KR20210142692A - 칼슘의 흡수를 촉진하는 신규 락트산 박테리아 균주 - 펩티드 및 연관 생성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간의 발효 후에 유액, 특히 우유 및 특히 탈지된 우유의 pH를 실질적으로 3.36 이하, 특히 3.32와 동등한 값으로 감소시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-1-5300 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주, 상기 VF45A 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 균주에 의한 유액, 특히 우유의 발효에 의해 수득될 수 있는 단리된 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-1-5403 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주, 및 상기 VFH049 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단리된 펩티드, 펩티드의 혼합물 및 연관 생성물 및 조성물, 및 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-1-5316 하에 제출된 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주, 및 상기 VF50b 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단리된 펩티드, 펩티드의 혼합물 및 연관 제약 및 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

칼슘의 흡수를 촉진하는 신규 락트산 박테리아 균주 - 펩티드 및 연관 생성물
본 발명은 신규 락트산 박테리아 균주 뿐만 아니라 β-카세인으로부터 유래되고 이들 균주에 의해 생산되는 단리된 펩티드 및 펩티드의 혼합물에 관한 것이다. 이들 펩티드는 ACE 억제제로서 또는 칼슘 흡수를 촉진하는 작용제로서 활성이다.
본 발명은 또한 식품 또는 제약 조성물 뿐만 아니라 연관 생성물에 관한 것이다.
문헌 WO 2007/096498 A1은 유액의 발효에 의해 안지오텐신 전환 효소 (ACE)를 억제하는 특성을 갖는 2종의 트리펩티드를 생산할 수 있는 락트산 박테리아의 신규 균주, 보다 구체적으로 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)를 기재한다. IPP 및 VPP 서열의 이들 2종의 펩티드는 ACE를 억제하고, 따라서 혈압을 감소시키는 것을 가능하게 하여, 이에 따라 고혈압 및 그로부터 유발되는 병리상태에 대항하는 것으로 공지되어 있다.
다른 한편으로는, 문헌 [International Dairy Journal vol 16, page 945 to 960 in 2006]에 공개된 에이치. 코르호넨(H. Korhonen) 등의 표제 "Bioactive peptide: production and functionality"의 출판물은 락트산 박테리아에 의한 유액 단백질의 가수분해에 의해 수득된, 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 검토하며; 이 출판물은 IPP 및 VPP 펩티드와 상이하지만 또한 ACE 억제제로 공지된 여러 펩티드를 기재한다.
또한, 혈압의 조절에서의 그의 역할에 더하여, ACE는 또한 골 흡수/형성의 메카니즘에 수반되는 것으로 공지되어 있다. 실제로, 저널 [Pharmacological reports 70, page 705-711 in 2018]에 공개된 엑스-에프 첸(X-F Chen)의 표제 "Inhibition of angiotensin-converting enzyme exerts beneficial effects on trabecular bone in orchidectimozed mice"의 논문은 ACE 억제제, 즉 캅토프릴이 골 보존 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
칼슘 흡수와 관련하여, 상기 언급된 에이치. 코르호넨의 출판물은 칼슘 및 아연의 흡수를 개선시키는 것으로 공지된 카세인 포스포펩티드를 언급한다. 이는 특히 미네랄의 흡수를 개선시키는 것으로 공지된 카세인 포스포펩티드 (CPP)를 함유하는 카폴락(Capolac)® 브랜드 제품을 언급한다. 작용 메카니즘과 관련하여, 이들 포스포펩티드는 칼슘에 결합하여 이를 생체이용가능하게 하는 것으로 공지되어 있는 것으로 보인다.
문헌 JP H0641191A는 칼슘의 용해도를 증가시키는 펩티드를 생산하는 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 균주를 기재한다. 그러나, 이 문헌은 장 세포 배양물에서의 칼슘 흡수에 대한 펩티드의 임의의 생물학적 활성은 기재하지 않는다.
더욱이, 2017년 5월 26일 저널 [F 1000 Research]에 공개된 디. 힐(D. Hill) 등의 출판물 "Recent advances in microbial fermentation for dairy and health"은 또한 단백질분해에 의해 ACE 억제제로서 생물활성 펩티드를 생산할 수 있는 박테리아를 보고한다. 이는 프룩토-올리고사카라이드가 골다공증에 대한 예방적 조치로서 사용될 수 있음을 추가로 나타낸다. 이러한 프룩토-올리고사카라이드의 작용 메카니즘은 다음과 같다: 대상체의 복부에서, 프룩토-올리고사카라이드는 작은 산 분자의 발효에 의해 생성되며, 이는 생체내 pH를 낮추고 인산칼슘의 용해를 유발하여 이에 따라 이를 생체이용가능하게 한다.
불충분한 칼슘 흡수 (저칼슘혈증)는 상이한 증상 또는 병리상태, 예컨대 골다공증, 동맥 고혈압 또는 대사 증후군으로 이어질 수 있다. 실제로, 칼슘은 환자의 연령과 무관하게, 골의 형성, 골격의 응고, 치아의 강성, 근육 수축 및 따라서 심장 수축, 시냅스에서의 신경 임펄스의 전파, 학습 및 기억, 타액 분비, 세포 성장 및 증식에 수반된다. 칼슘은 많은 효소를 활성화하고, 여러 호르몬을 방출하고, 혈액을 응고시키는 것을 가능하게 하고, 체중을 균형잡히게 하는 것을 돕는다. 저칼슘혈증은 또한 다양한 희귀 병리상태, 예컨대 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 및 보다 일반적으로 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환과 연관된다.
현재까지, 골다공증은 효과적으로 치료되지 않고 있다. 따라서, 가장 널리 사용되는 치료인 비스포스포네이트는 낮은 골절 위험을 갖는 환자의 경우에 매우 효과적이지 않다. 신체 활동의 규칙적인 실행, 균형잡힌 식이 및 담배 및 알콜의 제한을 통한 예방이 보다 효과적인 것으로 입증되었다.
문헌 WO 2007/096498 A1은 ACE 억제 트리펩티드를 생산할 수 있는 특정한 락토바실루스 헬베티쿠스 균주를 기재한다. 저널 [J. Dairy Sci in 2015]에 공개된 용푸 첸(Yongfu Chen)의 출판물 "characterization of angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk produced by Lactobacillus helveticus"은 본 발명의 균주에 대해 사용된 것 이외의 발효 조건 하에 수득된 발효물이 ACE를 억제하는, 락토바실루스 헬베티쿠스 균주를 기재한다.
"International Dairy Journal"에 공개된 니엘센(Nielsen) 등의 표제 "Peptide profiles and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk products: effect of bacterial strain, fermentation pH and storage time"의 출판물은 특정한 락토바실루스 헬베티쿠스 균주의 발효에 의해 ACE를 억제하는 발효물을 수득하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다. 이 문헌은 또한 ACE 억제 활성이 발효의 종료 시에 수득된 pH에 크게 의존한다는 것을 나타낸다.
저널 "frontiers in microbiology"에 공개된 이바나 스트라히닉(Ivana Strahinic)의 표제 "Technological and probiotic potential of BGRA43 a natural isolate of Lactobacillus helveticus"의 출판물은 인간 장으로부터 단리된 락토바실루스 헬베티쿠스 균주가 유액의 발효를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 발효된 유액은 염증유발 시토카인을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
저널 "Anaerobe"에 공개된 자스나 베가노빅(Jasna Beganovic) 등의 표제 "proteolytic activity of probiotic strain Lactobacillus helveticus M92"의 출판물은 특정한 단백질분해 활성을 갖는 균주 M92를 기재한다.
저널 [J. Dairy Sci. in 2015]에 공개된 왕(Wang)의 표제 "Fermentation characteristics and angiotensin I-converting enzyme-inhibitory activity of Lactobacillus helveticus isolate H9 in cow milk, soy milk and mare milk"의 출판물은 락토바실루스 헬베티쿠스 균주인 H9 균주가 상이한 유액을 발효시킬 수 있고 ACE 억제 트리펩티드를 생산할 수 있다는 것을 나타낸다.
2000년 9월에 저널 [Applied Environmental Microbiology]에 공개된 표제 "Production of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides in fermented milk fermented by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 and Lactobacillus lactis subsp. cremoris FTA D1"의 출판물은, 특정한 조건 하에서의 발효에 의해 ACE 억제 펩티드를 생산하지만 칼슘 흡수에 대해서는 어떠한 활성도 갖지 않는 락토바실루스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii)의 특정한 균주를 기재한다.
문헌 EP 2 735 616 A는 특정한 조건 하에서의 발효에 의해 뇌 활성의 감소에 의해 유발되는 질환에 유용한 펩티드를 생산하는 락토바실루스 델브루엑키이 균주를 언급한다.
문헌 WO 2008/002484는 결장의 염증성 질환, 예컨대 크론병, 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군 및 설사의 치료에 유용한 펩티드를 발효에 의해 생산할 수 있는 락토바실루스 델브루엑키이 균주를 기재한다.
본 발명의 목적은 위장 소화에 저항성이고, 매질을 산성화함으로써 칼슘을 가용성으로 만들어, 장벽을 통한 그의 흡수 및 통과를 용이하게 하도록 장에서 작용할 수 있는 락트산 박테리아의 균주를 제안하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 위장 소화에 저항성이고, 장 세포에 직접 또는 간접 작용함으로써 장 세포에 의한 칼슘 흡수를 자극할 수 있는 락트산 박테리아 균주를 제안하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정 공지의 락트산 박테리아보다 더 큰 성장을 갖고/거나 발효 매질, 특히 유액의 더 큰 산성화를 가능하게 하는 락트산 박테리아 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장에서의 칼슘 흡수를 촉진할 가능성이 있는, 새로운 인산화 펩티드를 생산할 수 있는 락트산 박테리아 균주를 제안하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ACE 억제 활성을 갖는 새로운 펩티드를 생산할 수 있는 락트산 박테리아 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ACE 억제 활성을 나타내고/거나 칼슘의 장 흡수를 촉진하고, 바람직하게는 장 세포에 대해 비-독성인 적어도 1종의 펩티드, 또는 심지어 펩티드의 혼합물을 제안하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IPP 및 VPP 펩티드의 활성보다 더 큰 ACE 억제 활성을 갖는 적어도 1종의 펩티드, 또는 심지어 펩티드의 혼합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 저칼슘혈증을 치료할 수 있고, 따라서 그로부터 유발되는 병리상태를 치료할 수 있는 제약 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
제1 측면
제1 측면에 따르면, 본 발명은 prtH2 및 prtH3 유전자를 가지며, 혐기성 발효에 의해 37℃에서의 48시간 발효 후에 유액, 특히 우유 및 특히 탈지된 우유의 pH를 실질적으로 3.36 이하, 특히 3.32와 동등한 값으로 감소시킬 수 있는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주에 관한 것이다. pH를 감소시킴으로써, 균주는 칼슘을 함유하는 화합물의 용해를 가능하게 하여, 후자가 장벽을 통해 흡수가능하게 한다. 이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간의 발효 후에 유액, 특히 우유 및 특히 탈지된 우유의 pH를 실질적으로 3.36 이하, 특히 3.32와 동등한 값으로 감소시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5300 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주, 상기 VF45A 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료를 위한 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용에 관한, 제1 측면에 관한 상기 언급된 균주에 관한 것이다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 1종의 균주에 의한 유액, 특히 우유의 발효에 의해 수득될 수 있고, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 19 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 ACE를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택될 수 있는 단리된 펩티드에 관한 것이다. 본 출원인은 실제로 상기 언급된 펩티드의 ACE 억제 활성 - 이 활성은 또한 우수한 골 건강과 연관됨 - 또는 상기 언급된 펩티드 중 일부로 인한 장벽을 통한 칼슘 흡수를 개선시키는 활성을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 장벽을 통한 칼슘 흡수를 통해 및/또는 ACE 억제를 통해 골 건강에 작용한다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열의 모든 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 상기 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 5종의 펩티드 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 펩티드로부터 선택된 적어도 1종의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 바람직하게는 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 5종의 펩티드 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물에 관한 것이다.
이들 혼합물은 ACE를 억제하고/거나 칼슘의 장 흡수를 개선시키는데 활성인 것으로 입증되었다.
본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한, 상기 언급된 단리된 펩티드 및 상기 언급된 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 매질, 및 활성 성분으로서, 제1 측면과 관련하여 상기 언급된 단리된 펩티드로부터 선택된 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제1 측면과 관련하여 상기 언급된 바와 같은 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 균주, 특히 VF45A 균주를 함유하는 식품 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
유리하게는, 제1 측면의 제1 실시양태에 따르면, 식품 또는 제약 조성물은 적어도 또는 오직 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열에 상응하는 5종의 펩티드를 활성 펩티드로서 포함한다. 이들 펩티드는 ACE 억제제로서 가장 활성이다. 이들은 선행 기술의 VPP 및 IPP 트리펩티드보다 더 활성이다.
이러한 제1 측면 및 제2 실시양태에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물은 본 발명의 제1 측면에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 활성 성분으로서 함유하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 동물 기원의 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 야크의 유액은 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 동물 기원의 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 단백질 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진다.
혐기성 발효 및 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과에 의해 수득된 상기 언급된 바와 같은 발효물은 야크의 유액으로부터 수득된 한외여과된 발효물을 포함한 본 발명의 제1 측면에 따른 발효물 중 일부이다.
우유로부터 수득된 발효물과 관련하여, 이는 유리하게는 실험 결과와 관련된 파트에 나타낸 온도 및 지속기간 조건에 따라 수득된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 식물 기원의 단백질 기질은 식물 유액, 예컨대 귀리 유액, 아몬드 유액, 쌀 유액, 대두 유액, 나맥 유액, 헤이즐넛 유액 및 이들 유액의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 유액과 무관하게, 이는 본 발명에 따른 박테리아에 의한 발효 전에 열적으로 멸균될 수 있다.
특정한 실시양태에 따르면, 상기 발효물은 40℃의 온도에서 pH=6에서 72시간 동안, 임의로 탈지되고/거나 열적으로 멸균된 유액, 특히 우유에서 제1 측면과 관련하여 상기 언급된 균주의 발효에 의해 수득되며, 상기 발효물은 또한 임의로, 발효 종료시 10kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과에 적용된다. 한외여과 또는 비-한외여과된 발효물은 ACE 억제 및/또는 칼슘 흡수에 대해 활성인 것으로 입증되었다.
본 발명의 모든 측면에서, 식품 또는 제약 조성물은 활성 성분으로서 펩티드(들) 및/또는 균주를 함유한다. 이는 또한 유리하게는 칼슘 및/또는 비타민 D를 포함할 수 있다.
