CN113481116A

CN113481116A - 对木质纤维素衍生的抑制物高耐受的耐热酵母、其构建方法及应用

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Publication number: CN113481116A
Application number: CN202110869044.8A
Authority: CN
Inventors: 洪泂; 姜自运; 王冬梅
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-30
Also published as: CN113481116B

Abstract

本发明提供一种对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母及其构建方法，所述耐热酵母的保藏号为CGMCC No.22080。本发明的耐热酵母不仅在木质纤维素衍生的抑制物耐受性方面得到了提高，而且更适用于高温SSF发酵生产乙醇，这对工业上木质纤维素生产燃料乙醇具有非常重要的生物学意义。

Description

对木质纤维素衍生的抑制物高耐受的耐热酵母、其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及一种基因工程改造菌株，对工程菌株改造使耐热性的马克斯克鲁维酵母对木质纤维素类生物质前处理过程中衍生的抑制物耐受性得到提高。本发明构建了对木质纤维素类生物质衍生的不同种类的抑制物如糠醛类物质、酚类物质、醋酸等弱酸类物质均具有耐受性的马克斯克鲁维酵母，其利用木质纤维素发酵生产乙醇的能力相对野生菌株得到大幅度提高。

背景技术

煤炭、石油、天然气等化石燃料一直是当今世界各国使用的主要能源，但是由于它不断枯竭、不可再生的特点，并且对生态环境造成了恶劣影响，所以寻找新型的代替化石燃料的可再生的清洁能源已经迫在眉睫，因此植物生物质衍生燃料逐渐受到广泛的关注(Abo，Gao et al.2019)。木质纤维素生物质是地球上最丰富的可再生碳源(Ravindran andJaiswal，2016)，主要来源于农业废料、林业废料、农业残留物以及厨余生活垃圾等，通常以不同的形式存在，例如本发明用到的玉米芯。木质纤维素一般由不同比例的纤维素、半纤维素、木质素以及少量其他物质组成(Mosier，Wyman et al.2005)，被水解后可以产生大量糖类物质如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，可以被微生物利用发酵生产乙醇、丁醇等第二代生物燃料以及其他高附加值产品(Theiri，Chadjaa et al.2020)。利用木质纤维素生产第二代生物燃料不仅对环境友好，而且不同于第一代生物燃料，不采用淀粉，不会与食品生产产生竞争，简而言之，就是“不与人争粮，不与粮争地”。因此，利用秸秆、蔗渣、玉米芯等木质纤维素类生物质生产生物燃料是当前科学研究的热点(Yu，Bao et al.2018)。

尽管木质纤维素生产生物燃料可能能够解决化学燃料能源危机，具有十分广阔的前景，但是微生物利用木质纤维素生产生物燃料的过程仍然有许多技术阻碍。纤维素、半纤维素和木质素在植物细胞壁中紧密地结合在一起，形成天然的壁垒，导致木质纤维素原料不易被水解(Sun，Sun et al.2016)。因此，需要使用适当的预处理方法改变木质纤维素的结构，使酶易于进入木质纤维素将其水解成单糖(Behera，Arora et al.2014)。

预处理主要是通过打开木质纤维素生物质的致密结构从而增加纤维素酶对纤维素的可及性来提高木质纤维素的酶促水解的效率。预处理的方法主要分为物理预处理、化学预处理、物理-化学预处理和生物预处理。物理处理一般是通过机械粉碎等方法减小木质纤维素的粒径、破坏其结构规律性从而增加木质纤维素的表面积并降低纤维素结晶度(Taherzadeh and Karimi 2008)。化学处理分为酸处理方法、碱处理方法、离子液体处理方法、有机溶剂处理方法等(Lorenci Woiciechowski，Dalmas Neto et al.2020)。物理-化学处理的方法有蒸汽爆炸、氨纤维爆炸、超临界CO₂处理等(Brodeur，Yau et al.2011)。它们的主要原理都是通过木质纤维素中氢键、酯键、醚键等化学键的断裂的方法去除木质素和半纤维素。生物预处理主要是通过微生物或酶来水解木质纤维素，虽然具有不消耗能源和化学药品等优点(Saritha，Arora et al.2012)，但是其消耗周期长、效率低等特点制约了其工业应用(Chandra，Bura et al.2007)。本发明中使用的处理玉米芯的预处理方法即为化学法中的酸处理方法，利用稀酸在高温和高压下破坏木质纤维素的结构，具有操作简单、反应迅速等优点，目前被广泛使用。

目前认为化学处理和物理-化学处理是最有效的前处理方法。但是化学处理和物理-化学处理的过程中一般都会用到高温和高压，在这种情况下，纤维素分解成葡萄糖、木糖等糖类物质，糖类物质又进一步降解形成糠醛和羟甲基糠醛以及甲酸等酸类物质，同时木质素也会降解形成苯酚衍生物，这些物质均会抑制微生物的发酵(Cunha，Romani etal.2019)。一般将这些抑制物分为三类：a)呋喃类衍生物；b)酚类物质；c)弱酸类物质。抑制物的种类和浓度取决于木质纤维素原料的种类和预处理的条件如时间、压力、温度、pH等因素。

木质纤维素预处理的过程会释放出大量抑制物，这些抑制物会影响微生物的发酵过程，是利用木质纤维素生产生物燃料和高附加值产品的主要瓶颈。为了提高木质纤维素的利用率和产物的得率，一般需要对预处理之后的木质纤维素培养基进行脱毒，去除其中的抑制物。目前的脱毒方法主要分为物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法(Mussatto andRoberto 2004)(Yang and Wyman 2008)(Chandel，Kapoor et al.2007)。

