CN117042761A - 用于增强乳酸菌的生理功效的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于增强乳酸菌的功效的组合物。更具体地，所述组合物包含选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸，并且可以增强乳酸菌的生理活性，例如，乳酸菌的生长促进功效或肠损伤抑制功效。

Description

用于增强乳酸菌的生理功效的组合物
技术领域
本发明涉及用于增强乳酸菌的生理功效的组合物。
背景技术
乳酸菌是使用糖类作为能量来源产生乳酸的细菌，发现于人或哺乳动物的消化器官、口腔等并且广泛分布于自然界，例如各种发酵食品。乳酸菌是人类已长期广泛使用的微生物之一，具有防止肠道内的腐败、同时不产生对人或动物的肠道有害的物质的良好功能。
作为代表性益生菌(probiotic)，乳酸菌不仅具有抗菌效果，还调节宿主的肠道菌群(microflora)，以便在多个方面表现有益效果，例如抑制各种肠道疾病和增强免疫力。因此，越来越有兴趣开发用于多种食品的材料。这些乳酸菌广泛用于人类生活，从发酵乳制品到各种发酵食品、酱汁、饮料、药物和家畜饲料添加剂。
同时，出于增加乳酸菌的效果的目的，将乳酸菌产品与例如维生素和膳食纤维等益生元(prebiotic)添加剂一起使用。以往或现在的乳酸菌相关产品仅是几种成分的简单组合，不显示显著的功效，或者如果大剂量摄取，可能会发生例如不利地影响使用者的体内代谢等问题。此外，缺少对添加剂如何影响乳酸菌的生理活性的研究。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种用于增强乳酸菌的功效的组合物。
此外，本发明的另一目的在于提供一种用于促进生长或抑制肠损伤的药物组合物。
此外，本发明的另一目的在于提供一种用于促进生长或抑制肠损伤的食品组合物。
用于解决问题的方案
1.一种用于增强乳酸菌的功效的组合物，其包含选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸(BCAA)。
2.根据上述1所述的组合物，其包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
3.根据上述1所述的组合物，其中所述乳酸菌的功效是促进个体生长或抑制肠损伤。
4.根据上述1所述的组合物，其中所述乳酸菌的功效是增加营养缺乏型个体的体重或骨密度中的至少一者、或者抑制营养缺乏型个体的肠漏。
5.根据上述1所述的组合物，其中所述乳酸菌是选自由乳杆菌属(Lactobacillusspp.)、乳球菌属(Lactococcus spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和双歧杆菌属(Bififobacterium spp.)组成的组的至少一种。
6.根据上述5所述的组合物，其中所述乳杆菌属是选自由以下组成的组的至少一种：植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)；副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)；发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)；嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)；加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)；德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)；罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)；和唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)。
7.一种用于促进生长或抑制肠损伤的药物组合物，其包含：根据上述1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
8.根据上述7所述的药物组合物，其中所述乳酸菌是选自由以下组成的组的至少一种：植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；发酵乳杆菌；干酪乳杆菌；嗜酸乳杆菌；加氏乳杆菌；德氏乳杆菌保加利亚亚种；罗伊氏乳杆菌；瑞士乳杆菌；和唾液乳杆菌。
9.一种用于预防或治疗选自由以下组成的组的至少一种疾病的药物组合物：生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征，所述药物组合物包含：根据上述1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
10.一种用于促进生长或抑制肠损伤的食品组合物，其包含：根据上述1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
发明的效果
本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物，通过包含支链氨基酸，可以增强乳酸菌的生理活性功能，例如，乳酸菌促进个体生长或抑制肠损伤的功效。
本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物，由于包含由乳酸菌中缺少的支链氨基酸的合酶合成的支链氨基酸，可以提高乳酸菌的生理活性功能。
本发明的药物组合物或食品组合物，由于包含用于增强乳酸菌的功效的组合物以及乳酸菌，可以在个体中提供生长促进效果和/或肠损伤改善效果。
附图说明
图1显示出，通过由蛋白质缺乏诱导的果蝇(果蝇属(Drosophila))的摄取行为的分析来观察营养满足的结果。具体地，图1A显示出，在按时间将果蝇分别置于含有蛋白质的培养基和缺乏蛋白质的培养基后，确认在L型必需氨基酸(自然界中存在的氨基酸的形式，L-form essential amino acid，L-EAA)和D型必需氨基酸(光学异构体，即，L型必需氨基酸的对映异构体，D-EAA)中优选哪种食物的结果。确认到暴露于缺乏蛋白质的食物的时间越长，对L-EAA的偏好指数(preference index)越高。图1B显示出在缺乏蛋白质的培养基中保持48小时的果蝇的摄取偏好的结果。确认其行为方向为满足L型氨基酸，L型氨基酸是自然界中存在的氨基酸的形式。图1C显示出，果蝇优选摄取L型氨基酸中的L型必需氨基酸以补充蛋白质缺乏的结果。图1D显示出，确认对于L型非必需氨基酸(L-form Nonessentialamino acid，L-NEAA)的摄取偏好即使在蛋白质缺乏的情况中也不会增加的结果。图1E显示出，确认食用相同热量值(calorific value)的、由不同蛋白质比例构成的培养基的果蝇的L-EAA摄取偏好的结果。对L-EAA的摄取偏好随着摄取的食物的蛋白质含量的增加而减少。图1F显示出，确认即使通过诱导破伤风毒素(TNT)的过表达来抑制已知为识别蛋白质的味觉感受器的Ir76b细胞的活性，不影响果蝇在蛋白质缺乏的情况中的L-EAA摄取偏好的结果。这表明满足蛋白质缺乏的必需氨基酸摄取行为是由先前已知的信号传导途径以外的途径调节的。AA缺乏(AA deprivation)是指氨基酸缺乏，L-EAA是指天然存在的L型的必需氨基酸，D-EAA是指对映异构体形式的必需氨基酸，L-NEAA是指非必需氨基酸。此外，在Ir76b-LexA的情况中，使用在已知为味觉感受器的Ir76b表达位点表达LexA蛋白的果蝇。此外，LexAop-TNT是指使用在存在LexA蛋白的情况下、通过表达TNT毒素来抑制味觉感受器的果蝇。
图2显示出作为由蛋白质缺乏而诱导的肠激素的CNMa激素的发掘结果，并且确认CNMa表达在果蝇肠中的位置。具体地，图2A显示出，通过用含有蛋白质的培养基和缺乏蛋白质的培养基喂养果蝇并解剖果蝇肠以通过实时qPCR研究11种肠激素的表达水平，来确认每种条件下的11种肠激素的mRNA表达水平的结果。在11种肠激素中，仅CNMa在蛋白质缺乏条件中具有增加的表达。图2B显示出，在用具有相同的热量值但不同的蛋白质(酵母)含量的培养基喂养果蝇后，在每种培养基条件下，果蝇肠中的CNMa mRNA的表达水平的测量结果。随着培养基中的蛋白质含量增加，CNMa激素的mRNA表达减少。图2C至D显示出，使用CNMa-Gal4>UAS-GFP果蝇系，在高蛋白质培养基(高AA)和低蛋白质培养基(低AA)的条件下，确认果蝇肠中表达的CNMa激素的表达水平的结果。在果蝇肠中，CNMa的表达在R2区的肠上皮细胞(intestinal enterocyte)中特异性增加。