본 발명의 모든 측면에서, 발효물에 대해 한외여과를 수행한다는 사실은 균주에 의해 생산된 펩티드를 단백질로부터 분리하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 한외여과된 발효물은 더 이상 단백질을 함유하지 않는다. 한외여과된 발효물이 위장 소화에 적용될 때, 단백질의 부재로 인해 다른 펩티드는 생성되지 않는다. 발효물의 한외여과에 의해 수득된 여과물은 단백질 소화로부터의 펩티드에 의한 간섭의 부재로 인해 섭취 및 소화되었을 때 보다 활성인 것으로 입증되었다.
본 발명의 제1 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물의 특정한 실시양태에 따르면, 이는 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 1종, 특히 락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주의 농도 및/또는 그램당 18 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유한다. 바람직하게는, 펩티드는 제1 측면과 관련하여 상기 언급된 발효물에 함유된 펩티드, 특히 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드이다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 특히 야크의 유액을 제외한 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품에 관한 것이다. 본 발명의 제1 측면에 따르면, 이러한 제품은 제1 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제1 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제1 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유한다.
이러한 제1 측면에 따르면, 본 발명은 또한 제1 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제1 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제1 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제1 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 특징적으로 포함하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제에 관한 것이다.
본 발명의 측면과 무관하게, 식품/제약 조성물 또는 식품 보충제는 분말, 용액, 특히 수용액, 정제, 또는 동결건조된 형태의 균주 및/또는 분말 또는 용액 형태의 펩티드 또는 펩티드의 혼합물을 함유하는 캡슐의 형태일 수 있다. 캡슐은 그의 내용물을 환자의 장으로 전달하도록 위장 소화에 저항할 수 있는 외부 쉘을 포함할 수 있다. 균주는 또한, 예를 들어 지질 코팅에 의해 마이크로캡슐화될 수 있고, 섭취가능한 분말의 형태일 수 있다.
제1 측면에 따른 식품 보충제의 경우에, 정제, 캡슐 또는 임의의 다른 1일 투여 단위 형태는 바람직하게는 제1 측면에 따른 활성 펩티드 적어도 0.6 g 및/또는 균주 107 CFU를, 임의로 혼합물로서 함유한다.
제약 조성물은 바람직하게는 경구 투여에 적합화될 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 유제품은 본 발명에 따라 제한되지 않는다. 이는 예를 들어 유액 드링크, 발효된 유액, 케피어, 요구르트, 산의 첨가에 의해 응고된 유액에 기초한 제품, 또는 신선 치즈 또는 발효 치즈일 수 있다.
제2 측면
제2 측면에 따르면, 본 발명은 prtH1 유전자를 가지며, 혐기성 발효에 의해 37℃에서의 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 3.45 이하, 특히 3.43과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고, 40%의 벽 소수성을 가지며, 산도에 대해 저항성이고/거나 장 세포에 의한 칼슘의 흡수를 증가시킬 수 있는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주에 관한 것이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 3.45 이하, 특히 3.43과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고/거나, 장 세포에 의한 칼슘의 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5403 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주, 및 상기 VFH049 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다.
이 균주는 숙주/환자의 장에서 칼슘을 가용성으로 만들 수 있는 산을 형성할 수 있는 것으로 입증되었다. 이는 또한 β-카세인의 단백질분해에 의해 활성 펩티드를 ACE 억제제로서 생산할 수 있거나, 또는 칼슘의 보다 우수한 장 흡수를 가능하게 할 수 있다. 균주 자체는 소화에 저항하고, 장 세포와 접촉 시 후자에 의한 칼슘의 보다 우수한 흡수를 가능하게 한다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한, 제2 측면에 관하여 언급된 균주 및 특히 VFH049 균주 또는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 균주에 의한 유액, 특히 우유의 발효에 의해 수득될 수 있고, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 74 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 ACE를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택될 수 있는 단리된 펩티드에 관한 것이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 모든 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 펩티드의 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드 중 적어도 1종으로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물에 관한 것이다. 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드는 ACE 억제제로서 가장 활성이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한, 제2 측면의 단리된 펩티드 또는 제2 측면에 따른 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 적어도 1종의 매질, 및 활성 성분으로서, 본 발명의 제2 측면에 따른 단리된 펩티드에 상응하는 적어도 1종의 펩티드, 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 펩티드의 혼합물, 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 균주, 특히 VFH049 균주를 함유하는 식품 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 식품 또는 제약 조성물은 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 모든 펩티드를 함유하는 혼합물, 또는 적어도 또는 오직 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열에 상응하는 펩티드 및 임의로 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드를 함유하는 혼합물을 함유한다.
이러한 제2 측면에 따르면, 식품 또는 제약 조성물은 본 발명의 제2 측면에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 아몬드를 포함한 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 동물 기원의 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 암말의 유액은 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 제2 측면의 특정한 실시양태에 따르면, 식품 또는 제약 조성물은 임의로 탈지된 유액, 특히 우유에서의 40℃의 온도에서 pH=6에서 72시간 동안의 VFH049 균주 또는 상기 언급된 바와 같은 균주의 혐기성 발효에 의해 수득되고, 임의로 10kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과에 적용된 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진다. 이러한 발효물은 본 발명의 제2 측면의 모든 펩티드를 함유하고; 따라서 이는 ACE 억제제 및 칼슘의 장 흡수를 촉진하는 작용제 둘 다로서 골 건강을 촉진하는 활성을 갖는다.
실시양태와 무관하게, 한외여과되거나 그렇지 않은 발효물 자체가 제약 또는 식품 조성물로서 간주될 수 있다.
이러한 제2 측면에 따르면, 상기 언급된 식품 또는 제약 조성물은 바람직하게는 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 1종, 특히 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주의 농도 및/또는 그램당 6 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유한다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유하는, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 암말의 유액을 제외한, 특히 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품에 관한 것이다.
이러한 제2 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제2 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 특징적으로 포함하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제에 관한 것이다.
예로서, 본 발명의 제2 측면에 따르면, 제약 또는 식품 조성물은 액체, 특히 상기 언급된 우유 발효물의 형태이다. 본 발명의 펩티드의 혼합물 0.2 g을 함유하는 이러한 용액의 30 ml 부피가 매일 경구로 투여된다.
제3 측면
제3 측면에 따르면, 본 발명은 prtB 유전자를 가지며, 혐기성 발효에 의해 37℃에서의 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 4.55 이하, 특히 4.51과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고, 적어도 35%의 벽 소수성을 갖고/거나 칼슘 흡수를 증가시킬 수 있는 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스(bulgaricus) 균주에 관한 것이다. 이러한 균주는 장에서 활성이고 위장 소화에 저항성인 것으로 입증되었다. 이는 장벽을 통한 칼슘의 통과를 증가시킬 수 있다. 이것이 생산하는 산은 또한 칼슘의 가용화를 가능하게 한다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 4.55 이하, 특히 4.51과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고/거나, 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5316 하에 제출된 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주, 및 상기 VF50b 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체에 관한 것이다.
제3 측면은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 상기 언급된 바와 같은 각각의 균주에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 161 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 ACE를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택된 단리된 펩티드에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 또한 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열의 모든 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 112 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 112 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드 중 적어도 1종을 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물, 특히 인간에서의 그의 사용을 위한, 제3 측면에 관하여 언급된 단리된 펩티드 또는 제3 측면에 관하여 상기 언급된 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 또한 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 적어도 1종의 매질, 및 활성 성분으로서, 본 발명의 제3 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제3 측면에 따른 펩티드의 혼합물을 함유하는 식품 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 조성물은 적어도 또는 오직 펩티드로서 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 161 서열에 상응하는 펩티드를 함유하는 혼합물, 또는 바람직하게는 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 모든 펩티드 및/또는 제3 측면에 따른 균주를 함유하는 혼합물을 함유한다.
본 발명의 제3 측면에 따른 제약 또는 식품 조성물의 바람직한 실시양태에 따르면, 이는 본 발명의 제3 측면에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 야크의 유액은 상기 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 단백질 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 제1 또는 제3 측면에 따른 균주에 의해 야크의 유액의 혐기성 발효에 의해 수득되고, 각각 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과된 발효물은 본 발명의 제1 및 제3 측면에 따른 발효물의 일부이다. 암말의 유액의 혐기성 발효에 의해 수득되고, 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과된 발효물은 본 발명의 제2 측면에 따른 발효물의 일부이다.
유리하게는, 본 발명의 제3 측면에 따른 상기 식품 또는 제약 조성물은 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 오직 1종, 특히 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주의 농도 및/또는 그램당 4 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유한다.
식품 또는 제약 조성물은 바람직하게는 임의로 탈지된 유액, 특히 우유에서의 40℃의 온도에서 pH=6에서 72시간 동안의 본 발명의 제3 측면에 따른 균주의 혐기성 발효에 의해 수득되고, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과에 적용된 발효물을 포함한다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제3 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제3 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제3 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 특징적으로 함유하는, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 특히 야크의 유액을 제외한 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 본 발명은 또한 제3 측면에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제3 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제3 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제3 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 특징적으로 포함하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제에 관한 것이다.
이러한 제3 측면에 따르면, 예를 들어, 식품 또는 제약 조성물은 액체 형태이다. 펩티드 0.2 g을 함유하는 이러한 조성물의 30 ml 부피가 매일 경구로 투여된다.
제4 측면
본 발명의 제4 측면에 따르면, 본 발명은 prtH2 및 prtH3 유전자를 갖고 혐기성 발효에 의해 37℃에서의 48시간 발효 후에 유액, 특히 우유 및 특히 탈지된 우유의 pH를 실질적으로 3.36 이하, 특히 3.32와 동등한 값으로 감소시킬 수 있는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주, 및 특히 CNCM에 순번 CNCM-I-5300 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주, prtH1 유전자를 갖고 혐기성 발효에 의해 37℃에서의 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 3.45 이하, 특히 3.43과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고, 40%의 벽 소수성을 가지며, 산도에 대해 저항성이고/거나 칼슘 흡수를 증가시킬 수 있는 락토바실루스 헬베티쿠스 균주, 특히 CNCM에 순번 CNCM-I-5403 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주, 및 prtB 유전자를 갖고 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 4.55 이하, 특히 4.51과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고, 적어도 35%의 벽 소수성을 갖고/거나 장 세포에 의한 칼슘의 흡수를 증가시킬 수 있는 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 균주, 특히 CNCM에 순번 CNCM-I-5316 하에 제출된 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주로부터 선택된 적어도 2종의 균주의 혼합물, 및 특히 3종의 VF45A, VFH049 및 VF50b 균주의 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제4 측면에 따르면, 본 발명은 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드를 포함하는 혼합물, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 펩티드, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 112 서열의 펩티드를 함유하는 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물에 관한 것이다.
이러한 제4 측면에 따르면, 본 발명은 또한 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 그의 사용을 위한, 본 발명의 제4 측면에 따른 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드 또는 혼합물로부터 선택된 단리된 펩티드에 관한 것이다.
이러한 제4 측면에 따르면, 본 발명은 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 적어도 1종의 매질, 및 본 발명의 제4 측면에 따른 균주의 적어도 1종의 혼합물 및/또는 본 발명의 제4 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 40℃의 온도에서 pH=6에서 72시간 동안, 임의로 탈지된 유액, 특히 우유에서의 본 발명의 제4 측면에 따른 균주의 혼합물의 발효에 의해 수득되고, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과에 적용된 발효물을 적어도 포함하는 식품 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
이러한 제4 측면에 따르면, 본 발명은 섭취될 수 있는 제약상 허용되는 부형제 또는 매질, 및 상기 언급된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드 또는 본 발명의 제4 측면에 따른 펩티드의 혼합물, 및/또는 본 발명의 제4 측면에 따른 균주의 혼합물을 함유하는 식품 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
이러한 제4 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명의 제4 측면에 따른 균주의 혼합물 및/또는 본 발명의 제4 측면에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 본 발명의 제4 측면에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유하는, 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품에 관한 것이다.
유리하게는, 식품 또는 제약 조성물은 생성물의 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주의 농도 및/또는 그램당 4 mg 이상의 동일하거나 상이한 펩티드의 농도를 함유한다.
정의
용어 "유액"은, 정확성의 부재 하에, 우유를 지칭한다.
용어 "요구르트"는 스트렙토코쿠스 써모필루스 및 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 락트산 박테리아를 첨가함으로써 발효에 의해 생산된 유제품을 지칭한다.
용어 "발효된 유액"은 유액 중 락트산 발효물의 첨가 후 카세인의 응고에 의해 수득된 유제품을 지칭한다.
용어 "발효물"은 발효의 종료시에 수득된 상청액을 나타낸다.
용어 "칼슘 흡수를 증가시킨다" 및 다른 관련 용어는 포유동물의 장벽을 통한 (예를 들어, cId-2 유전자의 발현의 증가로 인해 후자의 세포 사이에서) 칼슘의 전체 통과를 증가시키거나, 또는 실험 파트에 나타내어진 바와 같이 Caco-2 세포에서 형광을 증가시키거나 (장벽의 세포를 통한 칼슘의 보다 많은 통과), 또는 본 출원의 실험 파트에 나타내어진 바와 같이 장 세포에서 trpv6 및 vdr로부터 선택된 적어도 1종의 유전자의 발현을 증가시키는 (세포 자체에 의한 보다 우수한 흡수) 균주 또는 펩티드의 능력을 지칭한다.
용어 "산도에 대한 저항성"은 산도에 대한 저항성과 관련하여 본 출원의 실험 파트에 나타내어진 부류 3을 지칭한다.
용어 "프로바이오틱"은 숙주, 특히 인간의 장에서 생존할 수 있고, 장벽의 세포와 상호작용할 수 있고/거나 숙주의 장에 살아있는 다른 미생물과 상호작용할 수 있고, 숙주의 건강에 유익한 효과를 발휘할 수 있는 미생물을 지칭한다.
용어 "저칼슘혈증"은 2.20 mmol/L 미만인 알부민 수준으로 교정된 혈액 중 칼슘 농도를 나타낸다.
용어 "활성 성분"은 고려되는 성분 (펩티드, 펩티드의 혼합물 및/또는 균주)이 적어도 시험관 내에서 ACE의 억제 및/또는 칼슘 흡수에 대한 기술적 효과를 수득하는 것을 가능하게 하는 양/농도로 함유된 것을 의미한다.
용어 "대상체"는 인간 또는 동물, 특히 포유동물 (특히, 개, 고양이, 가금류, 양, 소, 염소 또는 파충류)을 지칭한다.
용어 "치료"는 방지적 (예방적) 치료 및 고려되는 병리상태의 적어도 1종의 증상의 개선을 수득하는 것을 가능하게 하는 치료 둘 다를 포괄한다.
용어 "백분율 동일성"은 전체 서열을 참조 서열과 비교하여 정렬함으로써, 비교되는 서열과 참조 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 따라서, 참조 서열과 % 동일성을 나타내는 단백질 서열은 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 백분율 동일성은 2개의 비교되는 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기가 관찰되는 위치의 수를 결정하고, 이어서 2개의 핵염기 사이에 또는 2개의 아미노산 잔기 사이에 동일성이 존재하는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고, 이어서 결과에 100을 곱하여 2개의 서열의 그 사이의 뉴클레오티드 또는 아미노산에서의 백분율 동일성을 수득함으로써 계산된다.
