JP2022531728A - 胆汁酸塩ヒドロラーゼを使用して消化管を調節するための組成物及び方法 - Google Patents

胆汁酸塩ヒドロラーゼを使用して消化管を調節するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、消化管を調節することに関する組成物及び方法を提供する。詳しくは、本開示は、特に、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝臓癌と結腸癌、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等の疾患の予防及び治療のために、胆汁酸ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）を使用して腸内細菌叢胆汁酸プールを選択的に調節するための新規治療戦略を提供する。

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月７日に出願された米国仮出願第６２／８４４，５１８号に対する優先権及び利益を主張するものであり、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
出願時に同時に提出された、２０２０年５月７日作成の「３７７３３－６０１＿ＳＴ２５」という名前の１つの２３７キロバイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別される、コンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、消化管を調節することに関する組成物及び方法を提供する。詳しくは、本開示は、特に、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝臓癌と結腸癌、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等の疾患の予防及び治療のために、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）を使用して腸内細菌叢胆汁酸プールを選択的に調節するための新規治療戦略を提供する。
〔背景技術〕
胆汁酸とも呼ばれる胆汁酸塩は、腸内全体の微生物組成の影響因子及び調節因子としてヒト消化管において重要な役割を果たす。場合によっては、様々な種類の胆汁酸塩（抱合、非抱合を問わない）が腸管の胆汁酸塩プールを構成し、この混合組成が、大腸マイクロバイオームの属、種、及び株の含量に影響を与える。結果として、腸の健康のいくつかの特性は、ヒト腸内の胆汁酸塩組成の影響を直接及び間接的に受ける。例えば、ある胆汁酸塩は、疾患（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症）の発症を助長し得、また別の胆汁酸塩は、病原体の発症または残存性を予防し得る。したがって、インビボで胆汁酸プールを直接変化させて調節し、ヒトの健康を導いてさらに促進するよう能動的に腸内マイクロバイオームの組成をシフトさせる、機能的に重要で、影響力の大きい胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）を定義する必要がある。
〔発明の概要〕
本開示の実施形態には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞が含まれる。これらの実施形態によれば、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子は、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異は、機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる。いくつかの実施形態では、胆汁酸塩基質は、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＦＣＡ、ＦＣＤＣＡ、ＦＬＣＡ、ＦＤＣＡ、ＦＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＬＣＤＣＡ、ＬＬＣＡ、ＬＤＣＡ、ＬＵＤＣＡ、ＹＣＡ、ＹＣＤＣＡ、ＹＬＣＡ、ＹＤＣＡ、ＹＵＤＣＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、胆汁酸基質は、ＧＣＡ、ＴＣＡ、またはＴＣＤＣＡである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＧＱＤ、ＩＰＡ、及び／またはＡＭＩのペプチドモチーフで存在する少なくとも１つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を含む。
いくつかの実施形態では、異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、２３、２５、２７、２９、４１、４３、５１、６１、６９、７１、７３、８５、９３、９７、１０３、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、２３、２５、２７、２９、４１、４３、５１、６１、６９、７１、７３、８５、９３、９７、１０３、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓという属のうちの１つから選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉという種のうちの１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ－１４、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｌｃ１１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５０、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＤＮＨ－４２９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ Ｌｇ－３６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ－１１５、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９４８、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９５７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９６４、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９７９、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ１３７０、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ２６７７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐｃ－３７、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ１１５、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＨＮ００１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ Ｌｒ－３２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ １Ｅ１、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌｓ－３３、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５５、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ ＢＬ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－０２、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ－０７、Ｂ．ｂｒｅｖｅ Ｂｂ－０３、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ｂｂ－０６、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｂｌ－０５、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｐ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｂｉ－２６．という株、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つから選択される。
いくつかの実施形態では、細胞は、疾患または状態と関連する少なくとも１つの生理的パラメータを改善することを必要とする対象に治療用組成物の一部として投与された場合に、そのような改善をする。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、胆汁酸調節異常と関連する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症と関連し、治療用組成物を投与することによりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症が治療される。
本開示の実施形態には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞であって、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子が、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む、細菌細胞と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む医薬組成物も含まれる。これらの実施形態によれば、組成物の投与により、対象における少なくとも１つの生理的パラメータが改善される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異は、機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる。いくつかの実施形態では、胆汁酸基質は、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＦＣＡ、ＦＣＤＣＡ、ＦＬＣＡ、ＦＤＣＡ、ＦＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＬＣＤＣＡ、ＬＬＣＡ、ＬＤＣＡ、ＬＵＤＣＡ、ＹＣＡ、ＹＣＤＣＡ、ＹＬＣＡ、ＹＤＣＡ、ＹＵＤＣＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉという種のうちの１つから選択される。
いくつかの実施形態では、対象への組成物の投与により、疾患または状態と関連する少なくとも１つの生理的パラメータが改善される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、胆汁酸調節異常と関連する。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症と関連し、組成物を投与することによりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症が治療される。
本開示の実施形態には、少なくとも１つの胆汁酸を調節することを、それを必要とする対象において行う方法も含まれる。これらの実施形態によれば、方法には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞であって、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子が、機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む、細菌細胞と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む治療用組成物を投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの胆汁酸を調節することによって対象における少なくとも１つの生理的パラメータを改善する。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕胆汁酸塩ヒドロラーゼは腸肝軸において循環抱合胆汁酸に作用する。（Ａ）肝臓で合成されて胆嚢に貯蔵された胆汁酸（ＢＡ）は、十二指腸を通って小腸に入り、そこではミリモル濃度に達する。ＢＡの大部分（９５％）は回腸で再吸収され、門脈を通って再び肝臓へ循環する。残りの集団は、引き続き再吸収されながら通過して結腸へ向かい、少量（＜５％）が糞便を介して排出される。再循環ＢＡは宿主組織に腸の外部で接近し、宿主生理に対する全身的作用を付与する。（Ｂ）ＢＳＨは、抱合ＢＡのアミド結合を切断して胆汁酸プールを開放し、複雑さを増大させる。腸内細菌叢により脱抱合ＢＡに対して追加の化学が作用して二次ＢＡプールが生成され、これが、腸肝循環に入って肝臓で再び抱合され得る。（Ｃ）Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓからの単量体ＢＳＨのオーバーレイ。ＣｐＢＳＨの活性部位において加水分解されたタウロデオキシコール酸塩（ＴＤＣＡ）は、他の構造と比較してペプチド骨格の変異を最も含むいくつかのループにより配位している（Ｆｏｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．２０１９）。
〔図２〕抱合胆汁酸の存在下でのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株のハイスループットスクリーニング。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株をＢＳＨプレート沈殿アッセイで使用し、（Ａ）ＭＲＳ培地、それに（Ｂ）０．２％ＴＤＣＡを添加したもの、及び（Ｃ）０．２％ＧＤＣＡ添加したものに播種した。ハローは、活性ＢＳＨを有するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを表す。株詳細は、各プレートの上段左隅から順に以下のとおりである：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＡＴＣＣ３３４、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＤＳＭ２０３１４、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＬＧＧ、Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｎｉ ＣＤ０３４、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉ ＤＳＭ２０５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ９９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ３３５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４４、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３。
〔図３〕１７０のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の系統樹へのＢＳＨタンパク質マッピング（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０１８）。群の色は先に記載されているものに従う：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ群は紫色で示され、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ群は緑で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ群は赤で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ群は黄色で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ群はえび茶色で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ群は青色で示されている。内側のメタデータレイヤーは、Ｄｕａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）に記載のような生活習慣名称をマッピングしている。外側のメタデータレイヤーは、１７０のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のそれぞれについてのＢＳＨタンパク質及びＰＶＡタンパク質の有無をマッピングしている。
〔図４〕ｂｓｈの多様性及び特性解析のサンプリング。９５％同一性閾値で４９０のＢＳＨから濃縮した、５７のＣＤ－ＨＩＴクラスターからのｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨの系統樹。２つの主なクレードが黒及び緑で示されている。複数のＢＳＨが単一株によりコードされ得、いくつかのクラスターに属する複数のＢＳＨをコードする種もある。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株は、異なるクラスターに属する２つのＢＳＨをコードする（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０１８。
〔図５Ａ〕Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。モデルのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株からのＢＳＨ活性を評価するため、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉのｂｓｈＡ、ｂｓｈＢ及びｂｓｈＣ（それぞれ、ＬｊＢＳＨａ、ＬｊＢＳＨｂ、及びＬｊＢＳＨｃ）を精製し、それらの具体的な活性と最適ｐＨをニンヒドリンアッセイで決定した。試験した酵素は、グリコ抱合型及びタウロ抱合型の胆汁酸ならびに酸性条件に対する異なる選択性を示した。
〔図５Ｂ〕Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。ＢＳＨアミノ酸配列の保存分析。クラスター化したデータセットの５７のクラスターからの代表的ＢＳＨタンパク質のアラインメントを、保存されたアミノ酸モチーフについて分析した。０．７５以上の保存スコアは破線で示されている。モチーフ及び保存されたアミノ酸をＷｅｂＬｏｇｏで示している。アスタリスクは、Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８からの、先に記載されている保存された活性部位残基を示す。
〔図５Ｃ〕Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。ＣｐＢＳＨ活性部位及び加水分解されたＴＤＣＡのクローズアップ構造図。活性部位ポケット内での保存された触媒的に重要な残基の位置を示すために、それらを強調表示している。
〔図６〕セフォペラゾンで処置したＣＤＩマウスモデルでのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ定着。実験タイムラインの概要。簡単に言えば、マウスを、セフォペラゾン含有飲料水で５日間処置した。２日間の洗浄の後、マウス（ｎ＝１６）に、１０９ＣＦＵのリファンピシン耐性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを強制経口投与した。記載されている日に１００μｇ／ｍＬのリファンピシン添加ＬＢＳ寒天に糞便を播種してコロニー形成をモニターした。
〔図７〕Ａ～Ｆは、抗生物質処置したマウスモデルでのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌量である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の経時的コロニー形成レベルがＣＦＵ／ｇ糞便で示されている。破線は、検出限界を示す。常在Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓをリファンピシン欠如ＬＢＳ寒天で計数した。
〔図８Ａ〕異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の投与により、７日後に別個の構造の腸内細菌叢がもたらされる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域のシーケンシングを使用して、ＬＡＢ定着マウスの便と盲腸の試料内の分類学的多様性を特徴付けした。Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓの距離に基づく非計量多次元尺度構成法による序列化を使用して、マウスの細菌叢がセフォペラゾン処置から回復する際の、ＬＡＢ処置群の細菌叢のβ－多様性を視覚化した。７日目における盲腸の群衆の相違は、ＬＡＢ定着が、抗生物質による混乱後の腸内細菌叢の集合を変化させることを示唆している。
〔図８Ｂ〕異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の投与により、７日後に別個の構造の腸内細菌叢がもたらされる。ＬＡＢ定着マウス間の群衆構造の相違を、７日目の盲腸試料中の細菌の門の相対的存在量を評価することによって詳細に記載した。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、及びＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａがＬＡＢ処置をしないマウスの細菌叢で優勢であった。しかしながら、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの定着はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの復帰を抑制し、またＬ．ｇａｓｓｅｒｉは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの復帰を抑制した。
〔図９〕Ｅ．ｃｏｌｉ由来組換えＢＳＨの過剰発現及び精製。（Ａ、Ｂ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（ＬａＢＳＨａ及びＬａＢＳＨｂ）及び（Ｃ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３の株のＢＳＨ活性をさらに評価するため、ＢＳＨ（ＬｇＢＳＨａ及びＬｇＢＳＨｂ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ３）に組換えにより発現させ、コバルトカラムでＣ末端Ｈｉｓタグ精製を使用して精製した。精製ＢＳＨタンパク質は、タンパク質分子量、タンパク質ラダー標準、及びゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥで視覚化される。
〔図１０〕ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＢＳＨは、胆汁酸抱合に対し様々な選択性を示す。組換えにより発現させ精製した（Ａ）ＬａＢＳＨａ、（Ｂ）ＬａＢＳＨｂ、（Ｃ）ＬｇＢＳＨａ、及び（Ｄ）ＬｇＢＳＨｂの平均比活性を、抱合胆汁酸パネルでのニンヒドリンアッセイにより決定した。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝３）からのｓ．ｄ．を表す。
〔図１１〕精製ＢＳＨ及びそれらの最適ｐＨ。（Ａ）ＬａＢＳＨａ、（Ｂ）ＬａＢＳＨｂ、（Ｃ）ＬｇＢＳＨａ、及び（Ｄ）ＬｇＢＳＨｂの、それぞれの好ましい基質とのｐＨ条件範囲全体にわたる比活性。
〔図１２〕Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢは、基質依存的に胆汁酸解毒に寄与する。胆汁酸存在下でのＢＳＨ変異体の増殖。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ増殖中のＢＳＨ活性の役割を評価するため、ＢＳＨの単一変異体及び二重変異体を胆汁酸添加ＭＲＳ培地で増殖させ、増殖をＯＤ６００ｎｍで測定した。
〔図１３〕Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢは、基質依存的及び濃度依存的に胆汁酸解毒に寄与する。胆汁酸存在下でのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｂｓｈ変異体の増殖は、（Ａ）ＭＲＳ培地単独ならびに胆汁酸（Ｂ）ＧＣＡ、（Ｃ）ＴＣＡ、（Ｄ）ＧＣＤＣＡ、（Ｅ）ＴＣＤＣＡ、（Ｆ）ＧＤＣＡ、及び（Ｇ）ＴＤＣＡを添加した培地においてＯＤ６００ｎｍで測定することにより評価した。各増殖の終点のＣＦＵは図１７Ａに示されている。
〔図１４〕Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの定着は、盲腸の脱抱合胆汁酸をわずかに増加させる。盲腸試料でターゲットメタボロミクスを実施して一次胆汁酸（Ａ）ＣＡ、（Ｂ）ＣＤＣＡ、及び（Ｃ）α／βＭＣＡを定量した。
