FR3093923A1 - Nouvelles souches de bacteries lactiques favorisant l’absorption du calcium – peptides et produits associes - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43. Ce mélange peut être utilisé en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Description
La présente invention concerne de nouvelles souches de bactéries lactiques ainsi que des peptides isolés et des mélanges de peptides issus de la β-caséine et produits par ces souches. Ces peptides sont actifs, soit en tant qu’inhibiteurs de l’ACE, soit comme agent favorisant l’absorption du calcium.
La présente concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique ainsi que des produits associés.
Le document WO 2007/096498 A1 décrit une nouvelle souche de bactérie lactique, plus précisément deLactobacillus h elveticuscapable de produire par fermentation du lait deux tripeptides ayant des propriétés d’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE). Ces deux peptides de séquences IPP et VPP sont connus pour inhiber l’ACE et permettent donc de réduire la pression sanguine et de lutter ainsi contre l’hypertension et les pathologies qui en découlent.
D’autre part, la publication intitulée « Bioactive peptide : production and functionality » de H. Korhonen et al et publiée dans International Dairy Journal vol 16, page 945 à 960 en 2006 passe en revue les peptides obtenus par hydrolyse des protéines laitières par des bactéries lactiques, et possédant une activité biologique ; cette publication décrit plusieurs peptides différents des peptides IPP et VPP, mais également connus en tant qu’inhibiteurs de l’ACE.
Par ailleurs, il est connu qu’outre son rôle dans la régulation de la pression sanguine, l’ACE est également impliquée dans les mécanismes de résorption/formation osseuse. En effet, l’article intitulé « Inhibition of angiotensin-converting enzyme exerts beneficial effects on trabecular bone in orchidectimozed mice » de X-F Chen, publié dans la revue Pharmacological reports 70, page 705-711 en 2018, indique qu’un inhibiteur de l’ACE, à savoir le captopril présente une activité de préservation osseuse.
S’agissant de l’absorption du calcium, la publication précitée de H. Korhonen cite des caseino-phospho-peptides connus pour améliorer l’absorption du calcium et du zinc. Elle cite notamment le produit de marque Capolac® qui contient un caseino-phospho-peptide (CPP) connu pour améliorer l’absorption des minéraux. S’agissant du mécanisme d’action, il semble que ces phospho-peptides sont connus pour se lier au calcium, le rendant ainsi biodisponible.
Le document JP H0641191A décrit une souche deLactobacillus h elveticusqui produit des peptides, lesquels augmentent la solubilité du calcium. En revanche, ce document ne décrit aucune activité biologique des peptides pour l’absorption du calcium sur cultures cellulaires intestinales.
Par ailleurs, la publication « Recent advances in microbial fermentation for dairy and health » de D. Hill et al, publiée le 26 mai 2017 dans la revue in F 1000 Research fait également état de bactéries capables de produire par protéolyse des peptides bioactifs en tant qu’inhibiteur d’ACE. Elle indique de plus qu’un fructo-oligosaccharide peut être utilisé à titre préventif contre l’ostéoporose. Le mécanisme d’action de ce fructo-oligosaccharide est le suivant : dans le ventre du sujet, le fructo-oligosaccharide génère par fermentation des petites molécules d’acide, lesquelles diminuent le pHin vivoet entraînent la dissolution de phosphates de calcium qui seraient ainsi biodisponibles.
Une absorption insuffisante du calcium (hypocalcémie) peut conduire à différents symptômes ou pathologies telles que l’ostéoporose, l’hypertension artérielle ou le syndrome métabolique. En effet, le calcium est impliqué quel que soit l’âge du patient, dans la formation des os, la solidification du squelette, la rigidité des dents, la contraction musculaire et donc la contraction cardiaque, la transmission de l’influx nerveux au niveau des synapses, l’apprentissage et la mémorisation, la sécrétion salivaire, la croissance et la prolifération cellulaire. Le calcium permet d’activer de nombreuses enzymes, de libérer plusieurs hormones, de coaguler le sang et participe à l’équilibre du poids corporel. L’hypocalcémie est également liée à diverses pathologies rares telles que les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels et plus généralement les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium.
A ce jour, l’ostéoporose n’est pas traitée de manière efficace. Ainsi, les bisphophonates qui sont le traitement le plus utilisé, s’avèrent peu efficaces dans le cas de patientes qui présentent un faible risque de fracture. La prévention à travers la pratique régulière d’une activité physique, une alimentation équilibrée et la limitation du tabac et de l’alcool s’avère être plus efficace.
Un but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique résistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible d’agir dans l’intestin en acidifiant le milieu, rendant ainsi le calcium soluble, afin de faciliter son absorption et son passage à travers la paroi intestinale.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique résistante à la digestion gastro-intestinale et susceptible de stimuler l’absorption du calcium par les cellules intestinales, en agissant directement ou indirectement sur celles-ci.
Un autre but de la présente invention est de fournir une souche de bactérie lactique qui a une croissance plus importante que certaines bactéries lactiques connues et/ou qui permet une acidification plus importante du milieu de fermentation, notamment du lait.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides phosphorylés susceptibles de favoriser l’absorption du calcium au niveau intestinal.
Un autre but de la présente invention est de proposer une souche de bactérie lactique susceptible de produire de nouveaux peptides ayant une activité inhibitrice de l’ACE.
Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l’ACE et/ou favorise l’absorption intestinale du calcium et qui de préférence, soit non toxique pour les cellules intestinales.
Un autre but de la présente invention est de proposer au moins un peptide, voire un mélange de peptides qui présente une activité inhibitrice de l’ACE qui soit supérieure à l’activité des peptides IPP et VPP.
Un autre but de la présente invention est de proposer une composition pharmaceutique ou alimentaire apte à traiter l’hypocalcémie et donc les pathologies qui en découlent.
Premier aspect
Selon un premier aspect, l’invention concerne une souche deLactobacillus helveticusprésentant les gènesprtH2etprtH3et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C. En réduisant le pH, la souche permet la dissolution des composés contenant du calcium, rendant ce dernier absorbable par la paroi intestinale.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également la souche deLactobacillus helveticusVF45A déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5300, ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF45A et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C.
Selon ce premier aspect, l’invention concerne également les souches précitées en référence au premier aspect pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament pour le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment de vache par au moins une souche selon le premier aspect de l’invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 43, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 1 à SEQ ID NO 19 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium. La Demanderesse a en effet mis en évidence soit l’activité inhibitrice de l’ACE des peptides précités– laquelle activité est également liée à la bonne santé osseuse- soit l’activité d’amélioration de l’absorption du calcium à travers la paroi intestinale due à certains des peptides précités. Ainsi, les peptides de l’invention agissent sur la santé osseuse via l’absorption du calcium à travers la paroi intestinale, et/ou via l’inhibition de l’ACE.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, les mélanges comprenant ou constitués desdits peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les mélanges comprenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et d’au moins un peptide choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43, de préférence les mélanges contenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et des peptides de séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 20 à SEQ ID 43.
Ces mélanges s’avèrent être actifs sur l’inhibition de l’ACE et/ou pour l’amélioration de l’absorption intestinale du calcium.
La présente invention concerne également les peptides isolés précités et les mélanges précités pour leur utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif au moins un peptide choisi parmi les peptides isolés précités en référence au premier aspect et/ou un mélange de peptides tel que précité en référence au premier aspect et/ou une souche selon le premier aspect de l’invention et notamment la souche VF45A.
Avantageusement, selon un premier mode de réalisation du premier aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique comprend, au moins ou seulement en tant que peptides actifs, les 5 peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5. Ces peptides sont les plus actifs entant qu’inhibiteurs de l’ACE. Ils sont plus actifs que les tripeptides VPP et IPP de l’art antérieur.
Selon ce premier aspect et selon un second mode de réalisation, la composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention contient en tant qu’ingrédient actif ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le premier aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement, et/ou au moins partiellement écrémés, en particulier le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de yak pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits d’origine animale et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
Le fermentat tel que précité obtenu par fermentation anaérobie et ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le premier aspect de l’invention, y compris le fermentat ultrafiltré obtenu à partir du lait de yak.
S’agissant du fermentat obtenu à partir du lait de vache, il est avantageusement obtenu selon les conditions de température et de durée indiquées dans la partie relative aux résultats expérimentaux.
Dans toute la présente demande, le substrat protéique d’origine végétale peut être choisi parmi les laits végétaux tels que le lait d’avoine, le lait d’amande, le lait de riz, le lait de soja, le lait d’épeautre, le lait de noisette et les mélanges de ces laits. Quel que soit le lait, il peut être stérilisé thermiquement avant fermentation par la bactérie selon l’invention.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit fermentat est obtenu par fermentation de la souche précitée en référence au premier aspect, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé et/ou stérilisé thermiquement, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement également soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa à l’issue de la fermentation. Le fermentat ultrafiltré ou non s’avère actif pour l’inhibition de l’ACE et/ou pour l’absorption du calcium.
Dans tous les aspects de l’invention, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient en tant qu’ingrédient actif, le ou les peptides et/ou la souche. Elle peut également comprendre, avantageusement également du calcium et/ou de la vitamine D.
Dans tous les aspects de l’invention, le fait d’effectuer une ultrafiltration sur le fermentat permet de séparer les peptides produits par la souche des protéines. Le fermentat ultrafiltré ne contient donc plus de protéines. Lorsque le fermentat ultrafiltré est soumis à une digestion gastro-intestinale, il n’y a pas génération d’autres peptides, du fait de l’absence de protéines. Le filtrat obtenu par ultrafiltration du fermentat s’avère plus actif lorsqu’il est ingéré et digéré du fait de l’absence d’interférences par les peptides issus de la digestion des protéines.
Selon un mode de réalisation particulier de la composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention, elle contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la soucheLactobacillus helveticusVF45A égale ou supérieure à 107CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, supérieure ou égale à 18 mg par gramme. De préférence, les peptides sont les peptides contenus dans le fermentat précité en référence au premier aspect et notamment les peptides des séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID N° 43.
Selon ce premier aspect, la présente invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, en particulier de vache, de chèvre, de brebis et à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits. Selon le premier aspect de l’invention, ce produit contient au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect de l’invention.
Selon ce premier aspect, l’invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane, lequel de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le premier aspect et/ou au moins un peptide selon le premier aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le premier aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le premier aspect.
Quel que soit l’aspect de l’invention, la composition alimentaire/pharmaceutique ou le complément alimentaire peut être sous la forme d’une poudre, d’une solution notamment aqueuse, d’un comprimé, d’une gélule contenant la souche sous forme lyophilisée et/ou le peptide ou le mélange de peptides sous forme de poudre ou de solution. La gélule peut comporter une coque externe apte à résister à la digestion gastro-intestinale de manière à délivrer son contenu dans l’intestin du patient. La souche peut également être, par exemple, microencapsulée par un enrobage lipidique et se présenter sous la forme d’une poudre ingérable.
Dans le cas d’un complément alimentaire selon le premier aspect, le comprimé, la gélule ou tout autre forme unitaire de dosage journalier contient de préférence, au moins 0,6 g de peptides actifs et/ou 107CFU de souche selon le premier aspect, éventuellement en mélange.
La composition pharmaceutique peut être de préférence adaptée à une administration par voie orale.