그의 % 동일성에 의해 규정되는 펩티드는 따라서 1개 이상의 결실(들) 및/또는 1개 이상의 치환(들), 우선성 아미노산에 의한 삽입 또는 치환, 말단 카르복실산 기 및/또는 말단 아민 기의 보호기에 의한 대체, 예를 들어 레트로형 결합의 도입 (즉, 서열 내 제1 아미노산의 아민 관능기와 동일한 서열 내에서 이어지는 아미노산의 카르복실산 관능기 사이의 반응으로부터 생성된 펩티드 결합 -NH-CO-) 또는 레트로-인버소형 결합의 도입 (즉, 참조 서열의 아미노산의 배위와 역 배위인 아미노산과의 상기 언급된 레트로형의 펩티드 결합의 도입)을 포함할 수 있거나, 또는 보다 긴 아미노산 쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 측면과 무관하게, 펩티드는 인산화되거나 또는 인산화되지 않을 수 있다.
제약 조성물은 활성 성분, 및 특히 물, 오일, 알콜, 특히 에틸 알콜, 식물성 오일, 시클로덱스트린, 전분, 말토덱스트린, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜 및 생리 염수로부터 선택된 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 조성물인 것으로 정의된다.
용어 "이루어진"은 1종 이상의 펩티드와 관련하여 사용될 때 혼합물 또는 조성물이 펩티드(들)로서 다른 펩티드를 제외한 언급된 펩티드만을 함유하지만, 다른 화합물 또는 구성성분, 예컨대 용매, 비타민, 단백질 등은 존재할 수 있음을 나타낸다.
"섭취될 수 있는 매질"은 소화관에 어떠한 문제도 유발하지 않으면서 섭취 및 소화될 수 있는, 그의 물리적 상과 무관한 임의의 혼합물 또는 임의의 물질을 의미한다. 본 출원에서, 특히 실시예에서 언급된 제약상 허용되는 부형제는 섭취될 수 있는 매질이다.
본 출원 전반에 걸쳐, 서열은 통상적으로 그의 N-말단 단부에서 그의 C-말단 단부 방향으로 표시된다.
본 출원 전반에 걸쳐, VFH049 균주는 또한 VF49d로 지칭될 수 있다.
본 발명 전반에 걸쳐, 용어 "균주"는 구별 없이 살아있는 균주, 즉 적합한 영양 배지에서 발달될 수 있는 균주 및 불활성화된 균주, 즉 죽어서 그의 발달에 적합한 환경에서 발달될 수 없는 균주를 지칭한다.
[도 1]: 도 1은 본 발명의 3종의 균주 각각의 전자 현미경 사진을 나타내고; 가장 좌측의 사진은 VF45A 균주를 나타내고, 중앙의 사진은 VFH049 균주를 나타내고, 우측의 사진은 VF50b 균주를 나타낸다.
[도 2]: 도 2는 한천-유액에 대한 단백질분해 활성, 액체 배지 (유액)에서의 발효 동안의 성장, 발효 종료시의 pH, 생산된 펩티드의 양 및 균주에 의해 생산된 펩티드의 크로마토그래피 프로파일의 분석과 관련된 5개의 다른 기준 (겉보기 분자량 분포) 사이의 상관관계를 평가하는 PCA에 의해 수득된 지도를 나타내고;
[도 3]: 도 3은 대조군, 및 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득된 조 발효물의 ACE 억제 활성에 대한 IC50 (mg/mL)을 나타내고;
[도 4]: 도 4는 대조군, 및 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득되고 한외여과를 거친 발효물의 ACE 억제 활성에 대한 IC50 (mg/mL)을 나타내고;
[도 5]: 도 5는 대조군, 및 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득된 조 발효물의 칼슘 흡수율 (형광 방출/기저 방출 비)을 나타내고;
[도 6]: 도 6은 대조군, 및 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득되고 한외여과를 거친 발효물의 칼슘 흡수율 (형광 방출/기저 방출 비)을 나타내고;
[도 7]: 도 7은 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득된 조 발효물의 PBS 조건 대비 trpv6 유전자의 mRNA 수준을 나타내고;
[도 8]: 도 8은 VF45A 및 VFH049 균주의 발효에 의해 수득되고 한외여과를 거친 발효물의 PBS 조건 대비 trpv6 유전자의 mRNA 수준을 나타내고;
[도 9]: 도 9는 그의 산도 내성 부류에 따라 시험된 균주에 대해 수득된 벽 소수성의 백분율을 나타낸다.
[도 10]: 도 10은 HT-29 MTX 세포를 사용하여 VFH049 균주 및 VF50b 균주와의 24시간 접촉 후에 수득된 vdr, trpv6 및 cId-2 유전자의 대조군 대비 mRNA 수준을 나타낸다.
실험 파트
균주의 단리 및 특징화
본 발명의 3종의 균주는 상이한 유제품으로부터 추출되었다.
각각의 유제품의 샘플을 멸균 튜브에 수집하고, 분석 전에 최대 2일 동안 4℃에서 유지시킨다. 샘플을 염수 완충제 (0.85% NaCl 용액) 중에서의 일련의 희석에 적용한 다음, MRS-한천 플레이트(드만(De Man), 로고사(Rogosa) 및 샤르페(Sharpe)) 상에 스프레딩한다. 플레이트를 혐기성 배지 중에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 형태학적으로 구별되는 콜로니를 분리하고, 정제를 위해 동일한 배지의 플레이트 상에서 계대배양한다. 분리주의 순도를 보장하기 위해, 플레이트 상의 재-스프레딩을 적어도 3회 반복한다.
하기 표 1은 균주가 추출된 유제품을 나타낸다. 모든 이들 유제품은 몽골에서 유래된 것으로, 가을에 제조되었다.
광학 현미경 관찰을 수행하여 박테리아의 형상을 결정한다. 이들 관찰은 도 1에서 볼 수 있다. 각각의 균주의 그람은 통상적으로 그람 염색 기술 및 현미경 관찰에 의해 결정된다. 카탈라제에 대한 검색은 한천 배지 상에서 각각의 균주를 샘플링하고 과산화수소와 접촉시키는 것에 의한 통상적인 방식으로 각각의 균주에 대해 수행된다.
결과를 하기 표 1에 수집한다.
[표 1]
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균주의 기탁
락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주는 출원인에 의해 2018년 3월 29일에, 75724 파리 세덱스 15 독퇴르 루 스트리 25의 CNCM (국립 미생물 배양 협회(National Collection of Cultures of Microorganisms))에 순번 CNCM-I-5300 하에 제출되었다 (부다페스트 조약에 따라 제출됨).
락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주는 출원인에 의해 2019년 2월 19일에, 75724 파리 세덱스 15 독퇴르 루 스트리 25의 CNCM (국립 미생물 배양 협회(National Collection of Cultures of Microorganisms))에 순번 CNCM-I-5403 하에 제출되었다 (부다페스트 조약에 따라 제출됨). 출원의 나머지 부분에서, 이 균주는 또한 VF49d로도 불린다.
락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주는 출원인에 의해 2018년 4월 20일에, 75724 파리 세덱스 15 독퇴르 루 스트리 25의 CNCM (국립 미생물 배양 협회(National Collection of Cultures of Microorganisms))에 순번 CNCM-I-5316 하에 제출되었다 (부다페스트 조약에 따라 제출됨).
16S 리보솜 RNA를 코딩하는 게놈의 서열
균주의 16S 리보솜 RNA를 코딩하는 서열의 결정은 VF45A 및 VFH049 균주가 실제로 락토바실루스 헬베티쿠스 종의 균주임을 확인시켜주었다.
마찬가지로, 게놈의 분석은 VF50b 균주가 실제로 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 종의 균주임을 확인시켜주었다.
벽 프로테아제를 코딩하는 유전자의 PCR 검출
선택된 균주에 존재하는 벽 프로테아제의 확인은 이들 효소를 코딩하는 유전자의 PCR 검출에 의해 수행된다. 박테리아 세포를 탈지된 유액 배양물로부터 회수하고, 이어서 위자드 게놈 DNA 정제 키트 (프로메가(Promega), 미국 매디슨)를 사용하여 박테리아 DNA를 단리한다. 락토바실루스 헬베티쿠스의 CNRZ32 CIRM-BIA 103 균주 (국제 미생물 자원 센터에 의해 공급됨 - 식품 관련 박테리아, CIRM-BIA, INRA, 프랑스 렌)를 락토바실루스 헬베티쿠스 유전자에 대한 대조군으로서 사용하였다. 이러한 (CNRZ32) 균주는 4개의 prtH 유전자 (prtH1 내지 prtH4)를 갖는 것으로 공지되어 있다.
각각의 균주를 5종의 상이한 유전자, 즉 prtB, prtH1, prtH2, prtH3 및 prtH4에 상응하는 5쌍의 프라이머에 대해 시험한다. 문헌 [Hou et al., 2015]에 기재된 프라이머를 락토바실루스 델브루엑키이에서 prtB를 검출하는데 사용한다. 락토바실루스 헬베티쿠스 균주와 관련하여, 문헌 [Genay et al., 2009]에 기재된 프라이머는 prtH1 및 prtH2 유전자를 검출하는데 사용하고, 마지막으로 문헌 [Broadbent et al., 2011]에 기재된 것은 prtH3 및 prtH4를 검출하는데 사용한다.
12.5 μL의 PCR 마스터 믹스 (2) (써모피셔 사이언티픽, 미국 월섬), 2 μL의 각각의 프라이머 (12.5 μM), 2 μL의 추출된 박테리아 DNA (약 200 ng. μL-1) 및 6.5 μL의 H2O를 포함하는 25 μL의 최종 부피에서 PCR 반응을 수행한다. PCR 사이클은 써모사이클러 랩사이클러 (센소퀘스트(SensoQuest), 독일 괴팅겐)에서 수행한다. 95℃에서 5분 동안의 제1 변성 후에, 30 사이클의 PCR을 연속적으로 반복하며, 1 사이클은 95℃에서 30초 동안의 변성, 각각의 프라이머에 대해 요구되는 혼성화 온도에서 1분 동안의 혼성화, 및 72℃에서 30초 (prtH4 유전자의 경우 4분) 동안의 신장으로 이루어진다. 30회의 PCR 사이클 후에 72℃에서 10분 동안 최종 신장이 이루어진다. TBE 완충제 (트리스, 보레이트, EDTA) 중에서 제조된 1% (m/v)의 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. 겔에 0.008% (v/v)의 겔레드(GelRed)® (10,000x) (바이오티움(Biotium), 미국 프레몬트)를 첨가하여 DNA 단편을 밝혀낸다. 10 μL의 PCR 생성물을 4 μL의 로딩 완충제 (6x) (써모피셔 사이언티픽, 미국 월섬)와 혼합한 후, 아가로스 겔 상에 침착시킨다. 오진룰러(O'GeneRuler) DNA 래더 믹스 (써모피셔 사이언티픽, 미국 월섬) 혼합물을 크기 마커로서 사용한다. 100 V의 일정한 전압에서 45분 동안 이동이 이루어진다. 증폭 생성물을 겔 도크(Gel Doc)™ (바이오-라드(Bio-Rad), 미국 허큘레스)로 밝혀낸다.
결과를 하기 표 2에 제시한다. prtB 유전자는 락토바실루스 델브루엑키이의 VF50b 균주의 경우에 검출되지만, 락토바실루스 헬베티쿠스의 VF45A 및 VFH049 균주에서는 검출되지 않는다. prtH1 유전자는 락토바실루스 헬베티쿠스의 VFH049 균주 및 대조군에서 검출된다. 흥미롭게도, 다른 균주 (나타내지 않음)를 시험하였고, 이는 prtH1 유전자를 갖는 모든 락토바실루스 헬베티쿠스 균주가 발효된 암말의 유액으로부터 단리되었음을 입증한다. prtH2 및 prtH3 유전자는 락토바실루스 헬베티쿠스의 VF45A 균주 및 대조군에서 검출된다. prtH4 유전자는 대조군에서 검출되지만, 시험된 균주에서는 검출되지 않는다.
[표 2]
Figure pct00002
균주의 단백질분해 및 발효 활성의 결정
사용된 시험은 발효 능력 (성장 속도, 산성화) 및 단백질분해 활성 (단백질을 가수분해하는 능력) 둘 다를 포괄한다. 실제로, 2가지 측면은 대부분 연관되고, 박테리아의 성장 능력은 실제로 그의 단백질 가수분해 능력에 좌우된다 (이는 그의 성장을 보장하기 위해 가수분해 동안 방출되는 아미노산을 필요로 하기 때문임). 또한, 배지의 산성화 및 단백질의 가수분해는 상관관계가 있는 것으로 이미 공지되어 있다.
1) 실험실 규모 - pH 제어의 부재 하의 발효
유액 한천 방법에 따른 단백질분해 활성의 결정
각각의 균주를 한천-유액 웰에서 배양하고; 웰 주위의 환의 출현은 단백질분해를 반영한다. 환의 직경의 측정은 균주의 단백질분해 능력을 평가 가능하게 한다. 1.5% (m/v) 한천으로 보충된 5% (m/v) 농도의 탈지된 유액 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 세인트루이스)의 분말을 물 중에서 혼합함으로써 한천-유액을 제조한다. 110℃에서 10분 동안 멸균한 후, 유액을 페트리 디쉬에 붓는다. 이어서, 4-mm 직경 웰이 한천에서 형성된다. 균주를 혐기성 조건 하에 37℃에서 48시간 동안 액체 MRS 배지 (아가 오브 만(Agar of Man), 로고사, 샤르페)에서 배양한다. 이어서, 박테리아 세포를 MRS 배지 중에서 2회 세척한 다음, 최종적으로 소정의 부피의 MRS 배지 중에 재현탁시켜 1과 동등한 OD600이 수득되게 한다 (프림(Prim) 분광광도계, 세코맘(Secomam), 아쿠알라보 그룹(Aqualabo Group), 프랑스 샴피니). 20 μL의 부피의 박테리아 현탁액을 한천-유액 웰에 침착시킨다. 이어서, 접종된 플레이트를 혐기성 조건 하에 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에 웰 주위에 나타난 환의 직경을 측정함으로써 (mm로 표현됨) 균주의 단백질분해 활성을 정량화한다.
