KR101216426B1 - 해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법 - Google Patents

해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 해조류 원초 또는 해조류에서 추출한 다당류 물질에 분해효소 및/또는 가수분해 촉매를 처리하여 단당류를 생성하는 단계; 및 상기 단당류를 미생물에 의해 발효시키는 단계를 포함하는 해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오연료의 제조 방법은 바이오매스의 원료로 해조류를 사용하기 때문에 원료수급 문제를 획기적으로 개선할 수 있고, 종래 목질계 원료의 이용시 필수적으로 수반되는 리그닌 제거 공정이 필요하지 않아 공정 비용을 낮출 수 있으므로, 경제적 및 환경적으로 매우 유리하다.

Description

해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법{METHOD OF PRODUCING BIOFUEL USING SEA ALGAE}
본 발명은 바이오연료의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 해조류를 이용한 바이오 연료의 제조 방법에 관한 것이다.
바이오연료는 바이오매스(biomass)를 원료로 하여 얻어지는 에너지를 통칭하는 것으로서, 직접 연소, 알코올 발효, 메탄 발효 등을 통해 얻어진다. 바이오연료의 원료가 되는 물질인 바이오매스는 크게 당질계(사탕수수, 사탕무 등), 전분질계(옥수수, 감자, 고구마 등), 목질계(나무, 볏짚, 폐지 등)로 나누어지는데, 당질계의 경우 원료를 비교적 간단한 전처리 과정 후 이어지는 발효 공정을 통해 곧바로 바이오연료로 전환이 가능하지만, 전분질계와 목질계의 경우에는 적절한 전처리 과정과 당화 공정을 거친 당화액을 이용한 발효 공정을 통해 바이오연료를 제조할 수 있다. 목질계는 도시 폐기물 형태의 폐목재나 삼림 곳곳에 흩어져 있는 임산 부산물을 원료로 이용할 수 있으며, 식량으로서 활용가치가 없어 원료 수급의 안정성은 확보될 수 있으나, 공정상 반드시 수반되어야 하는 리그닌 제거 전처리 공정으로 인한 공정비 상승과 함께, 목질계 셀룰로오스 기질의 특징인 수소결합으로 이루어진 crystalline 구조로 인해 당화 수율이 낮아 경제성이 낮은 단점이 있다.
수송용 대체연료로서 바이오연료의 성공적인 상업화는 가솔린 대비 바이오연료, 예컨대 바이오에탄올의 가격 경쟁력 확보에 있다. 통상적으로 바이오연료 제조 단가 중 원료비와 공정비가 차지하는 비율은 바이오매스의 종류와 공정에 따라서 편차가 크다. 예컨대, 사탕수수나 사탕무를 이용하는 당질계의 경우 원료비 : 공정비가 약 75 : 25 정도인 반면, 옥수수, 감자, 카사바 등의 전분질계는 약 50 : 50 이고, 목질계의 경우는 약 25 : 75 정도이다.
그러나, 목질계를 제외하고는 현재 상용화된 바이오연료 생산 기술은 인간이 식량으로 사용할 수 있는 당질계 또는 전분질계 원료를 사용하므로 식량을 에너지원으로 사용한다는 문제뿐만 아니라, 앞으로 식량 수요가 늘어날 경우 원료 수급 문제가 발생할 수 있으며, 경제적인 측면에서도 곡물을 사용하는 것은 원료비용 측면에서 문제가 된다. 또한, 옥수수 재배는 상당량의 농약과 질소비료를 필요로 할 뿐 아니라 다른 작물에 비해 토양을 심하게 부식시키는 환경적인 단점도 존재한다.
바이오 에탄올은 2006년 현재 전세계적으로 약 513억 리터 규모로 생산되고 있다. 당질계를 이용한 바이오연료, 구체적으로 바이오에탄올의 전 세계 생산량은 약 187억 리터(2006년 기준)이고, 주요 생산국은 브라질, 인도, 대만이며, 이중 브라질이 178억 리터를 생산할 정도로 브라질이 주도하고 있다(글로벌바이오에너지파트너십(GBEP), 2006). 브라질은 풍부한 자원인 사탕수수를 원료로 수송용 바이오에탄올 생산이 활발히 진행되고 있으며, 실제 다양한 형태의 에탄올 혼합 가솔린(gasohol)이 보급되고 있다. 2003년에는 에탄올과 가솔린의 함량이 변화해도 운행이 가능한 FFV(Flexible Fuel Vehicle)이 판매되기 시작해으며, 2005년 5월 현재 총 승용차 판매수의 약 50％를 점유한 상태이다.
옥수수를 이용한 바이오에탄올의 전 세계 생산량은 약 198억 리터(2006년 기준)이고 주요 생산국은 미국, 유럽, 중국이며 이중 미국이 185억 리터를 생산할 정도로 주도하고 있다(표 1 참조). 미국은 오일쇼크 직후인 1978년에 에너지세법(Energy Tax Act)를 제정하여 에탄올 10％ 이내를 함유하는 가솔린에 대해 갤런당 4 $의 연방세 감세혜택을 주어 보급을 확대하고 있다. 이와 같이 미국은 넓은 경작지와 풍부한 자원인 옥수수를 원료로 수송용 바이오연료의 생산이 활발히 진행되고 있고, 신재생에너지 기술개발을 통해 석유의존경제에서 탈피할 고급 에너지 기술을 개발하고 있으며, 대체 에너지 개발의 일환으로 에탄올 생산기술의 개발을 추진하고 있고, 옥수수를 이용한 연료용 에탄올 생산 기반이 확대되는 추세이다.
목질계를 이용한 바이오연료 제조기술은 아직 상용화 단계까지 이르지 못했으므로 관측된 산업동향은 없다. 하지만 캐나다의 Iogen 사의 경우 목질계 바이오매스를 이용한 제조기술을 활발히 개발하고 있고, 미국은 차세대 바이오매스로서 농업 폐기물 및 식물 원료로부터 에탄올을 추출하는 기술을 2012년까지 상용화하기 위해 2007년 예산에 150백만불을 투입할 예정이며, 이를 통해 전체 수송연료의 30％를 에탄올로 대체하는 것을 추진 중에 있다.
바이오에탄올의 원료별 경제성 수치 비교(출처: DOE, EPA, Worldwatch Institute)
구분 옥수수 에탄올 사탕수수 에탄올 목질계 에탄올
전세계 생산량(ℓ) 198억(2006) 187억(2006) 0
단위면적당 생산량
(ℓ/ha)		 2,500 5,700~7,600 5,500
(스위치그래스)
생산비용
($/ℓ)(2007)		 0.29~0.33 0.19~0.23 R&D 단계
소매가
($/ℓ)		 휘발유: 0.80
E85: 0.69
E85: 0.981) 		E25: 1.30
E100: 0.77
E100: 1.03		 R&D 단계
에너지 Balance2 ) 1 : 1.3 1 : 8 1 : 2~36
(생산방식 편차)
온실가스 배출량
(g/ℓ)
(휘발유: 2437.8)		 1935.9
(22% 적음)		 1075.5
(56% 적음)		 227.05
(91% 적음)
1) 휘발유 1리터에 상응하는 에너지
2) 바이오연료 생산에 투입된 화석연료 투입량 대비 생산된 바이오에너지 산출량
한편, 해조류는 크게 대형조류(macroalgae)와 미세조류(microalgae)로 나누어지며 대형조류에는 홍조류, 갈조류, 녹조류, 미세조류에는 클로렐라, 스피루리나 등이 있다. 해조류의 생산량은 전 세계적으로 연간 약 1,400만 톤에 달하며 2020년에는 약 2,200만 톤 이상으로 증가될 것으로 예측되고 있다. 이러한 생산량은 전체 양식 생산량의 약 23％에 해당하는 것으로서, 이 중 90％ 이상이 미역, 다시마 등의 갈조류와 김, 우뭇가사리, 꼬시래기 등의 홍조류로 이루어져 있다. 우리나라의 해조류 양식 생산량은 현재 약 50만 톤으로 90년대 중반의 약 70만 톤 보다는 다소 줄어들었으나, 양식 어장의 총 면적은 약 7만 ha로 90년대 중반의 약 6만 ha보다 증가하였다.