Dans toute la demande, le produit laitier n’est pas limité selon l’invention. Il peut s’agir d’une boisson lactée, d’un lait fermenté, de kéfir, d’un yaourt, d’un produit à base de lait coagulé par ajout d’acide ou d’un fromage frais ou à pâte levée, par exemple.
Deuxième aspect
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne une souche deLactobacillus helveticusprésentant le gèneprtH1et capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40 % et résistante à l’acidité et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne la souche deLactobacillus helveticusVFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VFH049 et capable de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86 et/ou capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capables d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales.
Cette souche s’est avérée capable de former des acides qui sont susceptibles de rendre soluble le calcium dans l’intestin d’un hôte/patient. Elle est également capable de produire, par protéolyse de la β-caséine, des peptides actifs en tant qu’inhibiteur de l’ACE ou permettant une meilleure absorption intestinale du calcium. La souche elle-même résiste à la digestion et permet lorsqu’elle est en contact avec les cellules intestinales une meilleure absorption du calcium par ces dernières.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également les souches citées en référence au deuxième aspect et notamment la souche VFH049 ou ses mutants ou variants pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également un peptide isolé pouvant être obtenu par fermentation du lait, notamment du lait de vache, par au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 86, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 44 à SEQ ID NO 74 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 75 à SEQ ID NO 86 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges de peptides contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID 44 à SEQ ID 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58, les mélanges constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86, les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86. Les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 sont les plus actifs en tant qu’inhibiteur de l’ACE.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé du deuxième aspect ou le mélange selon le deuxième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin.
Selon ce deuxième aspect, la présente invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un peptide correspondant aux peptides isolés selon le deuxième aspect de l’invention, et/ou un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention, et/ou une souche selon le deuxième aspect de l’invention, en particulier la souche VFH049. De préférence, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient un mélange contenant tous les peptides de séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 ou un mélange contenant au moins ou seulement les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 58 et éventuellement les peptides de séquence SEQ ID NO 75 à SEQ ID NO 86.
Selon ce deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le deuxième aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque dont l’amande, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits d’origine animale éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis à l’exception du lait de jument pour le fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale.
Selon un mode de réalisation particulier du deuxième aspect de l’invention, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient ou est constituée du fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche VFH049 ou d’une souche telle que précitée, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa. Ce fermentat contient tous les peptides du deuxième aspect de l’invention ; il est donc actif pour favoriser la santé osseuse, à la fois en tant qu’inhibiteur de l’ACE et en tant qu’agent favorisant l’absorption intestinale du calcium.
Quel que soit le mode de réalisation, le fermentat lui-même, ultrafiltré ou non peut être considéré comme une composition pharmaceutique ou alimentaire.
Selon ce deuxième aspect, la composition alimentaire ou pharmaceutique précitée contient, de préférence une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une desdites souches, notamment la soucheLactobacillus helveticusVFH049 égale ou supérieure à 107CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86, supérieure ou égale à 6 mg par gramme.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, à l’exception du lait de jument, en particulier à partir de lait de vache, de chèvre, de brebis ou d’un mélange de laits, qui contient au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l’invention.
Selon ce deuxième aspect, l’invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane qui de manière caractéristique comprend au moins une souche selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le deuxième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le deuxième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le deuxième aspect de l’invention.
A titre d’exemple, selon le deuxième aspect de l’invention, la composition pharmaceutique ou alimentaire se présente sous la forme d’un liquide, notamment du fermentat de lait de vache précité. Un volume de 30 mL de cette solution contenant 0,2 g du mélange de peptides de l’invention est administré quotidiennement, par voie orale.
Troisième aspect
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne une souche deLactobacillus delbrueckii ssp . b ulgaricusprésentant le gèneprtBet capable de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d’au moins 35% et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium. Une telle souche s’est avérée être active dans l’intestin et résistante à la digestion gastro-intestinale. Elle est capable d’augmenter le passage du calcium à travers la paroi intestinale. Les acides qu’elle produit permettent également de solubiliser le calcium.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne la souche deLactobacillus delbrueckii ssp . b ulgaricusVF50b déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5316 et ses mutants et variants présentant au moins 80% d’identité, de préférence au moins 90% d’identité, de préférence au moins 95% d’identité avec le génome de ladite souche VF50b et capables de produire au moins un peptide correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et/ou capable d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Le troisième aspect concerne également chacune des souches les telles que précitées pour son utilisation en tant que médicament, et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne un peptide isolé choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199, les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 161 et capables d’inhiber l’ACE et les peptides présentant au moins 80% d’identité, notamment au moins 90% d’identité, en particulier au moins 95% d’identité avec lesdits peptides correspondant aux séquences SEQ ID 162 à SEQ ID NO 199 et capables d’augmenter l’absorption intestinale du calcium.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne également un mélange de peptides choisi parmi les mélanges contenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID 199, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 112, les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 87 à SEQ ID 112 et d’au moins un des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199 et les mélanges contenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID NO 162 à SEQ ID NO 199.
Selon le troisième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé cité en référence au troisième aspect ou un mélange précité en référence au troisième aspect pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement dans le traitement de l’hypocalcémie ou d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou pour le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère, en particulier un humain ayant un tel besoin.
Selon ce troisième aspect, l’invention concerne également une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un peptide isolé selon le troisième aspect de l’invention et/ou un mélange de peptides selon le troisième aspect.
De préférence, la composition contient un mélange contenant au moins ou seulement en tant que peptides, les peptides correspondant aux séquences SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 161, ou un mélange contenant de préférence tous les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 87 à SEQ ID NO 199 et/ou une souche selon le troisième aspect.
Selon un mode de réalisation préféré de la composition pharmaceutique ou alimentaire selon le troisième aspect de l’invention, elle comprend ou est constituée par le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de vache éventuellement écrémé au moyen d’une souche selon le troisième aspect de l’invention, ledit fermentat ayant éventuellement subi une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa ou elle contient ou est constitué du fermentat obtenu par fermentation anaérobie et éventuellement après une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa d’un substrat protéique choisi parmi les substrats protéiques d’origine végétale provenant d’au moins une céréale et/ou d’au moins un pois et/ou d’au moins un champignon et/ou d’au moins un fruit à coque, les mélanges d’au moins deux substrats protéiques d’origine végétale, les laits éventuellement stérilisés thermiquement et/ou au moins partiellement écrémés, notamment le lait de vache, de chèvre ou de brebis, à l’exception du lait de yak pour ledit fermentat non ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa, les mélanges d’au moins deux laits et les mélanges d’au moins un substrat protéique d’origine végétale et d’au moins un lait d’origine animale
Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de yak par une souche selon le premier ou le troisième aspect de l’invention et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie respectivement des fermentats selon le premier et le troisième aspect de l’invention. Le fermentat obtenu par fermentation anaérobie du lait de jument et ultrafiltré à un seuil de coupure de 10kDa fait partie des fermentats selon le deuxième aspect de l’invention.
Avantageusement, ladite composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention contient une concentration d’au moins une desdites souches et de préférence d’une seule desdites souches, notamment lasouche Lactobacillus delbrueckii ssp . b ulgaricusVF50b égale ou supérieure à 107CFU par gramme et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 199, supérieure ou égale à 4 mg par gramme.
La composition alimentaire ou pharmaceutique comprend de préférence, le fermentat obtenu par fermentation anaérobie de la souche selon le troisième aspect de l’invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa.
Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne également un produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, notamment de vache, de chèvre, de brebis à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits, lequel de manière caractéristique contient au moins une souche selon le troisième aspect de l’invention et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention.
Selon ce troisième aspect, la présente invention concerne également un complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal en particulier choisi parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane, lequel comprend de manière caractéristique au moins une souche selon le troisième aspect et/ou au moins un peptide selon le troisième aspect et/ou au moins un mélange de peptides selon le troisième aspect et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le troisième aspect de l’invention.
Selon ce troisième aspect, par exemple, la composition alimentaire ou pharmaceutique se présente sous la forme d’un liquide. Un volume de 30 mL de cette composition contenant 0,2 g de peptides sont administrés quotidiennement, par voie orale.
Quatrième aspect
Selon un quatrième aspect de l’invention, la présente invention concerne un mélange d’au moins deux souches choisies parmi les souches deLactobacillus helveticusprésentant les gènesprtH2et prtH3et capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache et notamment le lait de vache écrémé à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,36, notamment égale à 3,32 au bout de 48 heures de fermentation à 37°C et notamment la souche deLactobacillus helveticusVF45A déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5300, les souches deLactobacillus helveticusprésentant le gèneprtH1, notamment la souche deLactobacillus helveticusVFH049 déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 3,45 et notamment égale à 3,43 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale de 40% et résistante à l’acidité et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium et les souches deLactobacillus delbrueckii ssp . b ulgaricusprésentant le gèneprtB, notamment la souche deLactobacillus delbrueckii ssp . b ulgaricusVF50b déposée à la CNCM sous le numéro d’ordre CNCM-I-5316, capables de réduire par fermentation anaérobie le pH du lait, notamment de vache à une valeur sensiblement égale ou inférieure à 4,55 et notamment égale à 4,51 au bout de 48 heures à 37°C et présentant une hydrophobicité pariétale d’au moins 35% et/ou capable d’augmenter l’absorption du calcium par les cellules intestinales et notamment les mélanges des trois souches VF45A, VFH049 et VF50b.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne un mélange de peptides choisi parmi les mélanges comprenant les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199, les mélanges contenant les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les peptides de séquence SEQ ID NO 44 à SEQ ID NO 86 et les peptides de séquence SEQ ID NO 87 à SEQ ID NO 112.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne également un peptide isolé choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 199 ou un mélange selon la quatrième aspect de l’invention pour son utilisation en tant que médicament et notamment dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui comprend au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou au moins un milieu apte à être ingéré et au moins un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins le fermentat obtenu par fermentation du mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention, dans du lait, notamment de vache, éventuellement écrémé, à une température de 40°C à pH=6 pendant 72h, ledit fermentat étant éventuellement soumis à une ultrafiltration à un seuil de coupure de 10kDa.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne une composition alimentaire ou pharmaceutique qui contient un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et au moins un peptide tel que précité ou un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention.
Selon ce quatrième aspect, l’invention concerne également un produit choisi parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, de vache, de chèvre, de brebis ou d’un mélange de laits qui contient un mélange de souches selon le quatrième aspect de l’invention et/ou au moins un mélange de peptides selon le quatrième aspect de l’invention et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon le quatrième aspect de l’invention.
Avantageusement, la composition alimentaire ou pharmaceutique contient une concentration desdites souches égale ou supérieure à 107CFU par gramme de produit et/ou une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents supérieure ou égale à 4 mg par gramme.
Définitions
Le terme «lait», en l’absence de précision fait référence à du lait de vache.
Le terme «yaourt» fait référence à un produit laitier élaboré par fermentation par ajout de bactéries lactiquesStreptococcus thermophilusetLactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus.
Le terme «lait fermenté» fait référence à un produit laitier obtenu par coagulation des caséines suite à l’ajout d’un ferment lactique dans le lait.
Le terme «fermentat» désigne le surnageant obtenu à la fin de la fermentation.