〔図１５Ａ〕胆汁酸の構造。胆汁酸の構造と本開示で使用される略語。
〔図１５Ｂ〕胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。本明細書で実験的に決定された胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。棒は、独立した実験（ｎ＝２）からの平均ＣＭＣ±ｓ．ｅ．ｍを表す。
〔図１５Ｃ〕胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ－ＢｌｕｅＢＡＬＬＳを使用してＣＭＣを決定した。２つの独立した実験からの吸光度データを各分子の胆汁酸濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して標準的５パラメータロジスティック曲線適合を実施し、Ｌｏｇ１０ＥＣ５０で表される各曲線の変曲点を計算することによりＣＭＣを決定した。変曲点値は、平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。
〔図１６〕脱抱合胆汁酸の野生型及びΔｂｓｈＡＢの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）。（Ａ）ＢＳＨが欠失したＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの（ΔｂｓｈＡＢ）株を使用して、抱合及び脱抱合の胆汁酸のＭＩＣを決定した。（Ｂ）野生型及びΔｂｓｈＡＢの脱抱合胆汁酸のみのＭＩＣ。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均ＭＩＣを表す。
〔図１７〕ＢＳＨは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの定着にＢＳＨ特異的及び胆汁酸特異的に影響を与える。（Ａ）ＭＲＳ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、またはＴＤＣＡで２４時間増殖させたＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及び（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉのＢＳＨ変異体。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝４）からの標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。破線は、０時間における開始時のおよそのＣＦＵ／ｍＬを示す。ΔｂｓｈＡＢ株を機能的に補完するため、外因性の組換え型ＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を、（Ａ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ΔｂｓｈＡＢまたは（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ΔｂｓｈＡＢの増殖物と等モル量で培養物に添加した。
〔図１８〕ＢＳＨ活性は、膜の統合性及び競合的動力学を胆汁酸特異的に変化させる。（Ａ）（Ｂ）様々な胆汁酸に曝露されるかまたは熱殺菌された（ＨＫ）、対数中期まで増殖したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの膜統合性を評価するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色。正規化した蛍光は、バックグラウンドＰＩの蛍光を減算し、胆汁酸曝露開始時のＯＤ６００を基準として正規化することにより計算した。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均蛍光を表し、エラーバーは、ｓ．ｄ．を表す。（Ｃ）（Ｄ）様々な胆汁酸の存在下で嫌気的に２４時間共培養したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの競合指標。競合指標（ＣＩ）を以下のとおり計算した：ＣＩ＝最終［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］／初期［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］。等モルのＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を培養０時間にて加えた。破線は、ＣＩ＝０を示す。
〔図１９〕ノトバイオートマウスでの株定着は、株依存的にＢＳＨ活性により変化させられる。５～８週齢の無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及び（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの単独定着。０日目、１日目及び４日目に糞便を採取し、７日目にマウスを屠殺して、その盲腸を播種した（７ｃ日目）。（Ｃ）野生型（ＲｉｆＲ）株及びΔｂｓｈＡＢ（ＳｔｒＲ）株を使用したＬ．ｇａｓｓｅｒｉの共定着（ｃｏ－ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）。破線は、検出限界を示す。
〔図２０〕ＢＳＨ特異性は、進化の関係を示す。（Ａ）組換えにより発現させ精製したＬＡＢ ＢＳＨを、グリシン抱合胆汁酸及びタウリン抱合胆汁酸のパネルに対して脱抱合についてアッセイした。各ＢＳＨの比活性は、ニンヒドリンアッセイによってアミノ酸放出量を定量化することにより決定した。近隣結合法を使用して、各ＢＳＨの一次アミノ酸配列に基づいた系統樹を構築した。いくつかのＢＳＨクレードは類似した基質特異性プロファイルを示し、これを使用して、ＢＳＨの活性を予測し、どの残基が基質特異性に寄与するのかを理解することができる。（Ｂ）各ＢＳＨの対応する配列番号（それぞれのアミノ酸同一性パーセントは＞９５％）。
〔図２１Ａ〕ＢＳＨ＿１～２１にＣＬＵＳＴＡＬＷ配列アラインメントを実施した。同一性には濃灰色で陰影を付け、類似性は黒枠で囲んでいる。抱合アミノ酸との推定的な相互作用領域は黒枠で囲んでいる。
〔図２１Ｂ〕（Ｂ）活性部位にＧＣＡ（濃灰色の球）があるＬｇＢＳＨａの予測される構造。３つのアミノ酸を有する推定上の基質結合ループが濃灰色で強調表示されている。
〔図２１Ｃ〕推定上の基質結合ループにおけるＬｇＢＳＨａの３つのキメラ変異体ならびにＧＣＡ及びＴＣＡに対するそれらの相対的活性。
〔図２２〕ＢＳＨ特異性を活用して、抱合胆汁酸基質依存的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを阻害することができる。（Ａ）組換えにより発現させ精製したＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＢＳＨを、ＧＣＤＣＡ及びＴＣＤＣＡを用いて脱抱合についてアッセイした。各ＢＳＨの比活性は、ニンヒドリンアッセイによってアミノ酸放出量を定量化することにより決定した。（Ｂ）（Ｃ）ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、またはＣＤＣＡと、精製したＬｊｏＢＳＨａもしくはＬｊｏＢＳＨｃとの組み合わせを添加したＢＨＩＳ培地におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの嫌気的増殖。
〔図２３〕セフォペラゾン処置マウスの盲腸のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅエキソビボ増殖。ＢＳＨ活性によりマウス盲腸内容物中で抑制性脱抱合胆汁酸が生成され、それがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を阻害した。
〔発明を実施するための形態〕
本開示の実施形態では、消化管を調節することに関する組成物及び方法を提供する。詳しくは、本開示は、特に、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝臓癌と結腸癌、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等の疾患の予防及び治療のために、胆汁酸ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）を使用して腸内細菌叢胆汁酸プールを選択的に調節するための新規治療戦略を提供する。本開示の実施形態は、インビボでの胆汁組成を調節することができる重要な胆汁酸塩ヒドロラーゼの遺伝的及び機能的特徴の同定を容易にする。いくつかの実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ由来の有益なＢＳＨは、健康を促進して感染を回避するために、工学的に操作されて他の腸管微生物へ送達される。
消化管（ＧＩＴ）常在細菌叢はヒトの健康にとって重要である。この微生物群集に対する変化は胆汁酸代謝に影響を与え、また肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、肝臓癌と結腸癌、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）を含む他のＧＩ疾患の発症と関連する。これらの疾患の米国医療制度に対する負担は天文学的であり、２０１７年には肥満単独で＄２３７０億ドルを上回っている。腸内細菌叢－胆汁酸プールを選択的に調整することができる新たな治療法は、上記疾患の予防及び治療のための新規戦略となる。
胆汁酸は肝臓でコレステロールから合成され、リポタンパク質、グルコース、薬物、及びエネルギーの代謝に必須である。胆汁酸は、核内受容体ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）及びＧタンパク質共役受容体ＴＧＲ５へのシグナル伝達分子として作用することを含めた様々な方法で、宿主生理機能を直接形成し得る。腸内細菌叢は、ＦＸＲを介した胆汁酸の代謝と合成の両方を調節することができる。一次胆汁酸は主にコール酸（ＣＡ）及びケノデオキシコール酸（ｃｈｅｎｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）（ＣＤＣＡ）であり、宿主により作られ、グリシンまたはタウリンに抱合され得る。これらが小腸を通って進む際、胆汁酸の９５％は腸肝系を介して回腸終末部で吸収され、大部分が抱合胆汁酸である（図１Ａ）。大腸まで達する残りの胆汁酸は、腸内細菌叢構成菌によってさらに生体内変換を受け、脱水酸化されてデオキシコール酸塩（ＤＣＡ）及びリトコール酸（ＬＣＡ）等の二次胆汁酸になる。腸内細菌叢構成菌は、ＧＩＴ全体にわたる胆汁酸代謝で必須の役割を果たす。
二次胆汁酸は、再吸収されてグリシンまたはタウリンに抱合され得（例えば、ＧＤＣＡ、ＴＤＣＡ等）、これが胆汁酸プールの複雑さをさらに増大させる。ＧＩＴにおいて最も多い抱合胆汁酸としては、タウロコール酸塩（ＴＣＡ）、グリココール酸塩（ＧＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸塩（ｔａｕｒｏｃｈｅｎｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）（ＴＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸塩（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸塩（ＴＤＣＡ）及びグリコデオキシコール酸塩（ＧＤＣＡ）が挙げられる。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ｂｓｈ）遺伝子をコードする腸内微生物は、抱合胆汁酸を脱抱合するかまたはそれからグリシン及びタウリンを切断して非抱合胆汁酸を生成することができる（例えば、タウロコール酸→タウリンとコール酸）。これは、微生物の胆汁酸代謝における重要な第一段階であり、これにより以降のすべての生体内変換がもたらされる（図１Ｂ）。抱合胆汁酸には両親媒特性があるため界面活性剤としてより効率的であり、これにより、胆汁酸代謝細菌の増殖を促進し、胆汁感受性細菌の増殖を低下させることによって腸内細菌叢をさらに形成することができる。したがって、これらの酵素を活用して胆汁酸プールを合理的に設計し、腸内細菌叢及び宿主代謝を変化させ、最終的に宿主の健康を形成することができる。胆汁酸を変化させる酵素が、疾患との関連においてどのようにして腸内細菌叢と宿主の両方を変化させることができるのかを検討した研究は少ない。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉはプロバイオティクス製剤で広く使用されており、多くの場合、正常な常在腸内細菌叢を修復するために抗生物質と協調して用いられるが、それらがどのようにして宿主の健康を改善し、どのように腸内細菌叢を形成するのかの機序は、十分に解明されていない。最近の研究では、一部のプロバイオティクスは有害であり、抗生物質治療後の腸内細菌叢の回復を長期化させることが示されている。これについては引き続き議論があり、基礎にある機序を検討するにはさらなる研究が必要である。一部のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、一次抱合胆汁酸及び二次抱合胆汁酸を脱抱合するＢＳＨ酵素をコードするｂｓｈ遺伝子を複数持っている。これらの酵素が胆汁酸を認識して、それに対して作用する分子基盤、及びこの活性がどのようにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの定着とＧＩＴ環境に影響を与えるのかは現在のところ不明である。
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを含め、多くの腸内細菌はＢＳＨをコードし、３３を超える酵素が生化学的に特徴付けられている。しかしながら、これらの研究からは、ＢＳＨ酵素学及び基質の特異性と認識の基礎にある、構造及び生化学の重要な情報が得られない。このことは、明らかにされている結晶構造が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓからの４つしかなく、それが唯一の酵素であり、基質がＴＤＣＡであるという事実によってさらに説明される（図１Ｃ）。いくつかのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｓｈ変異株には抱合胆汁酸存在下での増殖上の欠陥があり、それらが、ＧＩＴの胆汁耐性と定着に重要であることを示唆している。しかし、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉでの胆汁耐性試験は通常Ｏｘｇａｌｌ存在下のインビトロで行われ、ＧＩＴ中に存在する胆汁酸の組成または複雑さを模倣するものではない。さらに、以前の研究では、宿主の体重増加、脂質代謝、及び胆汁耐性の調節における腸内ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉのＢＳＨ活性の重要性が強調されているが、これがどのようにして腸内細菌叢を変化させるのかは検討されておらず、その活性は、腸内細菌叢の組成を形成する変数であることが知られている。
本明細書で記載されるように、現在のところ、宿主のＧＩの健康を修復するために、抗生物質治療後にプロバイオティクス栄養補助食品または生きた培養菌を含有するヨーグルトを摂取するというのが現状であるが、これがどのように宿主の健康を改善するのかを定義するメカニズム研究はない。一方、様々な疾患の予防及び治療のための前臨床試験及び臨床試験の異なる段階において、複数のプロバイオティクス製剤、すなわち、肥満のためのＯｐｔｉＢｉｏｔｉｘ Ｈｅａｌｔｈ製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ＩＢＤのためのＩｎｔｒｅｘｏｎ製Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）患者を治療するためのＢｉｏＫ Ｐｌｕｓ製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株３種カクテルがある。
マイクロバイオームの分野は前進していることから、肥満及び糖尿病ならびにＣＤＩのような他のＧＩ疾患を含む代謝性疾患を治療するために、定義された細菌カクテルまたは工学的に操作されたプロバイオティクス株を使用することができるであろうと期待される。しかしながら、これが現実の治療法となるまでに、プロバイオティクスの効果を評価するための十分に特徴付けされた頑健な系において基礎的メカニズム研究を行う必要がある。本開示の組成物及び方法は、微生物のＢＳＨを、生理学的に関連する抱合胆汁酸に対する酵素活性増強のために確実に工学的操作をするための新規プラットフォームを使用することにより、現在利用可能な手法とは対照をなす。これらの新規合成コンストラクトを、十分に特徴付けされた系においてインビトロ及びインビボの両方で試験した。本明細書に詳述される結果は、この手法が、腸内の胆汁酸組成を変化させるために有効であり得、結果として、ＧＩ疾患及び代謝性疾患を調節するための治療上の基盤を提供することができることを示している。
本項及び本明細書の開示全体で使用される項目見出しは構成のみを目的としており、限定することを意図しない。
〔１．定義〕
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含め、本書類が優先する。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本開示の実施または試験においては本明細書に記載される方法及び材料と類似するかまたは均等のものを使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は例示的なものに過ぎず、限定されることを意図しない。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びそれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を除外しない、非限定的な移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。本開示はまた、明示的な記載の有無を問わず、本明細書で提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も意図する。
本明細書の数値範囲の記述では、それらの間に介在する、同程度に正確な数値各々が明示的に意図される。例えば、６～９という範囲の場合、数値６及び９に加えて７及び８が意図され、６．０～７．０という範囲の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に意図される。
本明細書の数値範囲の記述では、それらの間に介在する、同程度に正確な数値各々が明示的に意図される。例えば、６～９という範囲の場合、数値６及び９に加えて７及び８が意図され、６．０～７．０という範囲の場合、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に意図される。
本明細書で使用される「と相関する」とは、「と比較して」ということを指す。
本明細書で使用される場合、用語「動物」とは、任意の動物（例えば、哺乳類）を指し、これにはヒト、非ヒト霊長類、ブタ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット等）、ハエ等が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「非ヒト動物」とは、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ等の脊椎動物等が含まれるが、これらに限定されない、あらゆる非ヒト動物を指す。
本明細書で使用される場合の用語「導入遺伝子」とは、（例えば、新たな受精卵または初期胚内に遺伝子を導入することにより）生物内に置かれた外来、異種、もしくは自己の遺伝子及び／またはその断片を指す。用語「外来遺伝子」とは、実験操作によって動物のゲノム内に導入された任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を指し、これには、導入された遺伝子が、その天然に存在する遺伝子のある位置と同じ位置に存在しないのであれば、その動物に見出される遺伝子配列が含まれてよい。
本明細書で使用される場合、用語「トランスジェニック動物」とは、導入遺伝子を含有している任意の動物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「微生物」とは、典型的には単一細胞からなる、顕微鏡的、超顕微鏡的（ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）、または超顕微鏡的（ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）な大きさの生物または微生物を指す。微生物の例としては、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻、及び原虫が挙げられる。いくつかの態様では、微生物は、１つ以上の治療用の目的分子またはタンパク質を産生するよう工学的に操作される（「工学的操作微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境から特定の代謝物または他の化合物を取り込んで異化するよう工学的に操作される。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝物または他の化合物（合成または天然に存在する）を合成し、それらをその微生物の環境に放出するよう工学的に操作される。特定の実施形態では、工学的操作微生物は、工学的に操作された細菌である。特定の実施形態では、工学的操作微生物は、工学的に操作されたウイルスである。
本明細書で使用される場合、「非病原性細菌」とは、宿主において疾患または有害な反応を引き起こす能力がない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、グラム陽性菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、リポ多糖（ＬＰＳ）を含有していない。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、腸内常在細菌叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの属に属する特定の株、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。天然で病原性の細菌は、病原性を低下または消失させるよう遺伝子工学的に操作され得る。
本明細書で使用される場合、用語「プロバイオティクス」は、生きている非病原性微生物、例えば、細菌であって、適切な量の微生物を含有する宿主生物に健康上の利益を付与することができるものを指して使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は、哺乳類である。いくつかの実施形態では、宿主生物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス細菌は、グラム陽性菌である。非病原性細菌のいくつかの種、株、及び／またはサブタイプが、現在プロバイオティクス細菌として認識されている。プロバイオティクス細菌の例としては、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの属に属する特定の株、例えば、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、株の例として、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ－１４、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｌｃ１１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５０、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＤＮＨ－４２９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ Ｌｇ－３６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ－１１５、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９４８、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９５７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９６４、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９７９、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ１３７０、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ２６７７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐｃ－３７、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ１１５、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＨＮ００１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ Ｌｒ－３２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ １Ｅ１、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌｓ－３３、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５５、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ ＢＬ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－０２、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ－０７、Ｂ．ｂｒｅｖｅ Ｂｂ－０３、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ｂｂ－０６、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｂｌ－０５、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｐ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｂｉ－２６．、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