虽然脱毒可以去除抑制物，但是一般大幅增加成本，在工业生产上不具有经济适用性。寻找能够对木质纤维素的水解产物中的抑制物产生适应性的微生物则更为可取(Parawira and Tekere 2011，Behera,Arora et al.2014)，例如Larsso，Simona等在酿酒酵母中异源表达来自白腐真菌Trametes versicolor的漆酶基因，提高了其对云杉水解产物中酚类抑制剂的抗性从而获得了更高的乙醇产率(Larsson，Cassland et al.2001)。目前，利用合成生物学、基因组学知识，运用基因工程、代谢工程等技术构建多种抑制物高耐受性菌株是利用木质纤维素水解液进行生产发酵的新趋势(Chen and Dou 2016)。

酵母菌是目前利用木质纤维素生产乙醇的主要微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为模式生物，被广泛应用于木质纤维素利用的研究和生产中，然而，酿酒酵母也有几点不容忽视的缺点：首先，酿酒酵母不能利用木质纤维素中第二丰富的糖类——木糖，对木质纤维素的利用率低，不能进行葡萄糖木糖共利用(

Aristidou etal.2003)；其次，酿酒酵母的最适生长温度在30℃左右，但是纤维素酶工作的最适温度是45-50℃，在木质纤维素的同步糖化共发酵中会导致纤维素酶酶活的降低。

本发明所改造的出发菌株为马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，具有能在高于42℃高温下生长的特点。据报道，有的马克斯克鲁维酵母菌株能在52℃生长，并在40℃的液体培养基中具有最大生长速率(Banat and Marchant)。如果用于发酵菌株它本身具有很多优势：首先，在工业生产中发酵会产生大量的热量，发酵过程中的温度需要维持在25-35℃之间以最大程度提高乙醇产量并防止酵母不可逆的热失活，这需要大量的能量输入，特别是在高温季节和炎热地区，“耐热”的特点让马克斯克鲁维酵母可以在高温下进行正常发酵，这就降低了在大规模发酵系统中维持生长温度需要的运营成本，同时被杂菌污染的可能性也大幅降低；其次马克斯克鲁维酵母是经美国FDA认证的一种GRAS(Generally Recognized as Safe)级别物种，本身就存在于许多食品中，具有安全可靠性；另外，马克斯克鲁维酵母具有底物广谱性，不仅可以利用葡萄糖、棉籽糖、蔗糖、果糖等底物进行生产发酵，而且能够代谢包括木糖、阿拉伯糖等五碳糖(Goshima，Negi et al.2013)，不同于酿酒酵母，马克斯克鲁维酵母对半纤维素中最丰富的糖类——木糖的利用使其具有更高的木质纤维素利用率，更适用于纤维素乙醇的工业生产。所以马克斯克鲁维酵母在纤维素乙醇的同步糖化发酵和同步糖化共发酵中具有更大的优势。

为了减少木质纤维素生物质利用过程中的步骤--脱毒(抑制物去除)带来的糖损失和费用，构建能够耐受木质纤维素预处理过程中产生的多种抑制物的菌株非常重要。本发明发现一个未研究过的假定蛋白的基因对多种抑制物的耐受非常重要，过表达该基因可以提高对抑制物的耐受。

发明内容

本发明通过一个功能未知的基因在耐热的马克斯克鲁维酵母中的过表达，获得了一个对木质纤维素生物质预处理过程中衍生的抑制物高耐受并且能够利用木质纤维素高产乙醇的菌株，该菌株对木质纤维素衍生的抑制物混合物、糠醛类抑制物、酚类抑制物以及弱酸类抑制物的耐受性相较于野生菌株得到了大幅度提高，并且对高乙醇、高盐、高温等胁迫条件均具有高耐受性。另外，该菌株在含抑制物的培养基中利用葡萄糖生产乙醇以及利用玉米芯进行同步糖化与发酵(SSF)发酵生产乙醇的能力相比野生菌株也都得到了大幅度提高。上述耐热工程菌株已于2021年3月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号为CGMCC No.22080，拉丁文学名为kluyveromycesmarxianus。

具体地，本发明包含以下内容：

一方面，本发明提供对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母，其过表达如SEQ ID NO.6所示的KmIRR基因。

在一些实施方案中，所述木质纤维素衍生的抑制物包括但不限于糠醛类抑制物、酚类抑制物以及弱酸类抑制物。

在一些实施方案中，所述木质纤维素衍生的抑制物选自糠醛类抑制物、酚类抑制物以及弱酸类抑制物。

在一些实施方案中，所述对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母，是马克斯克鲁维酵母YZY004菌株，拉丁文学名为Kluyveromyces marxianus，保藏号为CGMCC No.22080，于2021年3月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)。

另一方面，本发明提供生产乙醇的方法，所述方法包括将上述菌株接种在包含木质纤维素的培养基中进行发酵培养，从发酵液中得到乙醇。

在一些实施方案中，所述木质纤维素来源于农业废料、林业废料、农业残留物和厨余生活垃圾，优选地，所述木质纤维素来源于玉米芯。

在一些实施方案中，所述发酵在发酵罐中进行，发酵温度为37℃-42℃。

在一些实施方案中，所述菌株以未脱毒的酸处理玉米芯水解液和玉米芯残渣为碳源。

在一些实施方案中，所述酸选自H₂SO₄、盐酸和H₃PO₄。

在一些实施方案中，对未脱毒的酸处理玉米芯水解液的pH进行调节，pH调节剂选自水性氢氧化铵、NaOH、KOH和Ca(OH)₂。

在一些实施方案中，所述菌株的接种量为初始OD₆₀₀为1。

另一方面，本发明提供上述对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母在乙醇生产中的用途。

另一方面，本发明提供对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，其特征在于，通过过表达如SEQ ID NO.6所示的KmIRR基因对耐热酵母进行基因改造。