해조류는 여타 바이오매스에 비해 생장성이 훨씬 우수하고(아열대 지방의 경우 연 4～6회 수확 가능), 드넓은 바다를 이용할 수 있으므로 가용재배 면적이 넓으며, 담수, 토지, 비료 등 원가가 높은 자원의 사용이 적다는 장점이 있다. 또한, 목질계의 경우 반드시 제거해야 하는 리그닌 성분이 없으므로 바이오연료의 제조 공정이 간단하고, 총에너지 전환 수율도 높다. 뿐만 아니라 해조류는 이산화탄소 연간 흡수량이 ha당 36.7톤으로서 목질계보다 5～7배 높은 장점이 있으며, E20(20％ 에탄올이 첨가된 휘발유)을 사용한다고 가정할 때 연간 온실가스 저감율은 약 27％로, 이를 금액으로 환산 시 약 3,000억원의 탄소세 절감효과를 거둘 수 있다(표 2).
육상식물과 해양식물의 특징 비교
구 분 육상식물 해양식물
당전분질계(1세대) 목질계(2세대) 해조류(3세대)
원료 사탕수수, 옥수수 목재류 우뭇가사리, 꼬시래기, 코토니
원료 생산 주기 1년에 1~2회 최소 8년 이상 1년에 4~6회
단위면적당 원료 생산량(톤/ha) 180 9 565
단위면적당 CO2 흡수량(톤/ha) 5-10 4.6 36.7
제조 공정 간단 복잡(리그닌 제거) 간단(리그닌 부재)
재배환경 태양광, CO2, 담수, 토지, 비료 태양광, CO2, 담수, 토지, 비료 태양광, CO2, 해수
그러나, 해조류는 지금까지 주로 전기영동 시약, 비료, 유화제, 항암제 등 정밀화학 소재 및 의학 소재에 이용하거나, 식용, 약용 등 건강식품류로만 활용되어 왔을 뿐, 이를 이용한 바이오연료 개발에 관한 연구는 전무한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 바이오연료 제조 방법상의 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로서, 종래 바이오연료의 원료로 사용되던 당질계, 전분질계 또는 목질계 원료 대신 해조류를 이용함으로써 원료수급의 불안정, 낮은 당화 효율 등과 같은 문제점을 개선한 해양 신바이오매스를 원료로 이용한 바이오연료의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법은,
해조류 원초 또는 해조류에서 추출한 다당류 물질에 분해효소 및/또는 가수분해 촉매를 처리하여 단당류를 생성하는 단계; 및
상기 단당류를 미생물에 의해 발효시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오연료로는 C1 내지 C4의 알코올, C2 내지 C4의 케톤 등이 될 수 있으며, 이중에서 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 아세톤인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 다당류 물질로는 우무, 전분, 섬유소, 카라기난, 알긴산 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오연료의 제조 방법에서 사용되는 해조류로는 대형조류 또는 미세조류가 제한없이 사용될 수 있으며, 상기 대형조류에는 홍조류, 갈조류, 녹조류 등이 있고, 미세조류에는 클로렐라, 스피루리나 등이 있다. 상기 홍조류로는 우뭇가사리, 김, 코토니, 개도박, 둥근돌김, 개우무, 새발, 참풀가사리, 꼬시래기, 진두발, 참도박, 가시우무, 비단풀, 단박, 돌가사리, 석목, 지누아리 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 이 중에서도 우뭇가사리를 사용하는 것이 바람직하다. 우뭇가사리는 홍조류중에서 종의 종류가 가장 다양하고 생장성이 우수하며, 건조중량 기준으로 셀룰로오스 성분인 섬유소가 약 15～25％, 갈락탄이 주성분인 우무가 약 50～70％ 정도 차지하며, 이 외에 15％ 미만의 단백질과 7％ 미만의 지질로 구성되어 있다. 상기 갈조류로는 미역, 다시마, 헛가지말, 민가지말, 패, 고리매, 미역쇠, 감태, 곰피, 대황, 쇠미역사촌, 모자반, 괭생이 모자반, 지충이, 톳 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 갈조류는 다세포체이고, 조류 중에서 가장 잘 분화되어 있다. 상기 녹조류로는 청태, 해캄, 파래, 청각, 구슬청각, 옥덩굴, 염주말 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 녹조류는 엽록소를 갖고 있어 광합성에 의해 전분류를 만든다. 상기 갈조류와 녹조류의 구성성분을 살펴보면, 갈조류에는 알긴산이 약 30～40％, 섬유소가 약 5～6％ 포함되어 있고, 녹조류에는 탄수화물이 주성분인 전분류가 약 40～50％, 섬유소가 5％ 미만 함유되어 있다.
우무는 갈락토오스 폴리머로 이루어진 갈락탄이 주성분이며, 갈락탄은 적절한 저분자화 과정을 통해 갈락토오스 및 3,6-안하이드로갈락토오스 등의 단당류로 전환될 수 있다. 섬유소는 셀룰로오스로 이루어진 물질로서, 우뭇가사리의 경우 전체 성분의 약 15～25％를 차지한다. 상기 셀룰로오스는 적절한 효소나 산 촉매를 이용한 당화 공정을 통해 단당류인 글루코오스로 전환될 수 있다. 상술한 갈락토오스와 글루코오스는 발효 공정을 통해 바이오연료로 전환될 수 있는 전구체로 사용된다.
전분은 녹말이라고도 불리며, 녹색 식물의 엽록체 안에서 광합성으로 만들어져 저장되는 탄수화물로서, 글루코오스를 구성단위로 하는 다당류이다. 상기 전분은 적절한 효소나 산 촉매를 이용한 당화 공정을 통해 단당류인 글루코오스로 전환될 수 있다.
상기 해조류에서 우무, 섬유소, 전분, 카라기난, 알긴산 등과 같은 다당류 물질을 추출하기 위한 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에 알려진 어떠한 방법도 사용가능하다. 한 바람직한 구현예에 따르면, 해조류를 알칼리 수용액에 일정시간 침지시킨 후 물로 세척하고, 상기 세척된 해조류를 산성 약품으로 이루어진 추출용매에 일정시간 침지시켜 우무, 카라기난, 알긴산 성분을 추출한 후, 잔여 섬유소 및 전분류를 수집하는 단계를 통해 우무, 카라기난, 알긴산 성분 및 전분 또는 섬유소를 추출할 수 있다. 이때, 추출 온도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 80～150℃ 범위인 것이 바람직하다. 상기 산성 약품으로는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4(perchloric acid), H3PO4(phosphoric acid), PTSA (para-toluene sulfonic acid) 또는 상용 고체산 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 알칼리 수용액으로는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 암모니아 수용액 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
우무, 전분, 섬유소, 카라기난, 알긴산 등과 같은 다당류 물질 추출물에 적절한 분해효소 및/또는 가수분해 촉매를 처리하여 당화시킴으로써 단당류를 얻을 수 있다. 상기 단당류로는 갈락토오스, 3,6-안하이드로갈락토오스, 글루코오스, 푸코오스, 람노오스, 크실로오스, 만노오스 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 당화 공정은 크게 직접 당화법과 간접 당화법으로 나눌 수 있으며, 이하 상기 2가지 당화 공정과 이를 통해 얻어진 당화액을 이용한 바이오연료 발효방법에 대해 설명한다.