Les termes «augmenter l’absorption du calcium» et autres termes relatifs font référence à la capacité de la souche ou des peptides à augmenter le passage global du calcium à travers la paroi intestinale d’un mammifère (entre les cellules de cette dernière du fait de l’augmentation de l'expression du gènecld-2, par exemple), ou à augmenter la fluorescence dans des cellules Caco-2 comme indiqué dans la partie expérimentale (passage plus important du calcium à travers les cellules de la paroi intestinale) ou à augmenter l’expression d’au moins un gène choisi parmitrpv6, etvdrchez les cellules intestinales comme indiqué dans la partie expérimentale de la présente demande (meilleure absorption par les cellules elles-mêmes).
Les termes «résistante à l’acidité» font référence à la classe 3 indiquée dans la partie expérimentale de la présente demande en référence à la résistance à l’acidité.
Le terme «probiotique» fait référence à un microorganisme susceptible de survivre dans l’intestin d’un hôte, notamment un humain et d’interagir avec les cellules de la paroi intestinale et/ou d’interagir avec les autres microorganismes vivant dans l’intestin de l’hôte et d’exercer un effet bénéfique pour la santé de l’hôte.
Le terme «hypocalcémie» désigne une concentration en calcium dans le sang, corrigée avec le taux d’albumine inférieure à 2,20 mmol/L.
Le terme «ingrédient actif» signifie que l’ingrédient considéré (peptide, mélange de peptides et/ou souche) est contenu dans une quantité/concentration permettant d’obtenir un effet technique au moinsin vitrosur l’inhibition de l’ACE et/ou sur l’absorption du calcium.
Le terme «sujet» fait référence à un humain ou un animal, notamment un mammifère (en particulier, le chien, le chat, une volaille, un ovin, un bovin, un caprin ou un reptile).
Le terme «traitement» englobe à la fois le traitement préventif (prophylactique) et le traitement permettant d’obtenir une amélioration d’au moins un symptôme de la pathologie considérée.
Lepourcentage d’identitéfait référence au pourcentage de résidus d’acides aminés identiques entre la séquence à comparer et la séquence de référence, en alignant la totalité de la séquence comparée à la séquence de référence. La séquence protéique qui présente un % d’identité avec la séquence de référence peut ainsi comprendre des insertions ou des délétions. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un résidu d’acide aminé identique, est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions pour lesquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux résidus d’acides aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d’obtenir le pourcentage d’identité en nucléotides ou en acides aminés des deux séquences entre elles.
Les peptides définis par leur % d’identité peuvent ainsi comprendre une ou plusieurs délétion et/ou une ou plusieurs substitutions, l’insertion ou la substitution par un acide aminé dextrogyre, le remplacement du groupe terminal acide carboxylique et/ou du groupe terminal amine par un groupement protecteur, par exemple, l’introduction d’une liaison de type rétro (c’est-à-dire une liaison peptide -NH-CO- issue de la réaction entre la fonction amine du premier acide aminé dans la séquence avec la fonction acide carboxylique de l’acide aminé suivant dans la même séquence) ou l’introduction d’une liaison de type rétro-inverso (c’est-à-dire l’introduction d’une liaison peptidique de type rétro précité avec un acide aminé dans la configuration inverse que celle de l’acide aminé de la séquence de référence) ou comprendre une plus longue chaîne d’acides aminés.
Quel que soit l’aspect de l’invention, les peptides peuvent être phosphorylés ou non.
Unecomposition pharmaceutiqueest définie comme étant une composition contenant un ingrédient actif et un excipient pharmaceuticalement acceptable et notamment choisi parmi l’eau, les huiles, les alcools, notamment l’alcool éthylique, les huiles végétales, les cyclodextrines, l’amidon, la maltodextrine, le lactose, saccharose, le propylène glycol et le sérum physiologique.
Le terme «constitué» quand il est utilisé en référence à un ou des peptides indique que le mélange ou la composition contient en tant que peptide(s) uniquement les peptides cités à l’exception d’autres peptides mais d’autres composés ou constituants tels que des solvants, vitamines, protéines ou autres peuvent être présents.
Un « milieu apte à être ingéré » désigne tout mélange ou tout substance quelle que soit sa phase physique qui peut être ingéré et digéré sans causer de problème au tractus digestif. Les excipients pharmaceuticalement acceptables et notamment les exemples cités dans la présent demande sont des milieux aptes à être ingérés.
Dans toute la présente demande, les séquences sont indiquées classiquement dans le sens de leur extrémité N terminale vers leur extrémité C-terminale.
Dans toute la présente demande, la souche VFH049 peut également être dénommée VF49d.
Dans toute l’invention, le terme « souche » fait référence sans distinction à la souche vivante, c’est-à-dire capable de se développer dans un milieu nutritif adapté et à la souche inactivée, c’est-à-dire morte et donc incapable de se développer dans un milieu adapté à son développement.
Figures
Partie expérimentale
Isolation et caractérisation des souches
Les trois souches de l’invention ont été extraites de produits laitiers différents.
Les échantillons de chaque produit laitier sont collectés dans des tubes stériles, gardés à 4°C pendant maximum deux jours avant l’analyse. Les échantillons sont soumis à une série de dilutions dans un tampon salin (solution 0,85% NaCl), puis étalés sur plaques MRS-agar (De Man, Rogosa and Sharpe). Les plaques sont incubées pendant 48 heures à 37°C en milieu anaérobie. Les colonies morphologiquement distinctes sont séparées, repiquées sur des plaques du même milieu pour purification. Afin de s’assurer de la pureté des isolats, le ré-étalement sur plaque est répété au moins trois fois.
Le Tableau 1 ci-dessous indique les produits laitiers d’où ont été extraites les souches. Tous ces produits laitiers proviennent de Mongolie et ont été préparés à l’automne.
Des observations au microscope optique sont effectuées afin de déterminer la forme des bactéries. Ces observations sont visibles sur la Fig. 1. Le Gram de chaque souche est déterminé de manière classique par la technique de coloration de Gram et observation au microscope. La recherche de la catalase est effectuée pour chaque souche de manière classique par prélèvement de chaque souche sur un milieu gélosé et mise en contact avec de l’eau oxygénée.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 ci-dessous.
| Produit laitier source | souche | catalase | Gram | forme | Espèce |
| Yaourt (lait de yack) | VF45A | négatif | + | bacille | L. helveticus |
| Lait fermenté de jument | VF49d | négatif | + | bacille | L. helveticus |
| Yaourt (lait de yack) | VF50b | négatif | + | Bacille incurvé | L. delbrueckii ss bulgaricus |
Dépôt des souches
La soucheLactobacillus h elveticusVF45A a été déposée par la Demanderesse, le 29 mars 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-I-5300 (dépôt selon le traité de Budapest).
La soucheLactobacillus h elveticusVFH049 a été déposée par la Demanderesse, le 19 février 2019 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-I-5403 (dépôt selon le traité de Budapest). Dans la suite de la demande, cette souche est également dénommée VF49d.
La soucheLactobacillus delbrueckii ssp . bulgaricusVF50b a été déposée par la Demanderesse, le 20 avril 2018 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), cis au 25 rue du Docteur ROUX 75724 Paris Cedex 15 sous le numéro d’ordre CNCM-I-5316 (dépôt selon le traité de Budapest).
Séquence du génome codant pour l’ARN ribosomique 16S
La détermination de la séquence codant pour l’ARN ribosomique 16S des souches a confirmé que les souches VF45A et VFH049 sont bien des souches de l’espèceLactobacillus h elveticus .
De même, l’analyse du génome à confirmer que la souche VF50b est bien une souche de l’espèceL actobacillus . delbrueckii ss p . bulgaricus .
Détection par PCR des gènes codant pour les protéases pariétales
L’identification des protéases pariétales présentes chez les souches sélectionnées est réalisée par détection PCR des gènes codant pour ces enzymes. Les cellules bactériennes sont récupérées des cultures en lait écrémé, l’ADN bactérien est ensuite isolé par utilisation d’un kit wizard genomic DNA purification (Promega, Madison, Etats-Unis). La souche CNRZ32 CIRM-BIA 103 deL actobacillus helveticus(fournie par le Centre International de Ressources Microbiennes - Bactéries d’Intérêts Alimentaires, CIRM-BIA, INRA, Rennes, France) a été utilisée comme contrôle pour les gènes deL actobacillus helveticus .Cette souche (CNRZ32), est connue pour posséder les 4 gènesprtH(prtH1 à prtH4).
Chaque souche est testée pour 5 couples d’amorces correspondant à 5 gènes différents à savoir,prtB,prtH1,prtH2,prtH3etprtH4. Les amorces décrites par Houet al., 2015 sont utilisées pour la détection deprtBchezL actobacillus delbrueckii .Concernant les souches deL actobacillus helveticus ,les amorces décrites par Genayet al., 2009 sont utilisées pour la détection des gènesprtH1etprtH2et enfin celles décrites par Broadbentet al., 2011 pour la détection deprtH3etprtH4.
Les réactions PCR sont conduites dans un volume final de 25 µL comprenant 12,5 µL de PCR Master Mix (2×) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis), 2 µL de chaque amorce (12,5 µM), 2 µL d’ADN bactérien extrait (environ 200 ng.µL-1) et 6,5 µL d’H2O. Les cycles PCR sont réalisés dans un thermocycler labcycler (SensoQuest, Göttingen, Allemagne). Après une première dénaturation à 95°C pendant 5 min, 30 cycles de PCR sont répétés successivement, un cycle se compose d’une dénaturation à 95°C pendant 30 sec, d’une hybridation pendant 1 min à la température d’hybridation requise pour chaque amorce et d’une élongation à 72°C pendant 30 sec (4 min pour le gèneprtH4). Une dernière élongation à 72°C pendant 10 min a lieu après les 30 cycles PCR. Les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % (m/v) préparé dans un tampon TBE (Tris, Borate, EDTA). La révélation des fragments d’ADN est réalisée par l’ajout dans le gel de 0,008 % (v/v) de GelRed® (10.000×) (Biotium, Fremont, Etats-Unis). Dix µL de produits PCR sont mélangés avec 4 µL de tampon de charge (6×) (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) avant d’être déposé sur le gel d’agarose. Le mélange O’GeneRuler DNA Ladder Mix (ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) est utilisé comme marqueur de taille. La migration a lieu pendant 45 min à un voltage constant de 100 V. Les produits d’amplification sont révélés au Gel Doc™ (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis).
Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Le gèneprtBest détecté pour la souche VF50b deL actobacillus delbrueckiimais pas chez les souches VF45A et VFH049 deL actobacillus h elveticus. Le gèneprtH1est détecté pour la souche VFH049 deL actobacillus helveticuset dans le contrôle. De manière intéressante, d’autres souches (non représentées) ont été testées et il s’avère que toutes les souches deLactobacillus helveticusprésentant le gèneprtH1ont été isolées à partir de lait de jument fermenté. Les gènesprtH2etprtH3sont détectés chez la souche VF45A deL actobacillus helveticuset dans le contrôle. Le gène prtH4 est détecté dans le contrôle, mais pas dans les souches testées.
Détermination de l’activité protéolytique et fermentaire des souches
Les tests utilisés couvrent à la fois la capacité fermentaire (rapidité de croissance, acidification) et l’activité protéolytique (capacité à hydrolyser les protéines). En fait, les deux aspects sont largement liés, la capacité des bactéries à croître dépend en effet de leur capacité à hydrolyser les protéines (puisqu’elles ont besoin des acides aminés libérés lors de l’hydrolyse pour assurer leur croissance). Il est aussi déjà connu qu’acidification du milieu et hydrolyse des protéines sont corrélées.