プロバイオティクスは、細菌の変異型または変異株であり得る。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば、生存性を、増強させるかまたは改善するよう遺伝子工学的に操作され得る。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するよう遺伝子工学的に操作され得る。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を増強させるかまたは改善するよう遺伝子工学的に操作またはプログラムされ得る。
本明細書で使用される場合、用語「組換え細菌細胞」または「組換え細菌」とは、細菌細胞または細菌で、それらの天然状態から遺伝的に修飾されているものを指す。例えば、組換え細菌細胞は、それらのＤＮＡ内に導入されている、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド再構成、及びヌクレオチド修飾を有し得る。これらの遺伝的修飾は、細菌もしくは細菌細胞の染色体内、または細菌もしくは細菌細胞のプラスミド上に存在し得る。本明細書に開示される組換え細菌細胞は、プラスミドに外来ヌクレオチド配列を含み得る。別法として、組換え細菌細胞は、それらの染色体内に安定して組み込まれた外来ヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子導入系」とは、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入系としては、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び他の核酸を用いた送達系）、裸核酸のマイクロインジェクション、ポリマーを用いた送達系（例えば、リポソームを用いた系及び金属粒子を用いた系）、遺伝子銃によるインジェクション等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「ウイルス遺伝子導入系」とは、所望の細胞または組織への試料の送達を容易にする、ウイルスエレメント（例えば、無傷ウイルス、改変ウイルス及びウイルス構成成分、例えば、核酸またはタンパク質）を含む遺伝子導入系を指す。本明細書で使用される場合、用語「アデノウイルス遺伝子導入系」とは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する無傷または改変されたウイルスを含む遺伝子導入系を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない、任意の核酸含有分子を指す。この用語には、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケウオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、プソイドウラシル、ケウオシン、２－チオシトシン、及び２，６－ジアミノプリン等、これらに限定されないＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかが含まれている配列が包含される。
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の生成に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長配列または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合性、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限りにおいては、全長コード配列によるか、またはコード配列の任意の部分によりコードされ得る。用語はまた、構造遺伝子のコード領域、及びかかるコード領域に５’末端と３’末端の両方で隣接して位置し、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するよういずれの末端でも約１ｋｂ以上の距離にわたる配列をも包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」には、ｃＤＮＡ及びゲノムの両方の遺伝子形態が包含される。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されているコード領域を含有する。イントロンは、核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、エンハンサー等の調節エレメントを含有し得る。イントロンは、核内または一次転写産物から除去または「切り出」され、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物にはイントロンは存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を指定する機能を果たす。
本明細書で使用される場合、用語「異種遺伝子」とは、その天然環境に置かれていない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子には、ある種から別の種へ導入された遺伝子が含まれる。異種遺伝子にはまた、何らかの方法で改変されている、生物にとって天然である遺伝子（例えば、変異、複数コピーでの付加、非天然制御配列への連結等が行われているもの）も含まれる。異種遺伝子は内在性遺伝子とは区別され、異種遺伝子配列は典型的には、天然では、染色体においてその遺伝子配列と関連して見出されることがないかまたは天然では見出されない染色体部分と関連しているＤＮＡ配列に連結されている（例えば、その遺伝子が通常は発現されない遺伝子座で発現されている）。
本明細書で使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常は細菌に存在しない核酸配列、例えば、過剰コピーの内在性配列、あるいは異なる種、株、もしくは亜株の細菌からの配列であるかまたは同じサブタイプの細菌からの未修飾配列と比較して修飾及び／または変異が行われている配列等の異種配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成された天然には存在しない配列である。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、及び／または遺伝子カセットにした１つ以上の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、２つ以上の核酸配列で、互いに天然では同じ関係では見出されることのないものを指す。非天然核酸配列は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、及び／または遺伝子カセットの複数コピーが細菌内に存在してよく、かかる調節領域、プロモーター、遺伝子、及び／または遺伝子カセットの１つ以上のコピーを、本明細書に記載のように変異させるか、そうでなければ変化させてよい。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、コピー数を増大させるため、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる構成成分を含めるために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、及び／または遺伝子カセットの複数コピーを含むよう工学的に操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子工学的操作細菌は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子であって、天然では前記遺伝子と関連していない誘導性プロモーター、例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子に機能的に連結されているＦＮＲプロモーターに、直接または間接的に機能的に連結されている、遺伝子を含む。
本明細書で使用される場合、「機能的に連結されている」とは、核酸配列、例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子であって、その核酸配列の発現を可能にするよう、例えば、シスで作用するように、調節領域配列に連結されているものを指す。調節領域は、目的遺伝子の転写を導くことができる核酸であり、これは、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’の非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、ならびにイントロンを含み得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、コード配列またはコード遺伝子の発現を制御する能力があるヌクレオチド配列を指す。プロモーターは一般に、それらが制御する配列の５’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子由来であり得る、もしくは天然に見出されるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され得る、及び／または合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当業者は、特定の刺激に、例えば、細胞または組織に特異的に応答するか、異なる環境もしくは生理的な条件に応答するか、または特定の化合物に応答して、異なるプロモーターがコード配列またはコード遺伝子の発現を制御し得ることを容易に確認するであろう。原核生物のプロモーターは典型的には、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターという２つのクラスに分類される。
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように、核酸と関連して使用される「単離された」という用語は、核酸配列であって、その天然の供給源において通常は会合している少なくとも１つの構成成分または混入汚染物質から同定され、分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、それが天然において見出される場合とは異なる形態または状況で存在する。対照的に、非単離核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸で、天然においてそれらが存在している状態で見出されるものである。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞染色体上で隣接遺伝子に近接して見出され、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする他の多数のｍＲＮＡとの混合物として細胞内に見出される。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸には、例として、通常はその所与のタンパク質を発現している細胞における核酸であって、天然細胞の染色体上の位置とは異なる位置にあるか、そうでなければ、天然に見出される場合とは異なる核酸配列が隣接しているような核酸が含まれる。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。あるタンパク質を発現させるために単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用しようとする場合、かかるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには最低限センス鎖またはコード鎖が含有される（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が含有される（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る）場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「精製された」または「精製すること」とは、試料からの構成成分（例えば、汚染物質）の除去を指す。例えば、抗体は、免疫グロブリンではない汚染タンパク質の除去によって精製され、また、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。免疫グロブリンではないタンパク質の除去及び／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去により、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合増加がもたらされる。別の例では、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞で発現され、宿主細胞タンパク質の除去によってそのポリペプチドが精製され、それにより、試料中の組換えポリペプチドの割合が増加する。
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は本明細書では同じ意味で使用され、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジー等のようなサル）ならびにヒト）が含まれるが、これらに限定されない任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトでも非ヒトでもあり得る。一実施形態では、対象は、ヒトである。対象または患者は、様々な形態の治療を受け得る。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」または「治療」はそれぞれ本明細書では同じ意味で使用され、そのような用語が適用される疾患及び／または損傷あるいはそのような疾患の１つ以上の症状の進行を、回復させること、軽減すること、または阻害することを表す。用語はまた、対象の状態に応じ、疾患を予防することも指し、疾患の発症を予防すること、または疾患と関連する症状を予防することが含まれる。治療は、急性的にも慢性的にも実施され得る。用語はまた、疾患の重症度またはそのような疾患と関連する症状を、その疾患に罹患する前に低減することも指す。罹患前の疾患の重症度についてのそのような予防または低減とは、治療実施の時点ではその疾患に罹患していない対象に治療を行うことを指す。「予防すること」はまた、疾患またはそのような疾患と関連する１つ以上の症状の再発を予防することも指す。
本明細書で別段定義されない限り、本開示との関連で使用される科学用語及び技術用語は当業者が共通して理解する意味を持つものとする。例えば、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションとの関連で使用される任意の術語及びそれらに関する技術は、当該技術分野で周知の一般的に使用されるものである。用語の意味及び範囲は明確であるはずであるが、潜在的に曖昧性がある場合は、いかなる辞書または外的定義よりも本明細書で提供される定義が先行する。さらに、文脈で他の意味に解釈すべき場合を除き、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。
〔２．組成物及び方法〕
本開示の実施形態には、遺伝子工学的操作微生物、その医薬組成物、ならびに胆汁酸塩及び／または胆汁酸と関連する障害を治療する方法が含まれる。具体的には、本明細書に開示される組換え細菌は、対象の細菌叢を調節するよう工学的に操作されている。これらの組換え細菌は、安全かつ忍容性が高く、対象のマイクロバイオームの先天的活性を増強させて治療効果を達成する。
本開示の実施形態には、ＢＳＨ酵素で、天然に存在する酵素及び天然には存在しない酵素のいずれも含まれる。天然には存在しないＢＳＨ酵素としては、組換え体、変異体、キメラ、融合タンパク質、タグ付きのペプチド／ポリペプチド等、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本開示の天然には存在しないＢＳＨ酵素には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸置換とを有するポリペプチドが含まれ得る。本開示の天然には存在しないＢＳＨ酵素には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも１つの追加のペプチドまたはポリペプチドの断片とを有する、キメラポリペプチドまたは融合タンパク質も含まれ得る。いくつかの実施形態では、組換えＢＳＨ酵素は、活性部位内の選択アミノ酸の特定の変異、またはインデル、及び一緒に融合されている異なるＢＳＨの様々なセクションのペプチドもしくはポリペプチドの断片を含有する。
本明細書で詳しく開示されているように、組換えＢＳＨ酵素は、医薬組成物中に含まれ得る。例えば、組換えＢＳＨ酵素は、細菌（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の株内部にプラスミドもしくはゲノムの組み込みとして含めること、及び／または外因性のペプチド、ポリペプチド、もしくはポリヌクレオチドとして細菌の株と共に含めることができ、これらが共に医薬組成物を構成する。これらの実施形態によれば、本開示は、これらの医薬組成物を使用して胆汁酸塩及び／または胆汁酸と関連する障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細菌細胞は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）酵素をコードする異種遺伝子を含むよう遺伝子工学的に操作されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細菌細胞は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、及び１１４）及び／またはＢＳＨ酵素ではない第２の遺伝子を含むよう遺伝子工学的に操作されている。いくつかの実施形態では、工学的に操作された細菌は、胆汁酸塩及び／または胆汁酸の濃度を調節する能力がある。いくつかの実施形態では、工学的に操作された細菌は、低酸素環境（例えば、腸）において胆汁酸塩及び／または胆汁酸をプロセシングし、その濃度を低下させる能力がある。したがって、本明細書に開示される遺伝子工学的に操作された細菌細胞及びかかる細菌細胞を含む医薬組成物は、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等（ただし、これらに限定されない）の胆汁酸塩と関連する障害を治療及び／または予防するため、過剰胆汁酸塩を無毒性分子に変換するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子工学的に操作された細菌細胞及びかかる細菌細胞を含む医薬組成物は、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等の、胆汁酸塩及び胆汁酸塩代謝物（例えば、胆汁酸）と関連する障害を治療及び／または予防するため、過剰胆汁酸を無毒性分子に変換するために使用され得る。
開示の遺伝子工学的操作細菌等の、遺伝子工学的に操作された微生物またはプログラム微生物は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素の産生能がある。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、偏性嫌気性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、通性嫌気性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、好気性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、グラム陽性菌であり、ＬＰＳを欠く。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、グラム陰性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、グラム陽性の偏性嫌気性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、グラム陽性の通性嫌気性菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、プロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、病原性を低下または消失させるよう修飾または変異が行われている、天然で病原性の細菌である。例示的細菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ Ｍ－５５、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｅｌｓｉｎｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ－ＮＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｒａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｅａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ１９１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、及びＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子工学的操作細菌は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓからなる群から選択される。一実施形態では、細菌細胞は、グラム陽性菌細胞である。
別の実施形態では、細菌細胞は、グラム陰性菌細胞である。特定の実施形態では、細胞は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ－１４、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｌｃ１１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５０、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＤＮＨ－４２９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ Ｌｇ－３６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ－１１５、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９４８、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９５７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９６４、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９７９、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ１３７０、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ２６７７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐｃ－３７、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ１１５、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＨＮ００１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ Ｌｒ－３２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ １Ｅ１、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌｓ－３３、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５５、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ ＢＬ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－０２、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ－０７、Ｂ．ｂｒｅｖｅ Ｂｂ－０３、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ｂｂ－０６、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｂｌ－０５、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｐ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｂｉ－２６．という株、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つから選択される。