먼저, 간접 당화법을 이용한 당화 방법의 한 예로서, 우무를 출발 물질로 이용하여 당화하는 방법에 대해 설명한다. 우무는 갈락토오스 폴리머인 갈락탄이 성분의 대부분을 차지하고 있으며, 상기 갈락탄은 적절한 당화 공정(저분자화 공정)을 통해 발효가능한 단당류인 갈락토오스 또는 3,6-안하이드로갈락토오스로 전환될 수 있다. 이때, 당화 공정에 사용되는 방법으로는 크게 산 가수분해법과 효소 가수분해법이 있다. 산 가수분해법은 적절한 산 가수분해용 촉매를 이용하여 갈락탄을 저분자화하는 방법으로서, 사용 가능한 촉매로는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4 , H3PO4, PTSA 또는 상용 고체산 등이 있다. 이때, 사용된 산의 농도 및 반응 온도와 반응 시간 등을 잘 설정함으로써 갈락토오스의 당화 수율이 최대가 됨과 동시에 생성된 갈락토오스가 과분해되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 효소를 이용하여 우무를 당화하는 방법은 산 가수분해법에 비해 전환 효율이 저하될 수 있으나, 최적의 갈락토시다제 효소 군을 선택하면 이를 극복할 수 있다. 갈락탄을 가수분해하는 효소로는 β-아가라제 및 β-갈락토시다제가 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 β-아가라제는 수도모나스 아틀란티카(Pseudomonas atlantica) 또는 대장균(E. coli)으로부터 얻어질 수 있으며, β-갈락토시다제는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae) 또는 보바인 테스테스(Bovine testes)로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단당류는 우무에 대해 0.05～30％ 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 또는 PTSA와 같은 가수분해 촉매를 이용하여 60～200℃ 온도에서 0～6시간 반응시킴으로써 생성된다.
간접 당화법을 이용한 당화 방법으로서, 섬유소를 출발 물질로 이용하여 당화하는 방법을 살펴본다. 섬유소는 셀룰로오스로 이루어진 물질로서 당화 효소 및/또는 산 가수분해용 촉매를 이용하여 가수분해되어 글루코오스로 전환될 수 있다. 셀룰로오스를 가수분해하는 상용 효소로는 현재 약 52종이 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능한 β-글루코시다제(생산 균주: 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)), 엔도-1,4-β-글루카나제(생산 균주: 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 트리코더마 롱지브라치아텀(Trichoderma longibrachiatum), 탈라로마이세스 에머소니(Talaromyces emersonii)), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 및 트리코더마 비리데(Trichoderma viride))와 같은 효소가 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 셀룰로오스를 가수분해하는 촉매로는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 또는 상용 고체산 등이 사용될 수 있으며, 이때 사용된 산의 농도 및 반응 온도와 반응 시간 등을 잘 조절함으로써 글루코오스의 당화 수율이 최대가 됨과 동시에 생성된 글루코오스가 과분해되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단당류는 섬유소에 대해 0.05～50％ 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 또는 PTSA와 같은 가수분해 촉매를 이용하여 80～300℃의 온도에서 반응시킴으로써 생성된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단당류는 섬유소에 대해 분해효소를 이용하여 0 초과～144시간 반응시킴으로써 생성된다.
간접 당화법을 이용한 당화 방법으로서, 전분을 출발 물질로 이용하여 당화하는 방법을 살펴본다. 전분은 글루코오스로 이루어진 물질로서 당화 효소 및/또는 산 가수분해용 촉매를 이용하여 쉽게 가수분해되어 글루코오스로 전환될 수 있다. 전분을 가수분해하는 상용 효소로는 아밀라아제가 일반적으로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 아밀라아제는 다당류를 가수분해하는 효소로서 녹말(아밀로오스 및 아밀로펙틴)이나 글리코겐과 같이 주로 α-결합의 글루코오스로 이루어져 있는 다당류에 작용한다. 작용 양식에 따라 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제의 3종으로 나누어진다. 아밀라아제를 생산하는 미생물로는 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 나이거, 라이조프스 오리자에(Rhizopus oryzae), 사크라마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 라이케니포미스(Bacillus licheniformis), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 또는 초고온성 미생물(Pyrococcus furiosus) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전분을 가수분해하는 촉매로는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 또는 상용 고체산 등이 사용될 수 있으며, 이때 사용된 산의 농도 및 반응 온도와 반응 시간 등을 잘 조절함으로써 글루코오스의 당화 수율이 최대가 됨과 동시에 생성된 글루코오스가 과분해되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
직접 당화법을 이용한 당화 방법은, 섬유소 및/또는 우무, 카라기난이 모두 포함된 해조류 또는 전분 및/또는 알긴산, 섬유소가 모두 포함된 해조류 원초를 출발 물질로 이용하여 상기 물질들을 직접 당화하는 공정을 포함한다. 이때 효소 가수분해법과 산 가수분해법을 이용할 수 있다. 효소 가수분해법의 경우, 해조류 원초에 존재하는 주요 기질이 갈락탄 및 섬유소, 또는 카라기난 및 섬유소, 또는 알긴산 및 섬유소, 또는 전분 및 섬유소이고, 글루코오스로 전환되는 효소의 기작과 갈락토오스 및 3,6-안하이드로갈락토오스로 전환되는 효소의 기작이 서로 상이할 수 있으므로 효율적인 가수분해를 위해 상술된 효소의 적절한 선택이 요구될 수 있으며, 간접 당화 공정에서 사용되는 가수분해 효소 중 두 종 이상이 복합적으로 동시에 사용될 수 있다. 예를 들면, 녹조류의 경우 전분과 섬유소 두 종류의 다당류가 존재하므로, 전분을 분해하는 전분 분해효소와 섬유소를 분해하는 섬유소 분해 효소를 동시에 사용하는 복합효소군을 사용할 수 있다. 산 가수분해법의 경우, 산 가수분해용 촉매는 특별히 한정되지 않으며, 이미 상술한 바와 같이 간접 당화 공정에서 사용되는 가수분해 촉매가 사용될 수 있다. 이때, 산 촉매의 농도와 반응 온도 및 반응 시간을 적절히 조절함으로써 생성된 글루코오스와 갈락토오스의 당화 수율이 최대가 되는 조건 및 생성된 단당류가 과분해되지 않도록 하는 반응 조건을 찾는 것이 중요하다. 해조류 원초를 출발 물질로 하여 당화하는 경우에는 채취된 해조류를 수세 과정을 통해 불순물 제거와 세척 과정을 수행한 다음, 열풍건조기 또는 자연건조법을 이용해 완전히 건조시키고, 건조된 해조류를 원료분쇄기를 이용하여 잘게 부수어 입자가 고운 파우더 형태로 변환한 후 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단당류는 해조류 원초에 대해 0.05～50％ 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 또는 PTSA와 같은 가수분해 촉매를 이용하여 60～300℃ 온도에서 0 초과～6시간 반응시킴으로써 생성된다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단당류는 다단계 당화법을 이용하여 해조류 원초에 대해 0.05～50％ 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4, PTSA 및 상용 고체산으로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 촉매를 이용하여 60～300℃ 온도에서 0 초과～6시간 동안 반응시킨 후, 잔류 섬유소 혹은 전분을 대상으로 상기 반응조건에서 2차 혹은 3차 당화반응시킴으로써 생성된다.
상술한 바와 같이 생성된 갈락토오스, 3,6-안하이드로갈락토오스, 글루코오스 또는 그 혼합물을 포함하는 당화액은 바이오연료 발효용 균주, 예컨대 효모를 이용하여 바이오알코올로 전환될 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 발효용 효모로는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 바이예링키(Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 아우란티부틸리쿰(Clostriduim aurantibutylicum) 또는 클로스트리디움 테타노모르퓸(Clostridium tetanomorphum) 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 이들은 부탄올 및 아세톤 발효에 있어서 보다 바람직하다. 또한, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 사르시나 벤트리큘리(Sarcina ventriculi), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 자이고모모나스 모빌리스(Zygomomonas mobilis) 또는 클루이베로마이세스 막시아너스(Kluyveromyces marxianus) IMB3, 브레타노마이세스 쿠스테르시이(Brettanomyces custersii) 등이 사용될 수 있으며, 이들은 에탄올 발효에 있어서 보다 바람직하다.