1. Echelle du laboratoire – fermentation sans contrôle de pH
Détermination de l’activité protéolytique selon la méthode des géloses au lait
Chaque souche est cultivée dans des puits de gélose-lait ; l’apparition d’un halo autour du puits témoigne d’une protéolyse. La mesure du diamètre du halo permet d’évaluer les capacités protéolytiques de la souche. La gélose-lait est préparée en mélangeant dans l’eau une poudre de lait écrémé (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à une concentration de 5 % (m/v) supplémenté d’agar à 1,5 % (m/v). Après stérilisation à 110°C pendant 10 min, le lait est coulé dans des boites de Pétri. Des puits de 4 mm de diamètre sont ensuite formés dans la gélose. La souche est cultivée en milieu MRS (Gélose de Man, Rogosa, Sharpe) liquide pendant 48 h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules bactériennes sont ensuite lavées deux fois dans du milieu MRS puis finalement re suspendues dans un volume de milieu MRS permettant d’obtenir une DO600égale à 1 (spectrophotomètre Prim, Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Un volume de 20 µL de la suspension bactérienne est déposé dans les puits de gélose-lait. Les plaques inoculées sont ensuite incubées pendant 72h à 37°C en conditions anaérobies. L’activité protéolytique des souches est quantifiée en mesurant le diamètre (exprimé en mm) des halos apparus autour des puits après incubation.
Cultures en lait écrémé : croissance, pH
A partir d’une culture bactérienne en milieu MRS liquide, une pré-culture de 5 mL est réalisée dans un milieu composé à 100 % de lait écrémé UHT (Cora, Paris, France), pendant 72h à 37°C, en condition anaérobie. La souche est ensuite inoculée dans un volume final de 30 mL du même milieu, avec une DO600initiale de 0,3. Les cultures ont lieu pendant 48h à 37°C en condition anaérobie. En tant que contrôle, le même milieu lait non inoculé (Lait NI) est incubé dans les mêmes conditions. A la fin de la fermentation, l’acidité du milieu est évaluée en mesurant le pH par un pH mètre (Mettler Toledo, Greifensee, Suisse). Pour l’évaluation de la croissance bactérienne, une mesure directe de la DO ne peut être réalisée à cause de l’opacité du milieu. Le phénomène de coagulation des caséines après fermentation est également un problème, les caséines précipitant dès que le pH est inférieur à 4,6. Un protocole préalable de récupération des cellules bactériennes à partir de la culture lait est donc réalisé. Un volume de 1 mL de culture est dilué (1/10) dans une solution d’EDTA 2 % (m/v) à pH 12, ceci afin de re suspendre complètement les caséines précipitées. Les cellules sont ensuite récupérées par centrifugation à 13.400 rpm pendant 10 min. Ce protocole est répété une seconde fois et le culot bactérien obtenu est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS. La mesure de DO600est réalisée à partir de cette suspension, le blanc est obtenu en réalisant le même protocole avec du lait non inoculé.
La croissance cellulaire et le pH ont été mesurés après 48h d’incubation en lait écrémé. Les souches deLactobacillus helveticusprésentent une croissance très rapide, atteignant une OD600moyenne de 2.7 alors que les souches deL actobacillus delbrueckiiatteignent seulement 0.85 en moyenne.
L’acidification du lait inoculé a été comparée à celle du contrôle (Lait NI). Le pH initial du lait non inoculé était de 6.5, il a atteint 6.45 après 48h d’incubation. Dans presque tous les cas les souches deL actobacillus helveticusont conduit à une diminution du pH de 3 unités, atteignant une moyenne de 3.68, alors que le pH des échantillons inoculés avec la souche deL actobacillus delbrueckiia diminué de 2 unités pH au maximum, atteignant une moyenne de 4.57. Dans tous les cas, la fermentation a abouti à la coagulation du lait car les caséines précipitent lorsque le pH descend en dessous de 4,6.
Mesure des quantités de peptides produits et de leur répartition en poids moléculaire
Les peptides produits au cours de la fermentation des souches sont analysés par deux méthodes. Les concentrations en peptides sont évaluées d’abord par dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC) ; les peptides sont également analysés en fonction de leur répartition en poids moléculaire apparent par chromatographie d’exclusion stérique (SEC).
Extraction et purification des peptides produits
A partir des cultures en lait écrémé, un prélèvement de 4 mL est réalisé puis mélangé à un volume de 400 µL d’une solution d’acide trichloroacétique (TCA) à une concentration de 10 % (m/v) pour atteindre une concentration finale en TCA de 1 %. L’ajout d’une telle concentration de TCA permet la précipitation des protéines de haut poids moléculaire. Après une centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant contenant les peptides est récupéré.
Les peptides sont ensuite purifiés à partir du surnageant afin d’éliminer le TCA, les sucres, et les sels. La purification est réalisée par une extraction en phase solide (SPE), le principe de cette méthode est une séparation des composés d’un mélange par adsorption sélective sur une phase solide. Des micro-colonnes Bond Elut C18(1000 mg) (Agilent Technologies, Santa Clara, Etats-Unis) sont utilisées. ; il s’agit de colonnes composées d’une phase solide de silice greffée avec des groupements C18permettant la rétention de composés hydrophobes. Les colonnes sont équilibrées en passant un volume minimum de 10 mL d’une solution d’acétonitrile (ACN) 100 % supplémenté de 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) (v/v). Après un rinçage de la colonne par une solution d’H2O contenant 0,1 % de TFA (v/v), un volume de 4 mL de surnageant contenant les peptides extraits est ensuite chargé sur la colonne. Un nouveau rinçage à l’H2O supplémenté de 0,1 % de TFA permet d’éluer tous les composés non retenus par la colonne. Les peptides retenus sont finalement élués dans un volume de 2 mL d’une solution d’ACN à 80 % (v/v), 20 % d’H2O (v/v) et contenant 0,1 % de TFA. Les échantillons sont ensuite stockés à -20°C jusqu’à analyse.
Dosage au réactif de Folin-Ciocalteu
Les peptides extraits sont quantifiés par un dosage au réactif de Folin-Ciocalteu (FC). Il s’agit d’une solution de tungstate et molybdate de sodium préparés dans les acides phosphorique et chlorhydrique. Le complexe d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique de couleur jaune est réduit par des résidus de tyrosine, tryptophane, cystéine ou encore par des liaisons peptidiques en milieu alcalin pour donner une couleur bleue. L’apparition de la couleur bleue, proportionnelle à la concentration en peptides, est suivie par spectrophotométrie. Pour le dosage, la réaction est réalisée dans un volume final de 800 µL comprenant 200 µL de peptides extraits, 500 µL d’une solution de carbonate de sodium (NaHCO3) à 500 mM et 100 µL de réactif de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). La réaction est incubée à 37°C à l’obscurité pendant 30 min, puis la DO à 750 nm du mélange est mesurée par un spectrophotomètre Prim (Secomam, Groupe Aqualabo, Champigny, France). Le blanc est réalisé à partir de la solution servant à éluer les peptides des colonnes SPE (80 % ACN, 20 % H2O, 0,1 % TFA). La concentration dans les échantillons est déterminée par une gamme étalon d’une solution commerciale de peptides (peptide digest assay standard, ThermoFisher Scientific, Waltham, Etats-Unis).
Analyse par chromatographie d’exclusion stérique
Le but de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) est la séparation des composés d’un mélange en fonction de leurs tailles ou volumes hydrodynamiques. Dans cette étude, la SEC permet d’analyser la répartition en poids moléculaire apparent des peptides extraits après fermentation. La colonne utilisée pour la séparation des peptides est une Superdex Peptide 10/300 GL (10 × 300-310 mm, 13 µm, GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni) branchée sur un système de purification AKTA Protein (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni). Un volume de 25 µL d’échantillon est élué en condition isocratique dans un solvant composé de 30 % d’ACN (v/v), 70 % d’H2O (v/v) et 0,1 % de TFA (v/v), à un débit de 0,5 mL/min pendant 60 min. Un détecteur UV à 214 nm permet la détection des liaisons peptidiques. La quantité de peptides dans les échantillons est analysée par intégration des profils obtenus par SEC. Deux gammes de poids moléculaires ont été choisies pour les intégrations, la première concerne les peptides de poids moléculaire apparent supérieurs à 1.700 Da (appelée PHPM, peptides de haut poids moléculaire) et la deuxième les peptides de poids moléculaire apparent inférieurs à 1.700 Da (appelée PBPM, peptides de bas poids moléculaire). La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille est exprimée soit en pourcentage de l’aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l’aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI).
Les mesures de concentration à l’aide du réactif FC ont montré une augmentation de la quantité de peptides après 48 h, avec des concentrations supérieures à 4 g/L dans tous les cas, contre 2/06 g/L dans l’échantillon non inoculé.
La soucheL actobacillus helveticusVF45A est l’une des souches les plus efficaces avec une concentration finale en peptides supérieure à 6 g/L (voir Tableau 3 ci-dessous).
Le poids moléculaire des peptides générés a été analysé par SEC comme précité. La quantité de peptides appartenant à chaque classe de taille (inférieure ou supérieure à 1.700 Da) est exprimée soit en pourcentage de l’aire totale du chromatogramme (% PHPM et % PBPM), soit en pourcentage de l’aire du chromatogramme obtenu pour la condition contrôle lait non inoculé (% PHPM/Lait NI et % PBPM/Lait NI). L’inoculation et la fermentation conduisent à une augmentation des peptides de bas poids moléculaire par rapport au contrôle (1.5 fois en moyenne pour les souches deL actobacillus delbrueckii ,4.2 fois en moyenne pour lesL actobacillus helveticus).
Les résultats obtenus pour chaque souche sont regroupés dans le tableau 3 ci-dessous.
Les analyses en composantes principales (ACP) sont réalisées avec le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander et son plug-in FactorMineR.
Une analyse ACP a pris en compte 9 paramètres quantitatifs : l’activité protéolytique sur gélose-lait, la croissance lors d’une fermentation en milieu liquide (lait), le pH à la fin de la fermentation, la quantité de peptides produits, et 5 autres critères liés à l’analyse des profils chromatographiques des peptides (répartition en poids moléculaires apparents. La Fig. 2 montre la carte obtenue. Les composantes principales Dim1 et Dim2 représentent 60.82% et 23.56% de la variance totale, respectivement. Une corrélation positive est observée entre la valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire. De plus, la croissance est corrélée à une série de variables liées à la production de peptides (quantification par réactif FC, %PBPM, %PBPM/Lait NI) et au diamètre du halo de protéolyse. La valeur du pH et les peptides de haut poids moléculaire sont corrélés négativement avec des variables comme la croissance, la proportion de PBPM et le halo de protéolyse.