탈지된 유액 배양물: 성장, pH
액체 MRS 배지에서의 박테리아 배양으로부터, 5 mL의 전-배양을 100% UHT 탈지된 유액 (코라(Cora), 프랑스 파리))으로 구성된 배지에서 37℃에서 72시간 동안 혐기성 조건 하에 수행한다. 이어서, 균주를 최종 부피 30 mL의 동일한 배지에 0.3의 초기 OD600으로 접종한다. 배양을 37℃에서 48시간 동안 혐기성 조건 하에 수행한다. 대조군으로서, 동일한 비-접종 유액 배지 (NI 유액)를 동일한 조건 하에 인큐베이션한다. 발효 종료 시, pH 미터 (메틀러 톨레도(Mettler Toledo), 스위스 그라이펜제)에 의해 pH를 측정함으로써 배지의 산도를 평가한다. 박테리아 성장을 평가하는 경우, OD의 직접 측정은 배지의 혼탁으로 인해 수행될 수 없다. 발효 후 카세인 응고 현상이 또한 문제이며, pH가 4.6 미만이 되자마자 카세인이 침전한다. 따라서, 유액 배양물로부터 박테리아 세포를 회수하기 위한 선행 프로토콜이 수행된다. 1 mL 부피의 배양물을 pH 12의 2% (m/v) EDTA 용액에 희석 (1/10)하며, 이는 침전된 카세인을 완전히 재현탁시키기 위한 것이다. 이어서, 세포를 13,400 rpm에서 10분 동안의 원심분리에 의해 회수한다. 이 프로토콜을 2회 반복하고, 수득된 박테리아 펠릿은 PBS 완충제 1 ml 중에 재현탁시킨다. 이 현탁액으로부터 OD600의 측정을 수행하고, 비-접종 유액을 사용하여 동일한 프로토콜을 수행함으로써 블랭크를 수득한다.
탈지된 유액에서 48시간의 인큐베이션 후에 세포 성장 및 pH를 측정하였다. 락토바실루스 헬베티쿠스 균주는 2.7의 평균 OD600에 도달하는 매우 빠른 성장을 보여준 반면, 락토바실루스 델브루엑키이 균주는 단지 평균 0.85에 도달한다.
접종된 유액의 산성화를 대조군 (NI 유액)의 산성화와 비교하였다. 비-접종 유액의 초기 pH는 6.5였고, 이는 48시간의 인큐베이션 후에 6.45에 도달하였다. 거의 모든 경우에, 락토바실루스 헬베티쿠스 균주의 적용은 3 단위의 pH의 감소로 이어져 평균 3.68에 도달한 반면, 락토바실루스 델브루엑키이 균주로 접종된 샘플의 pH는 최대 2 pH 단위만큼 감소하여 평균 4.57에 도달하였다. 모든 경우에, pH가 4.6 미만으로 떨어질 경우 카세인이 침전되기 때문에 발효는 유액의 응고를 발생시켰다.
생산된 펩티드의 양 및 그의 분자량 분포의 측정
균주의 발효 동안 생산된 펩티드를 2가지 방법에 의해 분석한다. 펩티드 농도를 먼저 폴린-시오칼투(Folin-Ciocalteu) (FC) 시약으로 검정함으로써 평가하고; 펩티드를 또한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 그의 겉보기 분자량 분포에 의존하여 분석한다.
생산된 펩티드의 추출 및 정제
탈지된 유액 배양물로부터, 4 mL 샘플링을 수행한 다음, 최종 TCA 농도 1%에 도달하도록 10% (m/v) 농도의 트리클로로아세트산 (TCA) 용액의 400 μL 부피와 혼합한다.
이러한 TCA 농도의 첨가는 고분자량 단백질의 침전을 가능하게 한다. 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 펩티드를 함유하는 상청액을 회수한다.
이어서, 상청액으로부터 펩티드를 정제하여 TCA, 당, 및 염을 제거한다. 정제는 고체 상 추출 (SPE)에 의해 수행되고, 이 방법의 원리는 고체 상 상에서의 선택적 흡착에 의한 혼합물 중 화합물의 분리이다. 본드 엘루트(Bond Elut) C18 (1000 mg) 마이크로-칼럼 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 산타 클라라)을 사용하며; 이는 소수성 화합물의 체류를 허용하는 C18 기로 그라프팅된 실리카의 고체 상으로 구성된 칼럼이다. 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 보충된 100% 아세토니트릴 (ACN) 용액 10 mL의 최소 부피를 통과시킴으로써 칼럼의 균형을 맞춘다. 0.1% (v/v) TFA를 함유하는 H2O 용액으로 칼럼을 세정한 후, 추출된 펩티드를 함유하는 상청액의 4 mL 부피를 칼럼 상에 로딩한다. 0.1% TFA로 보충된 H2O로의 새로운 세정은 칼럼에 보유되지 않는 모든 화합물의 용리를 가능하게 한다. 보유된 펩티드를 최종적으로 80% (v/v), 20% (v/v) H2O이고 0.1% TFA를 함유하는 2 mL 부피의 ACN 용액 중에 용리시킨다. 이어서, 샘플을 분석 시까지 -20℃에서 저장한다.
폴린-시오칼투 시약 검정
추출된 펩티드를 폴린-시오칼투 (FC) 시약을 사용하는 검정에 의해 정량화한다. 이는 인산 및 염산 중에서 제조된 텅스텐산나트륨 및 몰리브데이트 용액이다. 황색의 포스포텅스텐산 및 포스포몰리브데넘산의 복합체는 티로신 잔기, 트립토판, 시스테인에 의해 또는 다르게는 알칼리성 매질 중 펩티드 결합에 의해 환원되어 청색을 생성한다. 펩티드 농도에 비례하는 청색의 외관은 분광광도측정법에 의해 추적된다. 검정을 위해, 추출된 펩티드 200 μL, 500 mM 탄산나트륨 (NaHCO3) 용액 500 μL 및 폴린-시오칼투 시약 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스) 100 μL를 포함하는 800 μL의 최종 부피에서 반응을 수행한다. 반응물을 암실에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 혼합물의 750 nm에서의 OD를 프림(Prim) 분광광도계 (세코맘(Secomam), 아쿠알라보 그룹(Aqualabo Group), 프랑스 샹피니)에 의해 측정한다. SPE 칼럼으로부터 펩티드를 용리하는데 사용된 용액 (80% ACN, 20% H2O, 0.1% TFA)으로부터 블랭크를 제조한다. 샘플 중 농도는 상업용 펩티드 용액 (펩티드 소화 검정 표준, 써모피셔 사이언티픽, 미국 월섬)의 표준 범위에 의해 결정된다.
크기 배제 크로마토그래피 분석
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 목적은 혼합물의 화합물을 그의 유체역학적 크기 또는 부피의 함수로서 분리하는 것이다. 본 연구에서, SEC는 발효 후에 추출된 펩티드의 겉보기 분자량 분포의 분석을 가능하게 한다. 펩티드의 분리에 사용되는 칼럼은 AKTA 단백질 정제 시스템 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 영국 리틀 챌폰트)에 연결된 슈퍼덱스 펩티드 10/300 GL (10 x 300-310 mm, 13 μm, 지이 헬스케어, 영국 리틀 챌폰트)이다. 25 μL 부피의 샘플을 등용매 조건 하에 30% (v/v) CAN, 70% (v/v) H2O 및 0.1% (v/v) TFA로 구성된 용매 중에 0.5 mL/분의 유량으로 60분 동안 용리시킨다. UV 검출기는 214 nm에서 펩티드 결합의 검출을 가능하게 한다. 샘플 중 펩티드의 양을 SEC에 의해 수득된 프로파일의 적분에 의해 분석한다. 적분을 위해 2가지 범위의 분자량을 선택하였고, 첫번째는 1,700 Da 초과의 겉보기 분자량의 펩티드 (HMWP, 고분자량 펩티드로 불림)에 관한 것이고, 두번째는 1,700 Da 미만의 겉보기 분자량의 펩티드 (LMWP, 저분자량 펩티드로 불림)에 관한 것이다. 각각의 크기 부류에 속하는 펩티드의 양은 크로마토그램의 총 면적의 백분율 (% HMWP 및 % LMWP)로서, 또는 비-접종된 유액 대조군 조건에 대해 수득된 크로마토그램의 면적의 백분율 (% HMWP/NI 유액 및 % LMWP/NI 유액)로서 표현된다.
FC 시약을 사용한 농도 측정은 48시간 후에 펩티드의 양의 증가를 나타내었고, 농도는 비-접종된 샘플에서의 2/06 g/L와 비교하여 모든 경우에 4 g/L를 초과하였다.
락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주는 6 g/L 초과의 최종 펩티드 농도를 갖는 가장 효과적인 균주 중 하나이다 (하기 표 3 참조).
생성된 펩티드의 분자량을 상기 언급된 바와 같이 SEC에 의해 분석하였다. 각각의 크기 부류 (1,700 Da 미만 또는 초과)에 속하는 펩티드의 양은 크로마토그램의 총 면적의 백분율 (% HMWP 및 % LMWP)로서, 또는 비-접종된 유액 대조군 조건에 대해 수득된 크로마토그램의 면적의 백분율 (% HMWP/NI 유액 및 또는 LMWP/NI 유액)로서 표현된다. 접종 및 발효는 대조군에 비해 저분자량 펩티드의 증가로 이어진다 (락토바실루스 델브루엑키이 균주의 경우 평균 1.5배, 락토바실루스 헬베티쿠스의 경우 평균 4.2배).
각각의 균주에 대해 수득된 결과를 하기 표 3에 수집한다.
[표 3]
Figure pct00003
주요 성분 분석 (PCA)은 R 코맨더(R Commander) 패키지 및 그의 팩토마인알(FactorMineR) 플러그-인에서 R 소프트웨어 (R 코어 팀(R core team), 2016, 오스트리아 비엔나)에 의해 수행된다.
PCR 분석은 9가지의 정량적 파라미터를 고려하였다: 한천-유액에 대한 단백질분해 활성, 액체 배지 (유액)에서의 발효 동안의 성장, 발효 종료 시의 pH, 생산된 펩티드의 양, 및 펩티드의 크로마토그래피 프로파일의 분석과 관련된 5가지의 다른 기준 (겉보기 분자량 분포). 도 2는 수득된 맵을 보여준다. 주요 성분 Dim1 및 Dim2는 각각 총 분산의 60.82% 및 23.56%를 나타낸다. pH 값과 고분자량 펩티드 사이에 양의 상관관계가 관찰된다. 또한, 성장은 펩티드의 생산 (FC 시약, %LMWP, %LMWP/NI 유액에 의해 정량화) 및 단백질분해 환의 직경과 연관된 일련의 변수와 상관관계가 있다. pH 값 및 고분자량 펩티드는 성장, LMWP의 비율 및 단백질분해 환과 같은 변수와 음의 상관관계가 있다.
2) 제어된 pH에서의 펩티드의 생산, 한외여과, 펩티드의 확인
생물반응기에서의 발효
각각의 균주를 500 mL 생물반응기 (미니바이오 500(MiniBio 500), 마이-컨트롤(my-Control), 애플리콘 바이오테크놀로지(Applikon Biotechnology), 네덜란드 델프트)에서 배양한다. 배지는 110℃에서 30분 동안 오토클레이빙된 탈지된 유액 (10 g/L (이전 단락 참조))으로 이루어진다. 균주를 0.3과 동등한 OD600으로 접종한다. 발효를 330 mL의 최종 부피로 300 rpm에서 교반하면서 40℃의 일정한 온도 하에 72시간 동안 수행한다. N2를 생물반응기에 20 mL/분의 유량으로 주입하여 혐기성 조건을 수득한다. 실험 전반에 걸쳐, HCl (1 M) 및 NaOH (3 M)의 용액으로 pH를 6으로 유지시키고, 생물반응기의 제어 유닛 상에 위치한 2개의 연동 펌프에 의해 공급을 수행한다. 박테리아 균주의 성장 뿐만 아니라 펩티드 농도의 진화를 분석하기 위해 0, 2, 17, 24, 41, 48, 65 및 72시간의 발효 시점에 무균 조건 하에 대략 5 mL의 샘플을 채취한다. 후자는 TCA 침전 후에 FC 시약 검정에 의해 평가된다. 1 mL 부피의 발효물을 pH 12의 2% (m/v) EDTA의 용액 중에 희석한 다음 (1/10), 13,400 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 25 μL의 상청액을 SEC에 의해 분석한다. 박테리아 성장을 평가하기 위해 박테리아 펠릿을 1 mL의 PBS 완충제 중에 재현탁시켜 OD600을 측정한다. 72시간의 발효 후, 전체 발효물을 회수하고, 이어서 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 분석 시까지 -20℃에서 저장한다. 발효물 중 건조 물질의 농도를 데시케이터 (XM60, 프레시사(Precisa), 프랑스 뿌와씨)에서 측정하며, 이는 항상 100 g/L와 동등하다. 최종 생성물의 특성에 대한 박테리아 발효의 영향을 확인할 수 있기 위해, 대조군을 수행한다 (CTLF). 이는 동일한 조건 하에 인큐베이션되지만 접종되지 않은 발효 배지이다. 72시간의 인큐베이션 후에, 이 배지를 원심분리하고, 다른 발효와 같이 저장한다.
제어된 pH에서 발효 동안 생산된 펩티드의 확인
비가수분해된 단백질을 제거하기 위해, 조 발효물의 일부를 한외여과 막에 의해 분획화한다. 막은 사르토콘(Sartocon)® 슬라이스 200 홀더 시스템 (사르토리우스(Sartorius), 독일 괴팅겐)에 연결된, 10 kDa의 컷-오프 역치를 갖는 0.1 m2의 히드로사트(Hydrosart) 카세트 (사르토콘® 슬라이스 히드로사트® 카세트, 사르토리우스, 독일 괴팅겐)이다. 발효물의 공급은 연동 펌프에 의해 수행되고, 보유물 압력은 여과 동안 약 1 bar에서 유지된다. 따라서, 10 kDa 미만의 분자를 함유하는 한외여과 투과물 (UFP)은 보유물 (UFR)로부터 분리된다. 이어서, 2개의 하위-분획을 분석 시까지 -20℃에서 저장한다. 한외여과 투과물을 40℃에서 15시간 동안의 원심 증발 (미박(miVac), 진 박(Gene Vac), 영국 입스위치)에 의해 초기 부피의 10%로 건조시킨다. 이어서, 생성물 (발효물 및 한외여과 발효물) 중 건조 물질 농도를 데시케이터 (XM60, 프리시사, 프랑스 뿌와씨)에서 측정한다.
