CN111748579A - 植物叶片离体培养表达蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。本发明可以充分将植物叶片进行离体培养，并正常表达产生所需要的重组蛋白。在培养的垂直空间占用上具有非常大的优势，同时不再需要营养土或营养液，成本低廉，价格优势明显，操作简单便捷，适用于大规模的商业化生产使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。
背景技术
植物作为一种蛋白生产的生物反应器，具有广阔的应用前景。目前生产重组蛋白的植物培养主要是以建造人工气候室或者培养间、培养箱为主。除了生菜等少数蔬菜可以用水培进行大量生产之外，绝大多数植物依然采用的是土培辅助以LED人工光源的方式或者直接在大田进行种植，进行重组蛋白的生产。
现有的几个以植物源重组蛋白为主的公司，如Medicago、Ibio等均在培养间内，利用人工LED光源、营养土培养本氏烟、生菜等植物，并采用农杆菌真空浸润法将需要的表达载体导入到植物叶片细胞中。这样的方法可以在植物上快速生产重组蛋白，不受环境条件和土地资源的制约。但这样子的培养方式也存在一定的缺陷：1、营养土比较昂贵且不易回收利用，成本较高；2、营养土的存在给真空浸润造成很多技术难题，增加设备成本；3、植物在立体式的培养模式下，增加了生产场地的空间占用消耗，增加了生产成本。因此，一种更加高效、集约、低成本的植物培养体系和重组蛋白生产体系是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，利用此方法可以更加简单操作、低成本、短周期地生产植物源重组蛋白。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；
步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；
步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；
所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；
步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia 1300。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μl ddH2O、25μl KOD OneTM PCR Master Mix、1μl 10μM上游引物、1μl 10μM下游引物、1μl 100ng/μl的含有GFP的质粒模板。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98度10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述含有所述重组蛋白的表达载体的序列如SEQ ID No.3所示。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述收集菌液浸润到植物叶片具体为：待菌液的OD600＝0.8时，8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液重悬，调节OD600＝0.6，将菌液浸润到植物叶片中；所述浸润缓冲液包括10mM MES，10mM MgCl2，1μM乙酰丁香酮。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述培养的条件为温度28℃，相对湿度100％，光照强度为250μmoles/m2/s，明暗时间为16h/8h。
在本发明的一些具体实施方案中，所述植物叶片为烟草叶片。
在本发明的一些具体实施方案中，所述支撑渗水部件(5)的厚度为1～3cm；所述锁水部件(3)的厚度为1～3cm；所述底部承载部件(2)的厚度为10～20cm。
本发明首次使用离体叶片成功表达外源重组蛋白。因为叶片一旦离体2个小时，就会萎蔫和干枯，细胞就会死亡，无法再表达外源蛋白。结合本发明提供的培养装置使得叶片在离体的条件下，保持原本的叶片形态和细胞功能，同时，还能够持续性地表达外源蛋白，并且，该外源蛋白仍然具有生物学活性。
用WB的方法检测整株有土栽培提的植株叶片上和离体培养装置内离体培养叶片上所表达的GFP蛋白量的差异。用Image J软件计算条带灰度进行统计分析，发现P＝0.96>0.05，这两者之间并没有显著的差异。但是，每立方米培养成本大幅下降：通过成本计算分析，发现体外离体培养叶片方式与传统有土整株栽培方式相比有明显的价格优势，显著降低用植物作为生物反应器生产重组蛋白的成本达66.7％～80.0％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示离体培养设备示意图，其中1-塑料薄膜(装置覆盖部件)；2-塑料拖盆(底部承载部件)；3-再生保湿锁水棉(锁水部件)；4-离体培养叶片；5-塑料网格架(支撑渗水部件)；
图2示1300-eGFP载体图谱；
图3示体外离体培养表达重组蛋白；
图4示3天WB比较结果。
具体实施方式
本发明公开了一种植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所包含有底部承载装置(可以是塑料、金属材料、复合材料等)(长60～120cm宽40～80cm高10～20cm)(2)、有一定厚度1～3cm厚锁水部件(3)、装置覆盖部件(1)、厚度1～3cm的支撑渗水部件(5)，四部分组成。使用时，将底部承载装置、支撑渗水部件消毒晾干，将锁水部件充分消毒后用双蒸水充分润湿。将锁水部件、支撑渗水部件依次装入承载装置内，将从植物上新鲜摘下并注射过含有1300-eGFP表达载体的农杆菌的本氏烟叶片，正面朝上放置于支撑渗水部件上，最后用装置覆盖部件覆盖整个装置，形成相对密封空间，并在四周用加固部件加固(绳子、皮筋、伸缩夹等)，放入具有LED光源的恒温组织培养间中。
本发明可以充分将植物叶片进行离体培养，并正常表达产生所需要的重组蛋白。在培养的垂直空间占用上具有非常大的优势，同时不再需要营养土或营养液，成本低廉，价格优势明显，操作简单便捷，适用于大规模的商业化生产使用。
本发明提供的植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 植物叶片离体培养装置的制备
本发明所包含有底部承载装置(可以是塑料、金属材料、复合材料等)(长60～120cm宽40～80cm高10～20cm)②、有一定厚度1～3cm厚锁水部件③、装置覆盖部件①、支撑渗水部件，厚度约1～3cm的⑤四部分组成。使用时，将底部承载装置、支撑渗水部件消毒晾干，将锁水部件充分消毒后用双蒸水充分润湿。将锁水部件、支撑渗水部件依次装入承载装置内，将从植物上新鲜摘下并注射过含有1300-eGFP表达载体的农杆菌的本氏烟叶片，正面朝上放置于支撑渗水部件上，最后用装置覆盖部件覆盖整个装置，形成相对密封空间，并在四周用加固部件加固(绳子、皮筋、伸缩夹等)，放入具有LED光源的恒温组织培养间中。如图1所示。