2. Production des peptides à pH contrôlé, ultrafiltration, identification des peptides
Fermentation en bioréacteur
Chaque souche est cultivée en bioréacteur de 500 mL (MiniBio 500, my-Control, Applikon Biotechnology, Delft, Pays-Bas). Le milieu est constitué de lait écrémé (10 g/L (voir paragraphe précédent), autoclavé 30 min à 110°C. La souche est inoculée à une DO600égale à 0,3. La fermentation est conduite pendant 72h à une température constante de 40°C avec une agitation de 300 rpm dans un volume final de 330 mL. La condition anaérobie est obtenue par injection de N2dans le bioréacteur à un débit de 20 mL/min. Tout au long de l’expérience, le pH est maintenu à 6 grâce à des solutions d’HCl (1 M) et de NaOH (3 M), l’approvisionnement est réalisé au moyen de deux pompes péristaltiques localisées sur l’unité de contrôle du bioréacteur. Des prélèvements d’environ 5 mL sont réalisés en condition d’asepsie à 0, 2, 17, 24, 41, 48, 65 et 72h de fermentation pour analyse de la croissance des souches bactériennes ainsi que de l’évolution de la concentration en peptides. Cette dernière est évaluée par un dosage au réactif FC après une précipitation au TCA. Un volume de 1 mL de fermentât est dilué (1/10) dans une solution d’EDTA 2 % (m/v) à pH 12 puis centrifugé à 13.400 rpm pendant 10 min, et 25 µL de surnageant sont analysés par SEC. Le culot bactérien est re suspendu dans 1 mL de tampon PBS pour mesure de la DO600afin d’évaluer la croissance bactérienne. Après 72h de fermentation, l’intégralité du fermentat est récupérée puis centrifugée à 10.000 rpm pendant 10 min, le surnageant est ensuite stocké à -20°C jusqu’à analyse. La concentration en matière sèche dans les fermentats est mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France) et est toujours égale à 100 g/L. Afin de pouvoir confirmer l’impact de la fermentation bactérienne sur les propriétés du produit final, un contrôle est réalisé (CTLF). Il s’agit du milieu de fermentation incubé dans les mêmes conditions mais non inoculé. Après 72h d’incubation, ce milieu est centrifugé et stocké comme les autres fermentations.
Identification des peptides produits lors de la fermentation à pH contrôlé
Afin d’éliminer les protéines non hydrolysées, une partie du fermentat brut est fractionnée au moyen d’une membrane d’ultrafiltration. La membrane est une cassette Hydrosart® (Sartocon® Slice Hydrosart® Cassette, Sartorius, Göttingen, Allemagne) de 0,1 m² avec un seuil de coupure de 10 kDa branchée sur un système Sartocon® Slice 200 Holder (Sartorius, Göttingen, Allemagne). L’alimentation du fermentat est réalisée par une pompe péristaltique et la pression du rétentat est maintenue à environ 1 bar pendant la filtration. Ainsi, le perméat d’ultrafiltration (UFP) contenant les molécules inférieures à 10 kDa est séparé du rétentat (UFR). Les deux sous-fractions sont ensuite conservées à -20°C jusqu’à analyse. Les perméats d’ultrafiltration sont séchés jusqu’à 10 % du volume initial par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 15h à 40°C. La concentration en matière sèche dans les produits (fermentat et fermentat ultrafiltre) est ensuite mesurée au dessiccateur (XM60, Precisa, Poissy, France).
Les peptides purifiés par SPE à partir des surnageants de culture (non ultrafiltrés) sont séchés par évaporation centrifuge (miVac, Gene Vac, Ipswich, Royaume-Uni) pendant 2h à 40°C puis re suspendus dans 100 µL d’H2O contenant 0,1 % de TFA (v/v) et centrifugés pendant 10 min à 8.000 rpm. Dix microlitres d’échantillon sont injectés sur une colonne C18-Kinetex (150 × 4,6 mm, 2,6 µm, 100 Å, Phenomenex, Torrance, Etats-Unis), branchée sur un système chromatographique d’Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Acquity (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Un gradient linéaire d’ACN contenant 0,1 % d’acide formique (AF) (v/v) est utilisé (de 5 à 15 % d’ACN pendant 30 min, puis de 15 à 30 % d’ACN pendant 60 min, de 30 à 50 % d’ACN pendant 10 min et enfin de 50 à 95 % d’ACN pendant 10 min) avec un débit de 500 µL.min-1. Les éluants d’UPLC sont directement pulvérisés par électrospray à un voltage de 3 kV, la désolvatation est réalisée par utilisation de diazote (N2) à un débit de 600 L.h-1à une température de 300°C. Le système chromatographique est couplé à un spectromètre de masse Synapt-G2-Si (Waters, Manchester, Royaume-Uni). Les mesures MS sont faites en mode data dependent (data dependent analysis, DDA) et les datas sont récupérées dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Un maximum de 15 ions précurseurs avec un seuil d’intensité de 10.000 sont sélectionnés pour fragmentation par la méthode de dissociation induite par collision (CID) à une puissance de 8 à 9 V pour les faibles masses et une puissance de 40 à 90 V pour les masses élevées. Les spectres MS/MS sont récupérés dans une gamme de masse allant de 100 à 2000 m/z. Les spectres sont traités par le logiciel Mass Lynx (version 4.1.) (Waters, Manchester, Royaume-Uni). L’analyse de l’échantillon contrôle (CTLF) a permis de définir l’hétérogénéité de base. 596 peptides provenant de 22 protéines de lait (αS1-caséine, β-caséine, αS2-caséine, GLYCAM1, κ-caséine, BTN1A1, β-lactoglobuline, FGFBP, lactoperoxidase, ostéopontine, périlipine, collagène α2, TRIP6, NPT2B, acylCoA désaturase, dysferline, COG8, B4GT1, PSME4, DHX9, RALYL et apolipoprotéine A2) ont été identifiés dans cet échantillon. 32% d’entre eux proviennent de la β-caséine. Par comparaison, entre 150 et 722 peptides ont été identifiés dans les échantillons fermentés par les différentes souches testées. Dans ces échantillons, les peptides de β-caséine représentent 44 à 67% de toutes les séquences identifiées. En raison de la prépondérance des peptides de β-caséine parmi les peptides identifiés, et de l’abondance naturelle de la β-caséine dans le lait, seuls les peptides issus de la β-caséine seront étudiés. Les peptides produits par les souches de l’invention sont donc tous issus de la protéolyse de la β-caséine du lait de vache. La recherche en banque de données est réalisée via le logiciel Peaks Studio (version 7.0.) (Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada) en utilisant la base de données UniProt (le 15 Mai 2017) restreinte au protéome complet de l’espèceBos taurus .Les seuils de tolérance des masses des ions précurseurs et fragments sont définis à 35 ppm et 0,2 Da. Les séquences peptidiques identifiées par le logiciel sont filtrées selon un taux de faux positif (false discovery rate) strictement inférieur à 1%.
Pour toutes les souches, les peptides identifiés proviennent du fermentat qui n’a pas subi d’ultrafiltration. Ces mêmes peptides devraient également se retrouver au vu de leur masse dans le fermentat ultrafiltré.
Il est à noter que lors de l’identification des peptides, les peptides pouvant provenir de la levure ont été considérés. Après analyse par spectrométrie de masse, la Demanderesse a constaté en utilisant les bases de données, qu’aucun peptide provenant de la levure n’était présent dans le fermentat ultrafiltré ou non.
Le tableau 4 regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 5 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF45A selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 6 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 7 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VFH049 selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Il est connu que les peptides phosphorylés peuvent être actifs dans l’absorption du calcium (confère la publication intitulée « Casein phosphopeptide promotion of calcium uptake in HT-29 cells - Relationship between biological activity and supramolecular structure » de Gravaghi, C., et al. publié en 2007, FEBS J. 274, 4999–5011. doi:10.1111/j.1742-4658.2007.06015.x.
Le tableau 8 ci-dessous regroupe les peptides non phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Le tableau 9 regroupe les peptides phosphorylés et considérés comme nouveaux qui sont produits par la souche VF50b selon la méthode de fermentation indiquée ci-dessus à pH 6.
Activités biologiques des fermentats et des peptides
Les fermentats (avant et après ultrafiltration) ont été testés pour deux activités biologiques, à savoir l’inhibition de l’ACE et la capacité à moduler l’absorption du calcium. Par ailleurs, la toxicité des hydrolysats a été évaluée. Pour les analyses, les différents échantillons sont dilués dans l’H2O à une concentration de 15 g/L de matière sèche.
Test de cytotoxicité
Le but de cette expérience est de tester l’éventuelle toxicité des fermentats envers les cellules intestinales. La viabilité cellulaire est mesurée par l’utilisation du réactif CCK-8 (Cell Counting Kit-8), cette méthode est basée sur la réduction d’un sel de tétrazolium par des déshydrogénases cellulaires produisant du formazan dont la formation est suivie à 450 nm. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 µL de milieu DMEM complet, et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2. Les fermentats sont dilués dans du milieu DMEM complet à une concentration de 5 et 10 g/L. Un tampon PBS également dilué dans du milieu DMEM (même facteur de dilution que les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Un volume de 150 µL d’échantillon est déposé dans chaque puits, suivi d’une incubation pendant 7 ou 24h à 37°C, 5 % de CO2. Après incubation, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois par du tampon PBS puis un volume de 150 µL de milieu DMEM complet supplémenté avec 5 % (v/v) de réactif CCK-8 (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) est ajouté dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée pendant 2h à 37°C, 5 % de CO2à l’obscurité, puis lue à 450 nm au spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La viabilité cellulaire est calculée par rapport à l’absorbance obtenue pour les puits contrôles (correspondant à 100 % de cellules viables). A une concentration de 5 g/L, les fermentats bruts (non filtrés) de chacune des souches de l’invention ne présentent aucune toxicité envers les cellules Caco-2 même après 24h de contact. La même observation est faite pour une concentration de 10 g/L de matière sèche. Les fermentats ultrafiltrés de chacune des souches ne présentent pas non plus de cytotoxicité.
Inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine
Le but est d’étudier le potentiel inhibiteur des fermentats envers l’ACE. Il repose sur l’utilisation d’un substrat fluorescent, le o-aminobenzoyl-Gly-p-nitro-L-Phe-Pro (Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro). L’hydrolyse de ce substrat par l’ACE génère le groupement fluorophore Abz-Gly pouvant être suivi par des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 355-375 nm et de 400-430 nm respectivement. Les échantillons, l’enzyme et le substrat sont préparés et dilués dans un tampon Tris-HCl (150 mM) à pH 8,3 aux concentrations désirées. La réaction d’hydrolyse est conduite en plaque 96 puits dans un volume final de 300 µL comprenant 50 µL d’échantillon ou de tampon Tris-HCl (pour le témoin négatif d’inhibition), 50 µL d’une solution d’ACE (0,05 U/mL) (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) et 200 µL de substrat Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro (0,45 mM) (Bachem, Bubendorf, Suisse). Un témoin ne contenant pas d’enzyme (remplacée par du tampon Tris-HCl) est également réalisé. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 1h, une mesure de la fluorescence a lieu toutes les 2 min avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 365 et 415 nm respectivement par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) équipé d’un bain-marie à 37°C. Les pourcentages d’inhibition et les IC50des différents échantillons testés sont calculés en fonction du témoin négatif d’inhibition.
Pour l’analyse des activités biologiques (de toutes les activités biologiques testées dans la présente demande), la significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d’un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value < 0,05. Les tests statistiques ont été conduits sous le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander.
Pour démontrer l’intérêt de la fermentation au niveau des activités biologiques étudiées, les activités sont comparées à celles du fermentat contrôle (CTLF), milieu de fermentation incubé sans inoculation.
Les échantillons ont été testés à différentes concentrations en matière sèche, ceci afin de pouvoir calculer la concentration inhibant la moitié de l’activité enzymatique (IC50). Les résultats sont représentés sur les Fig. 3 et 4.