배양물 상청액 (한외여과되지 않음)으로부터 SPE에 의해 정제된 펩티드를 40℃에서 2시간 동안 원심 증발 (미박, 진 박, 영국 입스위치)에 의해 건조시킨 다음, 0.1% (v/v) TFA를 함유하는 H2O 100 μL 중에 재현탁시키고, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 10 마이크로리터의 샘플을 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 액퀴티(Acquity) 크로마토그래피 시스템 (워터스(Waters), 영국 맨체스터)에 연결된 C18-키네텍스(Kinetex) 칼럼 (150 x 4.6 mm, 2.6 μm, 100Å, 페노메넥스(Phenomenex), 미국 토런스) 상에 주입한다. 0.1% (v/v) 포름산 (FA)을 함유하는 ACN 선형 구배 (30분 동안 5에서 15%의 ACN, 이어서 60분 동안 15에서 30%의 ACN, 10분 동안 30에서 50%의 ACN, 및 최종적으로 10분 동안 50에서 95%의 ACN)를 500 μL.min-1의 유량으로 사용한다. UPLC 용리액을 3 kV의 전압에서 전기분무에 의해 직접 분무하고, 300℃의 온도에서 600 L.h-1의 유량으로 이질소 (N2)를 사용하여 탈용매화를 수행한다. 크로마토그래피 시스템은 시냅트-G2-Si 질량 분광계 (워터스, 영국 맨체스터)에 커플링된다. MS 측정은 데이터 의존성 모드 (데이터 의존성 분석, DDA)로 이루어지고, 데이터는 100 내지 2000 m/z 범위의 질량 범위에서 회수된다. 낮은 질량의 경우에는 8 내지 9 V의 전력 및 높은 질량의 경우에는 40 내지 90 V의 전력에서의 충돌-유도 해리 (CID) 방법에 의한 단편화를 위해 10,000의 강도 역치를 갖는 최대 15개의 전구체 이온을 선택한다. MS/MS 스펙트럼은 100 내지 2000 m/z 범위의 질량 범위에서 회수된다. 스펙트럼은 매스 링스(Mass Lynx) 소프트웨어 (버전 4.1) (워터스, 영국 맨체스터)에 의해 프로세싱된다. 대조군 샘플 (CTLF)의 분석은 기본 불균질성이 정의되도록 하였다. 22종의 유액 단백질 (αS1-카세인, β-카세인, αS2-카세인, GLYCAM1, K-카세인, BTN1A1, β-락토글로불린, FGFBP, 락토퍼옥시다제, 오스테오폰틴, 페릴리핀, α2 콜라겐, TRIP6, NPT2B, 아실CoA 데새투라제, 디스펄린, COG8, B4GT1, PSME4, DHX9, RALYL 및 아포지단백질 A2)로부터 유래된 596종의 펩티드가 이 샘플에서 확인되었다. 이들 중 32%는 β-카세인으로부터 유래된다. 비교에 의하면, 상이한 시험된 균주에 의해 발효된 샘플에서 150 내지 722종의 펩티드가 확인되었다. 이들 샘플에서, β-카세인 펩티드는 모든 확인된 서열의 44 내지 67%를 나타낸다. 확인된 펩티드 중 β-카세인 펩티드의 우세성 및 유액 중 β-카세인의 천연 존재비로 인해, β-카세인으로부터 유래된 펩티드만이 연구될 것이다. 따라서, 본 발명의 균주에 의해 생산된 펩티드는 모두 우유 중 β-카세인의 단백질분해로부터 유래된다. 데이터 뱅크 연구는 보스 타우루스(Bos taurus) 종의 완전한 프로테옴으로 국한된 유니프롯 데이터베이스 (2017년 5월 15일)를 사용하는 피크스 스튜디오(Peaks Studio) 소프트웨어 (버전 7.0.) (바이오인포매틱스 솔루션즈(Bioinformatics Solutions), 캐나다 워털루)를 사용하여 수행한다. 전구체 이온 및 단편의 질량에 대한 내성 역치는 35 ppm 및 0.2 Da으로 정의된다. 소프트웨어에 의해 확인된 펩티드 서열을 엄격하게 1% 미만의 가양성률 (오류 발견율)에 따라 필터링한다.
모든 균주에 대해, 확인된 펩티드는 한외여과를 거치지 않은 발효물로부터 유래된다. 이들 동일한 펩티드는 또한 한외여과된 발효물에서 그의 질량의 관점에서 발견되어야 한다.
펩티드를 확인할 때, 효모로부터 유래될 수 있는 펩티드가 고려되었음에 주목해야 한다. 질량 분광측정법에 의한 분석 후, 본 출원인은 데이터베이스를 사용하여, 한외여과되거나 또는 그렇지 않은 발효물에 효모로부터 유래된 펩티드가 존재하지 않는다는 것을 관찰하였다.
표 4는 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VF45A 균주에 의해 생산된, 비-인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
표 5는 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VF45A 균주에 의해 생산된, 인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
하기 표 6은 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VFH049 균주에 의해 생산된, 비-인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
표 7은 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VFH049 균주에 의해 생산된, 인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
인산화된 펩티드는 칼슘 흡수에서 활성일 수 있는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [2007, FEBS J. 274, 4999-5011. doi: 10.1111/j.1742-4658.2007.06015.x.]에 공개된 표제 "Casein phosphopeptide promotion of calcium uptake in HT-29 cells - Relationship between biological activity and supramolecular structure" (Gravaghi, C., et al.)의 출판물 참조).
[표 6]
Figure pct00006
[표 7]
Figure pct00007
하기 표 8은 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VF50b 균주에 의해 생산된, 비-인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
표 9는 pH 6에서 상기 나타낸 발효 방법에 따라 VF50b 균주에 의해 생산된, 인산화되고 신규한 것으로 간주되는 펩티드를 그룹화한다.
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
발효물 및 펩티드의 생물학적 활성
발효물 (한외여과 전 및 후)을 2종의 생물학적 활성, 즉 ACE 억제 및 칼슘 흡수를 조정하는 능력에 대해 시험하였다. 또한, 가수분해물의 독성을 평가하였다. 분석을 위해, 다양한 샘플을 H2O 중에 15 g/L의 건조 물질의 농도로 희석한다.
세포독성 시험
본 실험의 목적은 장 세포에 대한 발효물의 가능한 독성을 시험하기 위한 것이다. 세포 생존율은 CCK-8 시약 (셀 카운팅 키트-8(Cell Counting Kit-8))을 사용하여 측정하며, 이 방법은 포르마잔을 생산하는 세포 데히드로게나제에 의한 테트라졸륨 염의 환원에 기초하고, 그의 형성은 450 nm에서 추적된다. Caco-2 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 8,000개 세포의 밀도로 200 μl 부피의 완전 DMEM 배지에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 7일 동안 배양한다. 발효물을 완전 DMEM 배지 중에 5 및 10 g/L의 농도로 희석한다. 또한 DMEM 배지 중에 희석한 PBS 완충제 (샘플과 동일한 희석 배율)를 대조군으로서 사용한다. 150 μL 부피의 샘플을 각 웰에 침착시킨 후, 37℃, 5% CO2에서 7 또는 24시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, Caco-2 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한 다음, 5% (v/v)의 CCK-8 시약 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스)으로 보충된 150 μL 부피의 완전 DMEM 배지를 각 웰에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2의 암실에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 크세니우스 XC(Xenius XC) 분광형광계 (사파스 모나코(Safas Monaco), 프랑스 모나코)를 사용하여 450 nm에서 판독한다. 세포 생존율을 대조군 웰에 대해 수득된 흡광도 (100% 생존 세포에 상응함)에 대비하여 계산한다. 5 g/L의 농도에서, 본 발명의 각각의 균주의 조 발효물 (미여과됨)은 심지어 24시간의 접촉 후에도 Caco-2 세포에 대한 독성을 갖지 않는다. 건조 물질 10 g/L의 농도에 대해 동일한 관찰이 이루어졌다. 각각의 균주의 한외여과된 발효물도 또한 세포독성을 갖지 않는다.
안지오텐신 전환 효소의 억제
목적은 ACE에 대한 발효물의 억제 잠재력을 연구하기 위한 것이다. 이는 형광 기질, o-아미노벤조일-Gly-p-니트로-L-Phe-Pro (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro)의 사용에 기초한다. ACE에 의한 이러한 기질의 가수분해는 Abz-Gly 형광단 기를 생성하고, 이는 각각 355-375 nm 및 400-430 nm의 여기 및 방출 파장에 의해 추적될 수 있다. 샘플, 효소 및 기질을 제조하고, pH 8.3의 트리스-HCl 완충제 (150 mM) 중에 목적하는 농도로 희석한다. 96 웰 플레이트에서 50 μL의 샘플 또는 트리스-HCl 완충제 (음성 억제 표지자용), 50 μL의 ACE 용액 (0.05 U/mL) (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스) 및 200 μL의 Abz-Gly-Phe (NO2)-Pro (0.45 mM) 기질 (바켐(Bachem), 스위스 부벤도르프)을 포함하는 300 μL의 최종 부피로 가수분해 반응을 수행한다. 효소를 함유하지 않는 (트리스-HCl 완충제에 의해 대체된) 표지자도 또한 수행한다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 수조가 장착된 크세니우스 XC 분광형광계 (사파스 모나코, 프랑스 모나코)에 의해 각각 365 및 415 nm의 여기 및 방출 파장으로 37℃에서 2분마다 형광 측정을 수행한다. 상이한 시험된 샘플의 억제 백분율 및 IC50을 음성 억제 표지자에 따라 계산한다.
(본 출원에서 시험된 모든 생물학적 활성의) 생물학적 활성의 분석을 위해, 결과의 유의성을 1-인자 분산 분석 (ANOVA)에 이어 평균의 다중 비교를 위한 터키 검정에 의해 평가한다. 평균 사이의 차이는 p 값 <0.05에 대해 유의한 것으로 간주된다. R 코맨더 패키지에서 R 소프트웨어 (R 코어 팀, 2016, 오스트리아 비엔나)를 사용하여 통계적 시험을 수행하였다.
연구된 생물학적 활성의 관점에서 관심 발효를 입증하기 위해, 활성을 대조군 발효물 (CTLF), 접종 없이 인큐베이션된 발효 배지의 활성과 비교한다.
샘플을 건조 물질의 상이한 농도에서 시험하였고, 이는 효소적 활성의 절반을 억제하는 농도 (IC50)를 계산할 수 있도록 하기 위한 것이다. 결과를 도 3 및 4에 나타낸다.
조 발효물은 조 대조군 발효물의 경우 12.76 mg/mL 범위, VF45A 균주에 의해 생산된 발효물의 경우 0.56 mg/mL의 IC50을 갖는다. VFH049 균주의 경우, 조 발효물의 IC50은 0.76 mg/mL이다. 한외여과된 발효물의 경우, IC50은 대조군이 8 mg/mL, VF45A 균주에 의해 생산된 발효물이 0.47 mg/mL 및 VFH049 균주에 의해 생산된 발효물이 1.76 mg/mL이다. VF45A 및 VFH049 균주는 대조군에 비해 ACE를 억제하는 발효물의 능력을 매우 유의하게 개선시킨다. 동일한 효과가 한외여과된 발효물에 의해 수득된다. 따라서, 관심 분자는 발효 동안 균주에 의해 생산되고, ACE 억제 활성을 갖는다.
QSAR 모델에 의한 ACE 억제 활성의 예측; 선행 기술의 펩티드와의 비교
각각의 확인된 펩티드 (비-인산화된 펩티드)의 ACE 억제 활성을 예측하기 위해, QSAR (정량적 구조 활성 관계) 통계 모델을 사용하였다. 이 모델은 헬베르크(Hellberg) 등 (1987)에 의해 기재된 아미노산 서술어로서 z-스코어 (z1, z2 및 z3)를 사용하여 프리프(Pripp) 등 (2004)에 의해 개발되었다. 예측은 (C 말단 위치의) 펩티드의 마지막 2개의 아미노산의 물리-화학적 특징에 기초하며, 이는 모델의 방정식을 통해 예측 IC50 값을 수득하는 것을 가능하게 한다. 본 발명자들의 펩티드의 IC50을 결정하는데 사용된 QSAR 접근법을 선행 기술의 VPP 및 IPP 펩티드에 대해 사용하였다. 그의 IC50은 26 μM인 반면, 본 발명의 펩티드 중 일부는 20 μM 미만의 IC50 값 (가장 활성인 경우 최대 8.7 μM)을 가지며, 따라서 선험적으로 보다 효과적이다.
결과를 하기 표 10 내지 12에 수집한다.
[표 10]
Figure pct00010
[표 11]
Figure pct00011
[표 12]
Figure pct00012
본 발명의 펩티드의 IC50을 결정하는데 사용된 QSAR 접근법을 선행 기술에 기재된 VPP 및 IPP 펩티드에 대해 사용하였다. 그의 IC50은 26 μM인 반면, 본 발명자들의 펩티드 중 일부는 20 μM 미만 (가장 활성인 경우 최대 8.7 μM)이며, 따라서 선험적으로 보다 효과적이다.
칼슘 흡수의 조정
소모된 칼슘의 대부분은 장에서 흡수되며, 장에서 2가지의 칼슘 수송 경로, 즉 세포주위 경로 및 세포횡단 경로가 확인되었다. 칼슘의 세포주위 수송은 내강으로부터 장 점막으로의, 이들 2개의 구획 사이에 형성된 구배에 따른 이러한 원소의 수동 확산이다. 세포 사이의 치밀 접합부의 일부이고 칼슘 채널로서 작용하는 2가지 단백질, 클라우딘 2 및 12 (CLD-2 -12)가 이러한 수송에 수반된다 (Fujita et al., 2008). 세포횡단 칼슘 수송은 TRPV6으로 불리는 수송체에 의한 장 세포 내의 칼슘의 혼입을 수반하는 능동 수송이다. 후속적으로 칼슘은 장 점막의 세포의 기저극에서 수송 및 배출된다. 이들 2가지 칼슘 수송 경로는 호르몬인 비타민 D에 의해 조절되며, 이는 일단 그의 핵 수용체에 고정되면 VDR (비타민 D 수용체)이 CLD-2 -12 및 TRPV6의 유전자를 제어하는 전사 인자로서 작용한다.
Caco-2 세포 상에서의 칼슘 혼입의 측정
발효물이 칼슘 흡수를 조정하는 능력을 Caco-2 세포를 사용하여 평가하였다. 시험은 발효물 (농도 10 g/L)을 Caco-2 세포와 7시간 동안 접촉시키는 것으로 이루어진다. 접촉 후에, 칼슘의 존재 하에 형광을 방출할 수 있는 세포내 프로브를 사용하여 세포에 의한 칼슘의 혼입을 평가한다. Caco-2 세포를 세정한 후, 플루오포르테(FluoForte)® 프로브를 플루오포르테® 칼슘 검정 키트 (엔조 라이프 사이언시스(Enzo Life Sciences), 미국 파밍데일) 지침서에 따라 첨가하고, 이어서 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안, 프로브의 침투 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 형광 방출을 크세니우스 XC 분광형광계 (사파스 모나코, 프랑스 모나코)에 의해 여기 파장 490 nm에서 추적하고, 방출은 525 nm에서 추적한다. 방출은 분광형광계에 커플링된 주입기 모듈에 의해 9 내지 10초의 동역학으로 25 μL의 250 mM CaCl2 용액을 주입하면서 30초 동안 측정한다. 이러한 주입은 장 세포 내의 칼슘의 갑작스런 진입을 유발하고, 이는 형광 방출의 증가로 이어진다. 세포에서 칼슘의 혼입을 조정하는 박테리아 균주의 능력은 칼슘 주입 후 형광의 이러한 증가에 의해 결정된다. 따라서, 결과는 웰의 기초 형광으로 간주되는, 0 내지 9초의 동역학에서 측정된 형광 평균에 대비하여 각각의 웰에 대해 표현된다. 따라서, 상이한 접촉 조건에 대한 형광 증가 비가 수득된다.