实施例2 构建1300-eGFP载体
以植物表达载体1300为基本骨架，用XhoⅠ酶切位点进行2个小时酶切，然后通过DNA凝胶电泳回收载体片段；用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别作为上下游引物，TOYOBO的KOD OneTM PCR MasterMix进行扩增反应，扩增体系为：22μl ddH2O、25μl KOD One TM PCRMaster Mix、1μl 10μM上游引物、1μl 10μM下游引物、1μl 100ng/μl的含有GFP的质粒模板。PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98℃10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。扩增的基因片段经过凝胶电泳进行割胶回收片段；用诺唯赞的Infusion酶进行单片段同源重组链接载体骨架和扩增片段。热激转化DH5α感受态后涂卡纳抗性培养基，于第二天进行菌落PCR验证，挑选阳性克隆摇菌并提取相应的质粒测序，如图2以及SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.1：ATCTATCTCTCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
SEQ ID No.2：tattatggagaaactcgagTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
SEQ ID No.3：
cgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattggctagagcagcttgccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagaccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctcgagATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT TCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGG CGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCC ACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCT TCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCG CGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGC AACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG GCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAA CACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGAC CCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGC TGTACAAGTAActcgagtttctccataataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagctcggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtccgggacggcgtcagcgggagagccgttgtaaggcggcagactttgctcatgttaccgatgctattcggaagaacggcaactaagctgccgggtttgaaacacggatgatctcgcggagggtagcatgttgattgtaacgatgacagagcgttgctgcctgtgatcaccgcggtttcaaaatcggctccgtcgatactatgttatacgccaactttgaaaacaactttgaaaaagctgttttctggtatttaaggttttagaatgcaaggaacagtgaattggagttcgtcttgttataattagcttcttggggtatctttaaatactgtagaaaagaggaaggaaataataaatggctaaaatgagaatatcaccggaattgaaaaaactgatcgaaaaataccgctgcgtaaaagatacggaaggaatgtctcctgctaaggtatataagctggtgggagaaaatgaaaacctatatttaaaaatgacggacagccggtataaagggaccacctatgatgtggaacgggaaaaggacatgatgctatggctggaaggaaagctgcctgttccaaaggtcctgcactttgaacggcatgatggctggagcaatctgctcatgagtgaggccgatggcgtcctttgctcggaagagtatgaagatgaacaaagccctgaaaagattatcgagctgtatgcggagtgcatcaggctctttcactccatcgacatatcggattgtccctatacgaatagcttagacagccgcttagccgaattggattacttactgaataacgatctggccgatgtggattgcgaaaactgggaagaagacactccatttaaagatccgcgcgagctgtatgattttttaaagacggaaaagcccgaagaggaacttgtcttttcccacggcgacctgggagacagcaacatctttgtgaaagatggcaaagtaagtggctttattgatcttgggagaagcggcagggcggacaagtggtatgacattgccttctgcgtccggtcgatcagggaggatatcggggaagaacagtatgtcgagctattttttgacttactggggatcaagcctgattgggagaaaataaaatattatattttactggatgaattgttttagtacctagaatgcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagggtgccttgatgtgggcgccggcggtcgagtggcgacggcgcggcttgtccgcgccctggtagattgcctggccgtaggccagccatttttgagcggccagcggccgcgataggccgacgcgaagcggcggggcgtagggagcgcagcgaccgaagggtaggcgctttttgcagctcttcggctgtgcgctggccagacagttatgcacaggccaggcgggttttaagagttttaataagttttaaagagttttaggcggaaaaatcgccttttttctcttttatatcagtcacttacatgtgtgaccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgggttccggttcccaatgtacggctttgggttcccaatgtacgtgctatccacaggaaagagaccttttcgacctttttcccctgctagggcaatttgccctagcatctgctccgtacattaggaaccggcggatgcttcgccctcgatcaggttgcggtagcgcatgactaggatcgggccagcctgccccgcctcctccttcaaatcgtactccggcaggtcatttgacccgatcagcttgcgcacggtgaaacagaacttcttgaactctccggcgctgccactgcgttcgtagatcgtcttgaacaaccatctggcttctgccttgcctgcggcgcggcgtgccaggcggtagagaaaacggccgatgccgggatcgatcaaaaagtaatcggggtgaaccgtcagcacgtccgggttcttgccttctgtgatctcgcggtacatccaatcagctagctcgatctcgatgtactccggccgcccggtttcgctctttacgatcttgtagcggctaatcaaggcttcaccctcggataccgtcaccaggcggccgttcttggccttcttcgtacgctgcatggcaacgtgcgtggtgtttaaccgaatgcaggtttctaccaggtcgtctttctgctttccgccatcggctcgccggcagaacttgagtacgtccgcaacgtgtggacggaacacgcggccgggcttgtctcccttcccttcccggtatcggttcatggattcggttagatgggaaaccgccatcagtaccaggtcgtaatcccacacactggccatgccggccggccctgcggaaacctctacgtgcccgtctggaagctcgtagcggatcacctcgccagctcgtcggtcacgcttcgacagacggaaaacggccacgtccatgatgctgcgactatcgcgggtgcccacgtcatagagcatcggaacgaaaaaatctggttgctcgtcgcccttgggcggcttcctaatcgacggcgcaccggctgccggcggttgccgggattctttgcggattcgatcagcggccgcttgccacgattcaccggggcgtgcttctgcctcgatgcgttgccgctgggcggcctgcgcggccttcaacttctccaccaggtcatcacccagcgccgcgccgatttgtaccgggccggatggtttgcgaccgtcacgccgattcctcgggcttgggggttccagtgccattgcagggccggcagacaacccagccgcttacgcctggccaaccgcccgttcctccacacatggggcattccacggcgtcggtgcctggttgttcttgattttccatgccgcctcctttagccgctaaaattcatctactcatttattcatttgctcatttactctggtagctgcgcgatgtattcagatagcagctcggtaatggtcttgccttggcgtaccgcgtacatcttcagcttggtgtgatcctccgccggcaactgaaagttgacccgcttcatggctggcgtgtctgccaggctggccaacgttgcagccttgctgctgcgtgcgctcggacggccggcacttagcgtgtttgtgcttttgctcattttctctttacctcattaactcaaatgagttttgatttaatttcagcggccagcgcctggacctcgcgggcagcgtcgccctcgggttctgattcaagaacggttgtgccggcggcggcagtgcctgggtagctcacgcgctgcgtgatacgggactcaagaatgggcagctcgtacccggccagcgcctcggcaacctcaccgccgatgcgcgtgcctttgatcgcccgcgacacgacaaaggccgcttgtagccttccatccgtgacctcaatgcgctgcttaaccagctccaccaggtcggcggtggcccatatgtcgtaagggcttggctgcaccggaatcagcacgaagtcggctgccttgatcgcggacacagccaagtccgccgcctggggcgctccgtcgatcactacgaagtcgcgccggccgatggccttcacgtcgcggtcaatcgtcgggcggtcgatgccgacaacggttagcggttgatcttcccgcacggccgcccaatcgcgggcactgccctggggatcggaatcgactaacagaacatcggccccggcgagttgcagggcgcgggctagatgggttgcgatggtcgtcttgcctgacccgcctttctggttaagtacagcgataaccttcatgcgttccccttgcgtatttgtttatttactcatcgcatcatatacgcagcgaccgcatgacgcaagctgttttactcaaatacacatcacctttttagacggcggcgctcggtttcttcagcggccaagctggccggccaggccgccagcttggcatcagacaaaccggccaggatttcatgcagccgcacggttgagacgtgcgcgggcggctcgaacacgtacccggccgcgatcatctccgcctcgatctcttcggtaatgaaaaacggttcgtcctggccgtcctggtgcggtttcatgcttgttcctcttggcgttcattctcggcggccgccagggcgtcggcctcggtcaatgcgtcctcacggaaggcaccgcgccgcctggcctcggtgggcgtcacttcctcgctgcgctcaagtgcgcggtacagggtcgagcgatgcacgccaagcagtgcagccgcctctttcacggtgcggccttcctggtcgatcagctcgcgggcgtgcgcgatctgtgccggggtgagggtagggcgggggccaaacttcacgcctcgggccttggcggcctcgcgcccgctccgggtgcggtcgatgattagggaacgctcgaactcggcaatgccggcgaacacggtcaacaccatgcggccggccggcgtggtggtgtcggcccacggctctgccaggctacgcaggcccgcgccggcctcctggatgcgctcggcaatgtccagtaggtcgcgggtgctgcgggccaggcggtctagcctggtcactgtcacaacgtcgccagggcgtaggtggtcaagcatcctggccagctccgggcggtcgcgcctggtgccggtgatcttctcggaaaacagcttggtgcagccggccgcgtgcagttcggcccgttggttggtcaagtcctggtcgtcggtgctgacgcgggcatagcccagcaggccagcggcggcgctcttgttcatggcgtaatgtctccggttctagtcgcaagtattctactttatgcgactaaaacacgcgacaagaaaacgccaggaaaagggcagggcggcagcctgtcgcgtaacttaggacttgtgcgacatgtcgttttcagaagacggctgcactgaacgtcagaagccgactgcactatagcagcggaggggttggatcaaagtactttgatcccgaggggaaccctgtggttggcatgcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgttattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgccaatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatccaagctcaagctgctctagcattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaatt划线区域为GFP编码框。
实施例3 分别浸润农杆菌到正常植物和离体叶片上，并进行培养
将测序结果完全正确的质粒用电击法导入农杆菌中，并涂抹于卡纳和利福平双抗培养基上。挑取单克隆用YEP培养基进行摇菌，待OD600＝0.8时，用8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液(10mM MES，10mM Mgcl2，1μM乙酰丁香酮)重悬起来，并调节OD600＝0.6，将菌液用去掉针尖的注射器浸润到烟草叶片中。将离体植物叶片放入离体培养装置培养，将完整植株放入培养室里培养。培养的条件为温度28℃，相对湿度100％，光照强度为250μmoles/m2/s，明暗时间为16h/8h。用手提紫外灯分别在浸润后3天进行拍照，附图3。
在手提紫外灯下可明显观察到，载体表达的GFP荧光蛋白在整株有土培养的植物叶片上和在离体培养装置内的离体叶片上的表达是没有显著性的差异存在的。但是在不使用离体培养装置的离体培养的叶片上，没有观察到载体表达的GFP荧光蛋白，同时，该叶片已经发生了皱缩和萎蔫，不具有表达重提蛋白的能力。
结果显示，离体培养叶片和在整株植物上表达的蛋白GFP量在第三天没有显著差异。
实施例4 SDS-PAGE胶以及WB操作
(1)、取浸润区叶片0.1g，用液氮研磨后，加入200ul蛋白提取缓冲液，15000rpm离心10分钟后，取上清200ul加入50ul蛋白上样loading。100度煮沸10分钟后于冰上冷却。
(2)、取10ul样品上样，80V电泳半小时后，100V电泳1小时。
(3)、切除凝胶浓缩胶后放入转移缓冲液中。剪取与凝胶大小相同的硝酸纤维素(NC)膜和干净滤纸于转移缓冲液中湿润5～10min。打开电转移夹，阴极黑色面朝下，按照海绵垫、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵垫的顺序润湿后平放，去中层间气泡后夹好电转移夹，采用恒压100V转膜60min。
(4)、NC膜用PBST缓冲液漂洗后，浸入封闭液中室温孵育1h；将膜浸入GFP一抗的稀释液，水平摇床上缓慢摇动常温孵育1～2h；用PBST洗膜3次后，将膜转移到所需二抗的稀释液中，室温下缓慢摇动反应1～2h；用PBST洗膜4次，每次5min，用PBS短暂洗涤，去除膜表面的吐温-20；
(5)、碱性磷酸酶(AP)显色：10mL显色缓冲液中分别加入66μLNBT和33μLBCIP，将膜浸入显色液后避光反应至特异性条带清晰，非特异性条带及背景较低为止，一般需3～30min。将显色完全的膜放入去离子水中以终止反应。
(6)、考马斯亮蓝染色：将SDS-PAGE胶用考马斯亮蓝染色液染色(40％甲醇；10％乙酸；0.25％考马斯亮蓝G250)在摇床上染色30min；用脱色液(40％甲醇；10％乙酸)至条带清晰可见。
结果发现，离体叶片表达GFP与整株植物土培所表达的GFP量没有显著的差异，附图4。
表1
| 条带相对灰度 | 有土栽培 | 离体培养 |
| 1 | 130.294 | 126.628 |
| 2 | 128.214 | 129.947 |
| 3 | 87.653 | 92.472 |
| Average | 115.387 | 116.349 |
| Stdev | 24.04085412 | 20.74457247 |
| T：P＝0.96 |
用WB的方法检测整株有土栽培提的植株叶片上和离体培养装置内离体培养叶片上所表达的GFP蛋白量的差异。用ImageJ软件计算条带灰度进行统计分析，发现P＝0.96>0.05，这两者之间并没有显著的差异。
但是，每立方米培养成本大幅下降：
表2
| 离体叶片培养 | 整株植物培养 | |
| 培养装置数目 | 5盆 | 2盆 |
| 叶片数 | 200-500片 | 200-300片 |
| 培养土 | 0 | 2公斤(10元) |
| 营养液 | 0 | 5升(5元) |
| 装置成本 | 25元 | 60元 |
| 每百片叶片成本/立方米 | 5-12.5元 | 25-37.5元 |
通过成本计算分析，发现体外离体培养叶片方式与传统有土整株栽培方式相比有明显的价格优势，显著降低用植物作为生物反应器生产重组蛋白的成本达66.7％～80.0％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。此专利中使用表达载体为pcambia1300，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，使用其他植物瞬时表达载体也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江华缔药业集团医药开发有限公司
<120> 植物叶片离体培养表达蛋白的方法
<130> MP2012470