上記の遺伝子工学的に操作された細菌のいくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子配列を含む。上記の遺伝子工学的に操作された細菌のいくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子配列及び１つ以上の他の外来遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、細菌のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、細菌のプラスミド上に存在し、プラスミド上で非天然プロモーターに機能的に連結されている。他の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、細菌染色体内に存在する。他の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子は、細菌染色体内に存在し、染色体内でプロモーターに機能的に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「胆汁酸塩ヒドロラーゼ」酵素とは、グリコール－抱合胆汁酸またはタウロ－抱合胆汁酸のアミノ酸側鎖の切断に関与して、非抱合胆汁酸を生成させる酵素を指す（図１）。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）酵素は、当業者に周知である。例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、及びＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．において検出されている。本明細書に記載される細菌細胞は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする異種遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子配列を含み、胆汁酸塩を非抱合胆汁酸に脱抱合する能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞における胆汁酸塩濃度を調節する（増加または減少させる）能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞における胆汁酸濃度を高める能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞におけるＴＣＡ濃度を低下させる能力がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＦＣＡ、ＦＣＤＣＡ、ＦＬＣＡ、ＦＤＣＡ、ＦＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＬＣＤＣＡ、ＬＬＣＡ、ＬＤＣＡ、ＬＵＤＣＡ、ＹＣＡ、ＹＣＤＣＡ、ＹＬＣＡ、ＹＤＣＡ、ＹＵＤＣＡ、及び／またはそれらの組み合わせの濃度を低下させる能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞における一次胆汁酸濃度を高める能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞におけるＣＡ濃度を高める能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞におけるＣＤＣＡ濃度を高める能力がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細菌細胞は、対象または細胞におけるＣＡ濃度及びＣＤＣＡ濃度を高める能力がある。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞での胆汁酸塩異化率を増大させる。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞内または対象での胆汁酸塩濃度を低下させる。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞内または対象でのタウロコール酸（ＴＣＡ）濃度を低下させる。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞内または対象でのグリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）濃度を低下させる。胆汁酸塩異化率及び胆汁酸塩と胆汁酸の濃度を測定する方法は当業者に周知である。例えば、胆汁酸塩及び胆汁酸は試料から抽出され得、胆汁酸塩異化率及び／または胆汁酸塩と胆汁酸の濃度を決定するために標準的ＬＣ／ＭＳ方法が使用され得る。
別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞内または対象での胆汁酸塩の濃度と比較して、細胞内または対象での胆汁酸の濃度を高める。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞でのコール酸（ＣＡ）濃度を高める。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素は、細胞でのケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）濃度を高める。
いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生する。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して腸管内の炎症を軽減し、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生してアテローム性動脈硬化を軽減し、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生してＣＮＳの炎症及び／または自己免疫疾患を軽減する。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して肝臓の脂肪及び線維症を軽減する。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して耐糖性及びインスリン耐性を高める。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して脂肪性肝炎を低下させる。組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して、脂肪酸合成に関与する遺伝子の肝臓での発現を減少させる、及び／またはＴＮＦ－ａを低下させる、及び／またはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファの発現上昇を抑制し、それによりＮＡＳＨ表現型を改善する。いくつかの実施形態では、組換え細菌は、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含み、かかる細菌は、ＣＤＣＡを産生して、線維症の進行を予防する、及び／または線維症を減少させる、及び／または肝硬変発症を低減する、及び／または門脈圧亢進を低下させる。
本開示の実施形態には、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、及び１１４）を含む核酸も含まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸をその配列中に含む１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素（複数可）をコードする遺伝子配列を含む。本明細書に記載される配列と実質的に同じアミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換、ならびにアミノ酸の欠失及び／または挿入を含む配列が含まれる。保存的アミノ酸置換とは、第１のアミノ酸を、化学的及び／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）が第１のアミノ酸と類似している第２のアミノ酸によって置き換えることを指す。保存的置換には、１つのアミノ酸を、以下の群内の別のアミノ酸によって置き換えることが含まれる：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ及びＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ。同様に、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置き換えること（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ同士での置き換え）、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置き換えること（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ間での置き換え）、中性アミノ酸を別の中性アミノ酸で置き換えること（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ同士での置き換え）が意図される。
いくつかの実施形態では、ＢＳＨ酵素をコードする遺伝子を変異誘発し、活性増大を示す変異体を選択し、ＢＳＨ酵素をコードする変異誘発された遺伝子を単離して本開示の細菌細胞内へ挿入する。本明細書に記載される修飾を含む遺伝子は、プラスミドまたは染色体に存在し得る。いくつかの実施形態では、開示は、１つ以上のＢＳＨ酵素をコードする遺伝子配列を含む核酸を提供し、ここで、かかるＢＳＨ酵素は変異誘発され、その対応するペプチドまたはポリペプチド内に合成される。いくつかの実施形態では、ＢＳＨ酵素は、本明細書で詳述されるように、もう１つの異なる胆汁酸に対する基質特異性を付与する異なるペプチドモチーフを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、ＢＳＨ酵素には、ＧＱＤ、ＩＰＡ、及び／またはＡＭＩのペプチドモチーフのうちの１つで存在する少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれる。
いくつかの実施形態では、変異誘発されたＢＳＨ酵素は、いかなる細菌細胞とも無関係に、医薬組成物の一部として対象に投与される。医薬組成物には、本明細書で詳述されるように、１つ以上の変異誘発されたＢＳＨ酵素が含まれ得る。これらの実施形態によれば、本開示は、これらの医薬組成物を使用して胆汁酸塩及び／または胆汁酸と関連する障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子配列を含む核酸は、様々な異なる種の細菌からの胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする遺伝子配列を含み得る。例えば、一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＷＣＦＳ１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ８０、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ５３３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ １００－１００、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ ＡＴＣＣ７００３９６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ３６７、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３である。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＣＣ２７０５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＤＪＯ１０Ａ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＢＢ５３６、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＳＢＴ２９２８、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ ＡＴＣＣ１１８６３、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓである。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓである。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ＭＣＶ１８５またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ １３である。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする遺伝子は、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．からのものである。一実施形態では、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．は、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉである。胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする他の遺伝子は当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかから選択される、１つ以上の胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素をコードする配列、またはその任意の変異型、変異体、キメラ、もしくは融合体を含む。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかの配列との同一性が少なくとも約８０％である。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかとの同一性が少なくとも約８５％である。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかとの同一性が少なくとも約９０％である。一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかとの同一性が少なくとも約９５％である。別の実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３のいずれかとの同一性が少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％である。したがって、一実施形態では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、及び１１４のいずれかとの同一性が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
本明細書ではさらに、胆汁酸塩と関連する疾患または障害を治療する方法が開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるのは、これらの疾患または障害と関連する１つ以上の症状（複数可）を軽減、改善、または消失させるための方法である。いくつかの実施形態では、胆汁酸塩と関連する疾患または障害は、心血管疾患、代謝性疾患、肝硬変もしくはＮＡＳＨ等の肝疾患、多発性硬化症及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の炎症性疾患と自己免疫疾患、消化管癌、及び／またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、開示は、これらの疾患と関連する、胸痛、心不全、もしくは体重増加が含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の症状（複数可）を軽減、改善、または消失させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患は、他の状態、例えば、心血管疾患または肝疾患に続発する。特定の実施形態では、細菌細胞は、胆汁酸塩と関連する障害を治療するために、対象において胆汁酸塩を脱抱合する能力がある。これらの実施形態では、胆汁酸塩と関連する障害、例えば、肥満を患う患者は、実質的通常食、または制限の緩和された食事を再開できる場合がある。
特定の実施形態では、細菌細胞は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症等の胆汁酸塩及び／または胆汁酸と関連する障害を治療または予防するために、対象において一次胆汁酸を二次胆汁酸に代謝する能力がある。これらの実施形態では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を患うリスクのある対象は感染に対する抵抗性が増強され、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症の対象は抵抗性が増強されて、より速やかに回復する。例えば、治療中の入院患者は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染する可能性が低くなる。
方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの遺伝子工学的に操作された種、株、またはサブタイプの細菌を用いて医薬組成物を調製すること、及びかかる医薬組成物を治療的有効量で対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの遺伝子工学的に操作された種、株、またはサブタイプの細菌を、ＢＳＨ酵素の配列を含む組換え型のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共に用いて医薬組成物を調製すること、及びかかる医薬組成物を治療的有効量で対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、例えば、液体懸濁液で経口投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、凍結乾燥してゲルキャップに入れ、経口投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、栄養管または胃シャントを介して投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、直腸内に、例えば、浣腸で投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、局所、腸管内、空腸内、十二指腸内、回腸内、及び／または結腸内（ｉｎｔｒａｃｏｌｉｃａｌｌｙ）に投与される。
方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの遺伝子工学的に操作された種、株、もしくはサブタイプの細菌及び／または少なくとも１つの組換えＢＳＨ酵素を用いて医薬組成物を調製すること、ならびにかかる医薬組成物を治療的有効量で対象に投与することを含み得る。遺伝子工学的に操作された微生物及び／または組換えＢＳＨ酵素は、局所的に、例えば、組織内に直接注射するかもしくは血管に供給して投与され得るか、あるいは全身性に、例えば、注入もしくは注射により静脈内投与され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経口投与、または局所投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子工学的に操作された微生物及び／または組換えＢＳＨ酵素は、静脈内投与、すなわち、全身投与される。
本発明の遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素を含む医薬組成物は、胆汁酸塩と関連する疾患または胆汁酸塩と関連する疾患もしくは障害と関連する症状（複数可）を、治療、管理、改善、及び／または予防するために使用され得る。医薬組成物にはまた、１つ以上の遺伝子工学的に操作された細菌、及び／または１つ以上の組換えＢＳＨ酵素が、単独か、あるいは予防薬、治療剤、及び／または薬学的に許容される担体と組み合わせて含まれる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素を発現させるため等、本明細書に記載される遺伝的修飾を含むよう工学的に操作されている１つの種、株、またはサブタイプの細菌を含む。代替実施形態では、医薬組成物は、例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼ酵素を発現させるため等、本明細書に記載される遺伝的修飾を含むようそれぞれが工学的に操作されている、２つ以上の種、株、及び／またはサブタイプの細菌を含む。
本明細書に記載される医薬組成物は、活性成分を医薬用組成物に加工することを容易にする、添加剤及び助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該技術分野で公知である（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照のこと）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腸溶でも非腸溶でもあり得る、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、ミクロ錠剤、ペレット、または粉末を形成するために、打錠、凍結乾燥、直接打錠、従来の混合、溶解、造粒、微粉化、乳化、封入、捕捉、または噴霧乾燥に供される。適切な製剤は、投与経路に応じて異なる。
本明細書に記載される遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、任意の好適な剤形（例えば、液剤、カプセル、小袋、硬カプセル、軟カプセル剤、錠剤、腸溶錠、懸濁用散、顆粒、または経口投与用マトリックス徐放性製剤）の、任意の好適な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即放性、パルス放出性、遅延放出性、または徐放性）のための医薬組成物に製剤化され得る。遺伝子工学的に操作された細菌の好適な投与量は、約１０５～１０１２の範囲の細菌、例えば、約１０５細菌、約１０６細菌、約１０７細菌、約１０８細菌、約１０９細菌、約１０１０細菌、約１０１１細菌、もしくは約１０１２細菌、またはそれ以上であり得る。本明細書に記載される遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換え酵素の任意の組み合わせを含み得る組成物は、１日１回以上、週１回以上、または月１回以上投与することができる。これらの組成物は、食前、食事中、または食後に投与され得る。いくつかの実施形態では、これらの医薬組成物は、対象が食事を食べる前に投与することができる。いくつかの実施形態では、これらの医薬組成物は、食事進行中に投与することができる。いくつかの実施形態では、これらの医薬組成物は、対象が食事を食べた後に投与することができる。
遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、１つ以上の薬学的に許容される担体、粘稠剤、希釈剤、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ）、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、表面活性剤、中性もしくはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、膜透過性促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例えば、医薬組成物には、カルシウム重炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、様々な糖と種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物性油、ポリエチレングリコール、及び界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）の追加が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子工学的操作細菌は、炭酸水素ナトリウム溶液、例えば、炭酸水素ナトリウム１モル溶液に（例えば、胃等の細胞内酸性環境を緩衝するため）製剤化され得る。遺伝子工学的操作細菌は、中性または塩の形態で投与及び製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する陰イオン等の陰イオンで形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する陽イオン等の陽イオンで形成される塩が挙げられる。
