CN112941097B - 对木质纤维素来源抑制物耐受提高的耐热酵母菌株和应用 - Google Patents

对木质纤维素来源抑制物耐受提高的耐热酵母菌株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明通过对马克斯克鲁维酵母中一个注释为前折叠素(prefoldin)亚基4(KmPFD4))的基因在马克斯克鲁维酵母中进行了过表达获得一个菌株，该菌株对木质纤维素类生物质前处理过程中产生的抑制物耐受能力有明显提高。过表达菌株在含有抑制物混合物的培养基中培养延滞期比对照菌株明显缩短，分别为12h和24h，在厌氧培养中，乙醇的产量和生产速度比对照菌株分别提高了8.93％，和46.27％。这是首个通过过表达KmPFD4基因提高抑制物耐受的耐热酵母菌株，而该菌株的特性可以成为构建利用木质纤维素工程菌的重要出发菌株，其保藏号为：CGMCC No.21813。

Description

对木质纤维素来源抑制物耐受提高的耐热酵母菌株和应用
技术领域
本发明涉及到生物技术领域。具体来说，涉及通过工程菌株改造耐热性的马克斯克鲁维酵母，使其对木质纤维素生物质前处理过程中的产生的抑制物的耐受提高。本发明建立了一个提高酵母对木质纤维素生物质前处理过程中产生的抑制物耐受的方法，并构建了具有该耐受能力的耐热酵母菌株。
背景技术
面对化石能源逐渐枯竭、能源供应安全、全球变暖的严峻的挑战，人类对能源的需求也在急剧增加。因此，清洁、无污染、可再生能源的开发越来越得到各个国家的重视。中国具有丰富的木质纤维素类生物质资源和更低的原料和劳动力成本，在利用木质纤维素生产生物能源方面具有很大的优势，具有很强的竞争能力(Callegari et al.,2020；Qu,2007)。
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成(Brandt et al.,2013；Kumaret al.,2009)。木质纤维素的水解产物中含量最多的就是由多种戊糖和己糖组成的糖类，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等(Jonsson&Martin,2016)。可以利用葡萄糖和木糖来生产生物燃料，化学品和聚合物，如乙醇和丁醇，为人类的生活提供所需的物品(Sims etal.,2010)。和小麦、玉米这些农作物相比，利用玉米秸秆等纤维素类生物质来生产液体燃料和生物制品，不会与现有耕地的粮食需求增加竞争，更适应我国目前的经济发展(Capolupo&Faraco,2016；Qu et al.,2006)。
由于木质纤维素其化学结构致密复杂，且成分多样，很难被酶直接高效水解，限制了后续的生物转化，所以要对其进行预处理，破坏其组分之间的结构。对纤维素类生物质进行预处理不仅可以提高酶水解效率，而且可以促进后续酶解糖化过程中纤维素酶与底物的结合，是降低生产成本必不可少的环节(Octave&Thomas,2009)。预处理方法主要有：物理法、生物法、化学法和物理化学法。物理法主要是通过机械粉碎、超声震荡、高温蒸煮等方法破坏木质素和半纤维素的结合层。化学法是用各种化学试剂进行碱处理、酸处理、氧化剂处理等，溶解脱去木质素，提高纤维素酶解效率。物理化学方法是结合物理、化学的方法破坏细胞壁结构，是最具有产业化前景方法之一。生物法是利用微生物或者其产生的酶来降解木质素和半纤维素(Silveira et al.,2015)。在实际使用过程中，一般是将上述某些方法结合使用，以达到最佳的预处理效果。目前，稀酸处理是预处理中较为成熟的方法，试剂价格低廉，过程简易，反应效率高(Saha,2003)。
木质纤维素类生物质在预处理过程中，不仅本身的复杂结构会被破坏，而且会过度降解，从而产生对微生物有毒性的物质，这些物质统称为抑制物。这些小分子化合物不仅会抑制糖化步骤中纤维素酶的水解效率(Jing et al.,2009)，也会对发酵菌株的生长代谢及产物生成等产生严重的抑制作用(Wang et al.,2016)。此外，各种抑制物对发酵的抑制有协同作用，抑制物的组合可以极大地阻碍发酵(Coz et al.,2016)。根据木质纤维素原料种类和预处理条件的不同，抑制物主要分为以下几类:呋喃类(糠醛和5-羟甲基糠醛等)，弱酸类(乙酰丙酸、甲酸和乙酸等)，酚类(香草醛、香草酸和紫丁香醛等)(Chandel et al.,2013)。