图3显示出，通过制备CNMa特异性抗体来确认内源性CNMa表达的结果，和再次确认CNMa激素的表达与在CNMa-Gal4表达区域同样地发生于果蝇肠的R2区的肠上皮细胞中中的结果。
图4显示出由缺乏单一的必需氨基酸而诱导的CNMa激素的表达的增加以及L-EAA偏好指数的变化。具体地，图4A显示出，在用已从全合成(Holidic)培养基(化学成分确定的培养基)去除精氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的培养基喂养果蝇后，确认果蝇肠R2区中的CNMa激素的表达的变化的结果。确认CNMa激素的表达仅由单一的必需氨基酸的缺乏而诱导。图4B显示出，确认即使仅缺乏一种类型的必需氨基酸，果蝇的L-EAA偏好指数增加的结果。
图5显示出普通果蝇和无菌果蝇(sterile Drosophila)之间的CNMa激素表达水平以及L-EAA偏好指数的差异的比较结果。具体地，图5A显示出，在按时间将无菌果蝇置于含有蛋白质的培养基和缺乏蛋白质的培养基后，L-EAA偏好指数的观察结果。图5B显示出，在用具有10％酵母浓度的食物喂养普通果蝇(CV)和无菌果蝇(GF)后，确认肠中的CNMa表达水平的结果。即使由具有相同蛋白质含量的培养基进行喂养，无菌果蝇中的CNMa激素的表达增加，并且在向培养基额外地添加酵母时，该增加的CNMa表达被抵消。图5C显示出，在用具有10％酵母浓度的食物喂养正常果蝇(CV)和无菌果蝇(sterile Drosophila)(GF)后，确认肠中的L-EAA偏好指数的结果。即使由具有相同蛋白质含量的培养基进行喂养，无菌果蝇对L-EAA喂养的偏好增加，并且在向培养基额外地添加酵母时，该结果被抵消。这些结果表明肠杆菌科(enterobacteriaceae)通过抵消L-EAA缺乏而影响取食偏好以满足宿主的营养。
图6显示出，引入醋杆菌(Acetobacter)的果蝇和引入乳杆菌(Lactobacillus)的果蝇之间的CNMa表达水平和L-EAA营养满足行为的差异的比较结果、以及醋杆菌科(Acetobacteraceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的氨基酸生物合成途径的比较结果。具体地，图6A显示出无菌果蝇(+无)、引入果实醋杆菌(A.pomorum)的果蝇(+果实醋杆菌)和引入植物乳杆菌(L.plantarum)WJL的果蝇(+植物乳杆菌WJL)的肠CNMa激素的表达水平。图6B显示出无菌果蝇(+无)、引入果实醋杆菌的果蝇(+果实醋杆菌)和引入植物乳杆菌WJL的果蝇(+植物乳杆菌WJL)的L-EAA营养满足行为的观察结果。确认醋杆菌抵消L-EAA缺乏，但乳杆菌不抵消L-EAA缺乏，由此诱导取食偏好以满足宿主的营养。图6C显示出，通过比较基因组分析的参与醋杆菌科、乳杆菌科的氨基酸生物合成途径的基因的分析结果。基于果实醋杆菌DM001的基因，基因的核苷酸序列相似性越高，蓝色越高，当相似性低于20％时，显示为红色。确认了乳杆菌科通常缺少涉及支链氨基酸(BCAA)生物合成的基因。
图7显示出来自Food Notice的乳杆菌菌株的BCAA生物合成途径基因的比较分析的结果。通过比较基因组分析来对参与乳杆菌的11个种的氨基酸生物合成途径的基因进行分析。基于果实醋杆菌DM001的基因，基因的核苷酸序列相似性越高，蓝色越高，当相似性低于20％时，显示为红色。确认了11种乳杆菌菌株共通地缺乏涉及支链氨基酸(BCAA)生物合成的基因。
图8显示出确认引入醋杆菌突变株的果蝇的CNMa激素表达水平和L-EAA营养满足行为的结果，所述醋杆菌突变株被调节为不生物合成作为一种类型的BCAA的亮氨酸。图8A至8B显示出：无菌果蝇(+无)、引入对照醋杆菌的果蝇(+Aceto WT)、引入不可生物合成亮氨酸的AcetoΔleuB的果蝇(+AcetoΔleuB)和引入不可生物合成脯氨酸的AcetoΔproC的果蝇(AcetoΔproC)的分别的(A)CNMa激素表达水平；和(B)L-EAA偏好指数。能够确认在向培养基添加亮氨酸时、或者在制备基因再引入缺乏的leuB的(+AcetoΔleuB+亮氨酸)的细菌并引入果蝇(+AcetoΔleuB _ leuB)时，引入AcetoΔleuB的果蝇的CNMa表达和L-EAA偏好指数降低。
图9显示出确认引入醋杆菌突变株的果蝇的CNMa激素表达水平和L-EAA营养满足行为的结果，所述醋杆菌突变株被调节为不生物合成作为一种类型的BCAA的异亮氨酸。具体地，图9A至9B显示出无菌果蝇(+无)、引入对照醋杆菌的果蝇(+Aceto WT)和引入不可生物合成异亮氨酸的AcetoΔilvA的果蝇(+AcetoΔilvA)的分别的(A)CNMa激素表达水平和(B)L-EAA偏好指数。确认了在向培养基添加异亮氨酸(+AcetoΔleuB+Ile)时，引入AcetoΔilvA的果蝇的CNMa表达和L-EAA偏好指数恢复至引入Aceto WT的果蝇的水平。
图10显示出根据乳杆菌的BCAA生物合成能力的CNMa激素表达和L-EAA营养满足行为指数的变化。具体地，图10A至10B显示出无菌果蝇(+无)、引入对照乳杆菌的果蝇(+LactoWT)和引入获得BCAA生物合成能力的突变乳杆菌(Lacto BCAA)的果蝇(+Lacto BCAA)的分别的(A)CNMa激素表达水平和(B)L-EAA营养满足行为的观察结果。可以看出，引入已获得BCAA生物合成能力的Lacto BCAA的果蝇抵消了L-EAA缺乏，从而减少宿主的CNMa激素表达和L-EAA营养满足行为指数。此外，在向引入Lacto WT的果蝇的培养基添加BCAA(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)时，CNMa表达和L-EAA营养满足行为指数减少至引入Lacto BCAA的果蝇的那些。
图11显示出，在果蝇模型中，在将BCAA和乳酸菌一起添加时，确认增强了动物生长功效的结果。在将BCAA添加至无菌果蝇EGG(+BCAA)时、在单独引入植物乳杆菌WJL(+WJL)时、或在将细菌和BCAA一起给予(+WJL+BCAA)时，每12小时观察蛹的形成并且测量了平均发生时间。可以看出，在添加作为营养物的BCAA(+BCAA)时，其对果蝇的生长完全没有帮助。另一方面，可以确认，在将乳酸菌和BCAA一起给予(+WJL+BCAA)时，果蝇的生长统计学地且显著地提高。
图12显示出，确认在将亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的至少两种或更多种BCAA和乳酸菌组合使用时的生长促进功效的结果。具体地，图12A显示出当用仅一种类型的氨基酸进行处理时、或者用除了乳酸菌以外还有一种类型的氨基酸来进行处理时的生长促进功效。图12B显示出当用两种或更多种类型的BCAA且无乳酸菌进行处理时、或者用除了乳酸菌以外还有两种或更多种类型的BCAA来进行处理时的生长促进功效。
图13显示出确认在将各种类型的乳酸菌与BCAA一起添加时，乳酸菌的生长促进功效是否增加的结果。
图14显示出确认在将各种类型的乳酸菌与BCAA一起添加时，乳酸菌的生长促进功效是否增加的结果。
图15显示出在小鼠动物模型中，确认在将BCAA与乳酸菌一起添加时，乳酸菌的生长促进功效或肠漏抑制功效是否增加的结果。具体地，图15A显示出在12周后，年轻小鼠(young mouse)的体重变化的测量结果。图15B显示出通过用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC)喂养小鼠，测量FITC通过肠流入血液的程度的结果，其中数值越高，肠漏越严重。在将乳酸菌和BCAA一起给予(+WJL+BCAA)时，可以看到小鼠体重增加，同时肠漏程度降低。体重增加和肠漏降低显示出统计学显著的结果。