在一些实施方案中，上述对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，包括将包含KmIRR基因的质粒转化到马克斯克鲁维酵母菌株中，优选地转化到营养缺陷性马克斯克鲁维酵母菌株中，优选地转化到亮氨酸和色氨酸的双重营养缺陷性马克斯克鲁维酵母菌株中。

在一些实施方案中，上述对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，其包括通过醋酸锂方法将包含KmIRR基因的质粒转化到马克斯克鲁维酵母菌株中。

另一方面，本发明提供对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，包括：

以马克斯克鲁维酵母菌株YWD005(Wu,Wang et al.2020)(亮氨酸和色氨酸的双重营养缺陷性)作为宿主，其过表达包含KmIRR基因的质粒，所述质粒的构建方法如下：

依据马克斯克鲁维酵母基因组中KmIRR基因(GenBank accessionNo.BAP73702.1，locus tag为KMAR_80012)的序列设计引物KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-NotI-R(SEQ ID NO.2)，以马克斯克鲁维酵母YHJ010菌株(Hong，Wang etal.2007)的基因组为模板进行PCR扩增，得到包括KmIRR基因ORF的DNA片段，用内切酶EcoRI和NotI双酶切，产物回收得到KmIRR片段，并且用内切酶EcoRI和NotI酶切质粒YEGAP(Hong,Tamaki et al.2001)，将KmIRR片段连接到载体YEGAP上，得到包含KmIRR基因的质粒pWD013。

在一些实施方案中，将pWD013质粒以General-F(SEQ ID NO.3)和General-R(SEQID NO.4)通过PCR扩增，获得线性化的pWD013质粒，通过醋酸锂方法转化到YWD005菌株中，通过在只含有亮氨酸的合成培养基(SD)上筛选获得KmIRR过表达菌株YZY004。

有益效果

本发明通过用功能未知的蛋白的基因在马克斯克鲁维酵母中过表达，所获得的酵母菌株在木质纤维素抑制物存在时表达大幅度上升，且该基因的过表达能够提高酵母菌株对木质纤维素类生物质前处理过程中产生的抑制物的耐受能力，该过表达菌株在含有抑制物混合物的合成培养基中培养延滞期比对照菌株明显缩短，分别为8h和12h，并最终积累了更高的细胞浓度；过表达该基因还可以提高对乙醇、盐、糖及温度的耐受；在含有抑制物和葡萄糖的厌氧培养中，乙醇的产量和生产速度比对照菌株分别提高了26.57％和20％，最终得率提高7.09％；在42℃利用抑制物未去除的预处理过的玉米芯进行发酵中，该未知功能基因过表达菌株的产量和生产速率比对照菌株高16.2％和14.3％；在37℃该未知功能基因过表达菌株的产量和生产速率比对照菌株高12.％％和35.5％。所以过表达此功能未知的基因可构建抑制物耐受提高的耐热酵母菌株，而该菌株的特性可以成为构建利用木质纤维素工程菌的重要出发菌株。

本发明的YZY004不仅在木质纤维素衍生的抑制物耐受性方面得到了提高，而且更适用于高温SSF发酵生产乙醇，这对工业上木质纤维素生产燃料乙醇具有非常重要的生物学意义。

附图说明

图1示出KmIRR过表达菌株YZY004以及对照菌株YZY001的基因型鉴定：1.以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-EcoRI-R(SEQ ID NO.2)为引物验证YZY001基因组的条带；2.以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和Ter-R(SEQ ID NO.5)为引物验证YZY001基因组的条带；3.以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-EcoRI-R(SEQ ID NO.2)为引物验证YZY004基因组的条带；4.以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和Ter-R(SEQ ID NO.5)为引物验证YZY004基因组的条带；基因KmIRR的长度为1181bp，Ter-R(SEQ ID NO.5)为位于载体上的引物。

图2示出过表达菌株YZY004对不同抑制物的耐受性比对照菌株YZY001高：(a)不添加任何抑制物的YPD培养基；(b)添加抑制物混合物(包括2.0g/L醋酸；1.0g/L糠醛类抑制物，其中糠醛与5-羟甲基糠醛各0.5g/L；0.2g/L酚类抑制物，其中儿茶酚、香兰素、丁香醛、羟甲基苯酚各0.05g/L)的YPD培养基；(c)添加20g/L醋酸钠的YPD培养基；(d)添加2.0g/L糠醛类抑制物(1.0g/L糠醛和1.0g/L 5-羟甲基糠醛)的YPD培养基；(e)添加1.2g/L酚类抑制物(包括儿茶酚、香兰素、丁香醛、羟甲基苯酚各0.3g/L)的YPD培养基。每个点均为三个OD₆₀₀重复的平均值±标准差。

图3示出过表达菌株YZY004对不同逆境环境的耐受性比YZY001高：(a)没有任何胁迫压力的YPD培养基中，42℃；(b)含20g/L乙醇的YPD培养基中，42℃；(c)含0.5M NaCl的YPD培养基中，42℃；(d)含180g/L葡萄糖的YPD培养基中，42℃；(e)YPD培养基中，45℃。

图4示出KmIRR过表达菌株YZY004在模拟木质纤维素水解液的培养基中进行厌氧发酵生产乙醇的性能探究：(a)YZY001和YZY004在含有抑制物混合物和葡萄糖的培养基中的生长曲线；(b)YZY001和YZY004在含有抑制物混合物和葡萄糖的培养基中进行无氧发酵的葡萄糖消耗情况和乙醇生产情况。每个点均是三个生物量重复的平均值±标准差。

图5示出KmIRR过表达菌株YZY004在42℃无氧的环境中利用玉米芯同步糖化发酵生产乙醇的性能探究：(a)YZY001和YZY004的乙醇产量；(b)YZY001和YZY004发酵时上清液残留的葡萄糖含量；(c)YZY001和YZY004发酵时上清液残留的木糖含量。

