CN108103080A

CN108103080A - 一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列及表达载体

Info

Publication number: CN108103080A
Application number: CN201711487691.2A
Authority: CN
Inventors: 王明珠; 蔡祥胜; 李静静; 李东升; 朱建斌; 李�昊; 佘妙琴; 王进辉; 于莉
Original assignee: Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Wei Tai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-06-01

Abstract

本发明公开了一种编码重组尿酸氧化酶蛋白，该编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明将编码尿酸氧化酶蛋白的核酸序列连接phoA启动子以及周质分泌信号肽StII序列，并转入大肠杆菌中，构建得到高效、稳定分泌表达的UOX大肠杆菌工程菌，然后用低磷酸盐培养基进行培养，发酵结束后，离心去除发酵液上清，获得菌体，用TSE溶液抽提得到所述重组尿酸氧化酶蛋白。纯化后，经检测尿酸氧化酶蛋白具有较好的生物学活性。

Description

一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列及表达载体

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列、表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体、基因工程菌、以及发酵生产重组尿酸氧化酶蛋白的方法。

背景技术

尿酸氧化酶(urate oxidase，Uricase,EC.1.7.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。尿酸广泛存在于细胞内液和体液中。在大多数哺乳类动物,尿酸在肝脏尿酸氧化酶的作用下,被迅速氧化成尿囊素,因而在血中含量很低。高尿酸血症主要出现在痛风和器官移植后，也是白血病和淋巴瘤治疗的一种常见的并发症。由于高尿酸血症的危害大且患者多，治疗高尿酸血症的药物市场广阔。目前常用于治疗高尿酸血症的药物主要为别嘌呤醇，该药物作用于嘌呤代谢中间环节，抑制尿酸形成，使中间产物黄嘌呤和次黄嘌呤增加，缺点是增加了肾脏负担。该药物还能够与白血病治疗药物6-巯基嘌呤交互抑制，降低疗效，不利于白血病的治疗。而尿酸氧化酶作用于嘌呤代谢终末环节，它的作用特点是起效快、不引起体内嘌呤堆积、也未发现与白血病治疗药物6-巯基嘌呤的相互抑制反应。这些优点使得尿酸氧化酶在高尿酸血症的治疗中具有更多优势，有望成为高尿酸血症治疗的首选药物。法国Sanofi公司新近开发了重组黄曲霉菌尿酸氧化酶，已经进入欧洲和美国市场。

发明内容

本发明的目的在于针对以上要解决的技术问题，提供一种编码重组尿酸氧化酶的核酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种表达重组尿酸氧化酶的载体。

本发明的又一个目的是提供一种基因工程菌。

本发明的再一个目的是提供一种发酵生产重组尿酸氧化酶蛋白的方法。

为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案是：

一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列，该核酸序列如SEQ ID NO：1所示。该核酸序列经过密码子偏好改造，并消除了不利于表达的二级结构。

一种表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体，所述质粒载体包含启动子序列、周质分泌信号肽序列以及上述编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。

优选地，所述启动子为phoA。phoA为磷酸盐启动子，可以利用低磷诱导表达，生产成本低。相反，其他的一些启动子多是由IPTG诱导的，容易产生不溶的包涵体，费用高。

优选地，所述周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、TorA或HlyA中的任意一种或多种。

优选地，所述周质分泌信号肽为StII。

本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含如上所述的质粒载体。

优选地，所述基因工程菌为大肠杆菌。

优选地，所述基因工程菌为大肠杆菌YK537。

本发明还提供了一种发酵生产重组尿酸氧化酶蛋白的方法，其包括下列步骤：将如上所述的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，发酵结束后，离心去除发酵液上清，获得菌体，用TSE溶液抽提得到所述重组尿酸氧化酶蛋白。

优选地，所述低磷酸盐培养基的组成为：每1000ml所述低磷酸盐培养基中含蛋白胨10g、酵母浸膏2.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、pH为8的1mol/L Tris-Cl 50ml、苯酚红2ml、葡萄糖10g。

