcac ccccaagcag ggccgcatga ccaacaagat 5820
gaagagcacc aaaggcgccc tgaccttcag cccctacctg ctgagccacg tgatgggcta 5880
cggcttctac cacttcggca cctaccccag cggctacgag aaccccttcc tgcacgccat 5940
caacaacggc ggctacacca acacccgcat cgagaagtac gaggacggcg gcgtgctgca 6000
cgtgagcttc agctaccgct acgaggccgg ccgcgtgatc ggcgacttca aggtggtggg 6060
caccggcttc cccgaggaca gcgtgatctt caccgacaag atcatccgca gcaacgccac 6120
cgtggagcac ctgcacccca tgggcgataa cgtgctggtg ggcagcttcg cccgcacctt 6180
cagcctgcgc gacggcggct actacagctt cgtggtggac agccacatgc acttcaagag 6240
cgccatccac cccagcatcc tgcagaacgg gggccccatg ttcgccttcc gccgcgtgga 6300
ggagctgcac agcaacaccg agctgggcat cgtggagtac cagcacgcct tcaagacccc 6360
catcgccttc gccagatccc gcgctcagtc gtccaattct gccgtggacg gcaccgccgg 6420
acccggctcc accggatctc gctaagaatt cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 6480
ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 6540
ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 6600
aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 6660
gagaatagca ggcatgctgg ggagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact 6720
ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 6780
ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg 6840
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 6900
catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 6960
tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 7020
tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 7080
gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 7140
gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 7200
atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg 7260
atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 7320
aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta 7380
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 7440
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 7500
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 7560
tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 7620
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 7680
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 7740
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 7800
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 7860
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 7920
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 7980
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 8040
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 8100
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 8160
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 8220
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 8280
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 8340
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 8400
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 8460
gtggaagccg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 8520
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 8580
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 8640
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 8700
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 8760
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 8820
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 8880
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 8940
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 9000
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 9060
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 9120
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 9180
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 9240
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 9300
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 9360
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 9420
ctcacatgt 9429
<210> 4
<211> 9429
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 4
tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60
gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120
gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300
tggaaaggac gaaacaccgg gtgaccctcc tccagtacgg ttttagagct agaaatagca 360
agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420
ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattagttt tagagctaga aatagcaagt 480
taaaataagg ctagtccgtt tttagcgcgt gcgccaattc tgcagacaaa tggctctaga 540
ggtacccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 600
cccattgacg tcaatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 660
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 720
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattgt gcccagtaca tgaccttatg 780
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt 840
gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta 900
tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc 960
gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc 1020
agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 1080
gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgacgctgc cttcgccccg 1140
tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 1200
cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagctg agcaagaggt 1260
aagggtttaa gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt taattacctg gagcacctgc 1320
ctgaaatcac tttttttcag gttggaccgg tgccaccatg gactataagg accacgacgg 1380
agactacaag gatcatgata ttgattacaa agacgatgac gataagatgg ccccaaagaa 1440
gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac aagaagtaca gcatcggcct 1500
ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc gacgagtaca aggtgcccag 1560
caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc atcaagaaga acctgatcgg 1620
agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc cggctgaaga gaaccgccag 1680
aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg caagagatct tcagcaacga 1740
gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa gagtccttcc tggtggaaga 1800
ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc gtggacgagg tggcctacca 1860
cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg gtggacagca ccgacaaggc 1920
cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc aagttccggg gccacttcct 1980
gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac aagctgttca tccagctggt 2040
gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac gccagcggcg tggacgccaa 2100
ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg gaaaatctga tcgcccagct 2160
gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg aaacctgatt gccctgagcc tgggcctgac 2220
ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc aaactgcagc tgagcaagga 2280
cacctacgac gacgacctgg acaacctgct ggcccagatc ggcgaccagt acgccgacct 2340
gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg agcgacatcc tgagagtgaa 2400
caccgagatc accaaggccc ccctgagcgc ctctatgatc aagagatacg acgagcacca 2460
ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag ctgcctgaga agtacaaaga 2520
gattttcttc gaccagagca agaacggcta cgccggctac attgacggcg gagccagcca 2580
ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag atggacggca ccgaggaact 2640
gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag cggaccttcg acaacggcag 2700
catcccccac cagatccacc tgggagagct gcacgccatt ctgcggcggc aggaagattt 2760
ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag atcctgacct tccgcatccc 2820
ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc gcctggatga ccagaaagag 2880
cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg gacaagggcg cttccgccca 2940
gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg cccaacgaga aggtgctgcc 3000
caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac gagctgacca aagtgaaata 3060
cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc gagcagaaaa aggccatcgt 3120
ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag cagctgaaag aggactactt 3180
caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc gtggaagatc ggttcaacgc 3240
ctccctgggc acataccacg atctgctgaa aattatcaag gacaaggact tcctggacaa 3300
tgaggaaaac gaggacattc tggaagatat cgtgctgacc ctgacactgt ttgaggacag 3360
agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg ttcgacgaca aagtgatgaa 3420
gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg agccggaagc tgatcaacgg 3480
catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc ctgaagtccg acggcttcgc 3540
caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg acctttaaag aggacatcca 3600
gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag cacattgcca atctggccgg 3660
cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag gtggtggacg agctcgtgaa 3720
agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggccagag agaaccagac 3780
cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag cggatcgaag agggcatcaa 3840
agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa aacacccagc tgcagaacga 3900
gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg tacgtggacc aggaactgga 3960
catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccatatcgtg cctcagagct ttctgaagga 4020
cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag aaccggggca agagcgacaa 4080
cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctgaacgc 4140
caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag gccgagagag gcggcctgag 4200
cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg gaaacccggc agatcacaaa 4260
gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag tacgacgaga atgacaagct 4320
gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg gtgtccgatt tccggaagga 4380
tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac cacgcccacg acgcctacct 4440
gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct aagctggaaa gcgagttcgt 4500
gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc gccaagagcg agcaggaaat 4560
cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc atgaactttt tcaagaccga 4620
gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg atcgagacaa acggcgaaac 4680
cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc gtgcggaaag tgctgagcat 4740
gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca ggcggcttca gcaaagagtc 4800
tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga aagaaggact gggaccctaa 4860
gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct gtgctggtgg tggccaaagt 4920
ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag ctgctgggga tcaccatcat 4980
ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg gaagccaagg gctacaaaga 5040
agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc ctgttcgagc tggaaaacgg 5100
ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag ggaaacgaac tggccctgcc 5160
ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat gagaagctga agggctcccc 5220
cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac aagcactacc tggacgagat 5280
catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg gccgacgcta atctggacaa 5340
agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc agagagcagg ccgagaatat 5400
catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc gccttcaagt actttgacac 5460
caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg ctggacgcca ccctgatcca 5520
ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg tctcagctgg gaggcgacaa 5580
aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag aaaaagggat ccgagggcag 5640
aggaagcctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatgg agagcgacga 5700
gagcggcctg cccgccatgg agatcgagtg ccgcatcacc ggcaccctga acggcgtgga 5760
gttcgagctg gtgggcggcg gagagggcac ccccaagcag ggccgcatga ccaacaagat 5820
gaagagcacc aaaggcgccc tgaccttcag cccctacctg ctgagccacg tgatgggcta 5880
cggcttctac cacttcggca cctaccccag cggctacgag aaccccttcc tgcacgccat 5940
caacaacggc ggctacacca acacccgcat cgagaagtac gaggacggcg gcgtgctgca 6000
cgtgagcttc agctaccgct acgaggccgg ccgcgtgatc ggcgacttca aggtggtggg 6060
caccggcttc cccgaggaca gcgtgatctt caccgacaag atcatccgca gcaacgccac 6120
cgtggagcac ctgcacccca tgggcgataa cgtgctggtg ggcagcttcg cccgcacctt 6180
cagcctgcgc gacggcggct actacagctt cgtggtggac agccacatgc acttcaagag 6240
cgccatccac cccagcatcc tgcagaacgg gggccccatg ttcgccttcc gccgcgtgga 6300
ggagctgcac agcaacaccg agctgggcat cgtggagtac cagcacgcct tcaagacccc 6360
catcgccttc gccagatccc gcgctcagtc gtccaattct gccgtggacg gcaccgccgg 6420
acccggctcc accggatctc gctaagaatt cctagagctc gctgatcagc ctcgactgtg 6480
ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 6540
ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 6600
aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 6660
gagaatagca ggcatgctgg ggagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact 6720
ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 6780
ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg 6840
atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 6900
catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 6960
tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 7020
tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 7080
gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 7140
gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 7200
atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg 7260
atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 7320
aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta 7380
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 7440
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 7500
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 7560
tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 7620
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 7680
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 7740
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 7800
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 7860
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 7920
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 7980
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 8040
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 8100
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 8160
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 8220
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 8280
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 8340
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 8400
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 8460
gtggaagccg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 8520
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 8580
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 8640
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 8700
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 8760
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 8820
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 8880
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 8940
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 9000
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 9060
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 9120
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 9180
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 9240
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 9300
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 9360
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 9420
ctcacatgt 9429
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 5
gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 6
ataccgttat taacatatga caactcaatt aaac 34
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 7
aatactcccc tgctaccggt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 8
aatctgggcc ttcttagcgg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 9
gagactacat cccactagcc aac 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 10
tagggcttcg tcaaagatgg tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 11
ccgcgatcta atgttctctt tc 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial sequence
<400> 12
ttcactccga ccttcaccat 20
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 13
tagccaacca ctttttgcct tcgaatggag agatccaggt gcgggaagaa ccgggc 56
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 14
aaccgggcag ctcacttgga cccgactgcc ccaagggttc aaaaactccc cgacca 56
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 15
tcaggatcca acacccccag gtgaccctcc tccagtacgt ggatgacctg cttctg 56
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 16
ccactttttg ccttcgaatg gagagatcca ggtgcgggaa gaa 43
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 17
ggtgaaaaac ggaagcttac ctctctaggt ccacgccctt ctt 43
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> retroviral provirus
<400> 18
ccactttttg ccttcttgag ttgtcatatg ttaataacgg tagaatggag agatccagg 59
<---
Claims (22)
1. Вагинальный гелевый препарат для доставки терапевтического гена во влагалище, содержащий носитель и указанный терапевтический ген, где носитель включает катионный полимер, при этом указанный вагинальный гелевый препарат отличается тем, что также содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, полученный путем модификации монтмориллонита производными целлюлозы.
2. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что указанный гидрофильный полимерный материал и монтмориллонит в монтмориллоните, модифицированном гидрофильным полимерным материалом, находятся в массовом соотношении от 0,1:1 до 1:1.
3. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что указанный монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, также содержит натриевую соль.
4. Вагинальный гелевый препарат по п. 3, отличающийся тем, что указанная натриевая соль представляет собой одно или большее количество из следующих веществ: бикарбонат натрия, гидрофосфат динатрия, гидроцитрат динатрия и ацетат натрия.
5. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что указанные катионный полимер и монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, находятся в массовом соотношении от 1:1 до 1:1000.
6. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что носитель и терапевтический ген формируют наночастицы, и вагинальный гелевый препарат содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, смешенный с этими наночастицами.
7. Вагинальный гелевый препарат по п. 1 или 6, отличающийся тем, что содержит воду.
8. Вагинальный гелевый препарат по п. 1 или 6, отличающийся тем, что указанные носитель и терапевтический ген находятся в массовом соотношении от 10:1 до 150:1.
9. Вагинальный гелевый препарат по п. 6, отличающийся тем, что указанные наночастицы имеют заряженные поверхности.
10. Вагинальный гелевый препарат по п. 1 или 6, отличающийся тем, что указанный носитель включает катионный полимер, который представляет собой одно или более, выбранное из группы, состоящей из поли(β-аминоэфира), полилизина, полиэтиленимина и полиамидамина.
11. Вагинальный гелевый препарат по п. 1 или 6, отличающийся тем, что указанный терапевтический ген представляет собой одно или более, выбранное из группы, состоящей из следующих элементов: плазмида, ДНК и РНК.
12. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что указанный вагинальный гелевый препарат имеет уровень pH 4,0-8,0.
13. Вагинальный гелевый препарат по п. 1, отличающийся тем, что указанный вагинальный гелевый препарат содержит наночастицы.
14. Вагинальный гелевый препарат для доставки терапевтического гена во влагалище, причем препарат содержит матрицу и наночастицы, причем наночастицы содержат катионный полимер и указанный терапевтический ген, при этом вагинальный гелевый препарат отличается тем, что матрица содержит монтмориллонит, модифицированный гидрофильным полимерным материалом, полученный путем модификации монтмориллонита производными целлюлозы, катионный полимер представляет собой поли (β-аминоэфир) со структурной общей формулой , где m представляет собой число от 5 до 200; терапевтический ген представляет собой плазмиду, образованную из SpCas9-HF1 и/или eSpCas9, и ДНК, которая может быть транскрибирована в sgРНК-1, и/или ДНК, которая может быть транскрибирована в sgРНК-3, при этом ДНК, которая может быть транскрибирована в sgРНК-1, имеет последовательность TTCGAATGGAGAGATCCAGG, а ДНК, которая может быть транскрибирована в sgРНК-3, имеет последовательность GGTGACCCTCCTCCAGTACG.
15. Способ приготовления вагинального гелевого препарата по любому из пп. 1-14, включающий следующие этапы:
обеспечение возможности носителю и терапевтическому гену образовывать наночастицы в кислом буфере с получением смеси, содержащей наночастицы;
непосредственное смешивание смеси, содержащей наночастицы, и монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом, для приготовления вагинального гелевого препарата, или диспергирование монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом, в воде и/или кислом буфере, а затем смешивание дисперсии со смесью, содержащей наночастицы.
16. Способ приготовления вагинального гелевого препарата по п. 15, отличающийся тем, что указанный способ приготовления также включает этапы приготовления монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом: добавление монтмориллонита и гидрофильного полимерного материала к воде, селективное добавление соли натрия, смешивание и перемешивание, затем доведение уровня pH до 4–6, перемешивание и выдерживание, затем сушка и измельчение коллоидной жидкости верхнего слоя с получением монтмориллонита, модифицированного гидрофильным полимерным материалом.