在高温和酸性条件下，纤维素和半纤维素水解释放的戊糖和一些己糖会生成糠醛和5-羟甲基-糠醛(HMF)，糠醛和HMF是呋喃衍生物，通常称为“呋喃类抑制物”。抑制物的毒性作用是由醛基官能团而不是呋喃环引起的。糠醛和HMF通常是酵母和细菌生长和发酵的代表性抑制物(Parawira&Tekere,2011)，通过抑制糖酵解酶，干扰脱氢酶活性，从而使细胞生长速率和细胞量下降(Jing et al.,2009；Parawira&Tekere,2011)。
HMF和糠醛会进一步分解产生乙酰丙酸、甲酸和呋喃酸。这些酸通过改变pH梯度，破坏细胞能量的产生。有机酸会抑制酵母生长，导致酵母细胞开始死亡，并使酶部分失活(Parawira&Tekere,2011)。
酚类化合物是木质素分解产生的另一种抑制物，可能以三种不同的形式存在：酸、酮和醛(例如，儿茶酚、香草酸、丁香醛和丙醛)。据报道，酚类物质是微生物发酵最具毒性的化合物之一(Kim,2018)。酚醛物质导致细胞膜完整性丧失，干扰细胞生长和糖的转运(Kumar et al.,2020)。
为了避免在木质纤维素预处理过程中由抑制物引起的问题，可以采取几种脱毒措施。
理化方法脱毒。水解产物中的抑制物通过调节消除或脱毒是减轻抑制问题最有效的方法之一。主要包括用化学添加剂处理、活性炭处理，液-液萃取，和木质素阻断剂(Kumaret al.,2020)。
生物脱毒。也称为微生物处理，可以改善纤维素的发酵性和酶促水解。几种微生物，如Paecilpmyces variotii,Urebacillus thermosphaericus等，可以降解抑制物进行脱毒(Cao et al.,2015)。
设计发酵过程的培养方案来避免抑制问题，例如，通过使用SSF来避免糖对纤维素分解酶的抑制，或者通过分批补料或连续培养而不是分批过程来进行(Olofsson et al.,2008)。但是，高产量、高生产率、高产品浓度以及再循环工艺是工业发酵的重要指标，另外由于蒸馏过程更昂贵，因此从含糖量低的稀释水解物中生产乙醇会带来高运营成本(Lin&Tanaka,2006)。
筛选抑制物耐受的微生物。解决抑制问题的其他可能性包括：从自然或工业环境中筛选对抑制剂具有高抗性的菌株或者在预处理后的带有抑制成分的培养基中筛选适应性进化的微生物(Almario et al.,2013)。
通过基因/代谢工程改造，提高微生物对抑制物的耐受性。利用基因工程，已经开发出对木质纤维素水解物显示出改进的抗性的重组微生物。通过遗传/代谢工程使用重组菌株被广泛应用于克服发酵过程中的抑制问题(Hasunuma et al.,2014)。但是这类基因工程构建的酵母常常只对一两种抑制物有耐受能力，而木质纤维素生物质前处理产生的抑制物种类较多，而且在抑制酵母生长和发酵上具有协同作用，因此，能够对混合抑制物耐受的菌株更为重要。
发明内容
本发明通过过表达前折叠素(prefoldin)的第4亚基(KmPFD4)构建耐热酵母菌株，该菌株对木质纤维素衍生的抑制物的耐受性获得了提高，乙醇的产量和生产速度也得到了提升。
本发明通过将耐热的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中过表达KmPFD4基因，成功获得了一个对木质纤维素生物质来源抑制物耐受提高的菌株。该菌株在包括乙酸盐、糠醛、酚类的复合抑制物存在时，生长速率和生物量的积累都有提高，在这些抑制物存在时，厌氧发酵的乙醇产量和速度分别提高了8.93％,和46.27％。上述耐热工程菌株已于2021年2月5日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号分别为CGMCC No.21813(YSY005)。
本发明所述菌株通过下述方法得到：以马克斯克鲁维酵母菌株YHJ010(Hong etal.,2007)(尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸的三重营养缺陷性)作为宿主，在其中过表达KmPDF4基因，获得木质纤维素生物质来源抑制物耐受提高的菌株。此菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.21813。