특히, 바이오연료 중에서 휘발유와 유사한 성분을 갖는 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등과 같은 특성을 포함한 주요 특성들이 좋은 연료의 기준을 만족시키고, 10％ 정도 혼합된 바이오부탄올 연료 혼합물의 성능이 가솔린 연료와 매우 비슷하며, 바이오부탄올의 에너지 밀도도 무연 휘발유에 거의 근접한다. 바이오부탄올은 바이오에탄올과는 달리 물이 존재하더라도 상 분리가 발생하지 않으며, 산소 함유량이 낮아 휘발유에 고농도의 바이오부탄올을 혼합시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 해조류를 이용한 바이오연료의 제조 방법은 바이오매스의 원료가 안정적으로 수급됨으로써 원료수급 문제를 획기적으로 개선할 수 있고, 종래 목질계 원료의 이용시 필수적으로 수반되는 리그닌 제거 공정이 필요하지 않아 공정 비용을 낮출 수 있으며, 글루코오스 이외에 갈락토오스, 3,6-안하이드로갈락토오스 등 해조류에 포함된 대부분의 당성분이 바이오연료로 전환될 수 있어 연료의 생산단가를 획기적으로 낮출 수 있으므로 에너지 자원 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 해조류의 경우 CO2 흡수 능력이 탁월하여 범국가적인 온실가스 저감에 기여하고 국제 환경 규제에 적극적으로 대처할 수 있어 경제적 및 환경적으로 매우 유리하다.
도 1은 당화 장치를 보여주는 개략도로서, (a) 배치 반응기, (b) 샘플링 포트, (c) 압력 게이지, (d) N2 가스 조절기, (e) N2 가스 통, (f) 콘트롤 박스, (g) N2 가스 보관기를 나타낸다.
도 2는 아가로스의 결합구조를 보여주는 화학 구조식이다.
도 3은 우무를 기질로 사용한 경우의 갈락토오스 수율에 미치는 반응 온도의 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 10 g, 1％ H2SO4 400 ㎖에서 30분간 반응이다.
도 4는 우무를 기질로 사용한 경우의 갈락토오스 수율에 미치는 샘플링 온도의 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 10 g, 1％ H2SO4 400 ㎖에서 해당 온도에 도달 시 반응이다.
도 5는 셀룰로오스를 기질로 사용한 경우의 글루코오스 수율에 미치는 H2SO4 농도의 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 20 g, 200℃에서 반응이다.
도 6은 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, 반응 온도 및 반응 시간이 (a) 글루코오스 수율, (b) 갈락토오스 수율, (c) 글루코오스+갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 22 g, 1％ H2SO4 400 ㎖이다.
도 7은 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, 반응 온도 및 반응 시간이 (a) 글루코오스 수율, (b) 갈락토오스 수율, (c) 글루코오스+갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 40 g, 1％ H2SO4 400 ㎖이다.
도 8은 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, 반응 온도 및 반응 시간이 (a) 글루코오스 수율, (b) 갈락토오스 수율, (c) 글루코오스+갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 60 g, 1％ H2SO4 400 ㎖이다.
도 9는 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, S/L 비(solid/liquid ratio)가 갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 1％ H2SO4 400 ㎖, 120℃에서 4시간 반응이다.
도 10은 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, H2SO4 농도가 (a) 글루코오스 수율, (b) 갈락토오스 수율, (c) 글루코오스+갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 60 g, 150℃에서 4시간 반응이다.
도 11은 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, 산의 종류가 (a) 글루코오스 수율, (b) 갈락토오스 수율, (c) 글루코오스+갈락토오스 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 기질 7.5 g, 1％ H2SO4 200 ㎖, 121℃에서 15분 반응이다.
도 12는 우뭇가사리를 기질로 사용한 경우, 가수분해 횟수가 단당류의 수율에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서, 실험 조건은 1％ H2SO4, 121℃에서 15분 반응이다.
도 13은 (a) 1.0％, (b) 2.0％, (c) 5.0％ 농도의 글루코오스 존재 하에 사카로마이세스 세레비시애의 성장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 14는 (a) 1.0％, (b) 2.0％, (c) 5.0％ 농도의 갈락토오스 존재 하에 사카로마이세스 세레비시애의 성장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 15는 (a) 1.0％, (b) 2.0％, (c) 5.0％ 농도의 글루코오스 존재 하에 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 성장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 16은 (a) 1.0％, (b) 2.0％, (c) 5.0％ 농도의 갈락토오스 존재 하에 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 성장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 17은 혼합당을 이용한 사카로마이세스 세레비시애에 의한 에탄올의 생산을 보여주는 그래프이다.
도 18은 혼합당을 이용한 브레타노마이세스 쿠스테르시이에 의한 에탄올의 생산을 보여주는 그래프이다.
도 19는 당화액(hydrolyzate)을 이용한 사카로마이세스 세레비시애에 의한 에탄올의 생산을 보여주는 그래프이다.
도 20은 당화액을 이용한 브레타노마이세스 쿠스테르시이에 의한 에탄올의 생산을 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에서는 하기와 같은 당화 장치, 실험 재료 및 분석 방법을 사용하여 실험을 수행하였다.
1. 당화 장치
당화 실험을 수행하기 위한 반응기와 콘트롤 박스로 구성된 당화장치 시스템이 도 1에 나타나 있다. 반응기는 500 ㎖ 용량(유효 용적: 400 ㎖)의 원통형으로 내부높이 12.5 cm, 내경 7 cm로 제작하였으며, 온도 재킷을 설치하여 설정된 반응 온도에 도달할 수 있도록 하였다. 반응기 내부 온도를 측정하기 위해 열전대(thermocouple)를 장착하였고, 과열되는 것을 방지하기 위해 반응기 외부에 냉각수가 순환 공급되도록 하였다. 반응 도중 샘플 채취를 용이하게 하기 위해 반응기 외부로부터 고압의 N2 가스가 유입될 수 있도록 하였고, N2 가스 저장소와 샘플 포트를 장착하였으며, 콘트롤 박스에는 RPM meter와 디지털 온도 조절기, 압력 게이지를 장착하였다.
2. 실험 재료
2.1. 기질
본 실시예에서는 홍조류로 모로코산 우뭇가사리, 제주산 우뭇가사리, 꼬시래기, 코토니를 사용하였고, 녹조류로는 청각을 사용하였으며, 갈조류로서는 다시마를 사용하였다.
본 실시예에서는 우뭇가사리를 원료로 이용한 직접당화법과 우뭇가사리로부터 분리/추출된 섬유소 및 우무를 원료로 이용한 간접당화법으로 나누어 실험을 진행하였다. 직접당화법을 위해서는 우뭇가사리를 증류수로 세척한 후, 40℃에서 건조하여 분쇄하고, 106, 300 mesh로 분체하여 사용하였다. 간접당화법을 위하여, 우무는 KOH 수용액에 일정시간 침지시켰다가 증류수로 세척하여 반 건조시킨 모로코산 우뭇가사리를 증류수 또는 에틸알코올이나 메틸알코올을 이용하여 추출한 후 40℃에서 건조하고 분쇄하여 사용하였고, 섬유소는 추출된 우무를 O3로 2회(1h/1회) 표백하고 60℃에서 CIO2로 2회(1.5h/1회) 표백한 후, 80℃에서 H2O2로 2회(1h/1회) 표백하여 사용하였다.
2.2. 균주 및 배지
본 실시예에서는 사카로마이세스 세레비시애 DKIC413 및 브레타노마이세스 쿠스테르시이(Brettanomyces custersii) H1-39 균주(한국종균협회 KCCM 11490)를 사용하였고, 배양배지로서 YEPD 배지(yeast extract 10 g/ℓ, peptone 20 g/ℓ, dextrose 20 g/ℓ)를 사용하였다. 배지는 고압반응기(Woosung Scientific co., Korea)에서 121℃, 15분간 멸균한 후 사용하였다.