图6示出KmIRR过表达菌株YZY004在37℃无氧的环境中利用玉米芯同步糖化发酵生产乙醇的性能探究：(a)YZY001和YZY004的乙醇产量；(b)YZY001和YZY004发酵时上清液残留的葡萄糖含量；(c)YZY001和YZY004发酵时上清液残留的木糖含量。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

试剂和酶：D-葡萄糖，D-木糖，L-阿拉伯糖，尿嘧啶，色氨酸，亮氨酸，酵母基本氮源(无氨基酸)，琼脂糖，氢氧化钙，饱和酚溶液及质粒抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司(中国上海)；各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，Taq PCR MasterMix，FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase购自Thermo Fisher(美国)；胶回收试剂盒购自Promega(美国)；高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS(宝生物，中国大连)；高保真DNA聚合酶KOD plus(TOYOBO Co，Ltd，日本)；磷酸，硫酸，甲醇，乙醇，甘油，三氯甲烷，异戊醇(国药，中国)；酵母提取物(LP0021)，胰蛋白胨(LP0042)，蛋白胨(LP0037)(Oxoid，英国)；酸洗玻璃珠(sigma，美国)；纤维素酶UTE-1500L(湖南优特尔生化有限公司，中国)

本发明使用到的培养基的配制：

LB培养基(100mL)：称取0.5g酵母提取物，1g胰蛋白胨，1g氯化钠，然后用超纯水溶解并定容至100mL；如果是固体培养基需添加1.5g琼脂糖；配好后高温高压灭菌，抗生素添加前确定培养基温度降到55℃以下。

SD固体培养基(100mL)：称取0.67g YNB(酵母基本氮源)，2g D-葡萄糖，1.5g琼脂糖，然后用超纯水溶解并定容至100mL，高温高压灭菌后待温度降为60℃左右按需添加合适氨基酸。

YPD培养基(100mL)：称取1g酵母提取物，2g蛋白胨，2g D-葡萄糖；然后用超纯水溶解并定容至100mL，高温高压灭菌，固体培养基需添加1.5g琼脂糖。

抑制物混合物储存液：500g/L醋酸、125g/L糠醛、125g/L 5-羟甲基糠醛、儿茶酚、香兰素、丁香醛、羟甲基苯酚各12.5g/L，使用时用YPD培养基稀释250倍得到含合适浓度的抑制物混合物的培养基。

实施例1.菌株的构建：

1.本发明中的基因KmIRR过表达的载体pWD013的构建：

1)引物设计

依据马克斯克鲁维酵母基因组中KmIRR基因(GenBank accessionNo.BAP73702.1，locus tag为KMAR_80012)的序列设计引物KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-NotI-R(SEQ ID NO.2)。

2)珠磨法酵母基因组提取

a)准备工作：裂解缓冲液(10mM Tris-HCL(pH＝8.0)，1mM EDTA，1％SDS(M/V)，2％Triton X-100(V/V)，100mM NaCl，)，酸洗玻璃珠，酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(PH>7.8))，1×TE缓冲液，预冷100％乙醇，预冷75％乙醇，RNase，3M醋酸钠溶液；低温冷冻离心机预冷至4℃；

b)取出过夜培养好的5mL酵母菌YHJ010(Hong，Wang et al.2007)培养液转移到离心管中离心去上清，离心条件为12000rpm，3min；

c)用移液器吸取500μL的无菌水重悬菌体，再通过离心去上清，离心条件为12000rpm，1min；

d)向离心管中加入200μL的裂解缓冲液，并通过移液器吹吸重悬菌体，然后用天平称取0.3g的酸洗玻璃珠加入重悬起来的菌体中；

e)再吸取200μL酚氯仿溶液加入离心管中，剧烈涡旋3min混匀；

f)然后再吸取200μL的1×TE缓冲液加入混匀后的溶液中，再剧烈涡旋30s混匀；

g)混匀后，将离心管置于提前预冷的4℃离心机中进行离心，离心条件为12000rpm，10min；

h)离心后，用移液器小心吸取上层水相转移至干净的1.5mL离心管中，再向离心管中加入1mL预冷的100％乙醇，混匀后，再将离心管置于4℃离心机中12000rpm，离心10min；

i)离心结束后，弃上清，再吸取400μl的1×TE缓冲液加入离心管中，摇匀后加入2mg/mL的RNase 2μL，37℃水浴锅温育5min，以除去提取物中可能混有的RNA；

j)温育结束后取出离心管，加入40μL 3M的醋酸钠溶液，混匀后再加入1mL预冷的100％乙醇，混匀后将离心管置于-20℃条件下30min；

k)低温处理30min后，取出离心管然后置于4℃离心机中离心，离心条件为12000rpm，10min；

l)离心结束后，小心去上清，然后再加入1mL预冷的75％乙醇重悬沉淀，然后再用4℃离心机中离心，离心条件为12000rpm，8min；

m)弃上清，再用离心机点离10s，用移液器吸取残留的液体并弃掉，然后将离心管敞口放置在室温下干燥15min左右，加入50μL无菌水溶解沉淀，获得酵母基因组，-20℃保存。

3)以马克斯克鲁维酵母基因组YHJ010为模板，以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-NotI-R(SEQ ID NO.2)为引物，用KOD plus DNA聚合酶扩增出KmIRR片段，KOD plusDNA聚合酶反应体系如下：

KOD plus DNA聚合酶反应程序如下：

反应程序及温度	反应时间
		预变性：95℃	5min
变性：95℃	30sec
		退火：55℃	30sec
延伸：68℃	1min
		返回变性(步骤2变性：95℃)	30个循环
延伸：68℃	10min
		保温：16℃	120min

