CN104498519A

CN104498519A - 一种表达重组载体及其应用

Info

Publication number: CN104498519A
Application number: CN201410799948.8A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 马伟超; 曹伟佳; 李艳; 张弘; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及一种表达重组载体、含其的基因工程菌及利用其全细胞转化生产1,5-戊二胺的方法。本发明公开了一种重组表达载体，其含有表达cadB的核酸序列和表达赖氨酸脱羧酶cadA的核酸序列，上述核酸序列各自受一单独启动子调控转录，其特征在于表达cadB的核酸序列的5’端融合周质分泌信号肽编码序列。本发明所得基因工程菌菌体活性高，初步研究发现全细胞转化343 g/l底物，1,5-戊二胺含量达到221 g/l，远优于现有技术报道。

Description

一种表达重组载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及一种表达重组载体、含其的基因工程菌及利用其全细胞转化生产1,5-戊二胺的方法。

背景技术

1,5-戊二胺（简称戊二胺），即尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，为蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下发生脱羧反应时生成的产物。在农业上, 1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育,改善植物果实发育,提高果实产量；医学上，亦可以作为一种有效治疗痢疾的药物成份；工业上是一种极为重要的化工原料，与己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分别形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10。

目前合成戊二胺的方法有化学合成法、酶转化法、微生物发酵生产法等。化学合成法条件苛刻、污染环境；酶转化法过程复杂、成本较高；微生物直接发酵生产法虽相对生产原料成本较低，但直接发酵生产的戊二胺含量较低，且发酵液成分复杂，副产物多，产物的分离纯化比较困难。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化，是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。相比发酵法，全细胞催化克服了发酵法生产周期长、代谢产物复杂、底物转化率低、产物分离提取困难及能耗高等缺点。相比纯酶催化反应，全细胞中各酶系维持原有状态和特定位置，酶稳定性更好，半衰期更长，适应性更强，更易实现能量和辅酶的原位再生；细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应，催化效率高。全细胞催化的另一特点是不需考虑催化产物对细胞的毒害作用，非常适合类似1,5-戊二胺等对细胞有毒性的物质的生产。

专利CN 103725724 A中利用固定化的蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）AS1.1009，通过流加200 g/l的L-赖氨酸母液，转化生产得到1,5-戊二胺60.54 g/l。

专利US 7189543中将E.coli W3110(ATCC 39936)的赖氨酸脱羧酶基因（cadA）克隆到质粒pUC18上，而后转化到E.coli JM109中构建了一株基因工程菌株，并利用该菌株采用全细胞催化技术生产1,5-戊二胺，其在反应液中浓度达到69 g/l，是目前报道最高产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产1,5-戊二胺基因工程菌的构建、表达和利用该菌生产1,5-戊二胺的方法。

为解决的上述技术问题，本发明公开了一种重组表达载体，其含有表达赖氨酸-尸胺反向转运蛋白（cadaverine/lysine antiporter, cadB）的核酸序列和表达赖氨酸脱羧酶（L-lysine decarboxylase，cadA/LDC）的核酸序列，上述核酸序列各自受一单独启动子调控转录，其特征在于表达赖氨酸-尸胺反向转运蛋白的核酸序列的5’端融合周质分泌信号肽编码序列。

优选的，所述周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、 TorA和HlyA等中之一。

优选的，所述的cadB和表达cadB的核酸序列的5’端融合的周质分泌信号肽编码序列之间，还可以融合链接一段链接肽。

优选的，所述重组表达载体表达cadB的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其突变体。

优选的，所述重组表达载体表达cadA的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其突变体。

另一方面，本发明还公开了一种基因工程菌，其特征在于所述宿主菌含上述重组表达载体。宿主菌没有特别的要求，如BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列均适用于本发明。