图16显示出在小鼠动物模型中，在将BCAA和乳酸菌一起添加时，股骨皮质骨矿物质密度(BMD)的测量结果。在用乳酸菌和BCAA一起进行处理(+WJL+BCAA)时，可以看到小鼠的骨密度统计学显著地增加。具体地，图16B显示出股骨的典型照片。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供一种用于增强乳酸菌的功效的组合物，所述组合物包含选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组中的至少两种支链氨基酸(BCAA)。
术语“乳酸菌的功效”是指乳酸菌作用于特定对象或个体的功能或效果，并且也可以表述为“乳酸菌的生理活性功能”。术语“生物学活性”是指特定药物或物质作用于生物体的性质。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以增强乳酸菌的生长促进功效、或提高乳酸菌的肠损伤抑制功效。
乳酸菌的功效可为促进个体生长或抑制肠损伤。具体地，乳酸菌的功效可为增加个体的体重或骨密度中的至少一者、或者抑制个体的肠漏。
乳酸菌的功效可为增加营养缺乏型个体的体重和骨密度中的至少一者、或者抑制营养缺乏型个体的肠漏。
术语“乳酸菌的生长促进功效”是指乳酸菌促进其他生物体或个体的生长的功效。例如，在与乳酸菌组合处理时，对于乳酸菌处理的个体，根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物可以增加促进个体生长的乳酸菌的功效。具体而言，与将乳酸菌单独施用至任意个体相比，在将本发明的功效增强组合物与乳酸菌组合使用以处理任意个体时，个体的生长促进效果为显著优异的。根据一个实施方案，与仅乳酸菌进行处理的情况相比，在将根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌一起使用时，在用上述组合处理的个体中，骨密度优异并显著增加，并且显示出体重增加效果。高骨密度有助于增加身高，并且本领域技术人员将骨密度用作生长的重要指标。
术语“乳酸菌的肠损伤抑制功效”是指其中乳酸菌抑制其他生物体或对象的肠损伤的乳酸菌的功效。例如，在将本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌组合使用时，可以增加用乳酸菌处理的个体中的乳酸菌抑制个体的肠损伤的功效。具体地，与将乳酸菌单独施用至任意个体的情况相比，在将本发明的功效增强组合物与乳酸菌组合使用以处理任意个体时，抑制个体的肠损伤的效果是显著优异的。肠损伤可以是肠漏和肠道炎症，但不限于此。
根据一个实施方案，与仅乳酸菌进行处理的情况相比，在将根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌一起使用时，在与乳酸菌组合处理的个体中出现显著优异的抑制肠漏的效果。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以充当能够进一步提高乳酸菌的效果(例如，生长促进效果、肠损伤抑制效果)的佐剂。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以与乳酸菌组合使用，并且可以充当通过与乳酸菌组合使用而能够进一步提高由单独的乳酸菌引起的效果的佐剂。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以与乳酸菌同时(simultaneously)、分别(separately)或顺序(sequentially)地进行处理。
个体可以是动物，包括人，例如人、狗、猫、马、牛、兔、山羊，但不限于此。
个体可以是营养缺乏或营养不均衡的。例如，个体可以是缺乏蛋白质营养的个体。
将用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌组合使用，通过增加营养缺乏型个体的体重或骨密度中的至少一者、或者抑制营养缺乏型个体的肠漏，以提高乳酸菌对营养缺乏型或营养不均衡型生物体或个体的功效。“营养缺乏”可以是指缺乏一种或多种必需营养物或热量的状态，并且可以是由例如营养的不充分摄入、吸收不良或加工障碍等引起的。在营养缺乏型个体的情况中，可出现例如体重不足、骨突出、皮肤干燥和弹性减少、或头发干燥等症状。“营养不均衡”是指身体所需的营养和从身体获得的营养之间的不均衡，并且可包括营养过剩和营养不良。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以增强乳酸菌促进营养缺乏型或营养不均衡型个体的生长的功效、或者增强抑制肠损伤的功效。
对个体的年龄没有限制，但个体可以包括例如未成年(child)个体、除了老年个体以外的成年个体、或老年个体等个体。
个体可以是未成年时期(childhood)的个体。未成年时期是指从受孕、出生到成年(adulthood)的时期。未成年时期可以包括细胞期、胎儿期、新生儿期、婴幼儿期(infancy)、儿童期和青春期。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以在体外提高乳酸菌的活性。例如，用于增强乳酸菌的功效的组合物可以在体外促进用乳酸菌处理的细胞或组织的生长。例如，用于增强乳酸菌的功效的组合物可以在体外抑制对用乳酸菌处理的肠相关细胞或组织的损伤。
乳酸菌是使用糖类作为能量来源产生乳酸的细菌，可发现于人或哺乳动物的消化器官、口腔等并且广泛分布于自然界，例如各种发酵食品产品。乳酸菌是人类已长期广泛使用的微生物之一，具有防止肠道内的腐败、同时不产生对人或动物的肠道有害的物质的良好功能。乳酸菌是指能够产生乳酸的有益细菌。
乳酸菌可以是乳杆菌科(Lactobacillaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)或双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。
乳酸菌可以选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属、和双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)组成的组。
乳杆菌属可以选自由以下组成的组：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌，但不限于此。根据一个实施方案，在将本发明的组合物与选自由以下组成的组的至少一种乳酸菌组合处理时，本发明的组合物能够增强乳酸菌的功效：植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、和唾液乳杆菌。
乳酸菌可分离自植物、发酵食品、包括哺乳动物或节肢动物在内的动物，或者可存在于个体的肠道中。根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物可以提高分离的乳酸菌的功效，并且可以增强存在于个体的肠道中的乳酸菌的功效。
乳酸菌可以是活的或死的细菌，对其形式没有特别限制。
在一个实施方案中使用的植物乳杆菌(L.plantarum)WJL可以通过已知的制造方法来制备(Eun-Kyoung Kim等,Genome Announcements,11月/12月2013,Vol.1,no.6e00937-13,GenBank AUTE00000000,植物乳杆菌WJL，全基因组鸟枪法测序计划(wholegenome shotgun sequencing project))。植物乳杆菌WJL可分离自果蝇。植物乳杆菌WJL可以是已保藏的菌株(登记号No.:KCTC14442BP，保藏机构：韩国典型培养物保藏中心(Biological Resources Center)，保藏日期：2021年1月11日)。
本发明人考虑到，通过乳酸菌的遗传分析发现乳酸菌缺少支链氨基酸生物合成酶相关基因，乳酸菌不能合成支链氨基酸，并预期如果将支链氨基酸与乳酸菌组合使用，可以提高乳酸菌的功效，因此，选择支链氨基酸作为根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物的活性成分。通过与在乳酸菌中不生物合成的氨基酸组合使用，用于增强乳酸菌的功效的组合物可以表现出提高乳酸菌的功效的效果。