4)凝胶电泳后回收KmIRR片段

采用美国Promega回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System，Promega，产品编号A9281，美国)，按照产品说明书进行切胶回收纯化KmIRR片段，最后用Nanodrop测完浓度后放置于-20℃冰箱保存。

5)将回收获得的KmIRR片段用内切酶EcoRI和NotI双酶切，并纯化；用内切酶EcoRI和NotI酶切质粒YEGAP(Hong,Tamaki et al.2001)，采用美国Promega回收试剂盒分别进行凝胶回收得到载体。

EcoRI和NotI双酶切反应体系如下：

6)将酶切之后的KmIRR片段和YEGAP载体用T4连接酶进行连接

反应体系如下：

在22℃连接2h，然后进行大肠杆菌转化。待长出克隆后挑取单克隆以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-NotI-R(SEQ ID NO.2)为引物进行菌落PCR，挑取阳性的克隆培养过夜后，提取质粒，然后送去测序确认序列信息，将所得的正确序列的质粒命名为pWD013。

2.YZY004的构建。

1)以pWD013为模板，General-F(SEQ ID NO.3)和General-R(SEQ ID NO.4)为引物(General-F和General-R以pWD013的序列设计，其能够将包括KmIRR基因和ScTRP1基因DNA片段扩增出来)，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶扩增，得到带KmIRR基因过表达框和ScTRP1(用于回补色氨酸营养缺陷型的磷酸核糖的邻氨基苯甲酸盐异构酶基因)标签的线性片段。PrimeSTAR HS DNA聚合酶反应体系如下：

PrimeSTAR HS DNA聚合酶反应程序如下：

2)乙醇沉淀DNA

a)将获得的PCR反应液汇集于干净的1.5mL离心管中，加入十分之一体积的3M醋酸钠溶液(pH＝5.2)，充分混匀；

b)再用移液器向离心管中加入约2.5倍体积的预冷处理过的无水乙醇，颠倒充分混合后放于-20℃冰箱静置约20min；此时将低温冷冻离心机打开预冷至4℃；

c)混合液静置完全后，取出，4℃离心机进行离心处理，离心条件为14000×g，30min；

d)离心结束后，取出离心管，小心弃去上清后，再用移液器向离心管中加入1mL预冷的75％的乙醇，14000×g转速离心5min；

e)离心结束后小心弃上清，然后用移液器小心吸取残留液体，开盖放置在室温中，挥发剩余的乙醇；

f)放置约10min后加入合适体积的灭菌水溶解获得的DNA沉淀，然后放置于-20℃冰箱保存。

3)通过酵母醋酸锂转化的方法将片段转化进入YWD005(Wu,Wang et al.2020)，通过添加了亮氨酸的合成培养基平板筛选成功转入片段的菌株，只有成功转入片段使YWD005恢复色氨酸合成能力的菌株才能在该平板上存活，具体步骤如下：

a)准备工作：47℃水浴锅，转化缓冲液(800μL 50％PEG4000，100μL 1M DTT，100μL2M醋酸锂)，YPD液体培养基，添加亮氨酸或0.1％5-FOA(5-氟乳清酸)的合成培养基，线性化的待转质粒；

b)取-80℃保存的冻存菌在含有所需亮氨酸的固体合成培养基上划线，然后置于37℃生化培养箱中培养过夜；

c)从固体培养基上挑取单克隆菌到含有5mL的新鲜YPD液体培养基的试管中，然后于37℃摇床250rpm的条件培养过夜；

d)转接500μL即10％的接种量的菌液到含有新鲜的5mL YPD液体培养基的试管中，37℃摇床250rpm培养约4h；

e)将菌液转移到离心管中，然后离心收集菌体，离心条件为5000×g，3min；

f)离心结束后，在超净工作台内将上清弃于废液缸中，并用移液器小心吸取上清以尽量除尽残留上清，再用移液器吸取600μL的转化缓冲液(800μL 50％PEG4000，100μL 1MDTT，100μL 2M醋酸锂)并通过吹吸方式重悬菌体，再5000×g离心10s；

g)离心结束后，用移液器吸取上清并弃掉，然后再向离心管中加入150μL的转化缓冲液重悬菌体，此时即获得制备好的酵母化学转化感受态细胞；

h)向新制备好的酵母化学转化感受态细胞中加入10μL线性化的待转质粒，混匀后置于47℃水浴锅热击15min；

i)热击后即可直接将菌体涂布于添加亮氨酸的合成培养基平板上，37℃生化培养箱培养2-3天。

4)以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和Ter-R(SEQ ID NO.5)为引物进行菌落PCR的方式确定片段转入，最终需要以抽提的基因组为模板进行PCR确定该菌株确实为对应基因过表达的菌株。

3.YZY001的构建

以空载质粒YEGAP(Hong,Tamaki et al.2001)为模板，General-F(SEQ ID NO.3)和General-R(SEQ ID NO.4)为引物，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶扩增，得到带ScTRP1标签的片段，进行乙醇沉淀，醋酸锂转化法转化到YWD005(Wu,Wang et al.2020)中，使用添加亮氨酸的合成培养基筛选，得到带有ScTRP1和ScURA3标签的菌株YZY001。

4.对YZY001和YZY004的鉴定。

以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-EcoRI-R(SEQ ID NO.2)，以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和Ter-R(SEQ ID NO.5)为引物对YZY001和YZY004进行了鉴定，反应混合物中模板为菌株的基因组DNA，其他条件与KmIRR的ORF片段的扩增相同。以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和KmIRR-EcoRI-R(SEQ ID NO.2)为引物，YZY001和YZY004扩增的片段大小约为1200bp，以KmIRR-EcoRI-F(SEQ ID NO.1)和Ter-R(SEQ ID NO.5)为引物，YZY001的基因组DNA扩增不出片段(没有过表达质粒)，而YZY004的基因组扩增出1300bp(图1)，说明YZY004包含了KmIRR的过表达框。