本发明中KmPFD基因表达的质粒为pSY003，该质粒的构建方法如下：
依据马克斯克鲁维酵母基因组中KmPFD4基因(GenBank accessionNo.:BAP73153)的序列设计引物KmPFD4-F(SEQ ID No.1)和KmPFD4-R(SEQ ID No.2)，以马克斯克鲁维酵母基因组为模板进行PCR扩增，得到包括KmPFD4基因开放阅读框(open reading frame,ORF)及上下游序列的DNA片段。将此片段插入到pGEM-Teasy载体中，得到质粒pSY001。
以pSY001为模板，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物)和引物KmPFD4-EcoRI-F(SEQ ID No.3)和KmPFD4-NotI-R(SEQ ID No.4)，进行PCR扩增，得到KmPFD4的开放阅读框。此阅读框在EcoR I和Not I酶切后插入到表达载体YEGAP中，获得KmPFD4的表达载体pSY003.
本发明的KmPFD4过表达耐热工程酵母菌株构建方法如下：
酿酒酵母的ScURA3表达框，利用引物ScURA3-SmaI-F(SEQ ID No.5)和ScURA3-SmaI-R(SEQ ID No.6)以质粒YEUGAP为模板通过PCR扩增后，转化到马克斯克鲁维酵母菌株YHJ010中，获得菌株YSY002。然后将质粒pSY003转化到YSY002中，获得KmPFD过表达菌株YSY005。同时YEGAP质粒和ScURA3表达框依次转化到YHJ010中，获得同样营养缺陷型(LEU2)的对照菌株YSY007。
本发明的KmPFD4过表达耐热工程酵母菌株YSY005在含有木质纤维素衍生的抑制物的培养中培养，生长状态有显著改善，相比对照菌株YSY007具有更短的延滞期(分别为12h和24h)。培养39小时，YSY005和YSY007的菌密度(OD600)分别为17.19和9.57。证明表达KmPFD4具有提高该酵母菌株对抑制物的耐受能力。
本发明的KmPFD4过表达耐热工程酵母菌株在含有木质纤维素衍生的抑制物的培养和葡萄糖的培养基中进行厌氧培养，YSY005在36h内生产了35.11g/L的乙醇，生产速率为0.98g/(L·h)，而YSY007在48h仅生产了32.23g/L乙醇，生产速率为0.67g/(L·h)。YSY005生产乙醇的产量和速率比对照菌株YSY007分别提高了8.93％,和46.27％。
综上所述，本发明提出以下实施方案：
1、KmPFD4基因在构建利用木质纤维素类生物质的工程菌中的用途。
2、根据项目1所述的用途，所述KmPFD4基因的序列为GenBank accession No.:BAP73153。
3、一种表达载体，其特征在于包含KmPFD4基因。
4、一种宿主细胞，其特征在于包括项目2所述的表达载体。
5、一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，其保藏编号为CGMCCNo.21813，其特征在于过表达KmPFD4基因。
6、一种项目5所述的马克斯克鲁维酵母在利用木质纤维素类生物质生产液体燃料或生物制品中的用途。
7、一种提高马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)对木质纤维素类生物质前处理过程中的产生的抑制物的耐受的方法，包括在马克斯克鲁维酵母中过表达KmPFD4基因。
8、根据项目7所述的方法，其中所述前处理选自物理法、生物法、化学法和物理化学法中的一种或多种，用于破坏木质纤维素类生物质的致密结构，使木质纤维素类生物质容易被酶水解。
9、根据项目7所述的方法，所述抑制物包括弱酸类化合物、醛类化合物和酚类化合物中的一种或多种。