术语“支链氨基酸(BCAA)”是具有脂肪族侧链的氨基酸，所述侧链具有中心碳原子键合至三个或更多个碳原子的分支结构(branch)。产生蛋白质的BCAA包括必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，而非蛋白质BCAA包括2-氨基异丁酸。支链氨基酸可以是游离氨基酸(free amino acid)。“游离氨基酸”是指不是蛋白质的一部分的氨基酸。
用于增强乳酸菌的功效的组合物可以包含选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸。
具体地，用于增强乳酸菌的功效的组合物可以包含：亮氨酸和异亮氨酸；亮氨酸和缬氨酸；异亮氨酸和缬氨酸；或亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
当根据本申请的用于增强乳酸菌的功效的组合物包含所有亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的两种或更多种时，与单独包含这些的情况相比，可以更有效地提高乳酸菌的功效。
用于增强乳酸菌的功效的组合物(例如，用于提高乳酸菌的生长促进功效的组合物，或用于提高乳酸菌的肠损伤抑制功效的组合物)可以包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
当本申请的用于增强乳酸菌的功效的组合物包含所有的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸时，可以最有效地提高乳酸菌的活性。
根据一个实施方案，与将包含单独的亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的组合物和乳酸菌组合进行处理的情况相比，当包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的两种或更多种的组合物与乳酸菌组合进行处理时，可以看到显著增强了个体的生长。
包含在本发明的组合物中的支链氨基酸可以起到提高乳酸菌在肠道中的功能的作用，而不仅是为了个体的营养补充而包含。
如上所述，在将在乳酸菌中缺少合成的支链氨基酸与乳酸菌组合使用时，增强了乳酸菌的生理活性(例如，生长促进效果或肠损伤抑制效果)，并且即使不与除了支链氨基酸以外的其它蛋白质一起使用，单独的本发明的组合物可充分表现增强乳酸菌的功效的效果。因此，根据本申请的用于增强乳酸菌的功效的组合物可以表现出优异的增强乳酸菌的功效的效果，并且在原料消耗方面具有经济优势。另外，通过含有其它蛋白质，可以降低支链氨基酸的功能劣化或发生意想不到的副作用的可能性。
例如，用于增强乳酸菌的功效的组合物除了支链氨基酸以外，可不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白(Whey protein))。即使用于增强乳酸菌的功效的组合物除了支链氨基酸以外不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白)，用于增强乳酸菌的功效的组合物可以显著增强乳酸菌的功效。在这种情况下，可以降低其它蛋白质的原料成本，从而产生优异的经济优势。此外，如果包含其它蛋白质，可以降低支链氨基酸的功能的劣化、或者不期望的副作用的可能性。
“乳清蛋白”是一种已从中去除了酪蛋白的乳蛋白。乳清蛋白的80％由乳白蛋白和乳球蛋白组成，并且进一步包括不因酸或热而凝固的例如蛋白(proteose)或蛋白胨(peptone)等其它组分。尽管乳清蛋白具有例如提高运动后的恢复速度、饱足感和体重控制等优点，然而缺少乳糖降解酶的乳糖不耐受者或具有乳过敏的个体在摄取乳清蛋白时可经历例如腹泻和腹痛等症状，因此需要谨慎。此外，需要蛋白质限制的患有肾病或肝病的个体在摄取乳清蛋白时也需要谨慎。
根据本发明的用于增强乳酸菌的功效的组合物可不含有乳清蛋白，使得不会引起在含有乳清蛋白时可能发生的问题(腹泻、腹痛、过敏等)，并且可促进乳酸菌的生长或者可以提高肠损伤抑制功效。
对于另一实例，用于增强乳酸菌的功效的组合物可由选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸构成。
此外，本发明提供了用于增强乳酸菌的功效的方法，所述方法包括：向个体施用上述用于增强乳酸菌的功效的组合物。
由于上文已描述了“用于增强乳酸菌的功效的组合物”、“乳酸菌”和“乳酸菌的功效”，将不会对这些进行详细描述。
乳酸菌可存在于个体的肠内。
个体可以是包括人在内的动物，例如人、狗、猫、马、牛、兔、山羊，但不限于此。
个体可以是患有生长迟缓或发生肠损伤的个体。
个体可以是由于营养缺乏或营养不均衡而具有受抑制的生长或发生肠损伤的个体。
用于增强乳酸菌的功效的方法可不包括施用除了支链氨基酸和乳酸菌以外的多肽或蛋白质(例如，乳清蛋白)。
此外，本发明提供用于促进生长或抑制肠损伤的药物组合物，所述药物组合物包括上述用于增强乳酸菌的功效的组合物；和乳酸菌。
通过包含提高乳酸菌的生长促进功效和肠损伤抑制功效的用于增强乳酸菌的功效的组合物以及乳酸菌二者，本申请的药物组合物可促进向其施用药物组合物的个体的生长、或者抑制肠损伤。
由于上文已描述了“用于增强乳酸菌的功效的组合物”和“乳酸菌”，将不会对这些进行详细描述。
生长促进效果可以是指促进向其施用药物组合物的包括人在内的个体的生长的效果。
生长促进可以是体重增加、身高增加和骨密度增加中的至少一种。
根据一个实施方案，确认了将本申请的用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌组合使用，动物的体重和骨密度增加。
肠损伤抑制效果可以是指抑制向其施用药物组合物的包括人在内的个体的肠损伤的效果。
肠损伤可以是炎性肠病、环境性肠病或肠漏综合征，但不限于此。
根据一个实施方案，确认了接受本申请的用于增强乳酸菌的功效的组合物与乳酸菌的组合施用的动物的肠漏被抑制。
此外，本发明提供了用于预防或治疗选自由以下组成的组的至少一种疾病的组合物：生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征，所述组合物包括：上述用于增强乳酸菌的功效的组合物；和乳酸菌。上述功能可包括通过提高向其施用药物组合物的受试者中的乳酸菌的生理活性效果(例如，生长促进效果和肠损伤抑制效果)而表现的效果。
术语“预防”是指通过施用用于增强乳酸菌的功效的组合物和乳酸菌而抑制疾病或延迟其发展的任何行为。术语“治疗”是指通过施用用于增强乳酸菌的功效的组合物和乳酸菌而改善或有利地改变疾病的症状的任何行为。
疾病可由营养缺乏或营养不均衡导致。由于上文已描述了“营养缺乏”或“营养不均衡”，将不会对此进行详细描述。
疾病可发生于包括人在内的动物，并且对其年龄没有限制。
疾病可发生于未成年个体、除了老年个体以外的成年个体、老年个体。具体地，这可包括发生于未成年个体中的疾病。由于上文已描述了术语“未成年”，将不会对此进行详细描述。
本申请的药物组合物可被施用至营养缺乏型或营养不均衡型个体。
本申请的药物组合物可被施用至未成年个体。
本申请的药物组合物可用于预防或治疗选自由以下组成的组的至少一种疾病：未成年个体中的生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征。
肠漏综合征是当覆盖肠内壁的膜中的细胞之间产生间隙时发生的疾病。这是一种使肠功能恶化同时增加肠道通透性，这反而导致水和营养物的吸收紊乱并由此导致免疫系统紊乱的疾病。
环境性肠病(EE)是一种由于同时发生营养不良和肠道感染而导致儿童的低生长及智力低下的疾病，仅向受试者供给营养物很难改善环境性肠病。
包含在本申请的药物组合物中的支链氨基酸通过提高乳酸菌的功效而表现优异的改善环境性肠病的效果，不仅是出于供给营养物的目的。
根据一个实施方案，本申请的药物组合物可包含：选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸；和选自由植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、和唾液乳杆菌组成的组的至少一种乳酸菌。