实施例2.YZY004对木质纤维素衍生的抑制物耐受性的鉴定

我们通过生长曲线测定了KmIRR的过表达菌株YZY004和对照菌株YZY001对抑制物混合物、醋酸类抑制物、糠醛类抑制物、酚类抑制物的耐受性的生长曲线。

生长曲线测定的步骤如下：

a)前培养：将YZY004和YZY001菌株接种到在试管中的YPD液体培养基中，37℃培养12h左右；

b)以OD₆₀₀＝0.3为起始菌浓度转接至5mL不含有抑制物，或含有抑制物的YPD培养基试管中，42℃(在高温胁迫下使用45℃)，250rpm培养。不同的培养基配方如下：

c)根据菌株生长的需要，每隔数小时取一次点，直至其生长至平台期。在超净工作台中取出适量体积的菌液并进行稀释，在吸光度为600nm处测量其吸光度，整理数据，绘制生长曲线。

结果如图2所示。在没有任何抑制物存在的培养基中生长时，YZY004的生长曲线和YZY001基本一致(图2a)。当培养基中存在抑制物混合物的时候，从生长曲线中我们可以明显地看出，过表达菌株YZY004则相比对照菌株YZY001(延滞期12h，生长速率为0.43±0.05h^-1，最终OD₆₀₀为20.84±0.88)呈现出更短的生长延滞期(8h)、更快的生长速率(0.48±0.01h^-1)、更高的最终生物量(24±0.34)(图2b)。

在其他含有20g/L醋酸钠、2.0g/L糠醛类抑制物、1.2g/L酚类抑制物等不同类型的抑制物的培养基中，过表达菌株YZY004都表现出与在抑制物混合物培养基中类似的生长趋势(图2c、2d、2e)。当培养基中添加20g/L醋酸钠的时候，过表达菌株YZY004的生长速率相比对照菌株YZY001(0.19±0.00h^-1)更快，为0.21±0.00h^-1，它的最终OD₆₀₀值相比YZY001(15.56±0.83)更高为19.84±0.51(图2c)。当培养基中添加1.0g/L糠醛和1.0g/L 5-羟甲基糠醛的时候，过表达菌株YZY004的生长延滞期相比对照菌株YZY001短4h，它的生长速率也相比对照菌株YZY001(0.25±0.06h^-1)更快，为0.65±0.02h^-1，它的最终OD₆₀₀值相比YZY001(25.08±0.85)更高为26.28±0.45(图2d)。当培养基中添加1.2g/L酚类抑制物的时候，同样地过表达菌株YZY004在每个时间点处的生物量也均高于野生型YZY001的OD₆₀₀值，它的最终OD₆₀₀值相比YZY001(24.72±1.35)更高，为26.20±0.79(图2e)。

以上实验结果表明过表达KmIRR的马克斯克鲁维酵母则会表现出对各种木质纤维素衍生的抑制物耐受性的提高，说明基因KmIRR在马克斯克鲁维酵母的抑制物耐受性中发挥了重要作用。

实施例3 YZY004对其他方面的抗逆能力鉴定

生长曲线的测定方法基本同上，测定YZY004相比野生菌株YZY001分别在含20g/L乙醇、0.5M NaCl、180g/L葡萄糖的YPD培养基以及在45℃高温环境中的生长状况。

图3的结果显示，在无胁迫压力的生长环境下，YZY004的生长曲线和YZY001基本一致(图3a)。在含20g/L乙醇的培养基中生长时，两种菌株并未在生长延滞期方面表现出差别，但是YZY004(24.95±0.34)的最终生物量OD₆₀₀明显高于YZY001(17.56±0.11)(图3b)。在含有0.5M NaCl的高渗透压环境下，过表达菌株YZY004则相比对照菌株YZY001(生长速率为0.40±0.00h^-1，最终OD₆₀₀为18.42±0.31)都呈现出更短的生长延滞期(0h)、更快的生长速率(0.47±0.01h^-1)、更高的最终生物量(20.36±0.39)(图3c)。在45℃的高温环境下，同样地，过表达菌株YZY004则相比对照菌株YZY001(生长速率为0.28±0.00h^-1，最终OD₆₀₀为13.97±0.95)都呈现出更快的生长速率(0.31±0.00h^-1)、更高的最终生物量(17.25±0.69)(图3e)。在含有180g/L葡萄糖的高糖环境下，两种菌株的生长延滞期、最终生物量相差不大，但过表达菌株YZY004(0.70±0.00h^-1)则相比对照菌株YZY001(0.62±0.01h^-1)在对数期的生长速率有所提高(图3d)。

以上结果均表明过表达KmIRR的菌株YZY004在乙醇、高渗透压、高温等方面的抗逆能力相比YZY001有所提高，也说明基因KmIRR在马克斯克鲁维酵母的抗逆能力方面具有重要意义。

实施例4 YZY004在含有抑制物的培养基中利用葡萄糖生产乙醇的能力鉴定

本发明的厌氧发酵主要是利用厌氧瓶营造发酵所需的无氧条件，具体发酵过程如下：

a)YZY004和对照菌株YZY001菌株从-80℃冰箱取出然后在YPD固体培养基上划线，37℃生化箱培养过夜；

b)第二天从划线的平板上挑取单克隆到装有5mL的YPD液体培养基的试管中进行培养过夜，培养条件为37℃，250rpm；

c)配制发酵所需的培养基并灭菌，培养基配方为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，100g/L葡萄糖，灭菌冷却后加入抑制物混合物储存液，使其稀释250倍最终得到含有2.0g/L醋酸，1.0g/L糠醛类抑制物，其中糠醛与5-羟甲基糠醛各0.5g/L；0.2g/L酚类抑制物，其中儿茶酚、香兰素、丁香醛、羟甲基苯酚各0.05g/L的培养基；