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctatctct ctcgagatgg tgagcaaggg cgagga 36
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattatggag aaactcgagt tacttgtaca gctcgtccat gc 42
<210> 3
<211> 8590
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 60
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 120
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 180
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc 240
caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga 300
agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt 360
ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta 420
caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 480
tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 540
gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 600
caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 660
ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 720
gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 780
cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 840
cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 900
cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccttc ctctatataa 960
ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta 1020
tctctctcga gatggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 1080
tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 1140
atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 1200
cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 1260
accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 1320
gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 1380
gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 1440
tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 1500
agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 1560
tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 1620
ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 1680
atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 1740
tgtacaagta actcgagttt ctccataata atgtgtgagt agttcccaga taagggaatt 1800
agggttccta tagggtttcg ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta gtatgtattt 1860
gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtact 1920
aaaatccaga tcccccgaat taattcggcg ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 1980
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc 2040
agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca 2100
tcagtccggg acggcgtcag cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta 2160
ccgatgctat tcggaagaac ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc 2220
ggagggtagc atgttgattg taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat caccgcggtt 2280
tcaaaatcgg ctccgtcgat actatgttat acgccaactt tgaaaacaac tttgaaaaag 2340
ctgttttctg gtatttaagg ttttagaatg caaggaacag tgaattggag ttcgtcttgt 2400
tataattagc ttcttggggt atctttaaat actgtagaaa agaggaagga aataataaat 2460
ggctaaaatg agaatatcac cggaattgaa aaaactgatc gaaaaatacc gctgcgtaaa 2520
agatacggaa ggaatgtctc ctgctaaggt atataagctg gtgggagaaa atgaaaacct 2580