根据一个实施方案，包含以下的本申请的药物组合物可以增加向其施用所述组合物的个体的发育或体重和骨密度：选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸；和选自由植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、和唾液乳杆菌组成的组的至少一种乳酸菌。根据一个实施方案，包含以下的药物组合物可以抑制向其施用所述组合物的个体的肠漏：选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸；和选自由植物乳杆菌、副干酪乳杆菌鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、和唾液乳杆菌组成的组的至少一种乳酸菌。
本发明的药物组合物除了支链氨基酸和乳酸菌以外，可不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白)。即使所述组合物不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白)，支链氨基酸和乳酸菌可显著促进向其施用所述组合物的个体的生长或显著抑制肠损伤。在这种情况下，可以减少其它蛋白质(例如，乳清蛋白)的成本，从而产生优异的经济优势。
本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体可以是通常用于制剂的那些，例如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体、和抗氧化剂，但不限于此。
本发明的药物组合物可以被配制成注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，但不限于此。
本发明的药物组合物可以根据期望的方法口服或肠胃外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)，并且可由本领域技术人员适当地选择。
本发明的药物组合物可以以药学上有效量施用。
本发明的药物组合物可以作为单个治疗剂施用或者与其它治疗剂联合施用，也可以与常规治疗剂顺序或同时施用，并且可以以单个或多个剂量施用。
根据本发明的药物组合物的有效量可以取决于患者的年龄、性别、状况和/或体重、体内活性成分的吸收、失活速率和排泄速率、疾病类型、和要组合使用的药物而变化。通常，每1kg体重0.001至150mg、优选0.01至100mg，可以每天或每隔一天施用，或者可以分为一日1至3次。然而，剂量可取决于施用途径、肥胖严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少，因此将不以任何方式限制本发明的范围。
因此，本发明提供用于促进生长或抑制肠损伤的方法，所述方法包括向个体施用用于增强乳酸菌的功效的组合物和乳酸菌。
由于上文已描述了“用于增强乳酸菌的功效的组合物”、“乳酸菌”、“促进生长”和“抑制肠损伤”，将不会对这些进行详细描述。
个体可以是包括人在内的动物，例如人、狗、猫、马、牛、兔、山羊，但不限于此。
个体可以是患有生长迟缓或发生肠损伤的个体。
个体可以是由于营养缺乏或营养不均衡而具有受抑制的生长或发生肠损伤的个体。
用于增强乳酸菌的功效的组合物和乳酸菌可以同时、分别或顺序地施用。
用于促进生长或抑制肠损伤方法可不包括施用除了支链氨基酸和乳酸菌以外的多肽或蛋白质(例如，乳清蛋白)。
此外，本发明提供用于促进生长或抑制肠损伤的食品组合物，所述食品组合物包括：上述用于增强乳酸菌的功效的组合物；和乳酸菌。
本申请的食品组合物可以包括提高乳酸菌的生长促进功效和肠损伤抑制功效的用于增强乳酸菌的功效的组合物以及乳酸菌二者，以便促进向其施用食品组合物的个体的生长、或者抑制肠损伤。
由于上文已描述了“用于增强乳酸菌的功效的组合物”、“乳酸菌”、“促进生长”、“抑制肠损伤”和“肠损伤”，将不会对这些进行详细描述。
本申请的食品组合物可用于预防或改善选自由以下组成的组的至少一种疾病：生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征。上述功能可包括通过增强向其施用食品组合物的个体中的乳酸菌的功效(例如，生长促进功效和肠损伤抑制功效)而表现的效果。
术语“改善”是指通过摄取食品组合物而降低与要治疗的病况相关的参数、例如疾病的症状严重程度的任何行为。
由于上文已描述了“疾病”，将不会对其进行详细描述。
本申请的食品组合物可施用至营养缺乏或营养不均衡的个体。
本申请的食品组合物可施用至未成年个体。
本申请的食品组合物可用于预防或改善选自由以下组成的组的至少一种疾病：未成年个体中的生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征。
根据一个实施方案，本申请的食品组合物可包括：选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸；和选自由植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、和唾液乳杆菌组成的组的至少一种乳酸菌。
本发明的食品组合物除了支链氨基酸和乳酸菌以外，可不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白)，并且即使所述组合物不包含其它蛋白质(例如，乳清蛋白)，其可显著促进向其施用支链氨基酸和乳酸菌的个体的生长、或显著抑制其肠损伤。在这种情况下，可以减少其它蛋白质(例如，乳清蛋白)的成本，从而产生优异的经济优势。
食品组合物只要是形式被认定为是食品，就可以不受限制地生产为各种类型。例如，食品包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、糕点糖果、披萨、日本拉面、其它面类、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤类、饮料(beverage)、茶、饮品(drink)、酒精饮料、维生素复合剂、保健功能食品、保健食品等，并且包括所有通常意义上的食品。
食品组合物可通过本领域中常用的方法来生产。
食品组合物可进一步包括本领域中通常添加的原料和成分。例如，食品组合物可进一步包括维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸、生物素、叶酸和泛酸。例如，食品组合物可进一步包含矿物质如锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)、铬(Cr)等。
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明的组成和效果。但是，以下实施例仅为说明性目的提供以帮助理解本发明，本发明的范围不限于此。
实施例
本发明人通过以下实验得到了增强乳酸菌的功效的乳酸菌和支链氨基酸的组合，作为满足营养缺乏型个体的营养的活性成分。在确认促进乳酸菌的功效的支链氨基酸与乳酸菌是否显示出乳酸菌的功效增强效果的结果之前，首先描述了作为在营养缺乏型个体中出现的特异性指标并且还作为满足营养缺乏型个体的营养的一种组分的乳酸菌的选择过程。
通过将对照组和实验组相比较，进行单向ANOVA(和Dunnett事后多重比较)统计分析，确认了乳酸菌的功效增强效果是否为统计学显著的。p值：***(p<0.001)，**(P<0.01)，*(P<0.05)显示出统计学显著的结果。另一方面，由于高p值被标注为“ns.”，实验组没有显示出统计学显著的结果。
1.营养缺乏型个体中的特异性标志的鉴定
1-1.营养缺乏型个体中的L-EAA偏好
基于果蝇在体内缺乏蛋白质的情况下特异性摄取必需氨基酸的取食行为，观察营养缺乏型个体的行为指数(behavior index)。具体地，将果蝇置于含有蛋白质的培养基和缺乏蛋白质的培养基(仅含有葡萄糖的培养基)中，研究了在L型必需氨基酸(自然界中存在的氨基酸的形式，即L-form essential amino acid，L-EAA)和D型必需氨基酸(L型必需氨基酸的对映异构体，即D-EAA)中优选哪一种作为食物。