d)取出第(b)步中前培养的试管，然后用分光光度计在600nm处的吸光度测量菌液浓度，通过计算转接一定量的菌液到含有30mL新鲜培养基的厌氧瓶中，保证接种量即保证发酵液起始OD₆₀₀为0.3；

e)为了监测菌的发酵情况，培养期间隔一段时间取400μL的菌液保存于-20℃冰箱，HPLC检测其中糖类和乙醇的含量。

结果见图4。由生长曲线的数据可知，相比YZY001的24h的延滞期，YZY004的延滞期缩短了一半，并且有更高的生长速率和乙醇产率。36h时，YZY004利用97.44±0.49g/L葡萄糖生产了45.90±1.49g/L乙醇，葡萄糖消耗速率达到2.71±0.01g/L/h，乙醇产率达到1.27±0.04g/L/h；YZY001利用46.01±2.78g/L葡萄糖生产了15.44±1.80g/L乙醇，葡萄糖消耗速率为1.28±0.07g/L/h，乙醇产率为0.43±0.05g/L/h。60h时，YZY004的葡萄糖利用率仍有1.62±0.01g/L/h，乙醇产率有0.78±0.00g/L/h，得率达48.38±0.46％，相比之下，野生型菌株YZY001的葡萄糖利用率为1.54±0.04g/L/h，乙醇产率为0.65±0.04g/L/h，得率为40.23％±0.16。

由以上数据可得出结论，在含木质纤维素衍生的抑制物的培养基中发酵时，KmIRR过表达的马克斯克鲁维酵母相比没有过表达的对照菌株乙醇的产量提高了26.57％，乙醇产率提高了20％，最终得率提高7.09％。这为工业上构建能利用木质纤维素水解液生产乙醇的抑制物耐受性工程菌株提供了思路。

表1 YZY004和YZY001的发酵情况

实施例5YZY004在含有抑制物的培养基中利用葡萄糖生产乙醇的能力鉴定

为了将KmIRR过表达菌株YZY004更好地应用于工业生产，我们以YZY001为对照，对YZY004进行了玉米芯同步糖化发酵实验比较，来验证其在工业上利用木质纤维素生产乙醇的能力。

1)玉米芯的酸处理方法步骤如下：

a)配置0.5％(w/w)H₂SO₄+1.5％(w/w)H₃PO₄的稀酸溶液，混合均匀备用；

b)用天平称取一定量的玉米芯然后装入合适大小的烧杯中，按照固液比1：3的比例加入稀酸溶液充分混合；

c)将玉米芯与稀酸溶液充分混合后放入灭菌锅中进行高温处理，处理条件为127℃，60min；

d)高温高压处理结束后取出放置于室温，待冷却后通过过滤将玉米芯残渣与上清分离；

e)由于此时的玉米芯水解液酸性太强并不适合用于酵母的生长和发酵，通过添加Ca(OH)₂调节pH到6，此时会产生大量沉淀，然后过滤去除沉淀后得到的上清即为未脱毒处理的玉米芯水解液；

f)将由(d)得到的玉米芯残渣置于去离子水中浸泡过夜，中间反复换水，直至浸泡液的pH呈中性，过滤去除水分，取100g湿润的玉米芯残渣置于烘箱中烘干称重，换算得出玉米芯残渣的干重，剩下的密封置于四度冰箱保存；

g)以上获得的即为未脱毒的酸处理玉米芯水解液和玉米芯残渣(CCR)，用来进行玉米芯发酵。

2)利用玉米芯发酵的方法步骤如下：

a)将冻存发酵菌株从-80℃冰箱取出然后在YPD固体培养基上活化，37℃生化箱培养过夜；

c)配制发酵所需的培养基并灭菌，培养基配方为：碳源为玉米芯酸处理得到的145g/L CCR、412.5mL/L玉米芯酸水解上清，氮源为10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，并在灭菌冷却后加入与玉米芯残渣含量相应的15FPU/g CCR的复合纤维素酶(65.5FPU)；

d)取出第(b)步中前培养的试管，然后用分光光度计在600nm处的吸光度测量菌液浓度，通过计算转接一定量的菌液到含有30mL新鲜培养基的厌氧瓶中，保证接种量即保证发酵液起始OD₆₀₀为1；

当在42℃无氧的环境中利用145g/L CCR、412.5mL/L玉米芯酸水解上清、15FPU/gCCR纤维素酶同步糖化发酵生产乙醇时(图5)，按照NREL法测得的葡萄糖和木糖含量换算，培养基中理论上含有77.64g/L葡萄糖和75.18g/L木糖。根据乙醇产量和上清中残留的葡萄糖和木糖含量可以推断出，YZY004和YZY001在前12h均处于生长延滞期，导致葡萄糖和木糖积累，24h时，开始利用葡萄糖和木糖生产乙醇，由于葡萄糖抑制效应，36h之后木糖就不断积累，碳源主要为葡萄糖。最终在72h内，YZY001生产了30.06±0.41g/L乙醇，乙醇产率为0.42±0.01g/L/h，根据培养基中理论上的葡萄糖含量(77.64g/L)与发酵过程中消耗的木糖含量(7.82g/L)计算乙醇得率约为37.36％，发酵过程基本没有木糖醇产生；YZY004生产了34.93±1.06g/L乙醇，乙醇产率为0.48±0.01g/L/h，根据培养基中理论上的葡萄糖含量(77.64g/L)与发酵过程中消耗的木糖含量(8.64g/L)计算乙醇得率约为40.48％，发酵过程基本没有木糖醇产生。相比YZY001，YZY004对玉米芯中葡萄糖的利用能力和乙醇产率均得到有效提高，产量和生产速率提高了16.2％和14.3％。