10、根据项目9所述的方法，所述弱酸类化合物包括乙酰丙酸、甲酸和乙酸，所述醛类化合物包括糠醛和5-羟甲基糠醛，所述酚类化合物包括香草醛、香草酸和紫丁香醛。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在马克斯克鲁维酵母中过表达KmPFD4基因实现了酵母对木质纤维素来源的多种抑制物的耐受的提高，构建的酵母在多种抑制物混合物存在时生长的延滞期为12小时，而对照菌株为24小时，培养39小时后，过表达菌株的菌密度(OD600)达17.19，而对照菌株仅9.57；在厌氧条件下培养，抑制物存在时，过表达菌株比对照菌株的乙醇产量和生产速率分别提高了8.93％和46.27％。这种表达一个基因就能同时提高多种抑制物耐受的改造的报导较少，尤其是在耐热酵母菌株中更少见。此过表达KmPFD4的耐热酵母菌株在构建高效利用木质纤维素生物质工程菌方面有很大潜在前途。据我们所知，目前还没有KmPFD4在木质纤维素来源的多种抑制物的耐受方面的研究。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：
图1PCR扩增KmPFD4基因DNA的琼脂糖电泳结果。
图2菌株的构建过程。
图3KmPFD4过表达菌株YSY005和对照菌株YSY007在有无抑制物时生长情况。A无抑制物；B有抑制物。
图4.本发明中KmPFD4过表达菌株YSY005和对照菌株YSY007厌氧发酵的结果。A生长曲线；B葡萄糖消耗；C乙醇生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
保藏说明
本发明的能共利用葡萄糖和木糖的耐热工程酵母菌株马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YSY005已经于2021年2月5日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其对应的保藏号为CGMCC No.21813(YSY005菌株)。
试剂和菌株：本发明中的所有实际均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中，葡萄糖、乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、邻苯二酚、香兰素、丁香醛、4-羟基苯甲醛酵母基本氮源，尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸，胶回收试剂盒以及所有的限制性内切酶均来源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，T4 DNA连接酶以购自于大连宝生物公司，pGEM-T-Easy载体购自Promega公司。大肠杆菌Escherichia coli DH5α菌株作为DNA操作时使用的宿主菌。包含100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基(1％胰蛋白胨,0.5％酵母提取物,1％ NaCl)用作培养E.coli。葡萄糖合成培养基(葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l)，依需要补充色氨酸20mg/l或亮氨酸30mg/l，主要用于酵母转化和转化子筛选。YPD培养基(10g/l酵母提取物，20g/l细菌蛋白胨，20g/l葡萄糖)用于酵母前培养。
本发明中使用的引物如表1所示。
表1
Figure GDA0003933108490000071
实施例1KmPFD4过表达菌株的构建:
1.KmPFD4过表达质粒的构建
1)KmPFD4基因的克隆。以马克思克鲁维酵母YHJ010基因组为模板，使用PrimeSTARDNA Polymerase和引物KmPFD4-F(SEQ ID No.1)，KmPFD4-R(SEQ ID No.2)扩增KmPFD4基因片段，通过在末端加上碱基“A”后，连入T-载体pGEM-T easy,获得YSY001。
提取马克斯克鲁维酵母的基因组DNA的方法为具体步骤为：
a)取冻存菌划线至YPD平板，37℃培养箱培养24小时。
b)挑取单克隆，接种于5ml YPD液体培养基中，37℃摇床，250rpm培养过夜。
c)12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。
d)取500μl无菌水重悬菌体，转移至1.5ml离心管中，12000rpm，离心1分钟，弃上清，收集菌体。
