CN106967690B - 一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体，本发明还提供该单克隆抗体的制备及其应用。通过基因工程的方法得了高纯度的磷酸酶2Cm重组蛋白；用该重组蛋白筛选出分泌磷酸酶2Cm蛋白抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC NO.13818。该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，能够检测BCAA代谢过程限速酶磷酸酶2Cm的含量，用于辅助诊断与BCKDH缺乏导致的相关疾病，还可用于动物选种育种中的早期筛选。

Description

一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体单克隆抗体，其可用于检测磷酸酶2Cm。
背景技术
磷酸酶2Cm(PP2Cm)在支链氨基酸(BCAA)的分解代谢中起关键的调节作用，有研究发现，PP2Cm对细胞存活及正常发育至关重要，压力条件下能下调其活性。应用蛋白组学的方法研究线粒体磷酸酶，发现PP2Cm能够特异性结合α-支链酮酸脱氢酶复合体(BCKDH)并在底物存在的情况下催化诱导Ser293位点去磷酸化。PP2Cm的缺失使体内及体外底物诱导α-支链酮酸脱羧酶(E1α)去磷酸化的能力消失，而且PP2Cm缺陷鼠表现出的BCAA代谢缺乏症与人类由于BCKDH缺陷导致遗传异常的枫糖尿病的中间症状相似，因此其缺失可能导致枫糖尿病。近期的研究发现，脑、心脏、肝脏及隔膜等组织PP2Cm依赖性BCAA分解代谢水平相对较高，PP2Cm具有与α-支链酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)竞争性结合BCKDH的能力，其二者根据PP2Cm的水平相互协调以保证最佳的BCKDH调节。
尽管长期的研究中发现PP2Cm在BCAA的分解代谢中起到关键的调节作用，但是过去20多年研究中，关于BCKDH和PP2Cm在BCAA代谢中相互之间的分子作用机理研究还不够完善，而且没有特异性检测的单克隆抗体。本单克隆抗体制备方法和应用的公开能够提供一种可被广泛应用、可检测BCAA代谢过程限速酶的抗PP2Cm蛋白单克隆抗体，并有助于BCAA代谢的进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗磷酸酶2Cm的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体的应用。
为了达到上述目的，本发明首先提供一株稳定分泌磷酸酶2Cm单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.13818。该杂交瘤细胞株7P3已于2017年3月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCC No.13818。
本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.13818的杂交瘤细胞株在制备磷酸酶2Cm含量检测试剂盒中的应用。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.13818的杂交瘤细胞株在制备诊断与α-支链酮酸脱氢酶复合体(BCKDH)缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用。
所述的疾病为枫糖尿病。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备磷酸酶2Cm含量检测试剂盒中的应用。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备诊断与α-支链酮酸脱氢酶复合体缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用。
所述的疾病为枫糖尿病。
本发明提供了一种用于检测磷酸酶2Cm含量的试剂盒，含有保藏编号为CGMCCNo.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的诊断试剂。
本发明通过克隆大鼠磷酸酶2Cm的基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，通过分子筛层析和离子交换层析纯化得了高纯度的磷酸酶2Cm重组蛋白；用该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出分泌磷酸酶2Cm抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，它们所产生的抗体即为所需的单克隆抗体。该单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效；可直接通过Western-blot直接用于血清中磷酸酶2Cm含量的检测，也可用于制备ELISA检测试剂盒等。
本发明不仅利用大肠杆菌表达系统成功表达了大鼠磷酸酶2Cm基因的主要抗原表位区，并且得到了高纯度的表达蛋白，进而用于单克隆抗体的制备，并得到了一组特异性更强、亲和力更高的单克隆抗体。该抗体可直接用于血清中磷酸酶2Cm的检测。该单克隆抗体的制备能够监测机体中磷酸酶2Cm的含量，用于辅助诊断与BCKDH缺乏导致的相关疾病，还可用于动物选种育种中的早期筛选。
附图说明
图1为pET-28a-PP2Cm诱导表达后菌液裂解上清/沉淀的SDS-PAGE电泳图。Marker为分子量标记，A1为未经诱导的菌液裂解上清，A2为经IPTG诱导的菌液裂解上清，B1为未经诱导的菌液裂解沉淀，B2为经IPTG诱导的菌液裂解沉淀。结果显示，目的蛋白的表达在包涵体沉淀内。
图2为pET-28a-PP2Cm重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE电泳图。由图中所示，重组PP2Cm蛋白分子量约为38kDa，蛋白纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/ml。可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。
图3为5只小鼠第三次免疫后血清效价检测。
图4为单克隆抗体纯化的SDS-PAGE电泳图。Marker为分子量标记，A为纯化前抗体，B为流穿液，C为纯化抗体。结果表明，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，分别为约55KD的重链和约25KD的轻链。
图5为免疫印迹实验结果，A为IPTG诱导表达的PP2Cm蛋白，B为鼠肝脏细胞制备物。结果显示，单克隆抗体7P3能与原核表达的PP2Cm反应，也可特异性识别鼠肝脏细胞中分子量约为37kDa的条带，具有很高的特异性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1重组大鼠PP2Cm蛋白的制备与纯化
1、基因克隆