本发明的有益效果是：

本发明所公开的编码重组尿酸氧化酶的核酸序列，是经过大量筛选得到，该核酸序列经过大肠杆菌偏好密码子改造，更适合在大肠杆菌中表达。

本发明将编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列连接大肠杆菌碱性磷酸酶phoA基因启动子以及周质分泌信号肽StII序列，并转入大肠杆菌YK537中，构建得到高效、稳定分泌表达的重组尿酸氧化酶大肠杆菌工程菌。

本发明利用原核表达系统，选用phoA载体构建重组质粒，转化大肠杆菌工程菌YK537。经高密度发酵培养，磷浓度的高低调节诱导，重组尿酸氧化酶以可溶形式存在于细胞周质。重组尿酸氧化酶表达水平高，占菌体总蛋白20％左右。由于表达水平较高，重组尿酸氧化酶可以分泌到细胞周质中，且具有天然活性，不但避免了粗提过程对蛋白质的破坏，而且提高了纯化收率，降低了成本。本发明方法表达量高，简便易行，成本低，便于质量控制，批间差异小，制剂质量稳定纯度高。通过补料方式，使表达水平达到20％以上，菌体产量达80g/L以上。本发明的方法制备的尿酸氧化酶蛋白可加入保护剂制成冻干制剂，用于高尿酸血症的治疗研究。

附图说明

图1为表达载体phoA-重组尿酸氧化酶的质粒构建示意图。

图2为尿酸氧化酶表达与纯化结果。其中，M:分子量Marker；1.诱导前；2.诱导后；3.周质腔抽提；4.离子交换层析纯化；5.分子筛层析。

图3为WB验证尿酸氧化酶结果。其中，M:分子量Marker；1.分子筛层析；2、3：WB检测结果。

图4为尿酸氧化酶活性测定的线性关系标准曲线。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，用构建的载体phoA进行表达，该载体含有phoA启动子，在含低浓度的磷酸盐培养基(低磷培养基)中能启动目的蛋白的表达，同时载体上带有分泌表达的信号肽StII，有助于一种重组尿酸氧化酶真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式分泌到细胞周质间隙中，只通过TSE溶液抽提就可释放出目的蛋白，从而简化了分离纯化工艺。

下面结合具体实验进一步阐述本发明，但不限于此。如未特别指出，以下实施例所涉及的实验操作为本领域技术人员所熟知的。

实施例l

构建重组尿酸氧化酶表达工程菌

1.目的基因合成

根据己知的重组尿酸氧化酶的天然氨基酸序列，经过筛选得到某特异性的重组尿酸氧化酶核酸序列片段，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计重组尿酸氧化酶的编码序列引物，其序列如下。

重组尿酸氧化酶上游引物：

5'GATGAT GCTAGC ATG TCA ACA ACG CTC TCA 3'NheI(SEQ ID NO.2)

重组尿酸氧化酶下游引物：

5'GATGAT GGATCC TTA CAA CTT GGT CTT CTC C 3'BamH I(SEQ ID NO.3)

通过搭桥PCR方法获得重组尿酸氧化酶的全长序列。

所得到的重组尿酸氧化酶序列如SEQ ID NO：1所示，长度为912bp。

本发明所扩增的片段与之前文献报导的不一样，现有技术中文献报道多为扩增表达小片段。而本发明中通过筛选获得片段更长，而且能获得高效扩增，经实际验证，成功率达到100％。本发明所获得重组尿酸氧化酶序列，除了保证一级结构和天然一样，更能保证其空间结构和天然存在的重组尿酸氧化酶更接近。

人工合成得到重组尿酸氧化酶基因的核酸序列，在该基因的5’端引入NheI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点。

2.表达质粒phoA-rhUOX重组尿酸氧化酶的构建与转化宿主菌

表达质粒为phoA表达载体(该表达载体含有phoA分泌信号肽以及周质分泌信号肽为StII)，宿主菌为大肠杆菌YK537。

用NheI和BamHI双酶切分别处理重组尿酸氧化酶和表达载体phoA，37℃酶切2小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有氨苄青霉素(l00ug/mL)的LB平板上挑选阳性克隆。表达载体phoA-重组尿酸氧化酶(phoA-UOX)的质粒构建示意图见图1。