2.3. 사용 효소
본 실시예에 이용된 효소는 상업용 효소로서 (주)바이오시스에서 구입하였다. 셀루클라스트(celluclast)는 트리코더마 리세이의 배양액을 농축한 것으로서 셀룰로오스를 글루코오스와 셀로바이오스로 분해하는 효소(cellulase)이고, 비스코자임(viscozyme)은 아스퍼질러스 아쿠레아투스(Aspergillus aculeatus)의 배양액을 농축한 것으로서 셀룰라제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 자일라나제가 혼합된 복합효소이다. 스피리자임(spirizyme)과 AMG(Amylo Glucosidase)는 아스퍼질러스 나이거로부터 생산된 아밀로글루코시다제로서, α-아밀라제와 이소아밀라제에 의해 말토-올리고머로 분해된 전분을 글루코오스로 분해하는 효소이고, 락토짐(lactozym)은 클루이베로마이세스 프라질리스의 배양액을 농축한 것으로 락토오스를 글루코오스와 갈락토오스로 분해하는 효소(lactase)이다. 각 효소의 기능 및 가수분해 조건은 표 3에 나타나 있다.
효소 특성 및 가수분해 조건
효소 특성 가수분해 조건 활성 목적
셀루클라스트 셀룰로오스
가수분해		 pH: 4.5-6.0,
온도: 50-60℃		 700 EGU1 )/g 셀룰로오스
가수분해
비스코자임 셀룰로오스, 자일로오스,
헤미셀룰로오스 가수분해		 pH: 3.3-5.5,
온도: 25-55℃		 100 FBG2 )/g 우무
가수분해
스피리자임 전분, 말토오스
가수분해		 pH: 4.2-4.5,
온도: 60-63℃		 400 AG3 )/g 우무
가수분해
AMG 전분, 말토오스
가수분해		 pH: 4.5,
온도: 60℃		 300 AG/g 우무
가수분해
락토짐 락토오스
가수분해		 pH: 6.5,
온도: 37℃		 3,000 LAU4 )/㎖ 우무
가수분해
1) EGU: 엔도-글루카나제 유닛
2) FBG: 진균류(fungal) 글루카나제 유닛
3) AG: 1 μ㏖ 말토오스/분
4) LAU: 1 m㏖ 글루코오스/단위
3. 분석 방법
3.1. 당 분석
당화액은 전류도 검출기가 장착된 HPLC (ICS-3000, Dionex Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, Carbopac PA 1(4250 ㎜, Dionex Co., USA)과 Carbopac PA 1(450 ㎜, Dionex Co., USA)을 칼럼으로 사용하였다. 이동상은 16 mM NaOH 용액을 사용하였고, 흐름 속도는 1 ㎖/분, 칼럼 온도는 30℃로 하였다. 글루코오스, 갈락토오스의 농도는 표준물질의 교정 곡선을 이용하여 정량 분석되었으며, 글루코오스 및 갈락토오스의 수율은 식 1에 따라 원료의 건조 총 중량 대비 생성된 글루코오스 및 갈락토오스의 수율로 계산하였다.
Figure 112012004061312-pat00001
C = 글루코오스 또는 갈락토오스의 농도(g/ℓ)
V = 당화에 이용된 총 용매량(ℓ)
S = 당화에 이용된 총 기질량(단백질, 섬유소, 갈락탄, 기타)(g)
3.2. 단백질 분석( Semi - micro Kjeldahl 법)
단백질을 분석하기 위해, 시료 0.5 g을 취하여 단백질 분해관에 넣은 후 분해관에 황산 20 ㎖과 분해 촉진제 (K2SO4 : CuSO4?5H2O = 9 : 1) 5 g을 넣어 단백질을 분해하였다. 분해가 끝난 후 증류수 70 ㎖를 가하고, 증류기에 32％의 NaOH 75 ㎖을 넣은 후, 단백질 증류장치를 이용하여 증류하였다. 증류에 의해 발생된 암모니아를 3％ 붕산 100 ㎖로 포집한 다음 0.1N HCl로 적정하여 식 2에 따라 총 질소 함량을 계산하였다.
Figure 112012004061312-pat00002
V0 = 공시료의 0.1 N HCl 소비량(㎖)
V1 = 본 시료의 0.1 N HCl 소비량(㎖)
f = 0.1 N HCl의 Factor
N = 질소 계수
s = 시료량(mg)
0.0014 : 0.1 N HCl 1 ㎖에 상당하는 질소량(g)
3.3. 회분 분석(건식회화법)
도가니를 항량이 될 때까지 550℃ 회화로에서 가열 후, 데시게이터에서 방냉하여 칭량하였다. 칭량한 도가니에 시료 2 g을 넣고 550℃ 회화로에서 백색 또는 회백색 재가 남을 때까지 회화한 후, 회화로 내에서 200℃로 방냉시키고, 데시게이터로 옮겨 실온으로 방냉하였다. 회분함량(％)은 식 3에 따라 계산하였다.
Figure 112012004061312-pat00003
W1 = 용기의 항량(g)
W0 = 회화 후 용기 + 회분량(g)
S = 시료 중량(g)
3.4. 균체 농도 측정
균체 농도는 분광광도계(Genesys 10-S, Thermo electron corp., USA)를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 균체 건조량은 시간별로 채취한 배양액을 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용하여 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 증류수로 세척하여 재 원심분리한 농축액을 50℃에서 24시간 건조하여 측정하였다. 균체 건조량(dry cell weight)은 사카로마이세스 세레비시애의 경우 균체건조량 = 0.3135 흡광도 + 0.1811(상관계수=0.994), 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 경우 균체건조량 = 0.1292 흡광도 + 0.8554(상관계수=0.999)의 관계를 이용하여 계산하였다.
3.5. 에탄올 분석
배양액 중의 에탄올 농도는 RI 검출기가 장착된 HPLC (Breeze HPLC system, Waters Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, 칼럼은 Aminex HPX-87H (3007.8 ㎜, Bio-rad)를 사용하였다. 이동상은 5 mM의 황산수용액을 사용하였고, 흐름 속도는 0.6 ㎖/분, 칼럼 및 RI 검출기의 온도는 50℃로 설정, 분석하였으며 에탄올 농도는 표준물질의 교정 곡선을 이용하여 정량 분석하였다.
실시예 1. 해조류 종류에 따른 섬유소 및 갈락탄 성분 분석
해조류(모로코산 우뭇가사리, 제주산 우뭇가사리, 꼬시래기, 코토니, 청각, 미역, 다시마) 0.3 g과 72％ 황산 수용액 3 ㎖를 유리 튜브에 넣어 30℃에서 2시간 동안 반응시켰다(1차 가수분해). 반응이 끝난 후, 반응액을 250 ㎖ 병에 넣어 증류수 84 ㎖를 첨가하고 고압반응기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용, 121℃에서 1시간 동안 가수분해하였다(2차 가수분해). 가수분해가 끝나면 고압반응기 내부 온도가 50℃일 때 병을 꺼내어 실온에서 방치, 냉각하고, 이 중 1 ㎖를 취하여 CaCO3로 중화한 후 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 CaSO4를 제거한 후 섬유소 및 갈락탄 성분을 분석하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 해조류의 종류에 따라, 같은 종일지라도 채취 장소에 따라 성분의 함량 차이를 보였으며, 탄수화물 함량은 우뭇가사리(모로코산, 제주산)가 70～80％로 가장 높았고, 미역이 41％로 가장 낮았다. 또한, 비탄수화물(단백질, 지질 및 기타) 함량은 미역이 59％로 가장 높았고 우뭇가사리(모로코산, 제주산)가 20～28％로 가장 낮아 홍조류인 우뭇가사리가 에탄올 생산원료로서 가장 효율적으로 이용되어 질 수 있음을 확인하였다. 따라서, 이후 실험에서는 탄수화물 함량이 상대적으로 높은 모로코산 우뭇가사리를 선택하여 당화/발효실험을 수행하였다.