VF45A 및 VFH049 균주에 의해 수득된 발효물의 효과를 PBS 완충제의 효과 및 대조군 발효물의 효과와 비교한다. 결과는 이들 2종의 균주에 의해 수득된 조 발효물이 PBS 완충제 및 대조군에 비해 칼슘의 혼입을 양으로 조정할 수 있다는 것을 보여준다 (도 5). 이에 따라, 형광 방출 대 기저 방출의 비는 PBS의 경우 1.08이고, 대조군 발효물의 경우 1.23이고, VF45A 균주에 의해 생산된 발효물의 경우 1.3이고, VFH049 균주에 의해 생산된 발효물의 경우 1.31이다. 그러나, 한외여과된 발효물을 시험할 경우, 효과는 VF49d 균주보다 VF45a 균주에서 덜 현저하다 (도 6). 그럼에도 불구하고, 흡수를 증가시키는 경향은 둘 다의 균주에 대해 관찰된다.
Caco-2 세포에서의 trpv6 유전자의 발현의 조정
본 파트의 목적은 발효물이 장 세포에 의한 trpv6 유전자의 발현을 조정하는 능력을 평가하기 위한 것이다. 모델로서 Caco-2 세포를 사용하여 RT-qPCR 접근법을 수행한다. Caco-2 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포의 밀도로 500 μL의 최종 부피의 완전 DMEM 배지 중에 시딩하고, 15일 동안 37℃, 5% CO2에서, 배양 7일 후에 2일마다 배지를 교체하면서 인큐베이션한다. 발효물을 완전 DMEM 배지 중에 10 g/L의 건조 물질의 농도로 희석한다. DMEM 배지 중에 희석된 PBS 완충제 (샘플과 동일한 희석 배율)를 대조군으로서 사용한다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한 다음, 300 μL의 부피의 각각의 샘플을 웰에 침착시킨다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 7시간 동안 인큐베이션한다. Caco-2 세포와 샘플 사이의 접촉 후에, 웰을 PBS 완충제로 2회 세정한 다음, 트리졸(TRIzol)™ 시약을 사용하여 RNA의 추출을 행한다. RNA 샘플을 먼저 DNase로 처리하여, 공동-추출되고/거나 추출 후에 남아있는 가능한 DNA 단편을 제거한다. 1000 ng의 RNA를 함유하는 8 μL 부피를 1 μL의 DNase 및 1 μL의 DNase 완충제 (써모사이언티픽, 미국 월섬)와 혼합한다. 37℃에서 30분 동안 반응을 수행하고, 1 μL의 50 mM EDTA 용액 (써모사이언티픽, 미국 월섬)을 첨가하여 이를 정지시킨 후, 65℃에서 10분 동안 인큐베이션한다.
후속적으로, 제공된 지침에 따라 리버트에이드 H 마이너스(RevertAid H minus) 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (써모사이언티픽, 미국 월섬)를 사용하여 샘플을 cDNA로 역전사시켰다. qPCR 반응을 위해, cDNA 샘플을 H2O 중에 희석한다 (1/16). 2 μL 부피의 샘플에 대해, 10 μL의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 (2x) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 포스터 시티), 0.6 μL의 각각의 프라이머 (10 μM) 및 6.8 μL의 H2O를 함유하는 18 μL의 qPCR 혼합물을 첨가한다. CFX 연결 실시간 검출 시스템 써모사이클러 (바이오-라드, 미국 허큘레스)에서의 반응 동안 형광을 추적한다. 95℃에서 10분 동안의 변성 단계 후, 40회의 PCR 사이클을 연속적으로 수행하며, 1회의 사이클은 95℃에서의 15초 동안의 변성, 사용된 프라이머 쌍에 따른 58 또는 60℃에서의 30초 동안의 혼성화, 및 72℃에서의 30초 동안의 신장을 포함한다. 용융 곡선의 실현은 반응을 종결시킨다.
연구된 유전자는 CaT1 (칼슘 수송체 1)로도 불리는 칼슘 수송체 (칼슘에 대해 선택적인 일시적 수용체 전위)를 코딩하는 유전자 (trpv6)이다. 이러한 유전자의 발현은 펩티딜프롤릴 이소머라제 A (ppiA)를 코딩하는 유전자의 발현에 대해 정규화된다. 사용된 프라이머 쌍, 뿐만 아니라 그의 혼성화 온도는 하기 표 13에 제시된다:
[표 13]
Figure pct00013
발효물 샘플을 Caco-2 세포와 접촉시킨 다음, trpv6 유전자의 발현의 변동을 qPCR에 의해 연구하였다.
VF45A 및 VFH049 균주에 의해 수득된 발효물은 유전자의 발현을 양으로 조정할 수 있다. 보다 특히, 균주 VFH049에 의해 생산된 발효물은 대조군보다 20배 더 큰 유전자의 과다발현을 유발한다 (도 7). 한외여과된 발효물의 효과는 덜 현저하며, 유전자를 유도하는 경향이 2종의 균주에 대해 명백하게 가시적인 경우에도 유의하지 않다 (도 8). 따라서, 2종의 균주에 의해 생산된 발효물은 비발효된 유액에 비해 칼슘 혼입 및 trpv6의 발현을 동시에 조정할 수 있다.
프로바이오틱 특징의 연구
결과의 유의성은 1-인자 분산 분석 (ANOVA)에 이어서 평균의 다중 비교를 위한 터키 검정에 의해 평가된다. Caco-2 세포의 막을 통한 칼슘 수송 실험과 관련하여, ANOVA-후 검정은 대조군 조건의 평균과의 비교를 유도하는 던 검정이다. 평균 사이의 차이는 p 값 <0.05에 대해 유의한 것으로 간주된다. R 코맨더 패키지에서 R 소프트웨어 (R 코어 팀, 2016, 오스트리아 비엔나)를 사용하여 통계적 시험을 수행하였다.
산도 내성 시험
본 시험의 원리는 pH 2에서의 2시간 인큐베이션과 MRS 배지의 pH (pH 6.2)에서의 인큐베이션 사이의 박테리아 균주의 생존의 비교에 기초한다. 이러한 실험을 위해, 각각의 수집 균주를 액체 MRS 배지에서 24시간 동안 37℃에서 혐기성 조건 하에 배양하였다. 이어서, 200 μL의 부피의 배양물을 pH 6.2의 동일한 MRS 배지 (튜브 A로 불림) 또는 염산 (HCl)에 의해 pH 2로 조정된 MRS 배지 (튜브 B로 불림) 중에 희석하였다 (1/10). 튜브 A 및 B를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각의 튜브의 10 μL를 MRS 한천 상에 스프레딩하였다. 시딩된 디쉬를 혐기성 조건에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
산도 내성은 디쉬 A 및 B 사이의 콜로니의 수를 비교함으로써 평가하였다. 균주를 B/A 비의 결과에 따라 상이한 산도 내성 부류로 나누었다. 부류 0은 산도에 내성이 없는 균주를 그룹화한다 (디쉬 B 상에 콜로니 부재). 부류 1은 약하게 내성인 균주 (디쉬 B = 디쉬 A 상의 콜로니의 0 내지 30%)에 상응한다. 부류 2는 중간 정도의 산도 내성을 갖는 균주를 그룹화한다 (디쉬 B = 디쉬 A 상의 콜로니의 30 내지 80%). 마지막으로, 부류 3은 산도 내성 균주에 상응한다 (디쉬 B는 디쉬 A의 콜로니의 80% 초과를 가짐).
균주를 부류 0 (비-내성 균주) 내지 부류 3 (내성 균주) 범위의 4개의 내성 부류로 나누었다.
균주의 벽 소수성의 결정
본 시험의 목적은 상이한 균주의 벽의 소수성 특징을 평가하기 위한 것이다. 이 기준을 평가하기 위한 간단한 시험이 이미 개발되어 있고, 즉 MATS (용매에 대한 미생물 접착) 시험이다. 이는 벽의 소수성을 추정하기 위해 비극성 탄화수소 (가장 종종 n-헥사데칸)에 대한 박테리아 균주의 선호를 측정하는 것으로 이루어진다. 실험을 위해, 수집 균주를 액체 MRS 배지에서 24시간 동안 37℃에서 혐기성 조건 하에 배양하였다. 이어서, 10,000 rpm에서 10분 동안의 원심분리 단계를 연속적으로 반복하여 세포를 2회 세척하며, 이어서 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 완충제, pH 7.4 중에 재현탁시키는 단계가 후속된다. 광학 밀도 (630nm에서의 OD (초기 OD630nm))를 ELx808 분광광도계 (바이오텍 인스트루먼츠 인크.(BioTek Instruments Inc.), 미국 버몬트)로 결정하였다. 이어서, 1 mL 부피의 현탁액을 100 μL의 n-헥사데칸 (아크로스 오가닉스(Acros Organics), 벨기에 헤일)과, 1분 동안 혼합물 중에 볼텍스를 형성시켜 혼합하였다. 이어서, 용액을 주위 온도에서 15분 동안 휴지되도록 설정한 다음, 630nm에서의 OD (최종 OD630nm)의 새로운 결정을 위해 100 μL의 수성 상을 수집하였다. 균주의 벽 소수성을 하기 식에 따라 계산하였다:
[수학식 1]
Figure pct00014
%H: 벽 소수성의 백분율, 초기 OD630nm: 현탁액의 초기 OD 및 최종 OD630nm: 현탁액의 첨가 및 n-헥사데칸과의 혼합 후에 측정된 OD.
산도 저항성 및 벽 소수성 시험의 결과를 도 9에 나타내며, 이는 그의 산도 내성 부류에 따라 시험된 균주에 대해 수득된 벽 소수성 백분율을 나타낸다. 도 9에서, VF50b 균주는 산도를 견디지 못한다는 것이 주목되며, 이는 VFH049 균주의 경우에는 그렇지 않다.
자기-응집 시험
본 시험은 액체 배지에서 그 사이에서 응집되는 균주의 능력을 평가 가능하게 한다. 이는 시간 0에서의 현탁액 위의 박테리아 농도를 임의의 교반 없이 주어진 시간 동안 인큐베이션된 동일한 현탁액의 박테리아 농도와 비교하는 것에 기초한다. 강한 자기-응집이 가능한 균주는 서로 응집하여, 그의 침강 속도가 증가될 것이다. 균주를 37℃에서 24시간 동안 MRS에서 배양한 다음, 세척하고, 600 nm에서의 OD 1로 PBS 완충제 중에 재현탁시킨다. 4 mL 부피의 현탁액을 교반하여 10초 동안 볼텍스를 형성하게 한 다음, 교반 없이 주위 온도에서 인큐베이션한다. 2.5 및 5시간 인큐베이션 후에, 배지 100 μL를 현탁액의 표면으로부터 조심스럽게 취한다. 이어서, 채취된 샘플을 600 nm에서의 OD의 측정을 위해 PBS 완충제 중에 희석한다 (1/10). 이어서, 균주의 자기-응집 백분율 (%A)을 하기 관계에 따라 계산하였다:
[수학식 2]
Figure pct00015
여기서, A0: 실험 시작시 측정된 (및 1과 동등한) 현탁액의 600 nm에서의 초기 흡광도 및 At: 2.5 또는 5시간 인큐베이션시 측정된 600 nm에서의 흡광도. VFH049 균주의 응집 %는 2.5시간 후에 5.38% ± 5.24이고, 5시간 후에 67.44% ± 6.99이다. VF50b 균주의 경우, 응집 %는 2.5시간 후에 33.33% ± 14.8이고, 5시간 후에 66.67% ± 17.97이다. 따라서, 균주는 장 세포에 부착할 수 있다.
위장 소화에 대한 내성의 평가
소화관을 통한 그의 통과 동안 및 통과 후의 균주의 생존을 평가하기 위해, 정적 소화 모델을 사용하였다 (Belguesmia et al., 2016). 이 모델은 소화관의 3개의 주요 구획, 즉 입, 위 및 장을 순차적 방식으로 시뮬레이션한다. 각각의 구획은 이 단계의 생리학적 조건을 모방하는 유체의 첨가에 의해 시뮬레이션된다. 모든 소화를 멸균 조건에서 수행하고, 모든 유체를 실험 전에 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙하고, 효소의 첨가를 멸균 후에 수행하고, 이어서 (0.2 μm에서) 멸균 여과한다. 균주를 37℃에서 24시간 동안 MRS 배지에서 배양한다. 박테리아 세포를 2회 세척한 다음, PBS 완충제 중에 109 CFU/mL의 농도로 재현탁시킨다. 소화를 위해, pH 6.8로 조정된 PBS 8 mL를 1 ml의 박테리아 현탁액에 첨가함으로써 협측상을 시뮬레이션한다. 혼합물을 37℃에서 5분 동안 200 rpm에서 일정한 교반 하에 인큐베이션한다. 소 펩신 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스) 1.56 mg/mL로 보충된 pH 3의 PBS 12 mL를 첨가함으로써 위상을 시뮬레이션한다. 현탁액을 200 rpm에서 교반하면서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 동안, 염산 (HCl) (1M) 또는 수산화나트륨 (NaOH) (1M)의 첨가에 의해 용액의 pH를 3 내지 3.5로 유지시킨다. 장상의 경우, 1 ml의 1 M 탄산나트륨 (NaHCO3)을 혼합물에 첨가하여 pH를 약 7로 상승시키고 펩신을 불활성화시킨다. 소 췌장 효소 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스) 0.28 mg/mL로 보충된 pH 8.2의 PBS 12 mL 부피에 이어서 Ox-담즙 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스) 60 g/L를 함유하는 pH 8.1의 PBS 6 mL 부피를 혼합물에 첨가하여 장 조건을 시뮬레이션한다. 이 단계는 pH를 7 내지 7.5로 유지시키면서 200 rpm으로 교반하면서 37℃에서 2시간 동안 수행된다. 소화의 각각의 단계의 종료 시에, 반응 혼합물 100 μL의 샘플을 취하고, 따라서 동일한 소화에 대해, 스톡 튜브 (TM), 타액상 (S), 2시간 인큐베이션 후의 위상 (G2), 및 최종적으로 2시간 장상 이후의 것 (I2)의 샘플링을 포함하는 4개의 샘플이 수득된다. 이어서, 각각의 샘플을 PBS 완충제 중에 연속적으로 희석한다 (1/10). 샘플 중 박테리아 농도를 결정하기 위해, 적절한 희석물 100 μL를 MRS 한천 상에 스프레딩한다. 이어서, 시딩된 플레이트를 혐기성 조건에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, CFU의 계수는 샘플 중 박테리아 농도를 측정하는 것을 가능하게 한다. 결과는 CFU/mL로 표현된다. 생존 박테리아 세포의 초기 수는 타액상에서 109 CFU/mL이다. DGI 동안, 박테리아의 양은 균주에 따라 다소 감소하고, 위상은 모든 균주에 대해 가장 유해하다. 이러한 상의 종료시, VFH049 균주는 107.8 CFU/mL의 양으로 존재하는 반면, VF50b 균주는 107.2 CFU/mL의 양으로 존재한다. 따라서, VFH049 및 VF50b 균주는 위장 소화를 견딘다.