此外，用常规方法进行正、逆向序列分析，并委托广州艾基生物公司进行序列的测定，证实克隆序列与设计序列完全一致。

摇瓶试验，经培养增菌后，将菌转移至低磷培养基培养10h后，离心分析细菌，重悬混匀孵育30分钟，上清液离心去掉沉淀。

实施例2

工程菌高密度发酵的研究

配置低磷培养基：低磷酸盐培养基为每1000ml培养基中含蛋白胨10g，酵母浸膏2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，1mol/L Tris-Cl(pH 8.0)50ml，苯酚红2ml，葡萄糖10g。

从阳性平板上挑取单克隆到含50mI LB培养基的250ml三角烧瓶中，培养过夜。次日，将过夜培养的菌液，按1：100的比例接种于低磷培养基。

适当补加碳源(如甘油)、氮源(如氨水)调节pH7.2～7.4、DO>50％、温度30～32℃、诱导12h结束。样品进行SDS-PAGE检测(并扫描)、测定蛋白含量。结果，如图2所示，重组尿酸氧化酶蛋白表达水平达到20％以上。

在发酵表达重组尿酸氧化酶后，以离心方式去除发酵液上清，获得菌体。

本发明用优化的重组尿酸氧化酶编码序列构建载体并转化大肠杆菌YK537，经高密度发酵培养，低浓度磷酸盐培养基中表达，通过信号肽的引导，本发明的重组尿酸氧化酶以可溶、活性形式存在于细胞周质腔中，同时简便纯化工艺，通过TSE溶液抽提的方法即获得高表达、高得率、极具产业化价值的活性重组尿酸氧化酶蛋白。

实施例3

重组尿酸氧化酶的纯化

配置TSE溶液：20mM Tris-Hcl，pH 7.0，20％葡萄糖，1mM EDTA。

发酵液在4℃下5000rpm离心l0min，得菌体，菌体使用预冷的TSE溶液重悬，并充分搅拌均匀。12000rpm离心10min，得沉淀。加入20Mm，pH7.0的Tris-CL重悬，并充分搅拌均匀。12000rpm离心10min，收上清。结果如图2泳道3所示。

进行三次层析。

1、离子交换层析

层析介质：DEAE层析柱

缓冲液：溶液A：PBS(pH7.4，20mM)

溶液B：PBS(pH7.4,20mM)+1MNaCL

上样：将TSE抽提溶液上样。

清洗：上样后用溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后将溶液B从0％升至100％。

收集：收集重组尿酸氧化酶样品峰。结果如图2泳道4所示。

2、分子凝胶排阻层析

选择S-100分子筛凝胶介质，收峰。经过三步纯化，如图2泳道5示，可得到纯度95％以上的重组尿酸氧化酶蛋白。

实施例4

重组尿酸氧化酶蛋白的鉴定及Western blot检测。

按照Bio-rad电转仪操作方法进行，首先剪PVDF膜适当大小，泡甲醇20min，然后同滤纸及海绵垫一起泡在转移缓冲液中。按照黑板-海绵垫-3层滤纸-PAGE胶-PVDF膜-3层滤纸-海绵垫-白板的顺序，将胶固定好，黑板对着转移槽的黑板，黑板一边放置冰盒，将转移槽放在冰浴中200mA，转膜90min后，将PVDF膜取出用0.01M PBS漂洗，加封闭液(5％脱脂奶粉)封闭2h。然后将1：100封闭液稀释的UOX单抗(abcam)点到PVDF膜上，4℃湿盒中孵育过夜。第二日，取出PVDF膜用PBS洗膜10min×2次。室温下与结合有HRP的兔抗羊的二抗(1：200)孵育90min。用含0.05％Tween 20的PBST洗膜10min×2次，再用PBS洗膜10min。将PVDF膜在DAB显色液中显色，至特异性杂交带出观后，用H₂O终止显色。结果如图3所示，在34KD有目的带。

实施例5

尿酸氧化酶活性测定方法学验证

依据参考文献：Koyama.Y.等人，J.Biochem.，120，969-973

1.测定方法的选择：

1).仪器：紫外可见分光光度计等

2)试剂：

A.20％KOH：20g KOH溶于100ml蒸馏水中。

B.0.001％尿酸溶液：将0.01％尿酸用试剂C稀释10倍；0.01％贮存液：10mg尿酸溶于100ml试剂C中。

C.酶稀释液：3.09g硼酸，0.37g EDTA-Na2·2H2O，0.01g Triton X-100溶于800ml蒸馏水中，用2N NaOH调PH值8.5，再补加蒸馏水至1000ml。