atatttaaaa atgacggaca gccggtataa agggaccacc tatgatgtgg aacgggaaaa 2640
ggacatgatg ctatggctgg aaggaaagct gcctgttcca aaggtcctgc actttgaacg 2700
gcatgatggc tggagcaatc tgctcatgag tgaggccgat ggcgtccttt gctcggaaga 2760
gtatgaagat gaacaaagcc ctgaaaagat tatcgagctg tatgcggagt gcatcaggct 2820
ctttcactcc atcgacatat cggattgtcc ctatacgaat agcttagaca gccgcttagc 2880
cgaattggat tacttactga ataacgatct ggccgatgtg gattgcgaaa actgggaaga 2940
agacactcca tttaaagatc cgcgcgagct gtatgatttt ttaaagacgg aaaagcccga 3000
agaggaactt gtcttttccc acggcgacct gggagacagc aacatctttg tgaaagatgg 3060
caaagtaagt ggctttattg atcttgggag aagcggcagg gcggacaagt ggtatgacat 3120
tgccttctgc gtccggtcga tcagggagga tatcggggaa gaacagtatg tcgagctatt 3180
ttttgactta ctggggatca agcctgattg ggagaaaata aaatattata ttttactgga 3240
tgaattgttt tagtacctag aatgcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 3300
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3360
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3420
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3480
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3540
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3600
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3660
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3720
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3780
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3840
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 3900
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 3960
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 4020
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 4080
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 4140
tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 4200
atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 4260
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 4320
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 4380
aaacgcgcga ggcagggtgc cttgatgtgg gcgccggcgg tcgagtggcg acggcgcggc 4440
ttgtccgcgc cctggtagat tgcctggccg taggccagcc atttttgagc ggccagcggc 4500
cgcgataggc cgacgcgaag cggcggggcg tagggagcgc agcgaccgaa gggtaggcgc 4560
tttttgcagc tcttcggctg tgcgctggcc agacagttat gcacaggcca ggcgggtttt 4620
aagagtttta ataagtttta aagagtttta ggcggaaaaa tcgccttttt tctcttttat 4680
atcagtcact tacatgtgtg accggttccc aatgtacggc tttgggttcc caatgtacgg 4740
gttccggttc ccaatgtacg gctttgggtt cccaatgtac gtgctatcca caggaaagag 4800
accttttcga cctttttccc ctgctagggc aatttgccct agcatctgct ccgtacatta 4860
ggaaccggcg gatgcttcgc cctcgatcag gttgcggtag cgcatgacta ggatcgggcc 4920
agcctgcccc gcctcctcct tcaaatcgta ctccggcagg tcatttgacc cgatcagctt 4980
gcgcacggtg aaacagaact tcttgaactc tccggcgctg ccactgcgtt cgtagatcgt 5040
cttgaacaac catctggctt ctgccttgcc tgcggcgcgg cgtgccaggc ggtagagaaa 5100
acggccgatg ccgggatcga tcaaaaagta atcggggtga accgtcagca cgtccgggtt 5160
cttgccttct gtgatctcgc ggtacatcca atcagctagc tcgatctcga tgtactccgg 5220
ccgcccggtt tcgctcttta cgatcttgta gcggctaatc aaggcttcac cctcggatac 5280
cgtcaccagg cggccgttct tggccttctt cgtacgctgc atggcaacgt gcgtggtgtt 5340