세포독성 시험
본 시험의 목적은 장 장벽에 대한 균주의 가능한 독성을 평가하기 위한 것이다. 이 목적을 위해 Caco-2 및 HT-29 MTX 세포를 사용한다.
세포독성 시험을 위해, 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 8,000개 세포의 밀도로 150 μL 부피의 배지에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 7일 동안 배양한다. 박테리아 균주를 첨가하기 전에, 장 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한다. 박테리아 균주를, 그들의 일부에 대해, 이전에 기재된 바와 같이 배양하고, 107 CFU/mL의 농도로 첨가 없이 DMEM 배지에 현탁시킨다. 각각의 웰에 대해, 박테리아 현탁액 150 μL를 첨가한다. 균주에 대한 것과 같이 첨가 없이 DMEM으로 희석된 PBS 완충제를 음성 대조군으로서 사용한다. 박테리아 균주와 장 세포 사이의 접촉은 37℃, 5%의 CO2에서 24시간 동안 일어난다. 균주를 Caco-2 세포 및 HT-29 MTX 세포 둘 다와 독립적으로 접촉시킨다. 장 세포 사멸률의 결정은 박테리아 균주의 가능한 독성을 평가하기 위해 본원에 사용된다. 세포의 사멸률은 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 활성을 검정함으로써 평가한다. 이러한 활성은 LDH 활성 검정 키트 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스)에 의해 검정되고, 이 키트는 산화된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD)의 락테이트 데히드로게나제에 의한 그의 환원된 형태 (NADH)로의 환원 반응에 기초하며, NADH는 450 nm에서 검출될 수 있다. 접촉 후, 50 μL의 상청액을 각각의 웰로부터 취하고, LDH 활성을 키트 프로토콜에 따라 검정한다. 플레이트의 흡광도를 크세니우스 XC 분광형광계 (사파스 모나코, 프랑스 모나코)에 의해 450 nm에서 판독한다. 장 세포 사멸률을 대조군 조건 (이러한 조건에서 방출된 LDH의 비율은 100%를 기준으로 함)의 흡광도의 평균의 백분율로서 계산한다. VFH049 및 VF50b 균주의 경우, 결과는 2종의 세포주에 대한 유의한 독성의 부재를 보여주며, 이는 이들 실험 조건 하에서, 선택된 박테리아 균주가 장 세포에 유해하지 않다는 것을 시사한다.
장 세포에 대한 균주의 부착의 평가
본 시험의 목적은 균주가 장 세포에 부착하는 능력을 평가하기 위한 것이다. 이는 박테리아의 초기에 첨가된 양 대비 Caco-2 세포 단층에 부착된 박테리아 세포의 양 사이의 비교를 기초로 한다. 이전에 기재된 바와 같이 균주를 배양 및 제조하고, 첨가 없이 DMEM 배지 중의 현탁액을 107 CFU/mL의 농도로 제조한다. Caco-2 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포의 농도로 완전 DMEM의 500 μL 부피 중에 시딩한다. 37℃, 5% CO2에서 7일 동안 인큐베이션한 후, 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한다. 박테리아 현탁액 300 μL 부피를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 사용된 박테리아 현탁액은 CFU 농도를 결정하기 위해 저장한다. 2시간 접촉 후에, 비-부착 박테리아를 제거하기 위해 Caco-2 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한다. 이어서, 0.1% (v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 보충된 PBS 완충제 100 μL를 첨가함으로써 장 세포를 용해시킨다. 주위 온도에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 용해물 및 사용된 스톡 현탁액을 PBS 중에 연속 희석 (1/10)한 다음, MRS 한천 상에 스프레딩한다. 시딩된 플레이트를 혐기성 조건에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 박테리아 농도 (CFU/mL)의 계수 및 결정 후에, 부착 박테리아 세포의 백분율을 실험 시작시 첨가된 박테리아의 양 (100%로 설정됨)을 나타내는 스톡 현탁액에서 수득된 농도에 대해 계산한다. Caco-2 세포에 부착된 세포의 %는 VFH049 균주의 경우 1.48 ±0.41이고, VF50b 균주의 경우 0.18 ±0.13이다. VFH049 균주는 장 세포에 훨씬 더 잘 부착하며, 이는 프로바이오틱 작용을 가질 가능성이 더 크다는 것을 나타내는 경향이 있다.
칼슘 흡수에 대한 균주의 생물학적 활성
박테리아 균주와 장 세포 사이의 일반적 접촉 프로토콜
본 접촉 프로토콜은 본 파트에 사용된 각각의 기술에 사용된다. 박테리아 균주를 혐기성 조건에서 37℃에서 24시간 동안 MRS에서 배양한다. 세포를 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 회수한 다음, PBS 완충제 중에 재현탁시키고, 이 단계를 2회 반복하여 박테리아 세포를 세척한다. 마지막으로, 107 CFU/mL의 농도로 첨가 없이 DMEM 배지를 사용하여 박테리아 현탁액을 제조한다.
HT-29 MTX 세포를 24 웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포의 농도로 완전 DMEM의 500 μL 부피 중에 시딩한다. Caco-2 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 8,000개 세포의 농도로 완전 DMEM 배지의 200 μL 부피 중에 시딩한다. 또 다른 실험을 위해, Caco-2 세포를 완전 DMEM 배지 500 μL 부피 중의 정단측 상의 12 웰 플레이트에 배치된 삽입물 (폴리에스테르 막, 0.4 μm, 코스타(Costar)®, 코닝(Corning), 미국 뉴욕주) 상에 시딩하고, 동일한 배지 1,500 μL 부피를 삽입물의 기저측에 첨가하였다. 모든 세포 배양물을 배양의 제2주 동안 2일마다 배지를 재생시키면서 15일 동안 배양하였다. 장 세포를 PBS 완충제로 2회 세척한 후, 박테리아 균주와 접촉시켰다. 150 μL의 부피의 박테리아 현탁액을 96 웰 플레이트에서의 배양을 위해 각각의 웰에 첨가하고, 한편 300 μL의 부피를 24 웰 플레이트에서 또는 12 웰 플레이트 상의 삽입물에서 접촉을 위해 첨가하였다. 모든 경우에, 접촉은 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 일어난다. 사용된 음성 대조군은 완전 DMEM 배지 중에 희석된 PBS 완충제이다.
총 칼슘 수송의 측정
총 칼슘 수송은 상피 장벽을 가로지름으로써 정단극에서 기저극으로 통과한 칼슘의 부분으로서 정의된다. 이러한 수송은 시간 경과에 따른 세포 장벽의 기저극에서의 칼슘 농도의 변동에 의해 평가된다. 12 웰 플레이트에서 삽입물 내에서 배양된 Caco-2 세포가 본 실험에 사용된다. 박테리아 균주와의 접촉을 시작할 때 (t = 0시간), 10 μL의 250 mM 염화칼슘 (CaCl2) 용액을 삽입물의 정단측에 첨가한다. 접촉 동안, 접촉 30분, 7시간 및 24시간 째에 100 μL의 샘플을 삽입물의 기저측에서 채취한다. 샘플을 분석 시까지 -20℃에서 저장한다. 상이한 샘플링 시점에, 경상피 전기 저항 (TEER)의 측정을 수행하여 Caco-2 세포 장벽의 완전성을 체크한다. 이 저항은 밀리셀(MilliCell) 전기 저항 시스템 전압계/저항계 (머크 밀리포어(Merck Millipore), 미국 벌링턴)에 의해 측정된다. 세포가 없는 빈 삽입물을 블랭크로서 사용하여 세포 장벽의 저항을 수득한다. 이어서, 각각의 웰에 대해 측정된 저항 (단위 Ω)에 삽입물의 면적을 곱하여 (사용된 삽입물에 대해 1.12 cm2와 동등함) 저항을 Ω.cm-2 단위로 수득한다. 결과는 각각의 웰에 대해 30분 접촉 시 수득된 값 (100%로 설정됨)의 백분율로서 표현된다. 칼슘의 총 수송을 측정하기 위해, 접촉 동안 Caco-2 세포의 막의 기저극에서 채취한 샘플에서 칼슘 농도의 검정을 수행한다. 칼슘 농도의 결정은 칼슘 비색 검정 키트 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스)를 사용하여 수행한다. 이 키트는 575 nm에서 검출될 수 있는 착색된 복합체를 형성하는 칼슘 이온과 오르토 크레졸프탈레인 사이의 비색 반응에 기초한다. 키트 프로토콜에 따라, 밀리-Q(MiIIi-Q)® H2O 중에 희석된 (1/2) 샘플 25 μL를 사용하여 검정을 수행한다. 575 nm에서의 샘플의 흡광도의 측정은 크세니우스 XC 분광형광계 (사파스 모나코, 프랑스 모나코)에 의해 수행한다. 샘플 중 칼슘 농도를 CaCl2의 표준 범위에 의해 결정하고, 이어서 접촉 시간 t = 30분에서의 농도에 대한 시간 t에서의 농도의 비의 함수로서 표현한다.
결과는 TEER이 균주와의 인큐베이션 시간 동안 뿐만 아니라 대조군 조건 (PBS 완충제)에서 증가함을 보여준다. 따라서, VFH049 균주의 경우, TEER은 t=0에서 100%로부터 24시간 후에 245%로 준-선형 방식으로 변화한다. VF50b 균주의 경우, TEER은 t=0에서 100%로부터 24시간 후에 231%로 준-선형 방식으로 변화한다. 또한, 본 발명의 균주는 PBS 완충제에 비해 7시간 접촉 후에 흡수를 유의하게 조정하지 않는 것으로 관찰된다. 그러나, 24시간 인큐베이션 후에, 칼슘 농도는 대조군 조건에 대해 기저 구획에서 감소하는 반면, VFH049 및 VF50b 균주에 대해서는 칼슘 양의 유의한 증가가 관찰된다. 따라서, VFH049 균주의 경우, t=2h에서의 농도/t=0에서의 농도 비는 1.08의 값에 도달한 한편, VF50b 균주의 경우, 동일한 비는 1.05이다.
칼슘 및 비타민 D의 대사에 수반되는 상이한 유전자의 발현의 연구
본 파트에서는, 박테리아 균주와 HT-29 MTX 세포 사이의 24시간 접촉 후의 몇몇 유전자의 발현의 변화를 연구하였다. 접촉을 이전에 기재된 바와 같이 24 웰 플레이트에서 수행하였다. 접촉 후, HT-29 MTX 세포를 PBS 완충제로 2회 세정한다. 이어서, 트리졸™ 시약 (시그마-알드리치, 미국 세인트루이스)을 사용하여 RNA 추출을 수행한다. RNA 샘플을 먼저 DNase로 처리하여, 공동-추출되고/거나 추출 후에 남아있는 가능한 DNA 단편을 제거하였다. 1000 ng의 RNA를 함유하는 8 μL 부피를 1 μL의 DNase 및 1 μL의 DNase 완충제 (써모사이언티픽, 미국 월섬)와 혼합한다. 마스터사이클러(Mastercycler) 구배 써모사이클러 (에펜도르프(Eppendorf), 독일 함부르크)에서 37℃에서 30분 동안 반응을 수행하고, 1 μL의 50 mM EDTA 용액 (써모사이언티픽, 미국 월섬)을 첨가하여 이를 정지시킨 후, 65℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. 후속적으로, 제공된 지침에 따라 리버트에이드 H 마이너스 제1 가닥 cDNA 합성 키트 (써모사이언티픽, 미국 월섬)를 사용하여 샘플을 cDNA로 역전사시켰다. qPCR 반응을 위해, cDNA 샘플을 H2O 중에 희석한다 (1/16). 2 L 부피의 샘플에 대해, 10 μL의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 (2x) (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스, 미국 포스터 시티), 0.6 μL의 각각의 프라이머 (10 μM) 및 6.8 μL의 H2O를 함유하는 18 μL의 qPCR 혼합물을 첨가한다. CFX 연결 실시간 검출 시스템 써모사이클러 (바이오-라드, 미국 허큘레스)에서의 반응 동안 형광을 추적한다. 95℃에서 10분 동안의 변성 단계 후, 40회의 PCR 사이클을 연속적으로 수행하며, 1회의 사이클은 95℃에서의 15초 동안의 변성, 사용된 프라이머 쌍에 따른 58 내지 61℃에서의 30초 동안의 혼성화, 및 72℃에서의 30초 동안의 신장을 포함한다. 용융 곡선의 실현은 반응을 종결시킨다. 본 파트에서는 4개의 유전자를 연구하고, 이는 치밀 접합부에 수반되고 칼슘의 통과를 위한 채널로서 작용하는 클라우딘 2 (cId-2)를 코딩하는 유전자이다. 비타민 D 수용체를 코딩하는 유전자 (vdr) 및 최종적으로 칼슘 수송체를 코딩하는 유전자 (trpv6). 이들 유전자의 발현은 참조로서 취한 펩티딜프롤릴 이소머라제 A (ppiA)를 코딩하는 유전자의 발현에 대해 정규화된다. 연구된 유전자에 사용된 프라이머의 쌍, 뿐만 아니라 그의 혼성화 온도는 하기 표에 제시된다:
[표 14]
Figure pct00016
결과를 도 10에 나타낸다. 비타민 D 수용체를 코딩하는 유전자 (vdr)의 발현은 VF50b 균주의 존재 하에 유의하게 증가되고; 이는 PBS 완충제에 비해 1.8배 증가된다. VFH049 균주와 관련하여, 이는 칼슘 수송체를 코딩하는 유전자 (trpv6)의 발현을 대조군보다 적어도 3배 더 많이 증가시킨다. VF50b 균주는 PBS 완충제에 비해 cId-2 유전자의 2.8배 더 큰 발현 증가를 유발하는 유일한 균주이다.
VF50b 균주의 발효 능력
VF50b 균주의 성장 및 산성화 특성은 동일한 종의 다른 균주의 것보다 더 크며, 이는 실제로 발효 유제품의 기술적 또는 산업적 생산을 위한 특히 흥미로운 균주이다 (발효 개시자로서 사용됨).