结果，确认了个体暴露于缺乏蛋白质的培养基的时间越长，对L-EAA的偏好指数越高(参见图1A和1B)。此外，确认了营养缺乏型个体优选摄取L型氨基酸中的L型必需氨基酸。此外，确认了即使在蛋白质缺乏的情况中，对L型非必需氨基酸(L-form Nonessentialamino acid，L-NEAA)的取食偏好不增加(参见图1C至1D)。此外，作为用相同热量但不同蛋白质比喂养的果蝇个体的L-EAA偏好指数的比较结果，能够确认在摄取高蛋白质含量食物的个体中，L-EAA偏好指数降低。由此，确认了果蝇补充L-EAA以满足蛋白质营养的取食行为是被精确调控的(参见图1E)。此外，在抑制了已知为识别蛋白质的味觉感受器的现有Ir76b细胞的活性后，确认了L-EAA偏好指数。具体地，将其中通过诱导破伤风毒素(TNT)过表达来使Ir76b细胞失活的果蝇以及对照果蝇置于蛋白质缺乏的情况中以确认L-EAA偏好指数。结果，其中使Ir76b细胞失活的果蝇显示出与对照果蝇类似的L-EAA偏好指数水平(参见图1F)。由此，发现除了先前已知的用于识别体内营养缺乏的信号传导途径以外，存在其它的信号传导途径。
1-2.营养缺乏型个体中的CNMa激素过表达
为了鉴定用于识别体内营养缺乏的新的信号传导途径，注意到肠道作为消化和吸收食物并分泌各种激素的内分泌器官。向果蝇喂食含有蛋白质的培养基和缺乏蛋白质的培养基，并解剖肠道。通过实时qPCR研究了每种条件下的11种肠激素的mRNA表达水平。用于实时qPCR的引物列于下表1中。
[表1]
结果，在营养缺乏条件下，表1中的11种肠激素中的CNMa的表达水平在个体中增加。由此，能够确认蛋白质缺乏诱导CNMa激素(参见图2A)。此外，作为向果蝇提供具有相同热量值但不同蛋白质(酵母)含量的培养基、并测定每种培养基条件下的果蝇肠道中的CNMamRNA的表达水平的结果，确认了随着培养基中的蛋白质含量增加，CNMa激素的mRNA表达增加(参见图2B)。为了在体内研究CNMa激素的表达水平，制备了Gal4系(CNMa-Gal4)果蝇，其表达受到CNMa启动子调控。具体地，在Mimic插入至CNMa基因的第一内含子的CNMa[MI10321](BDSC#54529)果蝇中，使用重组酶介导的盒式交换(RMCE)系统用gal4替代Mimic来产生CNMa-gal4。作为通过GFP来研究所制备的果蝇系中的CNMa的表达的结果，能够确认当实际果蝇肠道中的由果蝇摄取的蛋白质的量少时，CNMa激素的表达显著增加；另一方面，当摄取高蛋白质饮食时，CNMa激素的表达急剧下降(参见图2C和2D)。特别地，确认了CNMa的表达在果蝇肠道的R2区中的肠上皮细胞(enterocytes)中特异性增加(参见图2C和2D)。此外，为了研究内源性CNMa的表达，制备了CNMa特异性抗体并进行免疫组织化学。结果，确认了CNMa激素的表达发生于果蝇肠道的R2区中的肠上皮细胞中，类似于CNMa-Gal4系的表达(参见图3)。通过上述实验结果，确认了可以通过个体中的CNMa激素的表达水平来鉴定体内必需氨基酸的缺乏。
为了确定特定类型的必需氨基酸的缺乏是否会诱导CNMa基因的表达，向果蝇提供了单独缺乏精氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸的培养基。结果，确认了仅通过任何单一的必需氨基酸的缺乏而不是特定的必需氨基酸的缺乏，诱导了CNMa激素在肠上皮细胞中的表达(参见图4A)。类似地，确认了仅单一的必需氨基酸的缺乏诱导了果蝇中的L-EAA偏好指数的增加(参见图4B)。这阐明了单独的单一的必需氨基酸的缺乏表明了果蝇营养不良。
2.确定肠道微生物对个体的影响
进行以下实验以确定肠道微生物对个体中的营养满足的影响。
通过收集常规饲养蝇(conventionally reared fly)(CV)产下的卵，在3％NaClO溶液和70％乙醇溶液中交替漂洗以去除卵中含有的细菌，并在无菌培养基中诱导蝇的发育来制备无菌果蝇。确认了所制备的无菌蝇(germ-free fly)(GF)在缺乏蛋白质的培养基和含有蛋白质的培养基中显示出对L-EAA的偏好。结果，即使在富有蛋白质的条件下，与常规饲养蝇(CV)相比，无菌果蝇显示出增加的基础L-EAA偏好，并且偏好指数随着时间的推移而增加。即，确认了无菌果蝇总是感觉营养缺乏(参见图5A)。在无菌果蝇的情况中，发现肠道细菌在抵消L-EAA缺乏方面发挥重要作用，因为即使在没有蛋白质缺乏的情况下，无菌果蝇也显示出偏好必需氨基酸的取食行为。
此外，在向常规饲养蝇和无菌果蝇提供具有10％酵母浓度的食物后，研究了肠道中的CNMa的表达水平。结果，确认了即使摄取具有相同蛋白质含量的培养基，CNMa激素的表达在无菌果蝇中增加。在向培养基额外地添加酵母时(酵母15％)，确认了增加的CNMa表达降低(参见图5B)。还确认了即使摄取具有相同蛋白质含量的培养基，与常规饲养蝇相比，无菌果蝇的L-EAA偏好指数增加。此外，在向培养基额外地添加酵母时(酵母15％)，无菌果蝇中的L-EAA偏好指数降低(参见图5C)。通过上述结果，确认了肠道微生物抵消L-EAA缺乏并且影响果蝇中的CNMa激素的表达以及满足L-EAA营养的行为。
3.根据所引入的肠道微生物的类型的营养满足效果的确认
将作为肠道微生物最具代表性的实例的果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)(Science,2008年2月8日；319(5864):777-82.doi:10.1126/science.1149357.Epub 2008年1月24日；Appl Environ Microbiol.2008年10月；74(20):6171-6177.2008年8月22日在线出版.doi:10.1128/AEM.00301-08)和植物乳杆菌(L.plantarum WJL)(KCTC14442BP)分别引入至无菌果蝇，从而产生单一相关(mono-association)果蝇。然后，确认每个个体的肠道中的CNMa激素的表达。结果，确认了引入果实醋杆菌的果蝇具有低CNMa激素的表达水平，但引入植物乳杆菌WJL的果蝇具有与无菌果蝇相同的CNMa激素的表达水平(参见图6A)。本公开中描述的植物乳杆菌WJL可通过已知的制造方法来制备(Eun-Kyoung Kim等,GenomeAnnouncements,11月/12月2013,Vol.1,no.6e00937-13,GenBank AUTE00000000，植物乳杆菌WJL，全基因组鸟枪法测序计划)。植物乳杆菌WJL可分离自果蝇。
此外，作为研究每个个体中的L-EAA营养满足行为指数的结果，确认了只有引入果实醋杆菌的果蝇降低了L-EAA营养满足行为指数(参见图6B)。此外，当单独引入植物乳杆菌WJL时，偏好指数高于无菌果蝇的偏好指数，这意味着植物乳杆菌WJL可使宿主动物的肠道中的必需氨基酸的缺乏恶化。这对应于CNMa激素的表达模式。
根据引入作为肠道微生物的植物乳杆菌的个体中的CNMa激素的高表达水平和高L-EAA偏好指数的结果，研究者们发现，即使向营养缺乏型个体添加单独的植物乳杆菌，也没有出现期望的营养满足效果。因此，为了确定引入果实醋杆菌的果蝇和引入植物乳杆菌WJL的果蝇之间不同的CNMa表达水平和L-EAA偏好指数的原因，对乳杆菌和类似的乳酸菌的基因进行了分析。
4.肠道微生物的遗传分析和根据肠道微生物的遗传特征的效果的差异
4-1.醋杆菌科和乳杆菌科的遗传分析
通过比较基因组分析，将醋杆菌科和乳杆菌科的氨基酸生物合成相关基因进行比较。作为分析结果，确认了与支链氨基酸(BCAA)生物合成相关的所有酶存在于醋杆菌科，而乳杆菌科缺少与BCAA生物合成相关的酶(参见图6C)。通过使用能够生物合成所有氨基酸的果实醋杆菌DM001株的基因组作为模板，随着基因的核苷酸序列相似性增加，由蓝色表示，当相似性小于20％时，由红色表示。
4-2.乳酸菌的各个种中与BCAA合成相关的基因缺失的确认
进行以下实验以确定在除了植物乳杆菌以外的各种乳酸菌中是否缺少BCAA合成相关基因。
对于作为通常且广泛用于食品或乳酸菌产品的乳酸菌(食品告示菌株(foodnotification strains))的乳杆菌株的11个种，植物乳杆菌(KCTC14442BP)、嗜酸乳杆菌(ATCC 4796)、干酪乳杆菌(ATCC 393)、加氏乳杆菌(ATCC33323)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(ATCC 11842)、瑞士乳杆菌(ATCC 15009)、发酵乳杆菌(ATCC 14931)、副干酪乳杆菌(ATCC334)、罗伊氏乳杆菌(JCM 1112)、鼠李糖乳杆菌(DSMATCC 8530)、鼠李糖乳杆菌(DSMATCC8530)，通过比较基因组分析鉴定了与氨基酸生物合成相关的酶。在这方面，能够生物合成所有氨基酸的果实醋杆菌株的基因组用作模板用于进行比较(图7)。作为比较基因组分析的结果，确认了所有11种乳杆菌菌株缺少与BCAA生物合成相关的leuA、leuB、leuC、leuD、ilvA、ilvC、ilvD或ilvE基因(参见图7)。