本明細書に開示される遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、局所投与され得、軟膏、クリーム、経皮吸収パッチ、化粧水、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化され得る。一実施形態では、スプレー可能ではない局所適用製剤の場合、局所適用と適合性のある担体または１つ以上の添加剤を含み、かつ動的粘度が水より大きい、粘性から半固形または固形の形態が使用される。好適な製剤としては、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、粉末、塗布剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、これらは滅菌されるか、または様々な特性、例えば、浸透圧に影響を与えるための助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩）と混合される。他の好適な局所適用製剤としては、スプレー可能なエアロゾル調製物が挙げられ、固形または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧揮発性物質（例えば、フレオン等の気体状噴射剤）との混合物で包装されるか、または絞り出しボトルに包装される。医薬組成物及び剤形に保湿剤または保潤剤を加えることもできる。そのような追加成分の例は当該技術分野において周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生用品として製剤化され得る。例えば、衛生用品は、抗菌性製剤、または発酵ブロス等の発酵製品であり得る。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、及びリップバームであり得る。
本明細書に開示される遺伝子工学的に操作された細菌及び／または組換えＢＳＨ酵素は、経口投与され得、また錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤化され得る。経口用の薬理学的組成物は、固形添加剤を使用し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、所望に応じて好適な助剤を加えた後に顆粒混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得て製造することができる。好適な添加剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、もしくはソルビトール等の糖；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース組成物；及び／またはポルビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の生理学的に許容されるポリマー等の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤、例えば、架橋ポルビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを加えてもよい。
〔３．実施例〕
本明細書に記載される本開示の方法の他の好適な変更及び適応は、容易に適用及び認識することができ、それらは、本開示または本明細書に開示される態様及び実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して行われ得ることは、当業者に容易に明らかとなるであろう。ここまで本開示を詳細に記載してきたが、同記載は以下の実施例を参照にすることによってより明確に理解され、それらは、開示の態様及び実施形態の一部を説明することのみを意図しているに過ぎず、開示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で言及される学術誌参考文献、米国特許、及び刊行物のすべての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
実施例１
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ株、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ株、及び他の株を一晩増殖させ、ＭＲＳプレート、ＴＤＣＡ、及びＧＤＣＡを添加したＭＲＳ（ＧＩＴに存在する抱合胆汁酸、図２Ａ～２Ｃ）にスポッティングした。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株が活性ＢＳＨを有するかどうかを最初に決定するため、プレート沈殿アッセイを使用した。簡単に言えば、胆汁酸塩を寒天培地に添加し、培地の加水分解及び酸性化による遊離胆汁酸の沈殿であるハローがコロニーを囲んでいることによりＢＳＨ陽性株を同定する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、予想通り、ＭＲＳ培地単独ではハローを示さず、培地にＴＤＣＡ及びＧＤＣＡを添加した場合に差別的なハローを生成した。これらのデータは、これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株がＢＳＨ活性を有していることを示しており、基質特異性の相違を示唆している。
本明細書で提供される実施形態と併せて使用することができる株としては、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＡＴＣＣ３３４、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＤＳＭ２０３１４、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＬＧＧ、Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｎｉ ＣＤ０３４、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉ ＤＳＭ２０５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ９９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ３３５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４４、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３が挙げられるが、これらに限定されない。
図２の株のＢＳＨ活性をさらに評価するため、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢ（それぞれＬａＢＳＨａ及びＬａＢＳＨｂ）、ならびにＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３のｂｓｈＡ及びｂｓｈＢ（それぞれＬｇＢＳＨａ及びＬｇＢＳＨｂ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ３）に組換えにより発現させて精製し（図９）、関連する抱合胆汁酸のパネルに対して酵素測定法で試験した（図１０）。ＬａＢＳＨａ、ＬａＢＳＨｂ、及びＬｇＢＳＨｂは、タウロ－抱合胆汁酸と比較してグリコ－抱合胆汁酸に対し、より活性であった。ＬｇＢＳＨａは、試験したタウロ－抱合胆汁酸に対して高活性を示した。ニンヒドリンアッセイでＢＳＨ比活性を決定した。既知濃度のグリシン及びタウリンの標準曲線を使用して遊離したアミノ酸の量を算出した。これらのデータは、Ｅ．ｃｏｌｉで過剰発現された組換えＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＢＳＨが抱合胆汁酸に対する異なる比活性を有することを示している。
ＢＳＨ酵素は、グリシン及び／またはタウリンが抱合した胆汁酸塩からアミノ酸残基と非抱合胆汁酸への加水分解を触媒する。ヒトＧＩＴから分離された、活性ＢＳＨ（コリルグリシンヒドロラーゼ）酵素をコードするＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の特徴付けをした（例えば、図３、図４を参照のこと）。特定のセットの基準に基づいてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ株及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３株を選択した。どちらの株も、完全に配列決定されたゲノム、利用可能な遺伝的手段、活性かつ注釈付きＢＳＨを有し、またヒトでの研究において健康への正の効果と関連する。以前の研究では、両株のｂｓｈ遺伝子座がタンパク質レベルで３３％及び６５％の同一性を共有することが詳細に報告されている。現在までのところ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭのＢＳＨ酵素は、プレートでの沈殿アッセイでのみ特徴付けられており、両方のｂｓｈ遺伝子（ｂｓｈＡ及びｂｓｈＢ）の遺伝子ノックアウトが構築されている。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３は２つの異なるｂｓｈ遺伝子をコードするが、それにもかかわらず、それらは十分に明らかにされておらず、また他に臨床上関連するＬ．ｇａｓｓｅｒｉ株もそれらのＢＳＨもない。
抱合胆汁酸の存在下で増殖し、プレートアッセイでハローまたは沈殿を示すことができるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を、ＢＳＨ酵素アッセイに供した。簡単に言えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を１５ｍｌの還元ＭＲＳブロスで３７℃にて一晩、嫌気的に培養する。ＢＳＨ活性は、先に記載のように、変形２段階法により決定する。第１のステップでは、１００μｌの全細胞抽出物、９０μｌの反応緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）、及び１０μｌの特定の抱合胆汁酸（１００ｍＭ）を穏やかに混合し、３７℃で３０分間インキュベートする。反応混合物の５０μｌの分注に５０μｌの１５％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させる。この混合物を室温で５分間、１２，０００×ｇで遠心分離にかけ、沈殿物をすべて除去する。第２のステップでは、前のステップから得られた上清の５０μｌを９５０μｌのニンヒドリン試薬に加える。反応混合物を沸騰水浴で１４分間インキュベートし、氷上で３分間冷却する。５７０ｎｍでの吸光度（Ａ５７０）を測定する。各アッセイについてタウリンまたはグリシンを使用した標準曲線を作成し、分子吸光係数を決定する。アッセイはすべて、２つの生物学的反復を用いて三連で行われる。ＢＳＨ活性は、粗抽出物１ｍｇにつき１分間に基質から遊離したタウリンまたはグリシンのμｍｏｌとして記述される。
ＢＳＨはコロイルグリシンヒドロラーゼファミリーに属し、ｂｓｈ遺伝子をコードする腸内細菌叢構成菌は多数あるが、それらの機能はいまだ不明である。それらは保存されたアミノ酸活性部位（Ｃｙｓ２、Ａｒｇ１８、Ａｓｐ２１、Ａｓｎ１７５、及びＡｒｇ２２８）を共有しているが、ＢＳＨは、酵素動態特性、基質特異性、最適ｐＨ、及び制御において異なる。Ｃｙｓ２はＮ－アシルアミド結合の求核攻撃に必要とされ、すべての活性ＢＳＨで保存されている。活性部位アミノ酸が保存されている一方で、基質結合ポケットを構成する残基は保存されていない。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＢＳＨの酵素動態特性の詳細を記した研究はない。ＢＳＨ酵素動態をより良く理解するため、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉのｂｓｈ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ－２１ｂにクローニングし、染色体上にコードされるＴ７－ＲＮＡポリメラーゼのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性発現を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞に形質転換した。組換えＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＢＳＨの大規模タンパク質発現及び精製は、ニッケルカラムを用いたｈｉｓタグアフィニティクロマトグラフィーにより行われた。すべての画分は、１２．５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルに視覚化され、各精製ステップの間、酵素アッセイが実施された。
実施例２
Ｂｒａｎｄｔ及びＢａｒｒａｎｇｏｕにより最近報告された方法を使用して、ピルビン酸キナーゼ酵素配列基づきｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの１７０の種について系統樹を作成した（図３）。Ｄｕａｒ ｅｔ ａｌ．により最近報告されたように、生活習慣が不明、自由生活型、昆虫適応型、遊牧型（ｎｏｍａｄｉｃ）、または脊椎動物適応型というメタデータレイヤーを加えた。ＢＳＨタンパク質の存在と非存在を１７０のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種に対応付けた（図３）。ＢＳＨタンパク質をコードする種の大部分（８４．６２％）は脊椎動物適応型の生活習慣に対応付けられた（少数が不明［１２．８２％］及び遊牧型（ｎｏｍａｄｉｃ）［２．５６％］の生活習慣に対応付けられた）。ＢＳＨを含有していない種は昆虫適応型の生活習慣に対応付けられた。この分布パターンは、ＢＳＨタンパク質を選択的にコードするための、脊椎動物関連種に対する進化的圧力を反映すると考えられる。
図５Ａ～５Ｃに示すように、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉのＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。モデルのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株からのＢＳＨ活性を評価するため、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉのｂｓｈＡ、ｂｓｈＢ及びｂｓｈＣ（それぞれ、ＬｊＢＳＨａ、ＬｊＢＳＨｂ、及びＬｊＢＳＨｃ）を精製し、それらの具体的な活性と最適ｐＨをニンヒドリンアッセイで決定した。試験した酵素は、グリコ抱合型及びタウロ抱合型の胆汁酸ならびに酸性条件に対する異なる選択性を示した（図５Ａ）。ＢＳＨアミノ酸配列の保存分析も実施した（図５Ｃ）。クラスター化したデータセットの５７のクラスターからの代表的ＢＳＨタンパク質のアラインメントを、保存されたアミノ酸モチーフについて分析した。０．７５以上の保存スコアは破線で示されている。モチーフ及び保存されたアミノ酸をＷｅｂＬｏｇｏで示している。アスタリスクは、Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８からの、先に記載されている保存された活性部位残基を示す（図５Ｃ）。
実施例３
無菌（ｇｅｒｍ ｆｒｅｅ）マウスは、タウリン抱合胆汁酸を非抱合胆汁酸へと脱抱合する腸内細菌叢または細菌を欠く。ＧＦマウスの胆汁酸ターゲットメタボロミクスにより、ＧＩＴ（回腸、盲腸、及び結腸）が、タウリン抱合一次胆汁酸であるＴαＭＣＡ、ＴβＭＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、及びＴＨＤＣＡ／ＴＵＤＣＡのみで構成されることが明らかになった（図１５）。ＧＦマウスは、それが腸内細菌叢を欠いており、ＧＩＴ内にタウリン抱合一次胆汁酸が存在していることから、頑健なモデル系とされる。予備試験では、ＧＦマウスに、１０９ＣＦＵのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓもしくはＬ．ｇａｓｓｅｒｉのＷＴまたは両ＢＳＨ欠如株（ΔｂｓｈＡＢ）を０日目に単独定着させた。１週間を通して糞便を採取し、盲腸内容物を７日目に採取し、細菌計数用に播種した。
７日目までには、ＷＴ Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ株のＣＦＵは二重変異株よりも顕著に少なく、これは、一部のＢＳＨがマウスＧＩＴでの定着に有害であることを示唆している（図１９Ａ）。同じ時間枠にわたり、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの定着はΔｂｓｈＡＢ欠失による影響を受けなかった（図１９Ｂ）。
以前の研究では、セフォペラゾン、クリンダマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾール、及びカナマイシンを含めた様々な抗生物質治療の後、回腸及び盲腸のマイクロバイオームが定義されている。腸内細菌叢構成菌と胆汁酸との関係を調べるため、回腸と盲腸の両方からの全マウス処置群にわたるデータを使用して、すべての操作上分類単位（ＯＴＵ）の胆汁酸対についてＳｐｅａｒｍａｎの順位相関係数を計算した（図７）。これらの相関を視覚化するため、全処置群からのＯＴＵ及び胆汁酸の目的変数なしのクラスタリングを実施し、これにより、３つの別個のＯＴＵクラスター（Ｏ１～Ｏ３）及び２つの胆汁酸クラスター（Ｂ１、Ｂ２）が明らかになった。相関の組織化により、異なる群において、ＯＴＵと胆汁酸との特徴的な関係が明らかになった。第１のＯＴＵクラスター（Ｏ１）のＯＴＵは、タウリン抱合胆汁酸（水溶液）で構成された第１の胆汁酸クラスターＢ１において胆汁酸と正の相関を示し、クラスターＢ２のほとんどの胆汁酸と負の相関を示した。クラスターＯ１のＯＴＵには、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門からのメンバー、より具体的には、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科からのメンバーが多く含まれる。クラスターＯ１は、二次胆汁（黒色）のすべてを含有するクラスターＢ２とは反対の関係にある。これは、正の相関を示すクラスターＯ２とＢ２との関係とは対照的である。Ｏ２は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門からのメンバーで構成され、具体的には、これらのＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科メンバーは、すべての二次胆汁酸と正の相関を示す。クラスターＯ３は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門からのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科からのメンバーで構成され、クラスターＢ１及びＢ２からのすべての胆汁酸と正の相関を示す。場合によっては、本開示に基づいて当業者により認識されるように、ｑＲＴ－ＰＣＲ使用実験を行って、図７からの組織試料対と図６で見られるＧＦマウスにおいてＦＸＲシグナル伝達関連遺伝子の発現を定義することができる。
ＧＩＴにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの定着と病因は、腸内細菌叢の変化（ｃｈａｎｇｅ）及び胆汁酸プールの変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）に対して極めて敏感に反応する。以前の研究では、ヒトのＣＤＩに近いマウスモデルが作製された。抗生物質処置後、マウスはＣＤＩに易罹患性であり、これらのマウスの腸内は、宿主関連一次胆汁酸、具体的にはＴＣＤＣＡ及びＴＣＡで構成されている。ＴＣＤＣＡ単独ではＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに影響を与えないが、脱抱合ＣＤＣＡは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子発芽を阻害し、栄養細胞を殺傷する。再発性ＣＤＩ患者では、ＦＭＴ前の糞便で高濃度のＴＣＤＣＡが観察されている。また、ＦＭＴ後の便試料では、ＦＭＴ前試料と比較した場合にＴＣＤＣＡの顕著な減少あることも報告されている。ヒト及びマウスにおけるこれらのデータから、ＴＣＤＣＡは、ＣＤＩマウスモデルにおけるＢＳＨ酵素に対する有効な標的とされる。
実施例４
図９～１１に示すように、組換えＢＳＨを過剰発現させて均一になるまで精製し、それらの活性を評価するため実験を行った。２つの組換えＢＳＨ酵素をこのアッセイに使用した。ＬｊｏＢＳＨｃは、タウリン抱合胆汁酸（ＴＣＤＣＡ）に対して特異的なＢＳＨであり、放出されるＣＤＣＡに対してＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが感受性であることからこれを選択した。ＬｊｏＢＳＨａは、グリシン抱合胆汁酸（ＧＣＤＣＡ）に対して特異的である。増殖アッセイに使用する抱合胆汁酸としては、ＢＳＨ活性により放出されるＣＤＣＡに対してＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが感受性であることからＴＣＤＣＡを選択した。ＴＣＤＣＡを添加したＢＨＩＳ培地で増殖させたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、増殖阻害を示さないがＣＤＣＡ添加では完全な阻害を示す（図９）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをＬｊｏＢＳＨａと共に培養した場合、恐らくＴＣＤＣＡを効率的に切断することができないために（最も活性なのはＧＤＣＡに対してである）増殖がある。その触媒としての不足を克服するためには高用量のＬｊｏＢＳＨａが必要である（図９）。これらのデータはまた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅがＴＣＤＣＡ及びＬｊｏＢＳＨｃを添加された場合にのみ、ＴＣＤＣＡが切断されてＣＤＣＡになることによる効率的増殖阻害があることを示している。
図１０に示されるように、組換えにより発現させ精製した（Ａ）ＬａＢＳＨａ、（Ｂ）ＬａＢＳＨｂ、（Ｃ）ＬｇＢＳＨａ、及び（Ｄ）ＬｇＢＳＨｂの平均比活性を、抱合胆汁酸パネルでのニンヒドリンアッセイにより決定した。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝３）からのｓ．ｄ．を表す。これらは、先の図の株によりコードされるＢＳＨからの様々な抱合胆汁酸に対する酵素活性である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ／ｇａｓｓｅｒｉのＢＳＨは、胆汁酸抱合に対し様々な選択性を示す。
さらに、図１１に記載の結果から、精製された組換えＢＳＨが異なるｐＨ領域に対して最適活性を示すことを示している。それぞれ好ましい基質を用いた場合に示されたＬａＢＳＨａ（図１１Ａ）、ＬａＢＳＨｂ（図１１Ｂ）、ＬｇＢＳＨａ（図１１Ｃ）、及びＬｇＢＳＨｂ（図１１Ｄ）のｐＨ領域全体の相対的比活性を記載している。
実施例５
図１２～１４には、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ増殖中のＢＳＨ活性の役割を評価するために行った実験の代表的結果が記載されている。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢ遺伝子のインフレーム完全欠失を構築し、染色体内にプラスミドを持たず、そのため増殖培地に抗生物質を必要としない株を得た。ｂｓｈＡ、ｂｓｈＢ、及びｂｓｈＡＢが欠失したＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株をプレートアッセイで試験し、増殖曲線を求めた。胆汁酸解毒に対するＢＳＨの寄与を試験するため、ΔｂｓｈＡ、ΔｂｓｈＢ、及びΔｂｓｈＡＢのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ株を抱合胆汁酸の存在下で増殖させた。様々な胆汁酸濃度で増殖させたＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ変異体の増殖曲線を図１２に示す。示されているように、ＢＳＨの単一及び二重の変異体（ΔｂｓｈＡ及びΔｂｓｈＢ）を胆汁酸添加ＭＲＳ培地で増殖させた。結果は、増殖曲線表現型が、存在する胆汁酸の種類と濃度の両方に依存することを示している。二重欠失Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ変異体ΔｂｓｈＡＢは、２．５ｍＭのＧＣＤＣＡ、２．５ｍＭのＧＤＣＡ、及び５ｍＭのＴＤＣＡによって顕著に阻害された。しかしながら、この株の増殖は、５ｍＭのＧＣＡ及び５ｍＭのＴＣＤＣＡによる阻害は小さかった。二重欠失Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ変異体ΔｂｓｈＡＢは、２．５ｍＭのＧＣＤＣＡ及び１．２５ｍＭのＧＤＣＡによって顕著に阻害された。しかしながら、この株の増殖は、５ｍＭのＧＣＡ及び５ｍＭのＴＣＡによる阻害はかなり小さかった（図１８Ｂ）。これらのデータは、動的ＧＩＴにおいてｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ定着に影響を与えるようＢＳＨ活性を工学的に操作することの潜在的役割を強調している。