해조류의 화학적 조성
해조류 셀룰로오스
(%)		 갈락탄
(%)		 (탄수화물)
(%)		 단백질
(%) 		기타
(지질, 회분)
(%)
홍조류 우뭇가사리
(모로코)		 16.8 55.2
(Gal: 28%,
AHG: 27%)		 72.0 21.1 6.9
우뭇가사리
(제주)		 23.0 56.4 79.4 11.8 8.8
꼬시래기 19.7 54.4 74.1 11.0 14.9
코토니 7.1 43.4 50.5 4.9 44.6
녹조류 청각 10.9 47.8 58.7 34.7 6.6
갈조류 미역 2.4 38.7 41.1 24.2 34.7
다시마 6.7 40.0 46.7 12.2 38.1
실시예 2. 당화 실험
2.1. 산 당화
1％ 황산수용액과 기질 75 g을 4ℓ삼각플라스크에 넣어 121℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 상온으로 온도를 내려 당화액을 CaCO3로 중화하고 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 CaSO4를 제거하였다. 고압반응기에 S/L 비(5.5～15.0％)에 따른 기질과 황산수용액(0.5～4.0％)을 넣은 후, 설정된 온도 범위(80～200℃)와 시간(0～4시간)동안 당화 반응을 수행하였다. 또한, 설정된 시간에 샘플을 실시간으로 채취하고, 반응이 끝난 후에는 반응기를 실온으로 낮춘 후 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플은 CaCO3로 중화하고 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 CaSO4를 제거한 후 분석하였다. 그 결과는 다음과 같다.
2.1.1. 우무( Agar )를 이용한 당화
분리된 건조 우무를 기질로 하여 반응 온도에 따른 당화 수율을 비교하였다. 기질이 우무이므로 생성될 수 있는 단당류는 갈락토오스와 3,6-안하이드로갈락토오스(3,6-AHG)이지만(도 2 참조), 발효가능한 단당류만을 대상으로 하기위해 갈락토오스만을 수율로 나타내었다. 기질 10 g과 황산수용액 400 ㎖를 500 ㎖ 반응기에 넣어 80～120℃의 범위에서 반응을 진행하였으며, 각 반응 시간은 30분이었고 반응 종결 후 상온으로 낮춘 당화액을 중화하여 HLPC(ICS-3000, Dionex Co., USA)로 분석하였다. 도 3은 각 반응 온도에서 반응 종료 후 우무로부터 갈락토오스 수율을 나타낸 것이다. 갈락토오스 수율은 80℃에서 120℃로 반응 온도가 증가할수록 증가하였지만 150℃에서는 감소하였는데, 이는 반응 온도가 증가할수록 갈락토오스 수율도 증가하지만 적정 온도 이상에서는 시간이 증가함에 따라 생성당의 분해가 일어나 당화 수율을 감소시키기 때문인 것으로 생각된다. 따라서, 150℃에 도달하기 전 온도에서의 당화 수율을 확인하기 위해 반응 도중에 샘플을 채취하되, 샘플링 시점을 온도가 120, 140, 150℃에 도달하는 시점으로 하여 실험을 진행하였다.
도 4는 120, 140, 150℃에 도달하였을 때 우무로부터 갈락토오스 수율을 나타낸 것이다. 갈락토오스 수율은 온도가 증가할수록 함께 증가하여 150℃에서 37.1％(생성 가능한 갈락토오스 기준 시 74.2％)로 가장 높았으나, 반응기를 상온으로 낮춘 후에는 32.8％로 감소하여 냉각되는 도중에 생성당의 분해가 진행되었음을 알 수 있었다.
2.1.2. 섬유소를 이용한 당화
섬유소계 바이오매스의 경우는 보다 극한 조건에서 가수분해가 이루어지며, 특히 결정형 섬유소의 경우는 200～240℃의 높은 온도에서 가수분해가 이루어진다. 본 실시예에서는 이러한 점을 감안하여 반응 온도를 200℃로 설정하였으며, 촉매 농도에 따른 생성당의 수율을 비교하기 위해 0.5～4.0％ 범위의 황산 수용액을 촉매로 이용하였다. 기질 20 g과 황산수용액 400 ㎖를 반응기에 넣어 1시간 동안 당화 반응을 진행하였다. 도 5는 반응 온도(200℃)에 도달하였을 시점을 기준으로 촉매 농도에 따른 섬유소로부터 글루코오스 수율을 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 황산수용액의 농도가 높아질수록 수율이 감소하여 4.0％의 황산수용액을 이용한 경우는 0.1％, 2.0％에서는 2.6％, 1.0％에서는 12.3％, 0.5％ 황산수용액을 촉매로 하여 당화하였을 때에는 15.8％의 글루코오스 수율을 각각 나타내었다.
2.2. 효소 당화
기질(우무: 1.1 g, 섬유소: 2.5 g)과 증류수 100 ㎖를 250 ㎖ 삼각플라스크에 넣어 혼합하고, 사용 효소에 따라 pH를 조절한 후, 1 ㎖의 효소를 첨가하여 100 rpm에서 각 효소별 반응 조건에 따라 당화 실험을 수행하였다. 반응 도중 일정시간 간격으로 샘플을 채취하였으며 채취한 샘플은 원심분리기(VS-150FN, Vision Science Co., LTD., Korea)를 이용하여 3,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 뒤 상등액만 취하여 분석하였다.
섬유소 당화는 초기 기질 농도를 2.5％(2.5 g/100 ㎖)로 하여 144시간 동안 반응을 수행하였다. 그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 섬유소 당화에 의해 생산된 글루코오스 농도는 11.6 g/ℓ(1.16％)로 약 46％가 글루코오스로 전환된 것으로 나타났으며, 초기 3시간 이내에 빠르게 당화된 후 지속적으로 반응이 일어난 것을 알 수 있었다. 산당화에 의해 섬유소의 단당류(glucose)로의 전환이 최대 15％ 내외인 점을 고려하면(도 7 참조), 섬유소 분해효소에 의한 당화는 매우 효과적인 것으로 판단된다.
우무 당화시에는 1％ 이상의 용액에서 높은 점성을 보여 초기 기질 농도를 1.1％로 하여 144시간 동안 당화 반응을 진행하였으며, 당화효소는 경제성을 고려하여, 식품산업 등에서 사용되는 상용화된 전분 분해 효소와 말타제 및 락타제 기능의 복합효소를 이용하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 전분 분해효소를 비롯한 전분질계 당화효소는 우무 당화에는 큰 효과를 보이지 않았으며, 반응 초기에 검출된 갈락토오스는 우무 성분 분리 시에 분해된 유리 갈락토오스 단량체에 의한 것으로 생각된다.
기질로서 셀룰로오스 이용시 효소 당화에 의한 글루코오스 농도
기질 효소 글루코오스 농도(g/ℓ)
0h 3h 6h 24h 48h 72h 144h
셀룰로오스 셀루클라스트 0.44 7.68 7.94 9.64 9.63 10.23 11.6
기질로서 우무 이용시 효소 당화에 의한 갈락토오스 농도
기질 효소 갈락토오스 농도(g/ℓ)
0h 3h 6h 24h 48h 72h 144h
우무 비스코자임 1.18 3.1 1.73 1.19 1.19 1.37 1.38
스피리자임 0.23 1.36 0.24 0.25 0.24 0.43 0.44
AMG 0.27 0.28 0.28 0.28 0.28 0.47 0.47
락토짐 0 0 0 0 0 0.57 0.37
2.3. 원료 직접 당화
2.3.1. 온도 및 시간에 따른 영향
2.3.1.1. S/L 비 5.5％
모로코산 우뭇가사리 22 g을 기질로 이용, 1％ 황산수용액 400 ㎖를 이용하여 반응 온도 120～150℃에서 4시간 동안 당화 반응을 진행하였다. S/L 비 5.5％에서의 반응 온도, 시간에 따른 글루코오스, 갈락토오스 및 글루코오스+갈락토오스(단당류)에 대한 수율을 나타내었다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 글루코오스, 갈락토오스 모두 반응 온도 140℃에서 가장 높은 수율(글루코오스: 4.8％, 갈락토오스: 33.7％, 단당류: 38.5％)을 나타내었고, 낮은 온도(120℃)에서는 반응 시간이 경과함에 따라 수율이 증가하였으며, 갈락토오스의 경우 150℃에서는 반응 시간 15분 이후에 수율이 급감하였다.