利用现有的模板质粒PP2Cm，源基因在T载体上，质粒信息来源于文献：A novelmitochondrial matrix serine/threonine protein phosphatase regulates themitochondria permeability transition pore and is essential for cellularsurvival and development.Genes Dev 2007；21:784–96.[PMC free article][PubMed](由中国农业大学董冰提供)，选取基因部分片段377-1405bp进行克隆重组。在基因5’端和3’端分别加入Ncol和UTR限制性酶切位点，3’Xhol通过酶切位5’Ncol和3’Xhol将基因克隆至载体pET28a(Kan)，并交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：
上游引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGG；
下游引物(5’-3’)：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG。
对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用北京全式金生物技术有限公司生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号H41118)，根据制造商使用说明书实施操作，对PCR扩增产物进行回收。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示重组蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。
2、蛋白表达和纯化
按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至200mlLB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃震荡培养至OD600为0.6-0.8；加入0.1mol/L的IPTG，25℃震荡过夜，收菌后超声破碎，大部分蛋白以包涵体形式呈不可溶性表达，收集包涵体。该重组蛋白为PP2Cm蛋白带有6个组氨酸标签，便于使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。包涵体经过6M盐酸胍变性，用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，用透析的方法进行蛋白复性，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测。pET-28a-PP2Cm诱导表达后菌液裂解上清/沉淀的SDS-PAGE电泳图见图2，pET-28a-PP2Cm重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE电泳图见图3。
实施例2杂交瘤细胞系的建立
1、免疫
将实施例1中纯化的蛋白用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(购自北京维通利华试验动物技术有限公司)腹腔注射每只小鼠50μg蛋白，每14天加强免疫一次，第二次免疫抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，以后均用抗原直接免疫，剂量为50μg/只。第3次加强免疫后3天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量50μg/只。5只小鼠第三次免疫后血清效价检测见图3。免疫小鼠用的抗原为重组PP2Cm抗原蛋白，上述重组PP2Cm抗原蛋白由序列表1中的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达获得。
2、细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0以2:1比例混合，离心1500rpm，5min；弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Sigma公司)，并搅动细胞；在温水中静止1min后，加入10ml无血清的培养液，混匀，离心1000rpm，5min；弃上清后，用20％(v/v)FBS与1×HAT培养基添加剂Hybri-Max(Sigma公司)选择培养液重悬，将细胞悬液铺至96孔细胞培养板内，每孔加200μl。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。
3、挑克隆
融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
4、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和重组蛋白分别进行ELISA筛选；阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基；两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养；五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。
实施例3细胞株建立与腹水诱生法制备单克隆抗体
1、细胞株建立
经常规ELISA检测，得到5个阳性反应的细胞株，分别经过5次亚克隆发现其中1株反应值较高，命名为7P3，并扩大培养，分别用于液氮冻存和单抗腹水的制备。7P3号杂交瘤细胞株于2017年3月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCCNo.13818。
2、腹水制备
对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×105/ml,悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏小鼠；7天后开始收集腹水，取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min；小心吸出中间的腹水收集与离心管中，4℃或-20℃保存。
3、单克隆抗体的纯化
用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，纯化的抗体加50％甘油保存于-20℃。单克隆抗体纯化的SDS-PAGE电泳图见图5。
4、ELISA测定抗体效价
纯化的PP2Cm蛋白以2μg/ml的浓度100μl/孔包被ELISA板，37℃孵育1h，PBST洗3次，3min/次，拍干后用5％脱脂奶粉PBS封闭，37℃孵育1h，PBST洗3次，3min/次，拍干后加入2000×、4000×、8000×、16000×、32000×、64000×、128000×、256000×稀释的本研究制备的抗体，37℃作用1h，PBST洗3次，3min/次，以TMB显色，设正常Balb/c小鼠的血清为阴性对照。
表1间接ELISA结果
Figure BDA0001272845730000071
表1为纯化后单克隆抗体的效价。结果显示，本研究制备的单抗腹水与纯化PP2Cm的反应为阳性，与正常Balb/c小鼠的阴性血清的反应为阴性。