通过这些结果发现，由于在植物乳杆菌情况下的遗传特征，即使将其引入至个体中，也不表现营养满足效果。
4-3.取决于所引入的肠道微生物的遗传特征，对个体的营养满足效果可不同的证明
为了阐明诱导宿主中的L-EAA缺乏(CNMa激素表达)可由肠道微生物的遗传特征诱导，如下制备了其中使用于BCAA合成的基因突变的醋杆菌(Acetobacteraceae)，并确认了宿主中的L-EAA的肠缺乏。如下产生醋杆菌的特定基因突变株：通过PCR扩增要删除的基因的两个区域，将其插入至pK18mobGII载体，然后以三亲交配方式(triparental matingmanner)将克隆的载体和辅助菌株(helper strain)(大肠杆菌(Escherichia coli)HB101)一起引入野生型醋杆菌。
具体地，制备了不可生物合成BCAA中的亮氨酸的突变醋杆菌(AcetoΔleuB)。其中将对照醋杆菌引入至无菌果蝇的果蝇(+AcetoWT)显示出几乎没有CNMa激素表达。另一方面，在引入AcetoΔleuB的果蝇(+AcetoΔleuB)中，CNMa激素表达提高至无菌果蝇的水平。
此外，制备了不可生物合成作为非必需氨基酸之一的脯氨酸的proC突变醋杆菌(AcetoΔproC)。与将AcetoΔleuB引入至无菌果蝇的情况不同，引入AcetoΔproC菌株的果蝇(+AcetoΔproC)不增加CNMa激素的表达(参见图8A的左侧)。
另一方面，在通过将亮氨酸添加至引入AcetoΔleuB的果蝇的培养基而获得的果蝇(+AcetoΔleuB+亮氨酸)中、或者在引入AcetoΔleuB_leuB菌株的果蝇(+AcetoΔleuB_leuB)中，所述AcetoΔleuB_leuB菌株是通过将leuB基因再引入至AcetoΔleuB细菌而获得的，CNMa激素的表达降低(参见图8A的右侧)。与CNMa激素的表达模式类似的，确认了与将AcetoWT引入至无菌果蝇的情况相比，在引入AcetoΔleuB时，宿主无菌果蝇的满足L-EAA营养的行为增加(参见图8B)。在向培养基添加亮氨酸(+AcetoΔleuB+亮氨酸)时、或者在将基因再引入缺乏leuB的细菌引入至果蝇(+AcetoΔleuB_leuB)时，引入AcetoΔleuB的果蝇满足L-EAA营养的行为减少(参见图6B)。这意味着醋杆菌的亮氨酸生物合成能力在肠上皮细胞中的CNMa激素的表达和宿主果蝇中的L-EAA取食行为中起到重要作用。
类似地，制备了不可生物合成BCAA中的异亮氨酸的AcetoΔilvA突变株并进行上与上述相同的实验(参见图9)。作为无菌果蝇(+无)、引入醋杆菌的对照果蝇(+AcetoWT)和引入不可生物合成异亮氨酸的AcetoΔilvA的果蝇(+AcetoΔilvA)的CNMa激素表达水平以及宿主的L-EAA营养满足行为指数的比较结果，引入AcetoΔilvA的果蝇(+AcetoΔilvA)表现出与无菌果蝇(+无)类似的CNMa表达水平和L-EAA营养满足行为(参见图9A)。此外，在向引入AcetoΔilvA的果蝇的培养基添加异亮氨酸(+AcetoΔleuB+Ile)时，确认了CNMa表达水平和L-EAA营养满足行为恢复至引入AcetoWT的果蝇的水平(参见图9B)。
此外，通过将与BCAA生物合成相关的7种酶引入至缺少与BCAA生物合成相关的酶的乳杆菌来制备能够BCAA生物合成的功能获得型(gain of function)突变株。具体地，使用棒状乳杆菌亚种(Lactobacillus coryniformis subsp)的基因组、通过扩增用于BCAA合成的7种基因如leuA、leuB、leuC、leuD、ilvA、ilvC和ilvD来获得具有遗传获得型BCAA生物合成能力的Lacto BCAA菌株。Torquens DMS20004株的基因组作为模板被扩增，然后将其插入至PGID023A/B载体，接着通过电穿孔将该克隆的载体引入至LactoWT菌株，然后通过同源重组将其插入至特定基因区域。
对于无菌果蝇(+无)、引入对照乳杆菌的果蝇(+LactoWT)和引入具有遗传获得型BCAA生物合成能力的突变乳杆菌(LactoBCAA)的果蝇(+LactoBCAA)，观察了CNMa激素表达水平和L-EAA营养满足行为。作为结果，确认了与引入LactoWT的果蝇相比，引入LactoBCAA的果蝇具有减少的CNMa激素表达和L-EAA营养满足行为指数(参见图10A)。此外，在将BCAA(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)添加至引入LactoWT的果蝇的培养基，确认了CNMa表达和L-EAA营养满足行为指数减少至引入LactoBCAA的果蝇的水平(参见图10B)。
通过上述结果，确认了在宿主动物营养缺乏的情况下，宿主中的L-EAA缺乏是否被抵消，取决于肠道微生物的遗传特征。特别地，在作为代表性乳酸菌的乳杆菌的情况中，难以合成BCAA，使得没有抵消宿主肠道中的L-EAA缺乏，从而显示出导致满足宿主营养的取食偏好。此外，确认了如果补充BCAA，由乳酸菌引起的宿主的激素变化和行为变化(偏好指数)消失。
5.乳酸菌和BCAA组合在营养缺乏型个体中的生长促进和肠损伤改善效果
通过上述实验结果，即使营养缺乏型个体摄取乳酸菌，也难以补充营养。此外，表明了如果摄取乳酸菌时不能在乳酸菌中良好合成的BCAA被联合摄入，个体的营养需求将被满足。基于这些结果，认为BCAA与乳酸菌一起进行处理可以增强单独的乳酸菌的效果。因此，对于果蝇动物模型和小鼠动物模型，研究了在营养缺乏条件下，通过将BCAA和乳酸菌一起补充，乳酸菌是否可以增强宿主(要引入乳酸菌的个体)的生理活性功效。
5-1.乳酸菌和BCAA的组合处理对营养缺乏型个体的生长促进效果的确认
5-1-1.乳酸菌与包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的三种BCAA的组合效果
对于无菌果蝇模型，通过在缺乏蛋白质的培养基(1％酵母，10％蔗糖，玉米粉培养基)中，向无菌果蝇分别或一起添加乳杆菌和BCAA(包括所有的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，观察生长变化。具体地，对于向无菌果蝇EGG添加BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的组(+BCAA)；仅引入植物乳杆菌WJL的组(+WJL)；和其中将植物乳杆菌WJL细菌和BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)一起引入的组(+WJL+BCAA)，以12小时的间隔观察蛹形成。然后，测量发育所需的平均时间(在下文中称为平均发育期)。
结果，BCAA(单独添加亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)组具有与对照组(+无)类似的平均发育期。这意味着单独补充营养不能弥补营养缺乏情况下的生长不足。仅引入乳酸菌的组具有比对照组和单独添加BCAA的组更短的平均时间。然而，确认了将乳酸菌和BCAA一起引入的组显示出生长促进功效的统计学显著的增加(参见图11，***(p<0.001)，**(P<0.01)，*(P<0.05)，ns：不统计学显著)。
5-1-2.乳酸菌与亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的至少两种BCAA的组合效果
此外，进行以下实验以研究在营养缺乏型个体中，如果单独的亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸与乳酸菌组合使用、或者其它氨基酸与乳酸菌组合使用，是否会出现生长促进功效。除了用不同类型的氨基酸进行处理以外，进行与上述5-5-1的实验方法相同的过程以观察营养缺陷型果蝇个体的生长变化。