另一方面，本发明涉上述基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的用途。

另一方面，本发明还涉及全细胞转化合成戊二胺的方法，所述方法为：

将所述产戊二胺的基因工程菌经种子培养基37℃过夜活化后，按1%比例接种到发酵培养基，37℃，200 rpm, 1 vvm，培养至对数中期，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mM，25~30 ℃、200rpm、1 vvm诱导培养4~6小时，离心收集菌体。转化体系包括：菌体8~20 g DCW/l，磷酸吡哆醛（PLP） 0.01~1 mM，Fe²⁺ 1~100 mM，底物L-赖氨酸量与菌体量比率维持在15~25 g / g DCW，转化反应在pH5~8的缓冲体系中进行，转化条件为30~50 ℃，200 rpm，转化8~24小时，其间补加酸维持pH稳定。

本发明还公开了两种底物补加策略，应用该策略可有效消除转化过程中的底物抑制现象，具体为：

策略1：初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为15~25 g / g DCW，当赖氨酸消耗至2.5 ~ 4 g /g DCW时，补加底物至15~25 g / g DCW。其中，优选初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为18.75 g / g DCW，补加的底物为固体粉末。

策略2：初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为8~12 g / g DCW，转化过程中按10 g L-赖氨酸/g DCW·h速率补加底物。其中，优选初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为10 g / g DCW，补加的底物为固体粉末。

另外，

本发明中，种子培养基为用于培养大肠杆菌的常规培养基，如LB培养基。

本发明中，发酵培养基，可以使用含有可同化的碳源、氮源及无机盐类等的营养培养基。作为碳源，可以使用例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解产物等。作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机和有机铵盐类，尿素，其它含氮化合物，以及肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆水解产物等含氮有机物。作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙、氯化钠、硫酸铵、钼酸铵等。此外，根据需要，可以添加生物素、硫胺素、维生素B6等微量营养源。

本发明中，底物L-赖氨酸优选为L-赖氨酸盐酸盐，也可以为其他赖氨酸盐，例如赖氨酸·己二酸盐、赖氨酸·癸二酸盐、赖氨酸·琥珀酸酸盐等。

本发明中，缓冲体系可以使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液或Tris-盐酸缓冲液等，优选使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。

本发明中，对于转化过程pH的调节，优选使用盐酸或二羧酸。pH调节到5~8，优选控制在pH 5.6。

本发明中，表达cadB的核酸序列来源广泛，如埃希氏杆菌属、梭菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、气单胞菌属、拉乌尔菌、预研菌属、哈夫尼菌属、沙雷菌属、爱德华菌属、特拉布斯氏菌属、克吕沃尔氏菌属、邻单胞菌属、嗜血杆菌属、发光杆菌属微生物的cadB核酸序列均可。

本发明中，表达cadA的核酸序列来源广泛，如埃希氏杆菌属、肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷菌属、爱德华菌属、气单胞菌属芽孢杆菌属、哈夫尼菌属、月形单胞菌属、链霉菌属、艾肯氏菌属、优杆菌属、奈瑟菌属、热原体属或者火球菌属微生物的cadA核酸序列序列均可。

本发明所述的产戊二胺基因工程菌的构建、表达及应用的效果具体体现在：

（1）提供一种依据周质表达信号肽和强启动子的基因构建策略，从而协调赖氨酸的摄取、赖氨酸脱羧及戊二胺外排等转化生产戊二胺的关键过程。

（2）提供了两种底物L-赖氨酸的补加策略，有效消除转化过程中的底物抑制现象，提高了全细胞转化效率。

（3）所得基因工程菌菌体活性高，初步研究发现全细胞转化343 g/l底物，1,5-戊二胺含量达到221 g/l，远优于现有技术报道。

附图说明

图1质粒pETDuet-pelB-CadB-CadA构建示意图。

图2基因工程菌发酵液转化生产1,5-戊二胺试验。

图3不同赖氨酸浓度下全细胞转化生产1,5-戊二胺试验。

图4基因工程菌全细胞转化产物HPLC分析结果（峰1：单丹酰尸胺；峰2：双丹酰尸胺）。

图5基因工程菌全细胞转化产物MS分析结果（峰1，单丹酰尸胺）。

图6基因工程菌全细胞转化产物MS分析结果（峰2，双丹酰尸胺）。

图7融合蛋白pelB-CadB 对1,5-戊二胺生产的影响。

具体实施方式

术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述cadB的突变体或SEQ ID NO.2所述cadA的突变体。相比于天然的蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和／或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。如Soksawatmaekhin W, Uemura T, Fukiwake N, et al.Identification of the cadaverine recognition site on the cadaverine-lysine antiporter cadB. J Biol Chem, 2006.281(39): 29213–29220.。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、产1,5-戊二胺菌株的构建