3)检测条件：

温度：25℃

检测波长：290nm

4)操作步骤:

①将下列试剂吸取至试管中：

2.0ml尿酸溶液(试剂B)

0.5ml蒸馏水

②25℃平衡5分钟；

③加0.5ml样品，25℃孵育5分钟；

④加0.2ml KOH(试剂A)终止反应；

⑤读取290nm下的吸收值(As)

2.线性关系

取rUOX酶标准品(Sigma)，以试剂C溶解，配成下列浓度的溶液，进行线性考察，结果见下表1，线性关系标准曲线见图4。

表1：线性考察结果表

结论：线性方程：y＝16.23x-0.596，r＝0.9996。说明rUOX在0.2-1μg/ml范围内呈良好线性关系，故将rUOX测定范围定在此范围内。

3.纯化的尿酸氧化酶活性检测结果如下表2所示：

表2：纯化的尿酸氧化酶活性检测结果

序列表

<110> 广东唯泰生物科技有限公司

<120> 一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列及表达载体

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

atgtcaacaa cgctctcatc atccacctac ggcaaggaca acgtcaagtt cctcaaggtc 60

aagaaggacc cgcaaaaccc aaagaagcag gaggttatgg aggccaccgt cacgtgtctg 120

cttgaaggtg ggttcgacac ctcgtacacg gaggctgaca actcgtccat cgtgccaaca 180

gacaccgtga agaacaccat tctcgtgttg gcaaagacca cggagatttg gccaattgag 240

agatttgcag ccaagctggc cacgcacttt gttgagaagt actcgcacgt ctctggcgtc 300

tccgtcaaga ttgtccagga cagatgggtc aagtacgccg ttgatggcaa gccacacgac 360

cactctttta tccacgaagg tggtgagaag agaatcactg acctgtacta caagagatcc 420

ggtgattaca agctgtcgtc tgccatcaag gacttgacgg tgctgaagtc caccggctcg 480

atgttctacg gctacaacaa gtgtgacttc accaccttgc aaccaacaac tgacagaatc 540

ttgtccaccg acgtcgatgc cacctgggtt tgggataaca agaagattgg ctctgtctac 600

gacatcgcca aggctgcaga caagggaatc tttgacaacg tttacaacca ggctagagag 660

atcaccttga ccacctttgc tctcgagaac tctccatctg tgcaggccac gatgttcaac 720

atggctactc agatcttgga aaaggcatgc tctgtctact cggtttcata cgccttgcca 780

aacaagcact acttcctcat tgacttgaaa tggaaaggtt tggagaacga caacgagttg 840

ttctacccat ctccacatcc aaatgggttg atcaagtgta ctgttgtccg taaggagaag 900

accaagttgt aa 912

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<400> 2

gatgatgcta gcatgtcaac aacgctctca 30

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<400> 3

gatgatggat ccttacaact tggtcttctc c 31

Claims

1.一种编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列，其特征在于，该核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达重组尿酸氧化酶蛋白的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体包含启动子序列、周质分泌信号肽序列以及权利要求1所述的编码重组尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。

3.根据权利要求2所述的的质粒载体，其特征在于：所述启动子为phoA。

4.根据权利要求3所述的的质粒载体，其特征在于：所述周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、TorA或HlyA中的任意一种或多种。

5.根据权利要求2至4任一项所述的质粒载体，其特征在于：所述周质分泌信号肽为StII。

6.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含如权利要求2-5所述的质粒载体。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为大肠杆菌。

8.根据权利要求6或7所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为大肠杆菌YK537。

9.一种发酵生产重组尿酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：将权利要求6-7任一项所述的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，发酵结束后，离心去除发酵液上清，获得菌体，用TSE溶液抽提得到所述重组尿酸氧化酶蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述低磷酸盐培养基的组成为：每1000ml所述低磷酸盐培养基中含蛋白胨10g、酵母浸膏2.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、pH为8的1mol/LTris-Cl 50ml、苯酚红2ml、葡萄糖10g。