taaccgaatg caggtttcta ccaggtcgtc tttctgcttt ccgccatcgg ctcgccggca 5400
gaacttgagt acgtccgcaa cgtgtggacg gaacacgcgg ccgggcttgt ctcccttccc 5460
ttcccggtat cggttcatgg attcggttag atgggaaacc gccatcagta ccaggtcgta 5520
atcccacaca ctggccatgc cggccggccc tgcggaaacc tctacgtgcc cgtctggaag 5580
ctcgtagcgg atcacctcgc cagctcgtcg gtcacgcttc gacagacgga aaacggccac 5640
gtccatgatg ctgcgactat cgcgggtgcc cacgtcatag agcatcggaa cgaaaaaatc 5700
tggttgctcg tcgcccttgg gcggcttcct aatcgacggc gcaccggctg ccggcggttg 5760
ccgggattct ttgcggattc gatcagcggc cgcttgccac gattcaccgg ggcgtgcttc 5820
tgcctcgatg cgttgccgct gggcggcctg cgcggccttc aacttctcca ccaggtcatc 5880
acccagcgcc gcgccgattt gtaccgggcc ggatggtttg cgaccgtcac gccgattcct 5940
cgggcttggg ggttccagtg ccattgcagg gccggcagac aacccagccg cttacgcctg 6000
gccaaccgcc cgttcctcca cacatggggc attccacggc gtcggtgcct ggttgttctt 6060
gattttccat gccgcctcct ttagccgcta aaattcatct actcatttat tcatttgctc 6120
atttactctg gtagctgcgc gatgtattca gatagcagct cggtaatggt cttgccttgg 6180
cgtaccgcgt acatcttcag cttggtgtga tcctccgccg gcaactgaaa gttgacccgc 6240
ttcatggctg gcgtgtctgc caggctggcc aacgttgcag ccttgctgct gcgtgcgctc 6300
ggacggccgg cacttagcgt gtttgtgctt ttgctcattt tctctttacc tcattaactc 6360
aaatgagttt tgatttaatt tcagcggcca gcgcctggac ctcgcgggca gcgtcgccct 6420
cgggttctga ttcaagaacg gttgtgccgg cggcggcagt gcctgggtag ctcacgcgct 6480
gcgtgatacg ggactcaaga atgggcagct cgtacccggc cagcgcctcg gcaacctcac 6540
cgccgatgcg cgtgcctttg atcgcccgcg acacgacaaa ggccgcttgt agccttccat 6600
ccgtgacctc aatgcgctgc ttaaccagct ccaccaggtc ggcggtggcc catatgtcgt 6660
aagggcttgg ctgcaccgga atcagcacga agtcggctgc cttgatcgcg gacacagcca 6720
agtccgccgc ctggggcgct ccgtcgatca ctacgaagtc gcgccggccg atggccttca 6780
cgtcgcggtc aatcgtcggg cggtcgatgc cgacaacggt tagcggttga tcttcccgca 6840
cggccgccca atcgcgggca ctgccctggg gatcggaatc gactaacaga acatcggccc 6900
cggcgagttg cagggcgcgg gctagatggg ttgcgatggt cgtcttgcct gacccgcctt 6960
tctggttaag tacagcgata accttcatgc gttccccttg cgtatttgtt tatttactca 7020
tcgcatcata tacgcagcga ccgcatgacg caagctgttt tactcaaata cacatcacct 7080
ttttagacgg cggcgctcgg tttcttcagc ggccaagctg gccggccagg ccgccagctt 7140
ggcatcagac aaaccggcca ggatttcatg cagccgcacg gttgagacgt gcgcgggcgg 7200
ctcgaacacg tacccggccg cgatcatctc cgcctcgatc tcttcggtaa tgaaaaacgg 7260
ttcgtcctgg ccgtcctggt gcggtttcat gcttgttcct cttggcgttc attctcggcg 7320
gccgccaggg cgtcggcctc ggtcaatgcg tcctcacgga aggcaccgcg ccgcctggcc 7380
tcggtgggcg tcacttcctc gctgcgctca agtgcgcggt acagggtcga gcgatgcacg 7440
ccaagcagtg cagccgcctc tttcacggtg cggccttcct ggtcgatcag ctcgcgggcg 7500
tgcgcgatct gtgccggggt gagggtaggg cgggggccaa acttcacgcc tcgggccttg 7560
gcggcctcgc gcccgctccg ggtgcggtcg atgattaggg aacgctcgaa ctcggcaatg 7620
ccggcgaaca cggtcaacac catgcggccg gccggcgtgg tggtgtcggc ccacggctct 7680
gccaggctac gcaggcccgc gccggcctcc tggatgcgct cggcaatgtc cagtaggtcg 7740
cgggtgctgc gggccaggcg gtctagcctg gtcactgtca caacgtcgcc agggcgtagg 7800
tggtcaagca tcctggccag ctccgggcgg tcgcgcctgg tgccggtgat cttctcggaa 7860