e)加入200μl裂解缓冲液(EDTA(1mM),TritonX-100(2％(w/v)),NaCl(100mM),SDS(1％(w/v)),Tris-Cl(10mM,pH 8.0))重悬菌体。
f)向其中加入0.3g玻璃珠(425-600nm，sigma，美国)和200μl酚氯仿溶液(25：24：1，pH 8.0)，高速涡旋震荡3分钟。
g)再加入200μl 1x TE缓冲液(1mM EDTA,10mM Tris-Cl，pH 8.0)，快速轻微震荡30秒。
h)12000rpm离心5分钟，将上层的水相转移至新的1.5ml离心管中，向其中加入1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。
i)4℃，12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用400μl 1x TE缓冲液重悬。
j)向其中加入2μl 2ng/ml的RNA酶A(中国上海，生工生物)，37℃温浴5分钟。
k)加入40μl 3M醋酸钠(pH 5.2)和1ml冰冷的无水乙醇，颠倒混匀。
l)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用1ml冰冷的75％乙醇清洗，再次离心去上清。
m)沉淀于室温下干燥10分钟，用40-100μl 1x TE缓冲液重悬，即为提取的酵母基因组DNA。
PCR扩增体系如下：
Figure GDA0003933108490000091
PCR扩增程序如下：
Figure GDA0003933108490000092
PCR产物进行电泳，目标大小在1.6Kb左右(图1)，复合预期大小。将PCR产物采用Promega公司的胶回收试剂盒按试剂盒说明书进行胶回收。
PCR产物回收后进行加“A”。
反应体系：
Figure GDA0003933108490000093
Figure GDA0003933108490000101
加A反应程序：72℃，60分钟；然后与pGEM-T easy进行“T”“A”连接。
连接反应体系如下：
Figure GDA0003933108490000102
22℃连接5小时
将连接产物转化到DH5α，37℃培养过夜。用引物KmPFD4-F(SEQ ID No.1)，KmPFD4-R(SEQ ID No.2)菌落PCR筛选阳性克隆。PCR反应体系和反应程序与前面KmPFD4基因扩增相同。将阳性克隆送上海生工进行测序，测序结果与GenBank accession No.:BAP73153的DNA序列对比，序列正确的保留，获得质粒为pSY001。
2)KmPFD4表达质粒的构建。
EcoR I和Not I双酶切质粒YEGAP(Hong et al.,2007)，同时以pSY001为模板，用引物KmPFD4-EcoRI-F(SEQ ID No.3)，KmPFD4-NotI-R(SEQ ID No.4)和PrimeSTAR DNAPolymerase扩增KmPFD4开放阅读框片段，PCR反应条件和KmPFD4基因扩增条件相同，KmPFD4开发阅读框片段也用EcoR I和Not I双酶切。将获得的载体片段和KmPFD4开发阅读框片段用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌中，37℃培养过夜，菌落PCR筛选阳性克隆，PCR条件也与KmPFD4基因扩增条件相同。获得的KmPFD4过表达质粒YSY003.
EcoR I和Not I双酶切体系如下：
Figure GDA0003933108490000103
Figure GDA0003933108490000111
酶切程序：37℃反应8h。
3)KmPFD4过表达菌株的构建。
以YEUKmPGK为模板，ScURA3-SMAI-F(Sequence ID no.5)和ScURA3-SMAI-R(Sequence ID no.6)为引物，用PrimeSTAR DNA Polymerase扩增，得到ScURA3片段。这里的PCR反应体系与扩增KmPFD4基因的体系，除引物和模板之外都相同。PCR反应条件也一致。扩增得到的ScURA3片段转化到宿主菌YHJ010里(Hong et al.,2007)，使用含有亮氨酸与色氨酸，但是不含有尿嘧啶的合成培养基筛选克隆，获得的菌株为YSY002(图2).