さらに、図１３に示される代表的結果は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢが基質依存的に胆汁酸解毒に寄与することを示している。単一濃度の様々な胆汁酸の存在下におけるＢＳＨ変異体の増殖曲線を示す。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ増殖中のＢＳＨ活性の役割を評価するため、ＢＳＨの単一変異体及び二重変異体をＭＲＳ培地単独（図１３Ａ）または胆汁酸のＧＣＡ（図１３Ｂ）、ＴＣＡ（図１３Ｃ）、ＧＣＤＣＡ（図１３Ｄ）、ＴＣＤＣＡ（図１３Ｅ）、ＧＤＣＡ（図１３Ｆ）、及びＴＤＣＡ（図１３Ｇ）を添加したＭＲＳ培地で増殖させた。２４時間後にＯＤ６００で増殖を決定した。結果は、図１２の場合と一致しており、増殖曲線表現型は、存在する胆汁酸の種類と濃度に依存することを示している。
野生型またはΔｂｓｈＡＢのいずれかのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを単独定着させた無菌マウスからの抱合一次胆汁酸のターゲットメタボロミクスを調べることによりインビボでの組換えＢＳＨの効果を評価するための実験も行った。完全な腸肝再循環を包含する、血清、回腸、または盲腸における、顕著なマウス抱合一次胆汁酸（ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、及びＴＭＣＡ）の濃度を評価するため、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ単独定着マウスのターゲットメタボロミクスを実施した。野生型Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、試験した胆汁酸濃度においてΔｂｓｈＡＢ変異体と比べて顕著な変化を誘導せず、このことは、ＢＳＨをコードするＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓをマウスに定着させても、高レベルの脱抱合が引き起こされないことを示している。したがって、ＢＳＨは、インビボで効果的に投与することはできるが、インビボでの効率的な脱抱合のためには様々なプロバイオティクス株及び／または送達ＢＳＨを改変し、最適化する必要があり得る。
実施例６
界面活性剤が膜損傷を誘導する能力の指標となる、本明細書に記載される様々な胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を評価するため、実験を行った。図１５には、胆汁酸の代表的な構造（図１５Ａ）及び実験的に決定したそれらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）（図１５Ｂ及び１５Ｃ）が記載されている。棒は、独立した実験（ｎ＝２）からの平均ＣＭＣ±ｓ．ｅ．ｍを表す。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ－ＢｌｕｅＢＡＬＬＳを使用してＣＭＣを決定した。２つの独立した実験からの吸光度データを各分子の胆汁酸濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して標準的５パラメータロジスティック曲線適合を実施し、Ｌｏｇ１０ＥＣ５０で表される各曲線の変曲点を計算することによりＣＭＣを決定した。変曲点値は、平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの野生株及び変異株に対する様々な胆汁酸の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を評価するための実験も行った。図１６Ａ及び１６Ｂに示すように、ＢＳＨが欠失したＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの（ΔｂｓｈＡＢ）株を使用して、抱合及び脱抱合の胆汁酸のＭＩＣを決定した。野生型及びΔｂｓｈＡＢの脱抱合胆汁酸のみのＭＩＣを図１６Ｂに示す。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均ＭＩＣを表す。これらのデータは、胆汁酸脱抱合が、ＢＳＨをコードするＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに対してあらゆる場合に正の効果を発揮するわけではなく、したがって、胆汁酸プールの調節は、特に、疾患または状態との関連においては、以前に認識されていたよりも複雑であるという予期しなかった知見を示している。
さらに、図１７での代表的結果は、ＢＳＨが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの定着にＢＳＨ特異的及び胆汁酸特異的に影響を与えることを示している。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（図１７Ａ）及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ（図１７Ｂ）のＢＳＨ変異体を、ＭＲＳ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、またはＴＤＣＡで２４時間増殖させた。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝４）からのｓ．ｄ．を表す。破線は、０時間における開始時のおよそのＣＦＵ／ｍＬを示す。ΔｂｓｈＡＢ株を機能的に補完するため、外因性の組換え型ＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ΔｂｓｈＡＢまたはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ΔｂｓｈＡＢの増殖物と等モル量で培養物に添加した。これらのデータは、様々な胆汁酸及び各種ｂｓｈ変異株間の増殖表現型についての包括的な概要を表す。示されているように、ＢＳＨが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの胆汁酸ストレスへの適応を補助する場合もあれば、ＢＳＨが、胆汁酸毒性及び増殖抑制を悪化させる場合もある。さらに、精製された組換えＢＳＨをΔｂｓｈＡＢ変異体に加えたところ、ＢＳＨが細胞外でも外因的に機能して変異体を機能的に補完することができることが示された。
実施例７
図１８に示されるように、ＢＳＨ活性がどのようにして胆汁酸特異的に膜の統合性及び競合的動力学を変化させることができるのかを評価するため、実験を行った。様々な胆汁酸に曝露されるかまたは熱殺菌された（ＨＫ）、対数中期まで増殖したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの膜統合性を評価するため、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を使用した。正規化した蛍光は、バックグラウンドＰＩの蛍光を減算し、胆汁酸曝露開始時のＯＤ６００を基準として正規化することにより計算した（図１８Ａ及び１８Ｂ）。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均蛍光を表し、エラーバーは、標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。様々な胆汁酸の存在下で嫌気的に２４時間共培養したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの競合指標（図１８Ｃ及び１８Ｄ）。競合指標（ＣＩ）を以下のとおり計算した：ＣＩ＝最終［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］／初期［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］。等モルのＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を培養０時間にて加えた。破線は、ＣＩ＝０を示す。
これらのデータは、ＢＳＨに関連する増殖表現型の機序基盤を示す。意外にも、ＢＳＨ活性は、細菌を毒性のある胆汁酸から保護する、またはそれに対して曝露することにより、細菌中で有益な効果も有害な効果も示し得る（図１８Ａ及び１８Ｂ）。さらに、これらのデータは、共培養の際の細菌競合に対してＢＳＨが有する効果の性質が予測不可能であることを示している（図１８Ｃ及び１８Ｄ）。
実施例８
次いで、本明細書で使用される様々なＢＳＨの活性を進化論的観点から評価した。図２０に示されるように、ＢＳＨ特異性は進化の関係を示すことが示された。組換えにより発現させ精製したＬＡＢ ＢＳＨを、グリシン抱合胆汁酸及びタウリン抱合胆汁酸のパネルに対して脱抱合についてアッセイした。各ＢＳＨの比活性は、ニンヒドリンアッセイによってアミノ酸放出量を定量化することにより決定した。近隣結合法を使用して、各ＢＳＨの一次アミノ酸配列に基づいた系統樹を構築した（図２０Ａ）。いくつかのＢＳＨクレードは類似した基質特異性プロファイルを示し、これを使用して、ＢＳＨの活性を予測し、どの残基が基質特異性に寄与するのかを理解することができる。各ＢＳＨの対応する配列番号（それぞれのアミノ酸同一性パーセントは＞９５％）を図２０Ｂに示す。
全体として、これらの分析により、本明細書で試験されたＢＳＨの酵素活性、ならびにアミノ酸配列に基づくそれらの進化距離についての概要が得られる。すべてのＢＳＨが、グリシン抱合胆汁酸またはタウリン抱合胆汁酸のいずれかに対する選択性を示した。
実施例９
配列アラインメント及び構造予測（図２１）により、基質特異性を決定するＢＳＨ活性部位の推定領域が容易に同定された。基質特異性に対する影響を試験するため、３つのキメラ変異体を作製した。詳しくは、図２１Ｂで強調表示されているＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓのＢＳＨに基づいて、ＬｇＢＳＨａの３つの領域（ＧＱＤ、ＩＰＡ、及びＡＭＩ）が、ＧＣＡの抱合グリシンを活性部位内に配位させる役割を果たすとして予測された。基質選択性の決定における各領域の重要性を理解するため、ＬｇＢＳＨａ（タウリン抱合胆汁酸選択性）からのモチーフをグリシン抱合胆汁酸選択性の相同ＢＳＨからの類似モチーフで置き換えることによって、キメラ変異体を作製した。図２１Ｃに示されるように、その後、キメラ変異体を、基質のＧＣＡ及びＴＣＡに対するＢＳＨ活性についてアッセイした。ＧＱＤ２３ ＥＦＳ変異は、基質選択性に対して影響を与えなかったが、ＩＰＡ２２２ ＤＳＥ変異は両基質に対する活性を顕著に減弱させた。さらに、ＡＭＩ２５８ ＥＱＱ変異は、ＴＣＡに対する活性を顕著に低下させたが、ＧＣＡでは低下させず、このことは、このモチーフが、タウリン抱合胆汁酸を配位させるために重要であることを示唆している。キメラＡＭＩ変異体は、それが新たな基質特異性を有する変異ＢＳＨを生成したことから新規であると決定された。
図２２に示されるように、２つの組換えＢＳＨ酵素をこのアッセイに使用した。ＬｊｏＢＳＨｃは、タウリン抱合胆汁酸（図２２ＡのＴＣＤＣＡ）に対して特異的なＢＳＨであり、放出されるＣＤＣＡに対してＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが感受性であることからこれを選択した。ＬｊｏＢＳＨａは、グリシン抱合胆汁酸（図２２ＡのＧＣＤＣＡ）に対して特異的である。この増殖（図２２Ｂ及び２２Ｃ）アッセイに使用する抱合胆汁酸としては、ＢＳＨ活性により放出されるＣＤＣＡに対してＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが感受性であることからＴＣＤＣＡを選択した。ＴＣＤＣＡを添加したＢＨＩＳ培地で増殖させたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは増殖阻害を示さないが、ＣＤＣＡ添加では完全な阻害を示す。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを図２２ＢのＬｊｏＢＳＨａと共に培養した場合、恐らくＴＣＤＣＡを効率的に切断することができないために（最も活性なのはＧＤＣＡに対してである）増殖がある。その触媒としての不足を克服するためには高用量のＬｊｏＢＳＨａが必要である。図２２Ｃでは、データは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅがＴＣＤＣＡ及びＬｊｏＢＳＨｃを添加された場合にのみ、ＴＣＤＣＡが切断されてＣＤＣＡになることによる効率的増殖阻害があることを示している。したがって、これらのデータは、胆汁酸選択性が異なる２つのＢＳＨを、それらにとって好ましい基質の存在に基づいてＣ．ｄｉｆｆ増殖を阻害するために使用することができること、及びＢＳＨ酵素の特異性がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの阻害にとって重要であることを示している。
図２３に示されるように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの栄養細胞を、対照盲腸内容物、及び１０μＭのＬｇＢＳＨａと共にプレインキュベートした盲腸内容物の両方に希釈した。どちらの条件でもＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を支持することができたが、ＬｇＢＳＨａの添加によりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの複製が顕著に制限された。このことは、ＴＣＤＣＡ等のタウリン抱合胆汁酸に特異的であるＢＳＨが盲腸内容物中で活性であり、脱抱合胆汁酸が生成されてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを阻害したことを示唆する。これらのデータは、ＢＳＨ活性により、マウス盲腸内容物中で抑制性脱抱合胆汁酸が生成され、それがＣ．ｄｉｆｆの増殖を阻害することができることを示している。
配列．
本明細書に記載される本開示の様々な実施形態には、以下で参照される配列のうち１つ以上が含まれ得、それらは、対応する配列表に見出すことができる。
ＷＰ＿００３５４６９６５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ］（配列番号１）。
ＮＣ＿００６８１４．３ ８６９３１７－８７０２９４（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ染色体、完全ゲノム（配列番号２）。
ＷＰ＿００３５４７３９５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ］（配列番号３）。
ＮＣ＿００６８１４．３ １０５８２７９－１０５９２５６（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ染色体、完全ゲノム（配列番号４）。
ＷＰ＿０５６９７６４１９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ］（配列番号５）。
ＮＺ＿ＡＹＹＰ０１００００１９．１ ３９６３４－４０６０８（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｉｌｉｓ ＤＳＭ２０５０９、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６）。
ＷＰ＿０５６９３９３１３．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ］（配列番号７）。
ＮＺ＿ＣＰ０１７７０６．１ １９８７８３０－１９８８８０７（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ ＤＳＭ２０５３１、完全ゲノム（配列番号８）。
ＷＰ＿０１３６４１９５９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ］（配列番号９）。
ＮＣ＿０１５２１４．１ １１４３４８７－１１４４４６４（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ株３０ＳＣ、完全ゲノム（配列番号１０）。
ＷＰ＿０１０６９０２９４．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ］（配列番号１１）。
ＮＺ＿ＪＭＨＵ０１０００００１．１ ９０４９４－９１４６８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ株３８１－ＩＬ－２８、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１２）。
ＷＰ＿００７１２３０１９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ］（配列番号１３）。
ＮＺ＿ＡＺＤＫ０１００００１７．１ ３９６２－４９３９（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ ＤＳＭ１６０４１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１４）。
ＫＲＫ５５３０７．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ ＤＳＭ１６０４１］（配列番号１５）。
ＡＺＤＫ０１００００４０．１ １０９９５－１１９６６（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒｉ ＤＳＭ１６０４１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１６）。
ＷＰ＿０２５０８７２７６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｏｄｅｍｉ］（配列番号１７）。
ＮＺ＿ＡＺＦＴ０１０００００６．１ ２７６４７－２８６２１（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｏｄｅｍｉ ＤＳＭ１６６３４、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１８）。
ＷＰ＿０２５０８７０６２．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｏｄｅｍｉ］（配列番号１９）。
ＮＺ＿ＡＺＦＴ０１００００５３．１ ３３７９９１－３３８９６８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｐｏｄｅｍｉ ＤＳＭ１６６３４＝ＪＣＭ１６１７２、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号２０）。
ＫＲＭ５２７５６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ２０６５３］（配列番号２１）。
ＡＹＹＺ０１００００１５．１ ３２７２８－３３６９３（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ２０６５３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号２２）。
ＫＲＭ５１５６６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ２０６５３］（配列番号２３）。
ＡＹＹＺ０１００００３０．１ ８４７２０－８５６７３（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｖｉａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ２０６５３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号２４）。
ＷＰ＿００６９１７５８６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ］（配列番号２５）。
ＮＺ＿ＧＧ６９８８０７．１ ８４９８２－８５９６８（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ１０１－４－ＣＨＮ、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号２６）。
ＷＰ＿００５７１８９４３．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ］（配列番号２７）。
ＮＺ＿ＧＧ６６９８１６．１ ２９８６５２－２９９６２９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＪＶ－Ｖ０１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号２８）。
ＷＰ＿０２３４８８４０４．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ］（配列番号２９）。
ＮＺ＿ＡＸＬＭ０１００００２１．１ ２７９６７－２８９４４（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＥＭ－ＬＣ１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号３０）。
ＷＰ＿０６８８１３７７６．１ 鎖状アミドＣ－Ｎヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ］（配列番号３１）。
ＮＺ＿ＰＫＩＷ０１００００２３．１ １７５４１－１８４９１（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ株ＵＭＢ００８５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号３２）。
ＷＰ＿０１３４３９４６１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ］（配列番号３３）。
ＮＣ＿０１４７２７．１ ８７８８４２－８７９８１６（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＮＤ０２、完全ゲノム（配列番号３４）。
ＷＰ＿００８４６００２５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｃｕｒｓｏｒｉｓ］（配列番号３５）。
ＮＺ＿ＣＡＬＺ０１０００１３２．１ ４３１６－５２９０（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｃｕｒｓｏｒｉｓ ６６ｃ、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号３６）。
ＷＰ＿０５７７５０４６２．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｍｅｎｔｉ］（配列番号３７）。
ＮＺ＿ＡＺＥＲ０１００００１６．１ ９０３３７－９１３１４（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｍｅｎｔｉ ＤＳＭ１３１４５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号３８）。
ＷＰ＿０５６９４５６４５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ］（配列番号３９）。
ＮＺ＿ＡＺＥＬ０１００００８３．１ ２３９８６－２４９６３（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ１０５３２＝ＪＣＭ２０１１株ＤＳＭ１０５３２ ＮＯＤＥ＿１７３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号４０）。
ＷＰ＿００３６４８０９８．１ 鎖状アミドＣ－Ｎヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ］（配列番号４１）。
ＮＣ＿００８５３０．１ ６９４３０－７０３８０（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、完全ゲノム（配列番号４２）。
ＷＰ＿００３６４７３３５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ］（配列番号４３）。
ＮＣ＿００８５３０．１ ９６０７４６－９６１７２３（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、完全ゲノム（配列番号４４）。
ＷＰ＿００３６４９００５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｇａｓｓｅｒｉ］（配列番号４５）。
ＮＺ＿ＣＰ０４０５００．１ ８２３５４７－８２４５２７（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ－Ｖ０３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号４６）。
ＷＰ＿０４８６８６８０１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ］（配列番号４７）。
ＮＺ＿ＭＵＪＡ０１０００００２．１ ３６２４０７－３６３３８７（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ株ＡＬ５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号４８）。
ＷＰ＿０４９１５９５９９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ］（配列番号４９）。