17. Способ приготовления вагинального гелевого препарата по п. 16, отличающийся тем, что смешивание и перемешивание проводят при температуре 50–90°С в течение 1–10 ч; после доведения уровня рН смесь перемешивают при постоянной температуре 50–90°С в течение 0,5–2 ч, затем охлаждают; добавляют воду, смесь хорошо смешивают путем перемешивания и затем выдерживают.
18. Способ доставки терапевтического гена во влагалище, при котором вагинальный гелевый препарат по любому из пп. 1-14 непосредственно вводят во влагалище.
19. Способ введения, при котором вагинальный гелевый препарат по любому из пп. 1-14 вводят путем вагинального местного введения.
20. Применение вагинального гелевого препарата по любому из пп. 1-14 в генной терапии заболеваний влагалища и/или шейки матки.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010594395.8 | 2020-06-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810116C1 true RU2810116C1 (ru) | 2023-12-21 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013110028A1 (en) * | 2012-01-19 | 2013-07-25 | The Johns Hopkins University | Nanoparticle formulations with enhanced mucosal penetration |
| CN109266631A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-25 | 北京市农林科学院 | 一种基因组定点敲除的方法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013110028A1 (en) * | 2012-01-19 | 2013-07-25 | The Johns Hopkins University | Nanoparticle formulations with enhanced mucosal penetration |
| CN109266631A (zh) * | 2018-09-26 | 2019-01-25 | 北京市农林科学院 | 一种基因组定点敲除的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Feng-Huei Lin et al. Modified montmorillonite as vector for gene delivery / F.-H. Lin et al. / Biomaterials, 2006, Vol.27, pp. 3333-3338. * |
| Ghorbanali Sharifzadeh et al. Montmorillonite-based polyacrylamide hydrogel rings for controlled vaginal drug delivery / Materials Science & Engineering, доступно онлайн 28.12.2019, Vol.110, pp.1-12. Inmaculada Salcedo et al. In vitro biocompatibility and mucoadhesion of montmorillonite chitosan nanocomposite: A new drug delivery / Applied Clay Science, 2012, Vol.55, pp.131-137. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021202866B2 (en) | Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof | |
| EP3641810A1 (en) | Herpes simplex virus vaccine | |
| WO2018170260A1 (en) | Respiratory syncytial virus vaccine | |
| RU2771383C2 (ru) | Контролируемая пищевым рационом экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу cas9, и ее применения | |
| AU2020455080B2 (en) | Vaginal gel preparation and preparation method therefor | |
| AU2016342376A1 (en) | Sexually transmitted disease vaccines | |
| CN107746845B (zh) | 特异性靶向LAG-3基因的sgRNA和特异性敲除LAG-3基因的方法 | |
| JP2005336206A (ja) | 組換えアライグマポックスウイルスおよびネコ伝染性腹膜炎ウイルス疾患に対する効果的なワクチンとしてのそれらの使用 | |
| KR101961667B1 (ko) | 돼지유행성설사병 바이러스에 내성을 가지는 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 | |
| AU2022246473A1 (en) | Expression vector and method | |
| CN106687592A (zh) | 一种重组质粒、其构建的重组疟原虫及其应用 | |
| KR20210005184A (ko) | 유전자 치료 방법 | |
| RU2810116C1 (ru) | Вагинальный гель и метод его изготовления | |
| KR20210102247A (ko) | Crispr 수퍼-리프레서에 의한 생체내 합성 면역조절 | |
| JP2023065516A (ja) | 結節性硬化症の遺伝子治療 | |
| CN112501139B (zh) | 一株重组新城疫病毒毒株及其制备方法和应用 | |
| CN108949691B (zh) | 一种制备可实时检测间充质干细胞衰老的细胞模型的方法 | |
| CN108949690B (zh) | 一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法 | |
| CN104328136B (zh) | 鸡新城疫病毒毒株rClone30‑fliC的制备及其在鸡新城疫病防治中的应用 | |
| CN113736676A (zh) | 一种表达猪流行性腹泻病毒s蛋白的口服重组酿酒酵母的制备与应用 | |
| CN112437684A (zh) | 以提高的生产率表达寨卡抗原的重组腺病毒载体 | |
| CN109628487A (zh) | 一种利用转基因猪唾液腺制备人神经生长因子的方法 | |
| CN112272565A (zh) | 使用慢病毒基因构建体的递送的体内基因疗法 | |
| CN109321601B (zh) | Aqp5重组过表达载体及其构建方法和用途 | |
| CN113234691B (zh) | 一种动态监测胆囊收缩素的生物荧光探针及其应用 |