하기 표 15는 VF50b 균주의 특성을 동일한 종의 다른 균주의 특성과 비교한다 (시험은 우유로 수행함):
[표 15]
Figure pct00017
더 큰 성장 (더 높은 광학 밀도) 및 더 효율적인 산성화 (더 낮은 pH)가 존재한다.
VF50b 균주는 예를 들어 요구르트를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드가 ACE 및/또는 칼슘 흡수에 대해 효과를 갖는지 결정하기 위해 이들 펩티드의 서열에 상응하는 역 펩티드 및 우선성 펩티드의 연구를 고려하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 도달범위 내에 있다.
[수탁번호]
기탁기관명 : CNCM
수탁번호 : CNCM-I-5300
수탁일자 : 20180329
기탁기관명 : CNCM
수탁번호 : CNCM-I-5403
수탁일자 : 20190219
기탁기관명 : CNCM
수탁번호 : CNCM-I-5316
수탁일자 : 20180420
SEQUENCE LISTING <110> VF BIOSCIENCE VF BIOSCIENCE <120> New lactic bacteria strains able to improve calcium absoprtion and related peptides and products <130> VFBIO FR 01 <160> 211 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> peptide <400> 1 Glu Glu Ile Val Pro Asn 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 2 Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 3 Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Asn 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> peptide <400> 4 Leu Thr Asp Val Glu Asn 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> peptide <400> 5 Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> peptide <400> 6 His Asn Ser Leu Pro Gln 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 7 Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> peptide <400> 8 Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 9 Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 1 5 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Gln 20 25 <210> 122 <211> 22 <212> PRT <213> peptide <400> 122 Leu Leu Gln Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr 1 5 10 15 Val Met Phe Pro Pro Gln 20 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> peptide <400> 123 Leu Gln Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val 1 5 10 15 Met Phe Pro Pro Gln 20 <210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> peptide <400> 124 Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe 1 5 10 15 Pro Pro Gln <210> 125 <211> 18 <212> PRT <213> peptide <400> 125 Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro 1 5 10 15 Pro Gln <210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> peptide <400> 126 Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro 1 5 10 15 Gln <210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> peptide <400> 127 His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln 1 5 10 15 <210> 128 <211> 15 <212> PRT <213> peptide <400> 128 Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln 1 5 10 15 <210> 129 <211> 22 <212> PRT 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peptide <400> 137 Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln 1 5 10 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 138 Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln 1 5 <210> 139 <211> 6 <212> PRT <213> peptide <400> 139 Thr Asp Val Glu Asn Leu 1 5 <210> 140 <211> 30 <212> PRT <213> peptide <400> 140 Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys 1 5 10 15 Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 20 25 30 <210> 141 <211> 27 <212> PRT <213> peptide <400> 141 Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro 1 5 10 15 Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 20 25 <210> 142 <211> 25 <212> PRT <213> peptide <400> 142 Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro 1 5 10 15 Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 20 25 <210> 143 <211> 23 <212> PRT <213> peptide <400> 143 Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg 1 5 10 15 Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 20 <210> 144 <211> 21 <212> PRT <213> peptide <400> 144 Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met 1 5 10 15 Pro Ile Gln Ala Phe 20 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> peptide <400> 145 Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 1 5 10 15 <210> 146 <211> 13 <212> PRT <213> peptide <400> 146 Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe 1 5 10 <210> 147 <211> 16 <212> PRT <213> peptide <400> 147 Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe 1 5 10 15 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> peptide <400> 148 Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe 1 5 10 15 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 149 Asp Glu Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe 1 5 10 <210> 150 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 150 Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe 1 5 <210> 151 <211> 19 <212> PRT <213> peptide <400> 151 Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val 1 5 10 15 Pro Pro Phe <210> 152 <211> 15 <212> PRT <213> peptide <400> 152 Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe 1 5 10 15 <210> 153 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 153 Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe 1 5 10 <210> 154 <211> 28 <212> PRT <213> peptide <400> 154 Val Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys 1 5 10 15 Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 20 25 <210> 155 <211> 20 <212> PRT <213> peptide <400> 155 Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro 1 5 10 15 Val Glu Pro Phe 20 <210> 156 <211> 18 <212> PRT <213> peptide <400> 156 Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu 1 5 10 15 Pro Phe <210> 157 <211> 17 <212> PRT <213> peptide <400> 157 Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro 1 5 10 15 Phe <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 158 His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 1 5 10 <210> 159 <211> 13 <212> PRT <213> peptide <400> 159 Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 1 5 10 <210> 160 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 160 Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 1 5 10 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> peptide <400> 161 Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe 1 5 10 <210> 162 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 162 Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 163 Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 164 Met Glu Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys 1 5 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 165 Met Glu Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 166 Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met 1 5 <210> 167 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 167 Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu 1 5 <210> 168 <211> 11 <212> PRT <213> peptide <400> 168 Asp Leu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Val Ile Arg 1 5 10 <210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 169 Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu 1 5 <210> 170 <211> 11 <212> PRT <213> peptide <400> 170 Gly Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Ser Lys Asp 1 5 10 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 171 Ile Ser Lys Glu Gln Ile Val Ile Arg 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 172 Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu 1 5 <210> 173 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 173 Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu 1 5 10 <210> 174 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 174 Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp 1 5 10 <210> 175 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 175 Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 176 Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 177 Lys Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu 1 5 <210> 178 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 178 Lys Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu 1 5 10 <210> 179 <211> 17 <212> PRT <213> peptide <400> 179 Lys Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu 1 5 10 15 His <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 180 Leu Ile Ser Lys Glu Gln Ile Val Ile Arg 1 5 10 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> peptide <400> 181 Met Glu Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys 1 5 <210> 182 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 182 Met Glu Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys Lys 1 5 10 <210> 183 <211> 17 <212> PRT <213> peptide <400> 183 Asn Arg Glu Gln Leu Ser Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val 1 5 10 15 Asp <210> 184 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 184 Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser 1 5 <210> 185 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 185 Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys 1 5 10 <210> 186 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 186 Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly 1 5 10 <210> 187 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 187 Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met Lys Glu Gly Ile His 1 5 10 <210> 188 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 188 Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln 1 5 10 <210> 189 <211> 13 <212> PRT <213> peptide <400> 189 Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp 1 5 10 <210> 190 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 190 Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu 1 5 10 <210> 191 <211> 14 <212> PRT <213> peptide <400> 191 Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met 1 5 10 <210> 192 <211> 15 <212> PRT <213> peptide <400> 192 Ser Lys Asp Ile Gly Ser Glu Ser Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu 1 5 10 15 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 193 Ser Lys Glu Gln Ile Val Ile Arg 1 5 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 194 Ser Thr Glu Val Phe Thr Lys 1 5 <210> 195 <211> 12 <212> PRT <213> peptide <400> 195 Ser Thr Ser Glu Glu Asn Ser Lys Lys Thr Val Asp 1 5 10 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 196 Ser Val Glu Gln Lys His Ile 1 5 <210> 197 <211> 8 <212> PRT <213> peptide <400> 197 Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln 1 5 <210> 198 <211> 10 <212> PRT <213> peptide <400> 198 Ser Val Glu Gln Lys His Ile Gln Lys Glu 1 5 10 <210> 199 <211> 16 <212> PRT <213> peptide <400> 199 Val Pro Gln Leu Glu Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His 1 5 10 15 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 200 tgatgcggct catcagtgcc agc 23 <210> 201 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 201 gtagaagtgg cctagctcct cg 22 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 202 tgctgactgt ggacaactcg 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 203 tgcagcgaga gcacaaagat 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 204 gccacctgct ctatgccaag 20 <210> 205 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 205 caggctgtcc tagtcaggag at 22 <210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> primer <400> 206 tgatgcggct catcagtgcc agc 23 <210> 207 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 207 gtagaagtgg cctagctcct cg 22 <210> 208 <211> 25 <212> DNA <213> primer <400> 208 tggcctctct tggcctccaa cttgt 25 <210> 209 <211> 22 <212> DNA <213> Primer <400> 209 ttgaccaggc cttggagagc tc 22 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 210 tgctgactgt ggacaactcg 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 211 tgcagcgaga gcacaaagat 20

Claims (30)

  1. 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간의 발효 후에 유액, 특히 우유 및 특히 탈지된 우유의 pH를 실질적으로 3.36 이하, 특히 3.32와 동등한 값으로 감소시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5300 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) VF45A 균주, 상기 VF45A 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 균주.
  3. 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 19 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 안지오텐신 전환 효소를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택된 단리된 펩티드.
  4. 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열의 모든 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 상기 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 5종의 펩티드 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열에 상응하는 펩티드로부터 선택된 적어도 1종의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 바람직하게는 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 5 서열의 5종의 펩티드 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물 및 서열식별번호: 20 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 것을 특징으로 하는 펩티드의 혼합물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증의 치료에서의 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료에서의 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 단리된 펩티드 또는 펩티드의 혼합물.
  6. 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 매질, 및 활성 성분으로서, 제1항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제3항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제4항에 따른 펩티드의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 제1항에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 활성 성분으로서 함유하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 동물 기원의 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 야크의 유액은 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 동물 기원의 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 단백질 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 생성물의 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 1종, 특히 락토바실루스 헬베티쿠스 VF45A 균주의 농도 및/또는 그램당 18 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 1 내지 서열식별번호: 43 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  9. 제1항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제3항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제4항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 특히 야크의 유액을 제외한 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품.
  10. 제1항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제3항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제4항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제.
  11. 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 3.45 이하, 특히 3.43과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고/거나, 장 세포에 의한 칼슘의 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5403 하에 제출된 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주, 및 상기 VFH049 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체.
  12. 제11항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 균주.
  13. 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 74 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 안지오텐신 전환 효소를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택된 단리된 펩티드.
  14. 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 모든 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 펩티드의 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드 중 적어도 1종으로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 58 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 혼합물 및 서열식별번호: 75 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 단리된 펩티드 또는 펩티드의 혼합물.
  16. 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 매질, 및 활성 성분으로서, 제11항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제13항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제14항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 제11항에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 아몬드를 포함한 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 동물 기원의 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 암말의 유액은 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진 것을 특징으로 하는 제약 또는 식품 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 1종, 특히 락토바실루스 헬베티쿠스 VFH049 균주의 농도 및/또는 그램당 6 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 44 내지 서열식별번호: 86 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  19. 제11항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제13항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제14항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 특히 암말의 유액을 제외한 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품.
  20. 제11항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제13항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제14항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제.
  21. 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 적어도 1종의 펩티드를 생산할 수 있고/거나, 혐기성 발효에 의해 37℃에서 48시간 후에 유액, 특히 우유의 pH를 실질적으로 4.55 이하, 특히 4.51과 동등한 값으로 감소시킬 수 있고/거나, 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는, CNCM에 순번 CNCM-I-5316 하에 제출된 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) VF50b 균주, 및 상기 VF50b 균주의 게놈과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 동일성을 갖는 그의 돌연변이체 및 변이체.
  22. 제21항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 균주.
  23. 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 펩티드, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 161 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 안지오텐신 전환 효소를 억제할 수 있는 펩티드, 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열에 상응하는 상기 펩티드와 적어도 80% 동일성, 특히 적어도 90% 동일성, 특히 적어도 95% 동일성을 갖고 칼슘의 장 흡수를 증가시킬 수 있는 펩티드로부터 선택된 단리된 펩티드.
  24. 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열의 모든 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 112 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 112 서열의 펩티드 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드 중 적어도 1종을 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물, 및 서열식별번호: 162 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드를 함유하거나 또는 그로 이루어진 혼합물로부터 선택된 펩티드의 혼합물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 약물로서의, 및 특히 저칼슘혈증 또는 칼슘 흡수의 결핍에 의해 유발된 병리상태 및 특히 동맥 고혈압, 대사 증후군, 골다공증으로부터 선택된 병리상태의 치료에서의, 또는 자가면역 부갑상선기능저하증, 비타민-D 의존성 저칼슘혈증성 구루병, 진행성 골 이형발생, 고립성 부갑상선기능저하증, 증후군성 부갑상선기능저하증, 가성-부갑상선기능저하증 및 과소-결핍 구루병, 부갑상선 호르몬, 비타민 D의 흡수 또는 칼슘 수용체의 기능의 기능장애로 인한 칼슘혈증의 조절에서의 이상에 의해 유발된 질환으로부터 선택된 병리상태에 의해 유발된 저칼슘혈증의 치료를 위한 약물로서의, 이러한 필요를 갖는 대상체, 특히 포유동물 및 특히 인간에서의 그의 사용을 위한 단리된 펩티드 또는 펩티드의 혼합물.
  26. 섭취될 수 있는 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제 또는 매질, 및 활성 성분으로서, 제23항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제24항에 따른 펩티드의 혼합물 및/또는 제21항에 따른 균주를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 제21항에 따른 균주에 의한 임의로 탈지된 우유의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과를 거친 발효물을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나, 또는 적어도 1종의 곡류 및/또는 적어도 1종의 완두 및/또는 적어도 1종의 진균 및/또는 적어도 1종의 너트로부터 기원한 식물 기원의 단백질 기질, 식물 기원의 적어도 2종의 단백질 기질의 혼합물, 임의로 열적으로 멸균되고/거나 적어도 부분적으로 탈지된 유액, 특히 소, 염소 또는 양의 유액 (예외적으로 야크의 유액은 발효물이 10kDa의 컷-오프 역치에서 한외여과되지 않음), 적어도 2종의 유액의 혼합물 및 식물 기원의 적어도 1종의 단백질 기질 및 동물 기원의 적어도 1종의 유액의 혼합물로부터 선택된 단백질 기질의 혐기성 발효에 의해 수득된, 임의로 10 kDa의 컷-오프 역치에서의 한외여과 후의 발효물을 함유하거나 또는 그로 이루어진 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 그램당 107 CFU 이상의 상기 균주 중 적어도 1종, 바람직하게는 상기 균주 중 1종, 특히 락토바실루스 델브루엑키이 아종 불가리쿠스 VF50b 균주의 농도 및/또는 그램당 4 mg 이상의 동일하거나 상이한 서열식별번호: 87 내지 서열식별번호: 199 서열의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 농도를 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 제약 조성물.
  29. 제21항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제23항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제24항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 특히 식제품, 특히 발효된 유액, 임의로 발효된 과일 및/또는 채소 주스, 발효된 채소 및/또는 과일, 발효된 진균, 냉육, 어류(들)를 기초로 하는 식품 제조물, 및 임의로 탈지된 유액으로부터, 특히 야크의 유액을 제외한 소, 염소, 양의 유액, 또는 유액의 혼합물로부터 수득된 유제품으로부터 선택된 제품.
  30. 제21항에 따른 적어도 1종의 균주 및/또는 제23항에 따른 적어도 1종의 펩티드 및/또는 제24항에 따른 적어도 1종의 펩티드의 혼합물 및/또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 식품 또는 제약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상체, 특히 인간, 또는 특히 고양이, 개, 가금류, 양, 염소, 소, 파충류, 특히 이구아나로부터 선택된 동물에 적합화된 식품 보충제.
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