ＮＺ＿ＭＴＺＴ０１０００００１．１ ７９１４３０－７９２４１０（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ株ＡＬ３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号５０）。
ＷＰ＿００８４７４２７１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｇｅｒｉｏｒｕｍ］（配列番号５１）。
ＮＺ＿ＣＡＫＣ０１００００９４．１ ５３８８－６３６８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｇｅｒｉｏｒｕｍ ＣＲＢＩＰ２４．８５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号５２）。
ＷＰ＿０９３６２５２２７．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｏｒｉｌｌａｅ］（配列番号５３）。
ＮＺ＿ＢＣＡＨ０１００００１８．１ ６２３１２－６３２９２（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｏｒｉｌｌａｅ株ＫＺ０１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号５４）。
ＷＰ＿０２５０８１２８９．１ 胆汁酸塩ヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｓｔｅｒｉ］（配列番号５５）。
ＮＺ＿ＡＺＧＩ０１００００６２．１ ８４９２－９４６９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｍｓｔｅｒｉ ＤＳＭ５６６１＝ＪＣＭ６２５６株ＤＳＭ５６６１ ＮＯＤＥ＿９３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号５６）。
ＫＲＯ１５３１１．１ 仮説タンパク質 ＩＶ６２＿ＧＬ０００３３７［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ］（配列番号５７）。
ＪＱＣＪ０１００００１４．１ ７６０５－８５８２（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ株ＬＭＧ２２４６４、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号５８）。
ＷＰ＿００８４７０７９０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ］（配列番号５９）。
ＮＺ＿ＣＡＫＥ０１００００１０．１ １０３４３７－１０４４１４（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ ＣＲＢＩＰ２４．１７９ 全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６０）。
ＷＰ＿０５６９５５４９３．１ コロイルグリシンヒドロラーゼタンパク質ファミリー［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｇｌｕｖｉｅｉ］（配列番号６１）。
ＮＺ＿ＡＺＦＫ０１００００８５．１ ８４６－１８２９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｇｌｕｖｉｅｉ ＤＳＭ１５９４６、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６２）。
ＷＰ＿０５７８１０４６７．１ コロイルグリシンヒドロラーゼタンパク質ファミリー［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ］（配列番号６３）。
ＮＺ＿ＡＺＧＮ０１００００４４．１ ４２１３４－４３１１１（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ６６２９、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６４）。
ＷＰ＿０５７８１０９６４．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ］（配列番号６５）。
ＮＺ＿ＡＺＧＮ０１００００４８．１ ２００１４－２０９９４（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ６６２９、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６６）。
ＷＰ＿０５７８１１６５７．１ 抱合胆汁酸塩ヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ］（配列番号６７）。
ＮＺ＿ＡＺＧＮ０１００００５５．１ ５９１５８－６０１０８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ６６２９、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号６８）。
ＷＰ＿００４８９８４４４．１ 抱合胆汁酸塩ヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ］（配列番号６９）。
ＮＣ＿００５３６２．１ ７７４６５－７８４１５（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ５３３、完全ゲノム（配列番号７０）。
ＷＰ＿０１１１６１９８６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ］（配列番号７１）。
ＮＣ＿００５３６２．１ １０６５９４６－１０６６９２３（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ５３３、完全ゲノム（配列番号７２）。
ＷＰ＿０１１１６２１７０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ］（配列番号７３）。
ＮＣ＿００５３６２．１ １２８６６７３－１２８７６５３（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ５３３、完全ゲノム（配列番号７４）。
ＷＰ＿００４８９７１６２．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ］（配列番号７５）。
ＡＦＱＪ０１０００００４．１ ７２０－１７００（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ｐｆ０１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号７６）。
ＷＰ＿０５７７９７８４８．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ］（配列番号７７）。
ＮＺ＿ＡＺＦＭ０１０００００７．１ ６２－１０３９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１６０４３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号７８）。
ＷＰ＿０５７７９８７３６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ］（配列番号７９）。
ＮＺ＿ＡＺＦＭ０１００００１６．１ ８０００－８９７７（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１６０４３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号８０）。
ＷＰ＿０５６９４１３１０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ］（配列番号８１）。
ＡＺＥＭ０１０００１２７．１ １１７３１５－１１８２６５（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ ＤＳＭ１０５５０＝ＪＣＭ８５７２、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号８２）。
ＷＰ＿００６４９９３６３．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ］（配列番号８３）。
ＮＺ＿ＡＺＥＱ０１００００１４．１ ６４２０１－６５１８１（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｏｓａｅ ＤＳＭ１３３４５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号８４）。
ＷＰ＿０５６９５９２１９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ］（配列番号８５）。
ＮＺ＿ＢＣＶＪ０１０００１１４．１ ２０３－１１８０（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｒｉｎｕｓ ＤＳＭ２０４５２＝ＮＢＲＣ１４２２１、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号８６）。
ＷＰ＿００３７１１８４９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ］（配列番号８７）。
ＮＺ＿ＡＥＫＬ０１００００２５．１ １０２９１２－１０３８８９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ ＰＢ０１３－Ｔ２－３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号８８）。
ＷＰ＿００３７１５２４１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ］（配列番号８９）。
ＮＺ＿ＡＺＧＥ０１０００００１．１ ２７１９０４－２７２８８１（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｒｉｓ ＤＳＭ４８６４、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号９０）。
ＫＲＭ２５０６０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ］（配列番号９１）。
ＮＺ＿ＡＺＧＭ０１０００１３８．１ ９１－１０６８（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ ＤＳＭ６０３５、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号９２）。
ＷＰ＿００３６４２８９８．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ］（配列番号９３）。
ＮＺ＿ＡＺＥＪ０１０００００５．１ １４１７９３－１４２７６７（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ１４９１７＝ＪＣＭ１１４９＝ＣＧＭＣＣ１．２４３７、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号９４）。
ＳＦＥ５４６１９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ］（配列番号９５）。
ＦＯＮＵ０１００００１０．１ ８５４７２－８６４４９（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ株ＡＴＣＣ２７７５３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号９６）。
ＳＦＥ７３１０９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼ［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ］（配列番号９７）。
ＦＯＮＵ０１００００１７．１ ２１３１－３１２０（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ株ＡＴＣＣ２７７５３、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号９８）。
ＷＰ＿００３６９７８４５．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ］（配列番号９９）。
ＮＺ＿ＡＦＹＥ０１００００５６．１ ３７４８４－３８４５８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ２５６４４、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１００）。
ＷＰ＿０３４９８３８３０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ］（配列番号１０１）。
ＮＺ＿ＣＰ００７６４６．１ ７８９２４１－７９０２１８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ株ＪＣＭ１０４６、完全ゲノム（配列番号１０２）。
ＷＰ＿００３７０６７６７．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ］（配列番号１０３）。
ＮＺ＿ＡＦＭＮ０１０００００３．１ ７９１４－８８８８（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＩＡＳ８４０、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１０４）。
ＷＰ＿０５７７４２３６９．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ］（配列番号１０５）。
ＮＺ＿ＪＱＢＷ０１００００１０．１ ６２７３２８－６２８３０２（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ株ＤＳＭ１７８９６、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１０６）。
ＷＰ＿００７１２５４７０．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ］（配列番号１０７）。
ＮＺ＿ＧＧ６９３２５３．１ ５０８８０７－５０９７８４（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１６０４７、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１０８）。
ＷＰ＿０７６４６１８７１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３５１９］（配列番号１０９）。
ＮＺ＿ＦＴＯＹ０１００００１１．１ ６９２１８８－６９３１６５（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３５１９、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１１０）。
ＷＰ＿０５６９７４５７１．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ］（配列番号１１１）。
ＮＺ＿ＡＺＧＬ０１００００１０．１ ３９４６９－４０４４６（－）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＤＳＭ５８３７ ＡＴＣＣ４９５４０株ＤＳＭ５８３７、全ゲノムショットガンシーケンス（配列番号１１２）。
ＷＰ＿００３６６８１３６．１ コロイルグリシンヒドロラーゼファミリータンパク質［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ］（配列番号１１３）。
ＮＣ＿００９５１３．１ ７９９１１７－８０００９４（＋）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＤＳＭ２００１６、完全ゲノム（配列番号１１４）。
胆汁酸塩ヒドロラーゼは腸肝軸において循環抱合胆汁酸に作用する。（Ａ）肝臓で合成されて胆嚢に貯蔵された胆汁酸（ＢＡ）は、十二指腸を通って小腸に入り、そこではミリモル濃度に達する。ＢＡの大部分（９５％）は回腸で再吸収され、門脈を通って再び肝臓へ循環する。残りの集団は、引き続き再吸収されながら通過して結腸へ向かい、少量（＜５％）が糞便を介して排出される。再循環ＢＡは宿主組織に腸の外部で接近し、宿主生理に対する全身的作用を付与する。（Ｂ）ＢＳＨは、抱合ＢＡのアミド結合を切断して胆汁酸プールを開放し、複雑さを増大させる。腸内細菌叢により脱抱合ＢＡに対して追加の化学が作用して二次ＢＡプールが生成され、これが、腸肝循環に入って肝臓で再び抱合され得る。（Ｃ）Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓからの単量体ＢＳＨのオーバーレイ。ＣｐＢＳＨの活性部位において加水分解されたタウロデオキシコール酸塩（ＴＤＣＡ）は、他の構造と比較してペプチド骨格の変異を最も含むいくつかのループにより配位している（Ｆｏｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．２０１９）。 抱合胆汁酸の存在下でのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株のハイスループットスクリーニング。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株をＢＳＨプレート沈殿アッセイで使用し、（Ａ）ＭＲＳ培地、それに（Ｂ）０．２％ＴＤＣＡを添加したもの、及び（Ｃ）０．２％ＧＤＣＡ添加したものに播種した。ハローは、活性ＢＳＨを有するｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを表す。株詳細は、各プレートの上段左隅から順に以下のとおりである：Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ｃａｓｅｉ ＡＴＣＣ３３４、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＤＳＭ２０３１４、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＬＧＧ、Ｌ．ｂｕｃｈｅｒｎｉ ＣＤ０３４、Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉ ＤＳＭ２０５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ９９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ３３５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４４、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４５、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１５５７、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３。 １７０のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の系統樹へのＢＳＨタンパク質マッピング（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０１８）。群の色は先に記載されているものに従う：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ群は紫色で示され、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ群は緑で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ群は赤で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ群は黄色で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ群はえび茶色で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ群は青色で示されている。内側のメタデータレイヤーは、Ｄｕａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）に記載のような生活習慣名称をマッピングしている。外側のメタデータレイヤーは、１７０のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のそれぞれについてのＢＳＨタンパク質及びＰＶＡタンパク質の有無をマッピングしている。 ｂｓｈの多様性及び特性解析のサンプリング。９５％同一性閾値で４９０のＢＳＨから濃縮した、５７のＣＤ－ＨＩＴクラスターからのｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨの系統樹。２つの主なクレードが黒及び緑で示されている。複数のＢＳＨが単一株によりコードされ得、いくつかのクラスターに属する複数のＢＳＨをコードする種もある。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株は、異なるクラスターに属する２つのＢＳＨをコードする（Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．２０１８。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。モデルのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株からのＢＳＨ活性を評価するため、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉのｂｓｈＡ、ｂｓｈＢ及びｂｓｈＣ（それぞれ、ＬｊＢＳＨａ、ＬｊＢＳＨｂ、及びＬｊＢＳＨｃ）を精製し、それらの具体的な活性と最適ｐＨをニンヒドリンアッセイで決定した。試験した酵素は、グリコ抱合型及びタウロ抱合型の胆汁酸ならびに酸性条件に対する異なる選択性を示した。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。ＢＳＨアミノ酸配列の保存分析。クラスター化したデータセットの５７のクラスターからの代表的ＢＳＨタンパク質のアラインメントを、保存されたアミノ酸モチーフについて分析した。０．７５以上の保存スコアは破線で示されている。モチーフ及び保存されたアミノ酸をＷｅｂＬｏｇｏで示している。アスタリスクは、Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８からの、先に記載されている保存された活性部位残基を示す。 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＢＳＨは、抱合胆汁酸に対する選択性のばらつきを示す。ＣｐＢＳＨ活性部位及び加水分解されたＴＤＣＡのクローズアップ構造図。活性部位ポケット内での保存された触媒的に重要な残基の位置を示すために、それらを強調表示している。 セフォペラゾンで処置したＣＤＩマウスモデルでのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ定着。実験タイムラインの概要。簡単に言えば、マウスを、セフォペラゾン含有飲料水で５日間処置した。２日間の洗浄の後、マウス（ｎ＝１６）に、１０９ＣＦＵのリファンピシン耐性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを強制経口投与した。記載されている日に１００μｇ／ｍＬのリファンピシン添加ＬＢＳ寒天に糞便を播種してコロニー形成をモニターした。 Ａ～Ｆは、抗生物質処置したマウスモデルでのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細菌量である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の経時的コロニー形成レベルがＣＦＵ／ｇ糞便で示されている。破線は、検出限界を示す。常在Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓをリファンピシン欠如ＬＢＳ寒天で計数した。 異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の投与により、７日後に別個の構造の腸内細菌叢がもたらされる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域のシーケンシングを使用して、ＬＡＢ定着マウスの便と盲腸の試料内の分類学的多様性を特徴付けした。Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓの距離に基づく非計量多次元尺度構成法による序列化を使用して、マウスの細菌叢がセフォペラゾン処置から回復する際の、ＬＡＢ処置群の細菌叢のβ－多様性を視覚化した。７日目における盲腸の群衆の相違は、ＬＡＢ定着が、抗生物質による混乱後の腸内細菌叢の集合を変化させることを示唆している。 異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の投与により、７日後に別個の構造の腸内細菌叢がもたらされる。