以质粒pSY003为模板，Expression-F(SEQ ID No.7)和Expression-R(SEQ IDNo.8)为引物，用PrimeSTAR DNA聚合酶扩增，得到带ScTRP1标签的KmPFD4过表达片段。这里的PCR反应体系与扩增KmPFD4基因的体系，除引物之外都相同。PCR反应条件也一致。扩增得到的片段转化到YSY002里，使用含有亮氨酸，不含色氨酸及尿嘧啶的合成培养基筛选，得到同时带有ScTRP1标签和ScURA3标签的KmPFD4过表达菌株YSY005(图2)。
同时进行了对照菌株的构建。将空载体YEGAP和ScURA3片段依次转化到YHJ010菌株中，在合成培养基上筛选，获得YSY006和YSY007菌株，其中YSY007和YSY005具有相同的遗传缺陷型，但KmPFD4基因没有过表达，是本发明的对照菌株(图2)。
实施例2YSY005对多种抑制物的耐受测试
1)KmPFD4过表达菌株及对照菌株(YSY005与YSY007)，划线至YPD固体培养基上，37℃培养箱中培养；
2)挑取单克隆至5mL YPD液体培养基中，过夜培养(37℃、250rpm)至对数期；
3)配置含有抑制物混合物的YPD液体培养基，分装30mL至锥形瓶中；抑制物混合物为1.9g/L乙酸+0.95g/L呋喃衍生物(糠醛和5-羟甲基糠醛各0.475g/L)+0.19g/L酚类化合物(邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛各0.0475g/L))。
4)将前培养按起始OD600＝0.3的量转接菌至上述培养基中；
5)摇床中培养(42℃、250rpm)，期间观察菌体生长状态，不同时间段取出500μL菌液，测量OD600。
6)结果显示(图3)，相比对照菌株YSY007具有更短的延滞期(分别为12h和24h)。培养39小时，他们的菌密度(OD600)分别为17.19和9.57。证明表达KmPFD4具有提高该酵母菌株对抑制物的耐受能力。
实施例3YSY005在多种抑制物存在时的发酵测试
1)KmPFD4过表达菌株及对照菌株(YSY005与YSY007)，划线至YPD固体培养基中，37℃培养箱中培养；
2)挑取单克隆至5mL YPD液体培养基中，过夜培养(37℃、250rpm)至对数期；
3)配置含有抑制物混合物[1.9g/L醋酸+0.95g/L糠醛+0.19g/L酚(邻苯二酚、丁香醛、香兰素和4-羟基苯甲醛各0.0475g/L)]的YPD液体培养基，分装20mL至无氧发酵小瓶中；由于采用不同的前处理方法，产生的抑制物种类、浓度和比例会不同，本发明采用了oliva等研究中采用的多种抑制配制成抑制物混合物(Oliva et al.,2004)来验证菌株对抑制物的耐受性。
4)按起始OD600＝0.3的量转接菌至上述培养基中；
5)摇床中培养(42℃、250rpm)，期间观察菌体生长状态，菌体开始繁殖生长时于不同时间段取出500μL菌液，一部分菌液测量OD600，一部分菌液离心(12000rpm、5min)取上清，-20℃保存备用；
6)发酵进行60后，培养基上清，离心(12000rpm、10min)取上清进行HPLC分析。HPLC(进样量20μL、流速0.3mL/min、流动相：0.025M硫酸)检测葡萄糖消耗量及乙醇产量情况,酵母细胞密度通过OD600测定。
7)结果显示(图4)，抑制物混合物存在时，无论是菌株生长状态，葡萄糖消耗速率还是乙醇产率及产量方面，YSY005菌株均优于YSY007菌株。YSY005在36h内生产了35.11g/L的乙醇，生产速率为0.98g/(L·h)，而YSY007在48h才生产了32.23g/L乙醇，生产速率为0.67g/(L·h)。YSY005生产乙醇的产量和速率比对照菌株YSY007分别提高了8.93％,和46.27％。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Figure IDA0003000984690000011
Figure IDA0003000984690000021

Claims (7)

1.KmPFD4基因在构建利用木质纤维素类生物质的工程菌中的用途，其特征在于所述KmPFD4基因的序列为GenBank accession No.:BAP73153，所述工程菌为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
2.一种马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，其保藏编号为CGMCCNo.21813，其特征在于过表达KmPFD4基因。
3.一种权利要求2所述的马克斯克鲁维酵母在利用木质纤维素类生物质生产液体燃料或生物制品中的用途。
4.一种提高马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)对木质纤维素类生物质前处理过程中产生的抑制物的耐受的方法，包括在马克斯克鲁维酵母中过表达KmPFD4基因，其中所述KmPFD4基因的序列为GenBank accession No.:BAP73153。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述前处理选自物理法、生物法、化学法和物理化学法中的一种或多种，用于破坏木质纤维素类生物质的致密结构，使木质纤维素类生物质容易被酶水解。
6.根据权利要求4所述的方法，所述抑制物包括弱酸类化合物、醛类化合物和酚类化合物中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的方法，所述弱酸类化合物包括乙酰丙酸、甲酸和乙酸，所述醛类化合物包括糠醛和5-羟甲基糠醛，所述酚类化合物包括香草醛、香草酸和紫丁香醛。
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