Les fermentats bruts présentent des IC50allant de 12,76 mg/mL pour le fermentat contrôle brut à 0,56 mg/mL pour le fermentat produit par la souche VF45A. Pour la souche VFH049, l’IC50du fermenta brut est de 0,76 mg/mL. Pour les fermentats ultrafiltrés, les IC50sont de 8 mg/mL pour le contrôle, 0,47 mg/mL pour le fermentat produit par la souche VF45A et de 1,76 mg/mL pour le fermenta produit par la souche VFH049. Les souches VF45A et VFH049 améliorent très significativement la capacité des fermentats à inhiber l’ACE par rapport au contrôle. Le même effet est obtenu avec les fermentats ultrafiltrés. Des molécules d’intérêt sont donc produites par les souches au cours de la fermentation et présentent une activité d’inhibition de l’ACE.
Prédiction de l’activité d’inhibition de l’ACE par modèle QSAR ; comparaison avec les peptides de l’art antérieur
Afin de prédire l’activité inhibitrice de l’ACE de chacun des peptides identifiés (peptides non phosphorylés), un modèle statistique QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) a été utilisé. Ce modèle a été développé par Pripp et al., (2004), en utilisant comme descripteurs des acides aminés les z-scores (z1, z2 et z3), décrit par Hellberg et al., (1987). La prédiction est basée sur les caractéristiques physico-chimiques des deux derniers acides aminés des peptides (en position C terminal) permettant d’obtenir via l’équation du modèle une valeur d’IC50prédictive. L’approche QSAR utilisée pour déterminer l’IC50de nos peptides a été utilisée sur les peptides VPP et IPP de l’art antérieur. Leur IC50est de 26 µM, alors que certains des peptides de l’invention présentent une valeur d’IC50en dessous de 20 µM (jusqu’à 8.7 µM pour les plus actifs), et sont donc à priori plus efficaces.
Les résultats sont regroupés dans les tableaux 10 à 12 ci-dessous.
L’approche QSAR utilisée pour déterminer l’IC50des peptides de l’invention a été utilisée sur les peptides VPP et IPP décrits dans l’art antérieur. Leur IC50est de 26 µM, alors que certains de nos peptides sont en dessous de 20 µM (jusqu’à 8.7 µM pour les plus actifs), et sont donc à priori plus efficaces.
Modulation de l’absorption du calcium
La majorité du calcium consommé est absorbée au niveau intestinal, deux voies de transport du calcium ont été identifiées dans l’intestin, la voie paracellulaire et la voie transcellulaire. Le transport paracellulaire du calcium est une diffusion passive de cet élément du lumen à la muqueuse intestinale, selon le gradient formé entre ces deux compartiments. Deux protéines sont impliquées dans ce transport, les claudines 2 et 12 (CLD-2 -12) qui font partie des jonctions serrées entre les cellules et agissant comme des canaux calciques (Fujita et al., 2008). Le transport transcellulaire du calcium est un transport actif impliquant l’incorporation du calcium au sein des cellules intestinales par un transporteur appelé TRPV6. Le calcium est par la suite transporté et excrété au pôle basal de la cellule dans la muqueuse intestinale. Ces deux voies de transport du calcium sont régulées par la vitamine D, une hormone qui, une fois fixée à son récepteur nucléaire le VDR (Vitamin D Receptor) agit comme un facteur de transcription contrôlant les gènes des CLD-2 -12 et de TRPV6.
Sur cellules Caco-2, mesure de l’incorporation du calcium
La capacité des fermentats à moduler l’absorption du calcium a été évaluée en utilisant les cellules Caco-2. Le test consiste à mettre en contact les fermentats (concentration de 10 g/L) avec les cellules Caco-2 pendant 7h. Après contact, l’incorporation du calcium par les cellules est évaluée par utilisation d’une sonde intracellulaire capable d’émettre une fluorescence en présence de calcium. Après rinçage des cellules Caco-2, la sonde FluoForte® est ajoutée en suivant les instructions du kit FluoForte® calcium assay (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Etats-Unis), la plaque est ensuite incubée à température ambiante pendant 1h, temps de pénétration de la sonde. L’émission de fluorescence est ensuite suivie par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France) avec une longueur d’onde d’excitation à 490 nm pour une émission suivie à 525 nm. L’émission est mesurée pendant 30 sec avec une injection de 25 µL d’une solution de CaCl2à 250 mM entre 9 et 10 sec de cinétique au moyen d’un module d’injecteurs couplé au spectrofluorimètre. Cette injection provoque une entrée brutale de calcium au sein des cellules intestinales ce qui conduit à une augmentation de l’émission de fluorescence. La capacité des souches bactériennes à moduler l’incorporation du calcium dans les cellules est déterminée par cette augmentation de fluorescence après injection du calcium. Les résultats sont ainsi exprimés pour chaque puits par rapport à la moyenne de fluorescence mesurée entre 0 et 9 sec de cinétique, considérée comme la fluorescence basale d’un puits. Un ratio d’augmentation de fluorescence, pour les différentes conditions de contact, est donc obtenu.
L’effet des fermentats obtenus avec les souches VF45A et VFH049 est comparé avec celui du tampon PBS et celui du fermentat contrôle. Les résultats montrent que les fermentats bruts obtenus avec ces deux souches sont capables de moduler positivement l’incorporation du calcium par rapport au tampon PBS et au contrôle (Fig. 5). Ainsi, le ratio d’émission de fluorescence sur l’émission basale est de 1,08 pour le PBS, de 1,23 pour le fermentat contrôle, de 1,3 pour le fermentat produit par la souche VF45A et de 1,31 pour le fermentat produit par la souche VFH049. Lorsque les fermentats ultrafiltrés sont testés, l’effet est cependant moins prononcé pour la souche VF45a que pour la VF49d (Fig. 6). Néanmoins, une tendance à l’augmentation de l’absorption est observée pour les deux souches.
Modulation de l’expression du gène
trpv6
chez les cellules Caco-2
L’objectif de cette partie est d’évaluer la capacité des fermentats à moduler l’expression du gènetrpv6par les cellules intestinales. Une approche par RT-qPCR est conduite en utilisant les cellules Caco-2 comme modèle. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 24 puits à une densité de 40.000 cellules par puits dans un volume final de 500 µL de milieu DMEM complet et incubées pendant 15 jours à 37°C, 5 % de CO2avec un changement du milieu tous les deux jours après 7 jours de culture. Les fermentats sont dilués en milieu DMEM complet à une concentration de 10 g/L de matière sèche. Le tampon PBS dilué dans le milieu DMEM (même facteur de dilution que pour les échantillons) est utilisé en tant que contrôle. Après incubation, les cellules sont lavées deux fois par du tampon PBS, puis un volume de 300 µL de chaque échantillon est déposé dans les puits. La plaque est ensuite incubée pendant 7h à 37°C, 5 % de CO2. Après contact entre les cellules Caco-2 et les échantillons, les puits sont rincés deux fois avec du tampon PBS puis une extraction des ARN par le réactif TRIzol™ est réalisée. Les échantillons d’ARN sont d’abord traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d’ADN co-extrait et/ou restant suite à l’extraction. Un volume de 8 µL contenant 1.000 ng d’ARN est mélangé avec 1 µL de DNase, et 1 µL de tampon DNase (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min, elle est stoppée par l’ajout d’1 µL de solution d’EDTA à 50 mM (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis), selon les instructions fournies. Pour la réaction de qPCR, les échantillons d’ADNc sont dilués (1/16) dans l’H2O. Pour un volume de 2 µL d’échantillon, 18 µL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 µL de Power SYBR® Green PCR Master Mix (2×) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Etats-Unis), 0,6 µL de chaque amorce (10 µM) et 6,8 µL d’H2O. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Detection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58 ou 60°C en fonction du couple d’amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d’une courbe de fusion (melting curve) termine la réaction.
Le gène étudié est le gène codant pour le transporteur du calcium (transient receptor potential selective for calcium) (trpv6) également appelé CaT1 (calcium transporter 1). L’expression de ce gène est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A (ppiA). Les couples d’amorces utilisés, ainsi que leurs températures d’hybridation, sont présentés ci-dessous dans le tableau 13 ci-dessous :
Les échantillons de fermentat ont été mis en contact avec les cellules Caco-2 et les variations de l’expression du gènetrpv6ont ensuite été étudiées par qPCR.
Les fermentats obtenus avec les souches VF45A et VFH049 sont capables de moduler positivement l’expression du gène. Plus particulièrement, le fermentat produit par la souche VFH049 entraîne une surexpression du gène 20 fois supérieure au contrôle (Fig. 7). L’effet des fermentats ultrafiltrés est moins prononcé, non significatif même si une tendance à l’induction du gène est clairement visible pour les deux souches (Fig. 8).Les fermentats produits par les deux souches sont donc capables de moduler à la fois l’incorporation du calcium et l’expression detrpv6par rapport au lait non fermenté.
Etude des caractères probiotiques
La significativité des résultats est évaluée par une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivi d’un test de Tukey pour la comparaison multiple des moyennes. Concernant l’expérience de transport du calcium au travers d’une membrane de cellules Caco-2, le test post-ANOVA est un test de Dunn aboutissant à une comparaison à la moyenne de la condition contrôle. La différence entre les moyennes est considérée comme significative pour une p value < 0,05. Les tests statistiques ont été conduits sous le logiciel R (R core team, 2016, Vienne, Autriche), sur le package R Commander.
Test de la tolérance à l’acidité
Le principe de ce test repose sur la comparaison de la survie d’une souche bactérienne entre une incubation de 2h à pH 2 et une incubation au pH du milieu MRS (pH 6,2). Pour cette expérience, chaque souche de la collection a été cultivée en milieu MRS liquide pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Un volume de 200 µL de culture a ensuite été dilué (1/10) soit dans le même milieu MRS à pH 6,2 (appelé tube A), soit dans un milieu MRS ajusté à pH 2 par de l’acide chlorhydrique (HCl) (appelé tube B). Les tubes A et B ont été incubés à 37°C pendant 2h puis 10 µL de chaque tube ont été étalés sur gélose MRS. Les boites ensemencées ont été incubées pendant 48h à 37°C en condition anaérobie.
La tolérance à l’acidité a été évaluée en comparant les nombres de colonies entre les boites A et B. Les souches ont été réparties en différentes classes de tolérance à l’acidité selon le résultat du ratio B/A. La classe 0 regroupe les souches non tolérantes à l’acidité (aucune colonie sur la boite B). La classe 1 correspond aux souches faiblement tolérantes (boite B = 0 à 30 % des colonies sur la boite A). La classe 2 regroupe les souches présentant une tolérance à l’acidité modérée (boite B = 30 à 80 % des colonies sur la boite A). Enfin la classe 3 correspond aux souches tolérantes à l’acidité (boite B présente plus de 80 % des colonies de la boite A).
Les souches ont été réparties en 4 classes de tolérance allant de la classe 0 (souches non tolérantes), à la classe 3 (souches tolérantes).