ＬＡＢ定着マウス間の群衆構造の相違を、７日目の盲腸試料中の細菌の門の相対的存在量を評価することによって詳細に記載した。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、及びＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａがＬＡＢ処置をしないマウスの細菌叢で優勢であった。しかしながら、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの定着はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓの復帰を抑制し、またＬ．ｇａｓｓｅｒｉは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａの復帰を抑制した。 Ｅ．ｃｏｌｉ由来組換えＢＳＨの過剰発現及び精製。（Ａ、Ｂ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ（ＬａＢＳＨａ及びＬａＢＳＨｂ）及び（Ｃ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３の株のＢＳＨ活性をさらに評価するため、ＢＳＨ（ＬｇＢＳＨａ及びＬｇＢＳＨｂ）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（λＤＥ３）に組換えにより発現させ、コバルトカラムでＣ末端Ｈｉｓタグ精製を使用して精製した。精製ＢＳＨタンパク質は、タンパク質分子量、タンパク質ラダー標準、及びゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥで視覚化される。 ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＢＳＨは、胆汁酸抱合に対し様々な選択性を示す。組換えにより発現させ精製した（Ａ）ＬａＢＳＨａ、（Ｂ）ＬａＢＳＨｂ、（Ｃ）ＬｇＢＳＨａ、及び（Ｄ）ＬｇＢＳＨｂの平均比活性を、抱合胆汁酸パネルでのニンヒドリンアッセイにより決定した。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝３）からのｓ．ｄ．を表す。 精製ＢＳＨ及びそれらの最適ｐＨ。（Ａ）ＬａＢＳＨａ、（Ｂ）ＬａＢＳＨｂ、（Ｃ）ＬｇＢＳＨａ、及び（Ｄ）ＬｇＢＳＨｂの、それぞれの好ましい基質とのｐＨ条件範囲全体にわたる比活性。 Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢは、基質依存的に胆汁酸解毒に寄与する。胆汁酸存在下でのＢＳＨ変異体の増殖。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ増殖中のＢＳＨ活性の役割を評価するため、ＢＳＨの単一変異体及び二重変異体を胆汁酸添加ＭＲＳ培地で増殖させ、増殖をＯＤ６００ｎｍで測定した。 Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのｂｓｈＡ及びｂｓｈＢは、基質依存的及び濃度依存的に胆汁酸解毒に寄与する。胆汁酸存在下でのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｂｓｈ変異体の増殖は、（Ａ）ＭＲＳ培地単独ならびに胆汁酸（Ｂ）ＧＣＡ、（Ｃ）ＴＣＡ、（Ｄ）ＧＣＤＣＡ、（Ｅ）ＴＣＤＣＡ、（Ｆ）ＧＤＣＡ、及び（Ｇ）ＴＤＣＡを添加した培地においてＯＤ６００ｎｍで測定することにより評価した。各増殖の終点のＣＦＵは図１７Ａに示されている。 Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの定着は、盲腸の脱抱合胆汁酸をわずかに増加させる。盲腸試料でターゲットメタボロミクスを実施して一次胆汁酸（Ａ）ＣＡ、（Ｂ）ＣＤＣＡ、及び（Ｃ）α／βＭＣＡを定量した。 胆汁酸の構造。胆汁酸の構造と本開示で使用される略語。 胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。本明細書で実験的に決定された胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。棒は、独立した実験（ｎ＝２）からの平均ＣＭＣ±ｓ．ｅ．ｍを表す。 胆汁酸の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ－ＢｌｕｅＢＡＬＬＳを使用してＣＭＣを決定した。２つの独立した実験からの吸光度データを各分子の胆汁酸濃度に対してプロットした。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して標準的５パラメータロジスティック曲線適合を実施し、Ｌｏｇ１０ＥＣ５０で表される各曲線の変曲点を計算することによりＣＭＣを決定した。変曲点値は、平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。 脱抱合胆汁酸の野生型及びΔｂｓｈＡＢの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）。（Ａ）ＢＳＨが欠失したＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉの（ΔｂｓｈＡＢ）株を使用して、抱合及び脱抱合の胆汁酸のＭＩＣを決定した。（Ｂ）野生型及びΔｂｓｈＡＢの脱抱合胆汁酸のみのＭＩＣ。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均ＭＩＣを表す。 ＢＳＨは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの定着にＢＳＨ特異的及び胆汁酸特異的に影響を与える。（Ａ）ＭＲＳ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、またはＴＤＣＡで２４時間増殖させたＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及び（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉのＢＳＨ変異体。エラーバーは、独立した実験（ｎ＝４）からの標準偏差（ｓ．ｄ．）を表す。破線は、０時間における開始時のおよそのＣＦＵ／ｍＬを示す。ΔｂｓｈＡＢ株を機能的に補完するため、外因性の組換え型ＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を、（Ａ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ΔｂｓｈＡＢまたは（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ΔｂｓｈＡＢの増殖物と等モル量で培養物に添加した。 ＢＳＨ活性は、膜の統合性及び競合的動力学を胆汁酸特異的に変化させる。（Ａ）（Ｂ）様々な胆汁酸に曝露されるかまたは熱殺菌された（ＨＫ）、対数中期まで増殖したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの膜統合性を評価するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色。正規化した蛍光は、バックグラウンドＰＩの蛍光を減算し、胆汁酸曝露開始時のＯＤ６００を基準として正規化することにより計算した。棒は、独立した実験（ｎ＝３）からの平均蛍光を表し、エラーバーは、ｓ．ｄ．を表す。（Ｃ）（Ｄ）様々な胆汁酸の存在下で嫌気的に２４時間共培養したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの競合指標。競合指標（ＣＩ）を以下のとおり計算した：ＣＩ＝最終［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］／初期［Ｌｏｇ１０（ΔｂｓｈＡＢ ＣＦＵ）／Ｌｏｇ１０（野生型ＣＦＵ）］。等モルのＬａＢＳＨａとＬａＢＳＨｂ（ＬａＢＳＨａｂ）またはＬｇＢＳＨａとＬｇＢＳＨｂ（ＬｇＢＳＨａｂ）を培養０時間にて加えた。破線は、ＣＩ＝０を示す。 ノトバイオートマウスでの株定着は、株依存的にＢＳＨ活性により変化させられる。５～８週齢の無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ及び（Ｂ）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの単独定着。０日目、１日目及び４日目に糞便を採取し、７日目にマウスを屠殺して、その盲腸を播種した（７ｃ日目）。（Ｃ）野生型（ＲｉｆＲ）株及びΔｂｓｈＡＢ（ＳｔｒＲ）株を使用したＬ．ｇａｓｓｅｒｉの共定着（ｃｏ－ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）。破線は、検出限界を示す。 ＢＳＨ特異性は、進化の関係を示す。（Ａ）組換えにより発現させ精製したＬＡＢ ＢＳＨを、グリシン抱合胆汁酸及びタウリン抱合胆汁酸のパネルに対して脱抱合についてアッセイした。各ＢＳＨの比活性は、ニンヒドリンアッセイによってアミノ酸放出量を定量化することにより決定した。近隣結合法を使用して、各ＢＳＨの一次アミノ酸配列に基づいた系統樹を構築した。いくつかのＢＳＨクレードは類似した基質特異性プロファイルを示し、これを使用して、ＢＳＨの活性を予測し、どの残基が基質特異性に寄与するのかを理解することができる。（Ｂ）各ＢＳＨの対応する配列番号（それぞれのアミノ酸同一性パーセントは＞９５％）。 ＢＳＨ＿１～２１にＣＬＵＳＴＡＬＷ配列アラインメントを実施した。同一性には濃灰色で陰影を付け、類似性は黒枠で囲んでいる。抱合アミノ酸との推定的な相互作用領域は黒枠で囲んでいる。 （Ｂ）活性部位にＧＣＡ（濃灰色の球）があるＬｇＢＳＨａの予測される構造。３つのアミノ酸を有する推定上の基質結合ループが濃灰色で強調表示されている。 推定上の基質結合ループにおけるＬｇＢＳＨａの３つのキメラ変異体ならびにＧＣＡ及びＴＣＡに対するそれらの相対的活性。 ＢＳＨ特異性を活用して、抱合胆汁酸基質依存的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを阻害することができる。（Ａ）組換えにより発現させ精製したＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＢＳＨを、ＧＣＤＣＡ及びＴＣＤＣＡを用いて脱抱合についてアッセイした。各ＢＳＨの比活性は、ニンヒドリンアッセイによってアミノ酸放出量を定量化することにより決定した。（Ｂ）（Ｃ）ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、またはＣＤＣＡと、精製したＬｊｏＢＳＨａもしくはＬｊｏＢＳＨｃとの組み合わせを添加したＢＨＩＳ培地におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの嫌気的増殖。 セフォペラゾン処置マウスの盲腸のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅエキソビボ増殖。ＢＳＨ活性によりマウス盲腸内容物中で抑制性脱抱合胆汁酸が生成され、それがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖を阻害した。

Claims (26)

  1. Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞であって、前記胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする前記異種遺伝子が、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む、前記細菌細胞。
  2. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす前記少なくとも１つの変異が、前記機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる、請求項１に記載の工学的操作細胞。
  3. 前記胆汁酸塩基質が、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＦＣＡ、ＦＣＤＣＡ、ＦＬＣＡ、ＦＤＣＡ、ＦＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＬＣＤＣＡ、ＬＬＣＡ、ＬＤＣＡ、ＬＵＤＣＡ、ＹＣＡ、ＹＣＤＣＡ、ＹＬＣＡ、ＹＤＣＡ、ＹＵＤＣＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の工学的操作細胞。
  4. 前記胆汁酸基質が、ＧＣＡ、ＴＣＡ、またはＴＣＤＣＡである、請求項１または請求項２に記載の工学的操作細胞。
  5. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ＧＱＤ、ＩＰＡ、及び／またはＡＭＩのペプチドモチーフで存在する少なくとも１つの置換を含む、請求項１～４のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  6. 前記異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１～５のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  7. 前記異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１～５のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  8. 前記異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、２３、２５、２７、２９、４１、４３、５１、６１、６９、７１、７３、８５、９３、９７、１０３、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１～５のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  9. 前記異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、２３、２５、２７、２９、４１、４３、５１、６１、６９、７１、７３、８５、９３、９７、１０３、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１～５のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  10. 前記細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓという属のうちの１つから選択される、請求項１～９のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  11. 前記細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉという種のうちの１つから選択される、請求項１～１０のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  12. 前記細胞が、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＦＭ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａ－１４、Ｌ．ｃａｓｅｉ Ｌｃ１１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５０、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＮＣＫ１３５１、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ ＤＮＨ－４２９、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＡＴＣＣ３３３２３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３３８、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ１３４３、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ Ｌｇ－３６、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４０、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＮＣＫ２１４１、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＪＶ Ｖ０３、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ－１１５、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９４８、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９５７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９６４、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ９７９、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ１３７０、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＫ２６７７、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐｃ－３７、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌｐ１１５、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＨＮ００１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ Ｌｒ－３２、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ １Ｅ１、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌｓ－３３、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５２、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＮＣＫ１３５５、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ ＢＬ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－０２、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｌ－０４、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｉ－０７、Ｂ．ｂｒｅｖｅ Ｂｂ－０３、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ｂｂ－０６、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ Ｂｌ－０５、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｐ ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｂｉ－２６．という株、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つから選択される、請求項１～１０のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  13. 前記細胞が、疾患または状態と関連する少なくとも１つの生理的パラメータを改善することを必要とする対象に治療用組成物の一部として投与された場合に、そのような改善をする、請求項１～１２のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  14. 前記疾患または状態が、胆汁酸調節異常と関連する、請求項１３に記載の工学的操作細胞。
  15. 前記疾患または状態が、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症からなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載の工学的操作細胞。
  16. 前記疾患または状態が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症と関連し、前記治療用組成物を投与することにより前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症が治療される、請求項１３～１５のいずれかに記載の工学的操作細胞。
  17. Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞であって、前記胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする前記異種遺伝子が、少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む、前記細菌細胞と、
    薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、
    医薬組成物であって、
    前記組成物の投与により、対象における少なくとも１つの生理的パラメータが改善される、前記医薬組成物。
  18. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす前記少なくとも１つの変異が前記機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記胆汁酸基質が、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＧＬＣＡ、ＧＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＦＣＡ、ＦＣＤＣＡ、ＦＬＣＡ、ＦＤＣＡ、ＦＵＤＣＡ、ＬＣＡ、ＬＣＤＣＡ、ＬＬＣＡ、ＬＤＣＡ、ＬＵＤＣＡ、ＹＣＡ、ＹＣＤＣＡ、ＹＬＣＡ、ＹＤＣＡ、ＹＵＤＣＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７または請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記異種胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、及び１１３からなる群から選択される野生型胆汁酸塩ヒドロラーゼポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を含む、請求項１７～１９のいずれかに記載の組成物。
  21. 前記細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉという種のうちの１つから選択される、請求項１７～２０のいずれかに記載の組成物。
  22. 前記対象への前記組成物の前記投与により、疾患または状態と関連する少なくとも１つの生理的パラメータが改善される、請求項１７～２１のいずれかに記載の組成物。
  23. 前記疾患または状態が、胆汁酸調節異常と関連する、請求項１７～２２のいずれかに記載の組成物。
  24. 前記疾患または状態が、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、肝硬変、がん、肥満、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗生物質関連下痢、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症からなる群から選択される、請求項１７～２３のいずれかに記載の組成物。
  25. 前記疾患または状態が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症と関連し、前記組成物を投与することにより前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症が治療される、請求項１７～２３のいずれかに記載の組成物。
  26. 少なくとも１つの胆汁酸を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、
    Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓに由来する機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする異種遺伝子を含む工学的に操作された細菌細胞であって、前記胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする前記異種遺伝子が、前記機能的胆汁酸塩ヒドロラーゼの胆汁酸基質特異性を変化させる少なくとも１つのアミノ酸置換をもたらす少なくとも１つの変異を含む、前記細菌細胞と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む治療用組成物を投与することを含み、
    前記組成物の投与により、前記少なくとも１つの胆汁酸を調節して対象における少なくとも１つの生理的パラメータが改善される、前記方法。
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