结果，与5-5-1类似的，仅氨基酸进行处理而乳酸菌未进行处理的组(无+3BCAA(＝BCAA)；无+亮氨酸；无+异亮氨酸；无+缬氨酸；无+组氨酸；无+亮氨酸+缬氨酸；无+亮氨酸+异亮氨酸；无+异亮氨酸+缬氨酸)具有与未处理组(无+无)类似的平均发育期(图12A和12B的左侧)。
另一方面，与用单独的乳酸菌或氨基酸进行处理的组相比，用乳酸菌和亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的至少两种或更多种一起进行处理的组(WJL+BCAA；WJL+亮氨酸+缬氨酸；WJL+亮氨酸+异亮氨酸；WJL+异亮氨酸+缬氨酸)显示出统计学上更短的平均发育期(图12B的右侧)。此外，与用单独的乳酸菌进行处理的组相比，用单独的亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸与乳酸菌一起进行处理的组(WJL+亮氨酸；WJL+异亮氨酸；WJL+缬氨酸)不显示出平均发育期的统计学显著的差异(图12A的右侧)。
通过上述结果，确认了本发明不是简单地组合使用氨基酸用于营养补充，而是两种或更多种类型的BCAA氨基酸作用于乳酸菌，并由此可以起到增强乳酸菌在个体中的活性的作用。
5-1-3.BCAA和各种乳酸菌的组合效果
确认了在营养缺乏型个体中，除了植物乳杆菌菌株以外的其它乳酸菌物种也可以由BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)增强生长促进功效。
除了使用通过基因组比较已被确认为缺少BCAA生物合成的属于乳杆菌组的11种食品告示菌株(3种植物乳杆菌(WJL、Nizo和Nc8)；2种副干酪乳杆菌(KCTC5058和IH30-12)；3种鼠李糖乳杆菌(KCTC3237、GG和IH37-25)；2种发酵乳杆菌(KCTC5467和IH37-57)；3种干酪乳杆菌(IH37-55、IH37-56和IH37-9)；1种嗜酸乳杆菌(KCTC3594)；1种加氏乳杆菌(KCTC3143)；2种保加利亚乳杆菌(IH37-37和IH37-19)；1种罗伊氏乳杆菌(KCTC3594)；2种瑞士乳杆菌(KCTC3545和KCTC15060)；2种唾液乳杆菌(KCTC3157和IH37-38))以外，进行与上述5-5-1的实验方法相同的过程。
结果，确认了通过乳酸菌与BCAA的组合处理，除了植物乳杆菌以外的其它乳酸菌物种也显示出生长促进功效的显著提高(参见图13和14)。
5-2.在将乳酸菌和BCAA组合并处理营养缺乏型个体时的生长促进效果和肠损伤改善效果的确认
基于在营养缺乏型个体中可能发生生长抑制或者肠损伤的事实，研究了在用乳酸菌和BCAA的组合进行处理时，小鼠模型中是否会出现促进生长和抑制肠损伤的效果。
具体地，用不充分的营养物喂养完全断奶后的三周龄小鼠动物模型，然后鉴定在单独地或组合地用乳酸菌和BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)进行处理后，是否存在生长和肠损伤改善：对照(无)；植物乳杆菌WJL单独处理组(+WJL)；和植物乳杆菌WJL和BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)组合处理组(+WJL+BCAA)。每组设定4只至5只小鼠，每日供给食物，每两日追踪例如体重等指数。在12周的观察后，解剖小鼠以监测肠漏(FITC)、骨生长程度、骨矿物质密度、和其它器官的其他疾病指数。为了测量肠漏，使用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-葡聚糖，sigma#FD4)等荧光物质，将相同量的FITC-葡聚糖喂给每只小鼠，4小时后测量血液中的FITC荧光。为了测量小鼠的骨密度，解剖小鼠的股骨并取样，然后将其转移并保存在4℃下、在70％乙醇溶液中。为了使用Micro-CT设备(SkyScan 1276,Bruker)，在成像前48小时，将骨从70％乙醇溶液转移至三重蒸馏水(tertiary distilled water)，然后保存在4℃下。使用SkyScan 1276程序获得骨图像。在拍摄时，将体素大小(voxel size)固定在32μm，并且在70kV和57μA的条件下获得图片。NRecon程序用于3D重建捕捉的图像，CTAn程序用于使用3D重建图像测量骨矿物质密度(BMD)、骨长度和皮质骨厚度。对于BMD测量，分别使用密度为0.25g/cm3和0.75g/cm3的两种骨密度体模(phantoms)以计算BMD比例方程，然后指定并测量股骨的中骨干部分。通过拖动并指定整个股骨，根据程序中固有的计算方法测量实际骨长度。在股骨的中骨干部分的中段测量皮质骨厚度。
结果，在用乳酸菌和BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)二者处理的小鼠组中，观察到统计学显著的体重增加效果和肠漏抑制效果(参见图15)。此外，在将乳酸菌和BCAA(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)一起引入的情况中，与单独用上述化合物的每一种进行处理的情况相比，骨密度统计学地且显著地增加(参见图16)。另一方面，如图16中所示，即使单独用乳酸菌进行处理，可以看到骨密度增加，因此，乳酸菌自身具有生长促进效果。然而，证实了BCAA显著增加这些乳酸菌的生长促进效果。
通过上述实验，与用单独的乳酸菌或BCAA、特别是用单独的乳酸菌进行处理时相比，用亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的至少两种或更多种与乳酸菌组合进行处理促进了营养缺乏型个体的生长。此外，也确认改善了疾病相关指数。
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PCT/RO/134表

Claims (10)

1.一种用于增强乳酸菌的功效的组合物，其包含选自由亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸组成的组的至少两种支链氨基酸(BCAA)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳酸菌的功效是促进个体生长或抑制肠损伤。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳酸菌的功效是增加营养缺乏型个体的体重或骨密度中的至少一者、或者抑制营养缺乏型个体的肠漏。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述乳酸菌是选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属和双歧杆菌属组成的组的至少一种。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述乳杆菌属是选自由以下组成的组的至少一种：植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；发酵乳杆菌；干酪乳杆菌；嗜酸乳杆菌；加氏乳杆菌；德氏乳杆菌保加利亚亚种；罗伊氏乳杆菌；瑞士乳杆菌；和唾液乳杆菌。
7.一种用于促进生长或抑制肠损伤的药物组合物，其包含：根据权利要求1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述乳酸菌是选自由以下组成的组的至少一种：植物乳杆菌；副干酪乳杆菌；鼠李糖乳杆菌；发酵乳杆菌；干酪乳杆菌；嗜酸乳杆菌；加氏乳杆菌；德氏乳杆菌保加利亚亚种；罗伊氏乳杆菌；瑞士乳杆菌；和唾液乳杆菌。
9.一种用于预防或治疗选自由以下组成的组的至少一种疾病的药物组合物：生长障碍、低生长症、骨质疏松症、骨软化症、骨质减少、环境性肠病和肠漏综合征，所述药物组合物包含：根据权利要求1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
10.一种用于促进生长或抑制肠损伤的食品组合物，其包含：根据权利要求1至6中任一项所述的组合物；和乳酸菌。
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