实施例4单克隆抗体的鉴定
1、单克隆抗体亚类鉴定
用100mM PBS(PH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。清空液体，用PBST清洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h；清空液体用PBST清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h；清空液体用PBST洗3次。用封闭液1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当地孔中，37℃孵育1h，清空液体用PBST洗3次。然后每孔加入50μg含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H2O2的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。
2、免疫印迹检测单克隆抗体的特异性
分别以IPTG诱导表达的PP2Cm蛋白和鼠肝脏细胞制备物为电泳样品，蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体(1:1000稀释)4℃过夜。用TBST洗膜后，加入1:5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司)室温孵育1h。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDoc MP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
其免疫印迹实验结果如图5所示，A为IPTG诱导表达的PP2Cm蛋白，B为鼠肝脏细胞制备物。结果显示，单克隆抗体7P3能与原核表达的PP2Cm反应，也可特异性识别鼠肝脏细胞中分子量约为37kDa的条带，具有很高的特异性。
3、亲和常数测定
包被重组PP2Cm蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μg/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。纯化的单克隆抗体，从1:200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。
用酶标仪测定波长450nm的吸光值，画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A，然后利用下列公式计算出亲和常数为1.97×109。亲和常数≈150000×A/抗体原始浓度
4、单抗抗体滴度
用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表明7P3单抗腹水效价达到10-7。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体及其应用
<130> KHP171110811.1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> PP2Cm
<400> 1
gaccacagac agatgactcc tgcctgctac tgctccattt cggagcccag gtgttctcgg 60
tttgatccgg acggaagtgg gcagccagcc acttgggaca attttgggat ctgggataac 120
cgcattgatg agccaattct gttgccacct agcatcaagt atggcaagcc aattcccaaa 180
attagcctgg agaacgtggg ctgtgcctcc ctcattggca aacgaaaaga aaacgaagat 240
cgatttgggt tcgcacagtt gacagaagag gtgctatact ttgcagtcta tgatgggcat 300
ggaggccctg cagctgctga cttctgtcac acacacatgg aaaaatgtgt tacggatttg 360
cttcctcggg agaaagactt ggaaactgtc ctgaccttgg cctttctaga aatagataaa 420
gccttttcaa gttatgccca cctgtctgct gatgcaagcc tcctgacctc tgggactact 480
gcaacagtag ccctgttgag agatggtgtt gaactggtgg tagccagtgt tggagacagc 540
cgggctcttt tgtgtagaaa aggcaaaccc atgaagctga ccactgacca taccccagag 600
agaaaagatg agaaagaaag gatcaagaaa tgcggtgggt ttgtagcttg gaatagcctg 660
ggacagcccc atgtaaatgg cagacttgcg atgacaagga gtattggaga tttggatctt 720
aaagccagtg gtgtaatagc agaacctgag acaaccagga ttaagctcta ccacgctgac 780
gacagtttcc tggtcctcac caccgacggg attaacttca tggtgaatag tcaagagatc 840
tgcgactttg tcaaccagtg ccacgatcct aaagaagcag ctcatgctgt gactgagcag 900
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Claims (8)

1.一株能够稳定分泌磷酸酶2Cm单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.13818。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备鼠磷酸酶2Cm含量检测试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断与鼠α-支链酮酸脱氢酶复合体缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用；所述疾病为枫糖尿病。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备鼠磷酸酶2Cm含量检测试剂盒中的应用。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断与鼠α-支链酮酸脱氢酶复合体缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用；所述疾病为枫糖尿病。
7.一种用于检测磷酸酶2Cm含量的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。
8.含有权利要求2所述单克隆抗体的诊断试剂。
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