aacagcttgg tgcagccggc cgcgtgcagt tcggcccgtt ggttggtcaa gtcctggtcg 7920
tcggtgctga cgcgggcata gcccagcagg ccagcggcgg cgctcttgtt catggcgtaa 7980
tgtctccggt tctagtcgca agtattctac tttatgcgac taaaacacgc gacaagaaaa 8040
cgccaggaaa agggcagggc ggcagcctgt cgcgtaactt aggacttgtg cgacatgtcg 8100
ttttcagaag acggctgcac tgaacgtcag aagccgactg cactatagca gcggaggggt 8160
tggatcaaag tactttgatc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga 8220
cgaacggata aaccttttca cgccctttta aatatccgtt attctaataa acgctctttt 8280
ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg 8340
aaacgacaat ctgatccaag ctcaagctgc tctagcattc gccattcagg ctgcgcaact 8400
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat 8460
gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa 8520
cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg 8580
agctcgaatt 8590
Claims (10)
1.植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；
步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；
步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；
所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；
步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia 1300。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μl ddH2O、25μl KOD OneTM PCR Master Mix、1μl 10μM上游引物、1μl 10μM下游引物、1μl 100ng/μl的含有GFP的质粒模板。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98度10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述含有所述重组蛋白的表达载体的序列如SEQ ID No.3所示。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，步骤2中所述收集菌液浸润到植物叶片具体为：待菌液的OD600＝0.8时，8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液重悬，调节OD600＝0.6，将菌液浸润到植物叶片中；所述浸润缓冲液包括10mM MES，10mMMgCl2，1μM乙酰丁香酮。
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3中所述培养的条件为：温度28℃，相对湿度100％，光照强度为250μmoles/m2/s，明暗时间为16h/8h。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物叶片为烟草叶片。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述支撑渗水部件(5)的厚度为1～3cm；所述锁水部件(3)的厚度为1～3cm；所述底部承载部件(2)的厚度为10～20cm。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101701035A (zh) * | 2009-09-21 | 2010-05-05 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种与植物耐旱相关的蛋白GaTPSP及其编码基因与应用 |
| CN101838664A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 复旦大学 | 一种利用基因工程方法增强烟草抗冻性能的方法 |
| CN206078798U (zh) * | 2016-08-26 | 2017-04-12 | 华南农业大学 | 一种便携式植物枝叶临时保藏盒 |
| CN209113901U (zh) * | 2018-10-23 | 2019-07-16 | 山东省果树研究所 | 一种用于无花果叶片或果实离体接种培养的装置 |
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2020
- 2020-08-07 CN CN202010788491.6A patent/CN111748579A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101838664A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 复旦大学 | 一种利用基因工程方法增强烟草抗冻性能的方法 |
| CN101701035A (zh) * | 2009-09-21 | 2010-05-05 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种与植物耐旱相关的蛋白GaTPSP及其编码基因与应用 |
| CN206078798U (zh) * | 2016-08-26 | 2017-04-12 | 华南农业大学 | 一种便携式植物枝叶临时保藏盒 |
| CN209113901U (zh) * | 2018-10-23 | 2019-07-16 | 山东省果树研究所 | 一种用于无花果叶片或果实离体接种培养的装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 莫倩珍: "弓形虫SAG1肽在烟草中的瞬时快速表达研究" * |
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