2.3.1.2. S/L 비 10.0％
모로코산 우뭇가사리 40 g을 기질로 이용, 1％ 황산수용액 400 ㎖를 이용하여 반응 온도 120～150℃에서 4시간 동안 당화 반응을 진행하였다. 도 7은 S/L 비 10.0％에서 반응 온도, 시간에 따른 글루코오스, 갈락토오스 및 글루코오스+갈락토오스(단당류) 수율을 나타낸 그래프이다. 글루코오스 및 갈락토오스 모두 반응 온도 150℃일 때 가장 높은 수율을 나타내었으며, 이 중 가장 높은 수율을 보인 반응 시간은 15분이었다(글루코오스: 4.7％, 갈락토오스: 29.8％, 단당류: 34.5％).
2.3.1.3. S/L 비 15.0％
도 8은 S/L 비 15.0％(기질: 60g, 1％ 황산수용액: 400 ㎖)에서의 반응 온도, 반응 시간에 따른 글루코오스, 갈락토오스 및 글루코오스+갈락토오스(단당류) 수율을 나타낸 결과이다. S/L 비 15.0％에서도 반응 온도 150℃, 반응 시간 0～15분일 때 가장 높은 수율을 나타내었으며(글루코오스: 4.0％, 갈락토오스: 22.0％, 단당류: 26.0％), 120～140℃에서 당화 반응 30분 이후로 가수분해가 거의 이루어지지 않아 S/L 비 10.0％에서와 동일한 경향성을 보였다.
2.3.2. S/L 비에 따른 영향
도 9는 S/L 비에 따라 반응 온도 120℃에서 4시간동안 반응시켰을 때의 갈락토오스의 전환 수율을 나타낸 결과이다. S/L 비와 반응 온도간의 상관관계를 최소화하기 위하여 가장 낮은 온도(120℃)에서의 당화 실험 결과를 비교하였으며, 글루코오스의 경우 당화 수율이 매우 낮아 갈락토오스 전환 수율만 나타내었다. 도 11에서 나타낸 바와 같이, 글루코오스, 갈락토오스 모두 S/L 비 5.5％일 때 가장 높은 수율을 나타냈으며, S/L 비 10.0％와 15.0％에서는 거의 비슷한 수율을 나타내었다.
2.3.3. 산 농도에 따른 영향
촉매 농도에 따른 우뭇가사리의 생성당 수율을 비교하기 위해, 기질 60 g과 0.5～1.25％ 황산용액 400 ㎖를 이용하여 150℃에서 4시간 동안 당화 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 1.0％ 황산용액을 촉매로 당화하였을 때 반응 시간 0～15분에서 글루코오스 4.0％, 갈락토오스 22.3％로 가장 높은 수율을 나타내었으며, 당화 15분 이후로는 생성당의 수율이 감소하였다. 0.75～1.25％ 농도의 황산 용액을 이용한 경우 반응 시간 1시간 이후로 생성당의 수율이 감소하였으나, 0.5％ 황산용액을 이용한 경우에는 당화시간에 따른 수율의 차이가 거의 없었다. 0.75％와 1.25％ 황산용액을 이용한 경우 거의 동일한 수율을 나타내었으며, 0.5％ 황산용액의 경우에는 가장 낮은 수율을 나타내었다.
2.3.4. 산 종류에 따른 영향
산 종류에 따른 생성당 수율을 비교하기 위해, 250 ㎖ 삼각플라스크에 모로코산 우뭇가사리 7.5 g과 1％ 황산, 염산, 질산, 아세트산 수용액을 각각 200 ㎖를 넣어 121℃에서 15분 동안 고압반응기에서 당화 반응을 수행하였다. 도 11은 상기 촉매를 이용하였을 때, 글루코오스, 갈락토오스 및 글루코오스+갈락토오스(단당류) 수율을 나타낸 것이다. 아세트산을 촉매로 이용한 경우에는 당화가 일어나지 않아 산 가수분해를 위한 촉매로서 아세트산은 적절하지 않았으며, 황산을 촉매로 이용하였을 때 갈락토오스 및 글루코오스 수율이 공통적으로 높았다.
2.4. 다단계 당화
앞선 실험에서, 원료의 직접 당화 및 분리 당화 실험을 통해 갈락토오스 및 글루코오스로의 가수분해 조건이 상이함을 확인하였으며, 우무의 갈락토오스로의 가수분해 조건은 섬유소로부터 글루코오스를 분해하기 위한 가수분해 조건에 비해 온화함을 알 수 있었다. 또한, 우뭇가사리를 직접 당화하였을 경우보다는 섬유소 및 우무로 분리하여 당화하였을 때 생성당의 수율이 높았다. 공정 최소화를 통하여 분리한 탄수화물 성분들을 가수분해하는 최적 조건을 찾아 당화 수율을 최적화하게 되면 이를 이용한 에탄올 생산을 극대화할 수 있을 것이다.
본 실시예에서는 이러한 점을 고려하여 250 ㎖ 삼각플라스크에 모로코산 우뭇가사리 7.5 g과 1％ 황산 수용액 200 ㎖를 넣어 121℃에서 15분 동안 고압반응기에서 1차, 2차, 3차, 4차 등 단계별로 당화 반응을 수행하고, 글루코오스 추출 수율과 단계별 당화에 따른 글루코오스 및 갈락토오스의 수율을 확인하였다. 그 결과, 표 7 및 도 12에 나타난 바와 같이, 글루코오스 추출 수율은 1차까지 당화하였을 경우 78.0％(우뭇가사리 중 섬유소 성분이 17％이며 원료량 대비 계산)였다. 또한, 단계별 당화에 따른 갈락토오스 수율은 2차 당화시 29.6％였는데, 이 수치는 전체 원료량 대비가 아닌 갈락토오스로 당화 가능한 성분(28％, 표 4 참조)만을 고려하였을 경우 105.7％(수율이 100％ 이상인 이유: 3,6-AHG의 일부가 갈락토오스로 전환된 것으로 판단됨)이므로, 우뭇가사리가 함유하고 있는 갈락토오스 성분은 거의 모두 추출되었고, 글루코오스 전환 수율은 1차 당화 이후 당화횟수를 거듭하여도 수율은 증가하지 않아 더 이상 가수분해가 이루어지지 않음을 알 수 있었다. 위의 반응 조건을 이용하여 2차까지 당화할 경우 우무의 갈락토오스로의 당화 공정 및 우뭇가사리로부터의 섬유소 성분 분리가 효과적으로 동시에 이루어질 수 있고, 이 후 분리된 섬유소 성분을 산 당화 또는 효소당화를 이용하여 글루코오스 수율을 높인다면 다단계당화 공정은 우뭇가사리의 당화 효율을 극대화할 수 있는 최적화 공정으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
우뭇가사리를 기질로 이용시 단당류 수율에 대한 가수분해 횟수의 효과(조건: 1％ H2SO4, 121℃, 15분)
가수분해 횟수 잔류 solid mass
(g)		 감소율
(%)		 글루코오스
수율(%)		 갈락토오스
수율(%)
0 2.9670 - - -
1회 0.6397 78.4 3.5 25.1
2회 0.4752 5.5 Not detected 4.5
3회 0.4207 1.8 Not detected Not detected
4회 0.4128 0.3 Not detected Not detected
실시예 3. 에탄올 생산 배양
3.1. 발효 균주의 성장 특성 확인
3.1.1. 사카로마이세스 세레비시애( S. cerevisiae )
에탄올 생산 균주인 사카로마이세스 세레비시애의 성장패턴 및 당 섭취 특성을 알아보기 위해 탄소원으로 글루코오스 및 갈락토오스를 이용하였으며, 이 때의 농도는 1％, 2％ 및 5％로 하였다. 도 13은 글루코오스 1％, 2％ 및 5％에서의 사카로마이세스 세레비시애의 성장곡선 및 당 섭취를 나타낸 것이고, 도 14는 갈락토오스 1％, 2％ 및 5％에서의 사카로마이세스 세레비시애의 성장곡선 및 당 섭취를 나타낸 것이다. 탄소원의 농도가 높아질수록 균체 농도 또한 증가하였으나, 가장 높은 5％ 농도에서는 기대값에 비해 낮은 균체 성장률을 보였다. 탄소원의 농도에 관계없이 글루코오스의 경우는 24시간, 갈락토오스의 경우는 48시간 이내에 모두 소비되었고, 글루코오스가 갈락토오스보다 빠른 속도로 소비되었으나, 균체 농도는 갈락토오스를 탄소원으로 이용한 경우에 가장 높았다(갈락토오스 5％를 이용한 경우 약 3.5 g/ℓ).