Détermination de l’hydrophobie pariétale des souches
L’objectif de ce test est d’évaluer le caractère hydrophobe de la paroi des différentes souches. Un test simple a déjà été mis au point pour évaluer ce critère, il s’agit du test MATS (Microbial Adhesion To Solvents). Il consiste à mesurer l’affection d’une souche bactérienne pour un hydrocarbure apolaire (le n-hexadécane le plus souvent) afin d’estimer l’hydrophobie de la paroi. Pour l’expérience, les souches de la collection ont été cultivées en milieu MRS liquide pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont ensuite lavées deux fois en répétant successivement une étape de centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min, suivi d’une étape de resuspension des cellules dans un tampon Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4. La Densité Optique (DO à 630 nm (DO630nminitiale) a été déterminée au spectrophotomètre ELx808 (BioTek Instruments Inc., Vermont, Etats-Unis). Un volume de 1 mL de suspension a ensuite été mélangé avec 100 µL de n-hexadécane (Acros Organics, Geel, Belgique) en créant un vortex dans le mélange pendant 1 min. La solution a ensuite été mise au repos à température ambiante pendant 15 min puis 100 µL de la phase aqueuse ont été récupérés pour une nouvelle détermination de la DO à 630 nm (DO630nmfinale). L’hydrophobie pariétale des souches a été calculée selon la formule suivante :
Avec %H : le pourcentage d’hydrophobie pariétale, DO630nminitiale : la DO initiale de la suspension et DO630nmfinale : la DO mesurée après ajout et mélange de la suspension avec le n-hexadécane.
Les résultats des tests de résistance à l’acidité et d’hydrophobie pariétale sont représentés sur la Fig. 9 laquelle représente les pourcentages d’hydrophobie pariétale obtenus pour les souches testées en fonction de leur classe de tolérance à l’acidité. Sur la Fig. 9, on remarque que la souche VF50b ne supporte pas l’acidité ce qui n’est pas le cas de la souche VFH049.
Test d’auto-agrégation
Ce test permet d’évaluer la capacité des souches à s’agréger entre elles dans un milieu liquide. Il repose sur la comparaison de la concentration bactérienne au-dessus d’une suspension au temps 0 avec la concentration bactérienne de la même suspension incubée pendant un temps donné sans aucune agitation. Les souches capables d’une forte auto-agrégation vont s’agréger entre elles augmentant ainsi leur vitesse de sédimentation. Les souches sont cultivées en MRS pendant 24h à 37°C puis lavées et re suspendues dans un tampon PBS à une DO à 600 nm de 1. Un volume de 4 mL de suspension est agité de manière à former un vortex pendant 10 sec puis incubé à température ambiante sans agitation. Après 2,5 et 5h d’incubation, 100 µL de milieu sont soigneusement prélevés à la surface de la suspension. Les échantillons prélevés sont ensuite dilués (1/10) dans du tampon PBS pour une mesure de la DO à 600 nm. Le pourcentage d’auto-agrégation des souches (%A) est ensuite calculé selon la relation :
Avec A0 : l’absorbance à 600 nm initiale de la suspension, mesurée au début de l’expérience (et égale à 1) et At : l’absorbance à 600 nm mesurée à 2,5 ou 5h d’incubation. Le % d’agrégation de la souche VFH049 est de 5,38% ± 5,24 au bout de 2,5 heures et de 67,44% ± 6,99 au bout de 5 heures. Pour la souche VF50b, Le % d’agrégation est de 33,33% ± 14,8 au bout de 2,5 heures et de 66,67% ± 17,97 au bout de 5 heures. Les souches sont donc aptes à adhérer aux cellules intestinales.
Evaluation de la tolérance à la digestion gastro-intestinale
Afin d’évaluer la survie des souches pendant et après leur passage au sein du tube digestif, un modèle de digestion statique a été utilisé (Belguesmiaet al. 2016). Ce modèle simule les 3 compartiments principaux du tube digestif à savoir la bouche, l’estomac et l’intestin de façon séquentielle. Chaque compartiment est simulé par l’ajout d’un fluide mimant les conditions physiologiques de cette étape. L’ensemble de la digestion est réalisé en condition stérile, tous les fluides sont autoclavés à 121°C pendant 20 min avant l’expérience, l’ajout des enzymes a lieu après stérilisation et est suivi d’une filtration stérilisante (à 0,2 µm). Les souches sont cultivées dans un milieu MRS pendant 24h à 37°C. Les cellules bactériennes sont lavées deux fois puis re suspendues dans un tampon PBS à une concentration de 109CFU/mL. Pour la digestion, la phase buccale est simulée par l’addition de 8 mL de PBS, ajusté à pH 6.8, à 1 mL de la suspension bactérienne. Le mélange est incubé sous une agitation constante à 200 rpm pendant 5 min à 37°C. La phase gastrique est simulée par l’ajout de 12 mL de PBS à pH 3 supplémenté de pepsine bovine (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 1,56 mg/mL. La suspension est incubée 2h à 37°C en agitation à 200 rpm. Durant l’incubation, le pH de la solution est maintenu entre 3 et 3,5 par l’addition d’acide chlorhydrique (HCl) (1 M) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) (1 M). Pour la phase intestinale, 1 mL de carbonate de sodium (NaHCO3) à 1 M est ajouté au mélange afin de remonter le pH à environ 7 et inactiver la pepsine. Un volume de 12 mL de PBS à pH 8,2 supplémenté des enzymes pancréatiques bovines (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) à 0,28 mg/mL, puis un volume de 6 mL de PBS à pH 8,1 contenant 60 g/L d’Ox-bile (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis) sont ajoutés au mélange afin de simuler les conditions intestinales. Cette étape se déroule pendant 2h à 37°C en agitation à 200 rpm en maintenant le pH entre 7 et 7,5. A la fin de chaque étape de la digestion, un prélèvement de 100 µL du mélange réactionnel est réalisé, ainsi pour une même digestion, 4 échantillons sont obtenus comprenant le prélèvement du tube mère (TM), de la phase salivaire (S), de la phase gastrique après 2h d’incubation (G2), et enfin celui après 2h de phase intestinale (I2). Chaque prélèvement est ensuite dilué (1/10) successivement dans un tampon PBS. Pour la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons, 100 µL des dilutions adéquates sont étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont ensuite incubées à 37°C pendant 48h en condition anaérobie. Après incubation, le dénombrement des CFU permet la détermination de la concentration bactérienne dans les échantillons. Les résultats sont exprimés en CFU/mL. Le nombre initial de cellules bactériennes viables est de 109CFU/mL dans la phase salivaire. Au cours de la DGI, la quantité de bactéries diminue plus ou moins selon les souches, la phase gastrique étant la plus délétère pour toutes les souches. A la fin de cette phase, la souche VFH049 est présente en une quantité de 107,8CFU/mL tandis que la souche VF50b est présente en une quantité égale à 107,2CFU/mL. Les souches VFH049 et VF50b tolèrent donc la digestion gastro-intestinale.
Test de cytotoxicité
Ce test a pour objectif d’évaluer l’éventuelle toxicité des souches vis-à-vis de la barrière intestinale. Les cellules Caco-2 et HT-29 MTX sont utilisées dans ce but.
Pour le test de cytotoxicité, les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits à une densité de 8.000 cellules par puits dans un volume de 150 µL de milieu et cultivées pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2. Avant l’ajout des souches bactériennes, les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS. Les souches bactériennes quant à elles, sont cultivées comme décrit précédemment et suspendues dans le milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107CFU/mL. Pour chaque puits, 150 µL de suspension bactérienne sont ajoutés. Du tampon PBS, dilué avec du DMEM sans ajout tout comme pour les souches, est utilisé comme contrôle négatif. Le contact entre les souches bactériennes et les cellules intestinales a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de CO2. Les souches sont mises en contact à la fois avec les cellules Caco-2 et les cellules HT-29 MTX de façon indépendante. La détermination de la mortalité des cellules intestinales est utilisée ici pour évaluer l’éventuelle toxicité des souches bactériennes. La mortalité des cellules est évaluée par dosage de l’activité de la lactate dehydrogenase (LDH). Cette activité est dosée par le kit LDH activity assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). , ce kit est basé sur la réaction de réduction du Nicotinamide Adénine Dinucléotide oxydé (NAD) en sa forme réduite (NADH) par la lactate déhydrogénase, le NADH pouvant être détecté à 450 nm. Après contact, 50 µL de surnageant sont prélevés dans chaque puits et l’activité de la LDH est dosée en suivant le protocole du kit. L’absorbance de la plaque est lue à 450 nm par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La mortalité des cellules intestinales est calculée en pourcentage de la moyenne des absorbances de la condition contrôle (la proportion de LDH libérée dans cette condition est prise pour référence à 100 %). Pour les souches VFH049 et VF50b, les résultats montrent une absence de toxicité significative envers les deux lignées cellulaires, ce qui suggère que dans ces conditions d’expérience, les souches bactériennes sélectionnées ne sont pas délétères pour les cellules intestinales.
Evaluation de l’adhésion des souches aux cellules intestinales
L’objectif de ce test est d’évaluer la capacité des souches à adhérer aux cellules intestinales. Il est basé sur la comparaison entre la quantité de cellules bactériennes adhérentes à la monocouche de cellules Caco-2 par rapport à la quantité de bactéries initialement ajoutée. Les souches sont cultivées et préparées comme décrit précédemment, une suspension en milieu DMEM sans ajout est préparée à une concentration de 107CFU/mL. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaques 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 µL de DMEM complet. Après incubation pendant 7 jours à 37°C, 5 % de CO2, les cellules sont lavées deux fois avec un tampon PBS. Un volume de 300 µL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits, la plaque est ensuite incubée à 37°C, 5 % de CO2, pendant 2h. La suspension bactérienne utilisée est conservée pour détermination de la concentration en CFU. Après 2h de contact, les cellules Caco-2 sont lavées deux fois avec du tampon PBS afin de retirer les bactéries non adhérentes. Les cellules intestinales sont ensuite lysées par l’ajout de 100 µL de tampon PBS supplémenté avec du Triton X-100 à 0,1 % (v/v). Après incubation pendant 15 min à température ambiante, le lysat et la suspension mère utilisée sont dilués successivement (1/10) en PBS, puis étalés sur une gélose MRS. Les plaques ensemencées sont incubées 48h à 37°C en condition anaérobie. Après dénombrement et détermination de la concentration bactérienne en CFU/mL, le pourcentage de cellules bactériennes adhérentes est calculé par rapport à la concentration obtenue dans la suspension mère représentant la quantité de bactéries ajoutée au début de l’expérience (fixée à 100 %). Le % de cellules adhérentes aux cellules Caco-2 est de 1,48 ±0,41 pour la souche VFH049 et de 0,18 ±0,13 pour la souche VF50b. La souche VFH049 est beaucoup plus adhérente aux cellules intestinales ce qui tend à indiquer qu’elle est davantage susceptible d’avoir une action probiotique.
Activités biologiques des souches sur l’absorption du calcium
Protocole général de contact entre les souches bactériennes et les cellules intestinales
Ce protocole de contact est utilisé pour chaque technique employée dans cette partie. Les souches bactériennes sont cultivées en MRS pendant 24h à 37°C en condition anaérobie. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 10.000 rpm pendant 10 min puis re suspendues dans un tampon PBS, cette étape est répétée une seconde fois pour laver les cellules bactériennes. Une suspension bactérienne est finalement préparée avec du milieu DMEM sans ajout à une concentration de 107CFU/mL.