当在37℃无氧的环境中145g/L CCR、412.5mL/L玉米芯酸水解上清、15FPU/g CCR纤维素酶同步糖化发酵生产乙醇时(图6)。培养基中的葡萄糖一直处于被消耗完的状态，木糖基本不被利用，最终在72h内，YZY001生产了26.73±0.46g/L乙醇，乙醇产率为0.31±0.01g/L/h，根据培养基中理论上的葡萄糖含量(77.64g/L)与发酵过程中消耗的木糖含量(5.39g/L)计算乙醇得率约为32.19％，发酵过程没有木糖醇产生；YZY004生产了30.09±0.97g/L乙醇，产率为0.42±0.01g/L/h，根据培养基中理论上的葡萄糖含量(77.64g/L)与发酵过程中消耗的木糖含量(4.84g/L)计算乙醇得率约为36.48％。在37℃时，YZY004和YZY001基本没有生长延滞期，但是乙醇产量不如42℃时高，可能是因为42℃时纤维素酶的活性更高，释放葡萄糖的效率更高，而在37℃时释放葡萄糖效率低，不能满足发酵菌株生长发酵的需求，这也导致了培养基中的葡萄糖一直都处于被完全利用，没有残糖剩余的状态。另外，37℃时YZY004对玉米芯中葡萄糖的利用能力和乙醇产率相比YZY001仍然更好，产量和生产速率提高了12.6％和35.5％。

以上结果表明YZY004不仅在抑制物耐受性方面得到了提高，而且更适用于高温SSF发酵生产乙醇，这对工业上木质纤维素燃料乙醇的生产具有非常重要的意义。

本发明涉及的引物信息

SEQ ID NO.:6KmIRR基因的DNA序列

1 ttagcgctgg tcgttatact ggcagatcga aagctgcgaa agagacatct tggtggacga

61 gtgtcccggc actatccgct ggggcttgca tctgaactga atgagttgca acaatggatc

121 gtcctggaaa ttcgagaact tttcctgtag cagatatagc ttgggacact ggaacttgaa

181 ctgcgaagag tagtacagct tcgcaaacgc cggcctgaga tcgttactca tcgagtcccc

241 gatacactgt agctgcaacg gaatgcagat cgagggcaac gagtagtgcg acaccttggg

301 gctgaagtat gcgggcccgt agagaatcac gttgcagaac aaccacagct cgctgacgtg

361 catttgcgag tcgccctgcg tcacgtgatc ataaaactcc aagtagtcaa agtttgggat

421 atcgaagtag aagttgatga tcgacaccaa gtacaccgag ccctccttgg atagcaacaa

481 ctggccgatg ttgtccaaag ggggaagctc ttcctccgat ttatctgcac tttgaagcac

541 ggatcgcacg ataaagctaa attcgagcaa cacttcttcc aggtcgtgga tatcgagttc

601 gaaattgttg aacatgagac agttgcggtt gagcatcaac cgcaagaact ttgactcgtt

661 caccttgatg atcctgctgg gtataactcc gctgagcgat ttcttgatcg aagaccacgt

721 gacctccgga ctagacctgt tgctgtgtcc actgttacca ctactaccac tactactact

781 accaccatcc caaccgatct cgttctcact tccgtactcg cttccggtct cgctaccgcc

841 caacacctgc acatccttat tgccgccgac gccgacactg ccgttaccct ccagttctaa

901 tccaaggccc atccccatat cgaggcgtcc catagacgcc gccgcatacg acgccgtctc

961 aaccgcgttc tgcaacaacc ggtccacgct gtgtttcacg cacgacacgc tctggtggag

1021 tttcttcaat tcgtccgaac gcttcggcgg caccacgtag tccagcgtgcacgtcaatcc

1081 gcgcttggag cacgaactac aaggccgcgg ccttgtttcc gcggaatcgcacttgatctt

1141 attctttctg caccgactgc atgacctaag cggtttcaac at

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以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母，其过表达如SEQ ID NO.6所示的KmIRR基因。

2.根据权利要求1所述的对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母，其是马克斯克鲁维酵母YZY004菌株，拉丁文学名为Kluyveromyces marxianus，保藏号为CGMCCNo.22080。

3.对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，其特征在于，通过过表达如SEQ ID NO.6所示的KmIRR基因对耐热酵母进行基因改造。

4.根据权利要求3所述的对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母的构建方法，其包括将包含KmIRR基因的质粒转化到马克斯克鲁维酵母菌株中，优选地转化到营养缺陷性马克斯克鲁维酵母菌株中，优选地转化到亮氨酸和色氨酸的双重营养缺陷性马克斯克鲁维酵母菌株中，任选地通过醋酸锂方法将包含KmIRR基因的质粒转化到马克斯克鲁维酵母菌株中。

5.生产乙醇的方法，所述方法包括将根据权利要求1或2所述的菌株接种在包含木质纤维素的培养基中进行发酵培养，从发酵液中得到乙醇。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述木质纤维素来源于农业废料、林业废料、农业残留物和厨余生活垃圾，优选地，所述木质纤维素来源于玉米芯。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述发酵在发酵罐中进行，发酵温度为37℃-42℃。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述菌株以未脱毒的酸处理玉米芯水解液和玉米芯残渣为碳源，任选地，所述酸选自H₂SO₄、盐酸和H₃PO₄。

9.根据权利要求8所述的方法，其中对未脱毒的酸处理玉米芯水解液的pH进行调节，pH调节剂选自水性氢氧化铵、NaOH、KOH和Ca(OH)₂。

10.根据权利要求1或2所述的对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母或根据权利要求3-4中任一项所述的方法生产的对木质纤维素衍生的抑制物耐受的产乙醇的耐热酵母在乙醇生产中的用途。