3.1.2. 브레타노마이세스 쿠스테르시이( B. custersii )
탄소원의 종류 및 농도를 사카로마이세스 세레비시애와 동일한 조건으로 하여 또 다른 에탄올 생산 균주인 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 성장 패턴 및 당 섭취 정도를 조사하였다. 그 결과, 도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 탄소원의 농도가 높아질수록 균체 농도 또한 증가하였고, 갈락토오스를 탄소원으로 이용한 경우에 가장 높은 균체 농도(5％ 갈락토오스를 이용한 경우 2.1 g/ℓ)를 나타내어 사카로마이세스 세레비시애와 동일한 경향을 보였다. 또한, 브레타노마이세스 쿠스테르시이에서도 탄소원의 농도에 관계없이 글루코오스가 갈락토오스보다 빠른 속도로 소비되었지만, 글루코오스의 경우는 12시간, 갈락토오스의 경우는 18시간 이내에 모두 소비되어져 사카로마이세스 세레비시애에 비해 당소비 속도가 2배 이상 높은 것으로 나타났다. 또한, 균체 성장 속도도 사카로마이세스 세레비시애보다 빨랐다.
3.2. 에탄올 발효
100 ㎖의 YEPD 배지가 함유된 250 ㎖ 용량의 삼각플라스크에 고형배지에서 보존중인 균주(사카로마이세스 세레비시애 및 브레타노마이세스 쿠스테르시이)를 백금이로 접종하여 37℃, 30℃에서 150 rpm으로 24시간 동안 균주별로 전배양하였다. 본배양은 혼합당 또는 당화액(1～20％)과 펩톤 15％, 효모 추출물 15％, 황산마그네슘 0.5％가 함유된 배지 150 ㎖(발효조를 이용한 경우 2.5 ℓ)에 전배양액 25％를 접종한 후, 초기 pH 5.0～5.5, 온도 37℃ 또는 30℃에서 48시간 동안 균주별로 배양하였다.
3.2.1. 혼합당을 이용한 발효
고압반응기를 이용, 121℃에서 15분 동안 우뭇가사리를 1차 당화하였을 때 갈락토오스 농도는 0.8～0.9％, 글루코오스 농도는 0.03～0.05％이다. 본 실시예에서는 당화액과 동일한 농도 및 갈락토오스:글루코오스의 비율로 혼합당을 조제하여 사카로마이세스 세레비시애 및 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 혼합당에서의 에탄올 발효 패턴을 조사하였다. 도 17 및 도 18은 사카로마이세스 세레비시애 및 브레타노마이세스 쿠스테르시이를 각각 발효균주로 하여 혼합당에서의 알코올발효 결과를 각각 나타낸 것이다.
사카로마이세스 세레비시애의 경우, 발효 48시간 경과 후에도 당을 모두 소비하지 않았으며(글루코오스는 모두 소비하였으나 갈락토오스는 약 35％ 소비), 글루코오스를 모두 사용한 후에 갈락토오스를 대사 대상으로 사용하는 것으로 나타났다. 반면, 브레타노마이세스 쿠스테르시이는 글루코오스와 갈락토오스를 동시에 대사 대상으로 사용하여 발효 24시간 이후에는 당을 모두 소비하였고, 발효시작 시점에서 에탄올이 생성되어(글루코오스에 의해 촉발된 것으로 판단됨) 48시간 후 약 4.1 g/ℓ의 에탄올을 생산하였다(에탄올 생산수율: 93.8％). 브레타노마이세스 쿠스테르시이를 발효균주로 한 경우, 탄소원이 고갈된 24시간 이후에도 에탄올 농도가 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 세포내 성분 전환으로 보여진다.
3.2.2. 당화액을 이용한 발효
도 19 및 도 20은 고압반응기를 이용하여 가수분해한 당화액에서의 사카로마이세스 세레비시애 및 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 알코올 발효 결과를 각각 나타낸 것이다. 사카로마이세스 세레비시애는 발효 48시간 후에도 에탄올을 생산하지 않았으며, 브레타노마이세스 쿠스테르시이는 12시간 이후로 에탄올 생성량은 4.6 g/ℓ(에탄올 생성수율: 96.0％)로 더 이상 증가하지 않았다. 혼합당을 이용하였을 때와 비교하면, 사카로마이세스 세레비시애와 브레타노마이세스 쿠스테르시이의 경우 모두 당 소비속도 및 에탄올 생성 정도가 적었다.

Claims (11)

  1. 홍조류를 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 암모니아로 구성된 군으로부터 선택되는 알칼리 수용액에 침지시킨 후 물로 세척하는 단계;
    상기 세척된 홍조류를 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 및 PTSA(para-tolune sulfonic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매에 침지시켜 우무 및 카라기난으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추출하는 단계;
    상기 추출물을 분리하고, 섬유소를 수집하는 단계;
    상기 우무, 카라기난 및 섬유소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다당류 물질에 분해효소 및 가수분해 촉매로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 처리하여 단당류를 생성하는 단계; 및
    상기 단당류를 미생물에 의해 발효시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 바이오연료는 C1 내지 C4의 알코올 및 C2 내지 C4의 케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 바이오연료는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 홍조류는 우뭇가사리, 코토니, 개도박, 김, 둥근돌김, 개우무, 새발, 참풀가사리, 꼬시래기, 진두발, 참도박, 가시우무, 비단풀, 단박, 돌가사리, 석목 및 지누아리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 단당류는 갈락토오스, 3,6-안하이드로갈락토오스, 글루코오스, 푸코오스, 람노오스, 크실로오스 및 만노오스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 분해효소는 β-아가라제, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-글루카나제 및 셀룰라제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 가수분해 촉매는 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 및 PTSA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 단당류는 우무에 대해 0.05～30%(v/v) 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 및 PTSA로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 촉매를 이용하여 60～200℃ 온도에서 0 초과～6시간 반응시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 단당류는 섬유소에 대해 0.05～50%(v/v) 농도의 H2SO4, HCl, HBr, HNO3, CH3COOH, HCOOH, HClO4, H3PO4 및 PTSA로 구성된 군으로부터 선택되는 가수분해 촉매를 이용하여 80～300℃의 온도에서 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 단당류는 섬유소에 대해 분해효소를 이용하여 0 초과～144시간 반응시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 발효 미생물은 사카로마이세스 세레비시애, 사르시나 벤트리큘리, 클루이베로마이세스 프라질리스, 자이고모모나스 모빌리스, 클루이베로마이세스 막시아너스, 브레타노마이세스 쿠스테르시이, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 바이예링키, 클로스트리디움 아우란티부틸리쿰 및 클로스트리디움 테타노모르퓸으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료의 제조 방법.
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