Les cellules HT-29 MTX sont ensemencées en plaque 24 puits à une concentration de 40.000 cellules par puits dans un volume de 500 µL de DMEM complet. Les cellules Caco-2 sont ensemencées en plaque 96 puits à une concentration de 8.000 cellules par puits dans un volume de 200 µL de milieu DMEM complet. Pour une autre expérience, les cellules Caco-2 sont ensemencées sur inserts placés en plaque 12 puits (membrane en polyester, 0,4 µm, Costar®, Corning, New-York, Etats-Unis) côté apical dans un volume de 500 µL de milieu DMEM complet, un volume de 1.500 µL de ce même milieu est ajouté du côté basal de l’insert. Toutes les cultures cellulaires sont cultivées pendant 15 jours avec un renouvellement du milieu tous les 2 jours lors de la deuxième semaine de culture. Les cellules intestinales sont lavées deux fois avec du tampon PBS avant le contact avec les souches bactériennes. Un volume de 150 µL de suspension bactérienne est ajouté dans chaque puits pour une culture en plaque 96 puitss, et volume de 300 µL est quant à lui ajouté pour un contact en plaque 24 puits ou en inserts sur plaque 12 puits. Dans tous les cas, le contact a lieu pendant 24 h à 37°C, 5 % de CO2. Le contrôle négatif utilisé est un tampon PBS dilué dans du milieu DMEM complet.
Mesure du transport total du calcium
Le transport total du calcium est défini comme étant la part de calcium passant du pôle apical au pôle basal en traversant la barrière épithéliale. Ce transport est évalué par la variation de la concentration en calcium au pôle basal de la barrière cellulaire au cours du temps. Les cellules Caco-2 cultivées en inserts en plaque 12 puits sont utilisées pour cette expérience. Au début du contact avec les souches bactériennes (t = 0h), 10 µL d’une solution de chlorure de calcium (CaCl2) à 250 mM sont ajoutés côté apical de l’insert. Durant le contact, des prélèvements de 100 µL sont réalisés du côté basal de l’insert à 30 min, 7 et 24h de contact. Les échantillons sont conservés à -20°C jusqu’à analyse. Au moment des différents prélèvements, une mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER) est réalisée pour vérifier l’intégrité de la barrière de cellules Caco-2. Cette résistance est mesurée par un voltmètre/ohmmètre MilliCell Electrical Resistance System (Merck Millipore, Burlington, Etats-Unis). Un insert vide sans cellules est utilisé comme blanc pour obtenir la résistance de la barrière cellulaire. La résistance (en Ω) mesurée pour chaque puit est ensuite multipliée par l’aire de l’insert (égale à 1,12 cm² pour l’insert utilisé) pour donner une résistance en Ω.cm-2. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la valeur obtenue à 30 min de contact (fixée à 100 %) pour chaque puits. Afin de mesurer le transport total du calcium, un dosage de la concentration en calcium est réalisé dans les prélèvements réalisés au pôle basal de la membrane de cellules Caco-2 au cours du contact. La détermination de la concentration en calcium est réalisée en utilisant le kit calcium colorimetric assay (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). Ce kit est basé sur la réaction colorimétrique entre les ions calcium et l’ortho-crésolphtaléine formant un complexe coloré pouvant être détecté à 575 nm. Le dosage est réalisé à partir de 25 µL d’échantillons dilués (1/2) dans l’H2O Milli-Q®, en suivant le protocole du kit. La mesure de l’absorbance des échantillons à 575 nm est réalisée par un spectrofluorimètre Xenius XC (Safas Monaco, Monaco, France). La concentration en calcium dans les échantillons est déterminée au moyen d’une gamme étalon de CaCl2, elle est ensuite exprimée en fonction du ratio de la concentration à l’instant t sur la concentration au temps t = 30 min de contact.
Les résultats montrent que la TEER augmente au cours du temps d’incubation avec les souches ainsi que dans la condition contrôle (tampon PBS). Ainsi, pour la souche VFH049, la TEER passe de 100% à t=0 à 245% au bout de 24h de manière quasi linéaire. Pour la souche VF50b, la TEER passe de 100% à t=0 à 231% au bout de 24h de manière quasi linéaire. Par ailleurs, on constate que les souches de l’invention ne permettent pas de moduler significativement l’absorption après 7h de contact par rapport au tampon PBS. Cependant, après 24h d’incubation, la concentration en calcium diminue dans le compartiment basal pour la condition contrôle, tandis qu’une augmentation significative de la quantité de calcium est observée pour les souches VFH049 et VF50b. Ainsi, pour la souche VFH049, le ratio concentration à t=2h / concentration à t=0 atteint la valeur de 1,08 tandis que pour la souche VF50b, le même ratio est de 1,05.
Etude de l’expression de différents gènes impliqués dans le métabolisme du calcium et de la vitamine D
Dans cette partie, les changements dans l’expression de plusieurs gènes après contact de 24h entre les souches bactériennes et les cellules HT-29 MTX ont été étudiés. Le contact a eu lieu en plaque 24 puits comme décrit précédemment. Après contact, les cellules HT-29 MTX sont rincées deux fois avec du tampon PBS. L’extraction des ARN est ensuite réalisée par le réactif TRIzol™ (Sigma-Aldrich, St Louis, Etats-Unis). Les échantillons d’ARN ont d’abord été traités à la DNase pour éliminer les éventuels fragments d’ADN co-extrait et/ou restant suite à l’extraction. Un volume de 8 µL contenant 1.000 ng d’ARN est mélangé avec 1 µL de DNase, et 1 µL de tampon DNase (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis). La réaction a lieu à 37°C pendant 30 min dans un thermocycler Mastercycler gradient (Eppendorf, Hambourg, Allemagne), elle est stoppée par l’ajout d’1 µL de solution d’EDTA à 50 mM (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis) suivi d’une incubation à 65°C pendant 10 min. Par la suite, les échantillons ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant le kit RevertAid H minus first strand cDNA synthesis (ThermoScientific, Waltham, Etats-Unis), selon les instructions fournies. Pour la réaction de qPCR, les échantillons d’ADNc sont dilués (1/16) dans l’H2O. Pour un volume de 2 µL d’échantillon, 18 µL de mélange qPCR sont ajoutés contenant 10 µL de Power SYBR® Green PCR Master Mix (2×) (Applied Biosystems, Life Technologies, Foster City, Etats-Unis), 0,6 µL de chaque amorce (10 µM) et 6,8 µL d’H2O. La fluorescence est suivie pendant la réaction dans un thermocycler CFX Connect Real Time Detection System (Bio-Rad, Hercules, Etats-Unis). Après une étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min, 40 cycles de PCR sont réalisés successivement, un cycle comprend une dénaturation à 95°C pendant 15 sec, une hybridation de 58 à 61°C en fonction du couple d’amorces utilisé pendant 30 sec et une élongation à 72°C pendant 30 sec. La réalisation d’une courbe de fusion (melting curve) termine la réaction. Dans cette partie, 4 gènes sont étudiés, il s’agit d’un gène codant pour la claudine 2 (cld-2), impliquée dans les jonctions serrées et agissant comme un canal pour le passage du calcium. Le gène codant pour le récepteur à la vitamine D (vdr) et enfin le gène codant pour le transporteur du calcium (trpv6). L’expression de ces gènes est normalisée par rapport à celle du gène codant pour la peptidylprolyl isomerase A (ppiA) pris pour référence. Les couples d’amorces utilisés pour les gènes étudiés, ainsi que leurs températures d’hybridation, sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Les résultats sont représentés sur la Fig. 10. L’expression du gène codant pour le récepteur à la vitamine D (vdr) est significativement augmentée en présence de la souche VF50b ; elle est augmentée de 1,8 fois par rapport au tampon PBS. S’agissant de la souche VFH049, elle entraîne une augmentation dans l’expression du gène codant pour le transporteur du calcium (trpv6) d’au moins 3 fois supérieure au contrôle. La souche VF50b est la seule souche entrainant une augmentation d’expression de 2,8 fois supérieure du gènecld-2par rapport au tampon PBS.
Capacité de fermentation de la souche VF50b
Les propriétés de croissance et d’acidification de la souche VF50b sont supérieures à celles d’autres souches de la même espèce, ce qui en fait une souche particulièrement intéressante pour la production artisanale ou industrielle de produits laitiers fermentés (utilisation comme starter de fermentation).
Le tableau 15 ci-dessous compare les propriétés de la souche VF50b à celles d’autres souches de la même espèce (tests réalisés avec du lait de vache) :
On constate une croissance plus importante (densité optique supérieure) et une acidification plus efficace (pH inférieur).
La souche VF50b peut être utilisée pour la fabrication de yaourt, par exemple.
Il est à la portée de l’Homme du métier d’envisager l’étude des peptides inverses et des peptides dextrogyres correspondant aux séquences des peptides de l’invention afin de déterminer si ces peptides ont un effet sur l’ACE et/ou l’absorption du calcium.
Claims (6)
- Mélange de peptides caractérisé en ce qu’il est choisi parmi les mélanges comprenant ou constitués de tous les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, les mélanges comprenant ou constitués desdits peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5, les mélanges comprenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et d’au moins un peptide choisi parmi les peptides correspondant aux séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43, de préférence les mélanges contenant ou constitués des 5 peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 5 et des peptides de séquences SEQ ID 20 à SEQ ID NO 43 et les mélanges comprenant ou constitués des peptides de séquence SEQ ID 20 à SEQ ID 43.
- Mélange de peptides selon la revendication 1, pour son utilisation en tant que médicament et notamment en tant que médicament dans le traitement de l’hypocalcémie ou dans le traitement d’une pathologie causée par une déficience d’absorption du calcium et notamment choisie parmi l’hypertension artérielle, le syndrome métabolique, l’ostéoporose ou dans le traitement de l’hypocalcémie induite par une pathologie choisie parmi les hypoparathyroïdies auto-immunes, le rachitisme hypocalcémique vitamine-D dépendant, l’hétéroplasie osseuse progressive, les hypoparathyroïdies isolées, les hypoparathyroïdies syndromiques, les pseudo hypoparathyroïdies et les rachitismes hypo-carentiels, les maladies causées par une anomalie de la régulation de la calcémie due au dysfonctionnement de la parathormone, de l’absorption de la vitamine D ou du fonctionnement du récepteur du calcium, chez un sujet, notamment un mammifère et particulièrement un humain ayant un tel besoin.
- Composition alimentaire ou pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle contient au moins un excipient pharmaceuticalement acceptable ou un milieu apte à être ingéré et en tant qu’ingrédient actif, au moins un mélange de peptides selon la revendication 1.
- Composition alimentaire ou pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu’elle contient une concentration en peptides lesquels sont identiques ou différents et choisis parmi les peptides de séquence SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 43, supérieure ou égale à 18 mg par gramme.
- Produit choisi notamment parmi les produits alimentaires, notamment les laits fermentés, les jus de fruit(s) et/ou de légume(s) éventuellement fermentés, les légumes et/ou fruits fermentés, les champignons fermentés, la charcuterie, les préparations alimentaires à base de poisson(s) et les produits laitiers obtenus à partir de lait éventuellement écrémé, en particulier de vache, de chèvre, de brebis, à l’exception du lait de yak, ou d’un mélange de laits, caractérisé en ce qu’il contient au moins un mélange de peptides selon la revendication 1 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 3 et 4.
- Complément alimentaire adapté à un sujet, notamment un humain ou un animal choisi en particulier parmi le chat, le chien, les volailles, les ovins, les caprins, les bovins, les reptiles, notamment l’iguane caractérisé en ce qu’il comprend au moins un mélange de peptides selon la revendication 1 et/ou une composition alimentaire ou pharmaceutique selon l’une des revendications 3 et 4.
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