根据大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)(GenBank: AM946981.2)的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因cadB基因和赖氨酸脱羧酶基因cadA序列设计引物：

CadB-BamHI-ET-F：CGCGGATCCTATGAGTTCTGCCAAG；

CadB-HindIII-ET-R：CCCAAGCTTTTAATGTGCGTTAGACG；

CadA-NdeI-Duet-F：GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG；

CadA-kpnI-Duet-R：GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC。

PCR得到的cadB基因先插入到pET-22b载体的BamH I 和 Hind III位点间，从而构建得到质粒pET22b-cadB。PCR得到的cadA基因插入到pETDuet-1载体的Nde I 和Kpn I 位点间，构建得到质粒pETDuet-CadA。而后，用Hind III 和Xba I酶切得到质粒pET22b-cadB上pelB-CadB片段，并插入到质粒pETDuet-CadA的Hind III - Xba I位点间，从而构建得到质粒pETDuet-pelB-CadB-CadA（图1）。

将构建的质粒pETDuet-pelB-CadB-CadA用常规方法导入大肠杆菌BL21 (DE3)，即得到产1,5-戊二胺的工程菌种，菌株命名为BL-DAB，并以甘油菌或冻干菌种形式保存。

实施例2、基因工程菌发酵液转化生产1,5-戊二胺试验

挑取单菌落于5ml含100 ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1%接种量转接到50 ml 含100 ug/ml 氨苄青霉素的液体发酵培养基中， 37℃、200 rpm 培养至OD600约为0.5。加入IPTG至终浓度0.5 mM，并加入底物L-赖氨酸盐酸盐至终浓度12.5 g/l （相当于L-赖氨酸浓度为10 g/l），30 ℃，200 rpm诱导培养12h。发酵培养基成分为：酵母提取物 0.5 g/l，蛋白胨 1.0 g/l，NaCl 0.5 g/l，3-（N-吗啉基）丙磺酸钠盐（MOPS） 100 mM，pH 7.6。

转化液中L-赖氨酸含量使用SBA-40E型生物传感仪进行检测。1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，反相高效液相色谱检测。

衍生步骤如下：移取100 ul离心后的转化液到5 ml离心管中，依次加入2 M NaOH溶液200 μl, 饱和NaHCO3溶液300 μl ，10 g/1的1,7-二氨基庚烷溶液（内标）100 μl及10 g/l 的丹磺酰氯溶液1 ml。混匀后置于40 ℃水浴中避光反应45 min，而后加入25%的氨水100 μl，混匀后室温避光静置30 min。反应结束后，用乙腈定容至5 ml。

HPLC分析使用agilent 1290 infinity system，色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC条件为：流动相A：100% 乙腈，流动相B：0.1 M 乙酸铵溶液，采用梯度洗脱，条件如下：初始：50% A；19 min：90% A；20-30 min：50% A；流速：1.0 ml/min；柱温：40±1 °C；进样量：10 μl。检测使用荧光检测器 (FLD G1321B)，激发波长：320 nm；发射波长：523 nm。

结果如图2所示，经12h诱导转化后基因工程菌BL-DAB转化得到1,5-戊二胺5.71 g/L，赖氨酸摩尔转化率为87.26%，与对照（初始菌株）BL21 (DE3)相比提高了40.78倍。

实施例3、不同底物浓度下的全细胞转化试验

挑取单菌落于5ml含100 ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1%接种量转接到50 ml 含100 ug/ml 氨苄青霉素的液体发酵培养基中， 37℃、200 rpm 培养至OD600约为0.5。加入IPTG至终浓度0.5 mM，30 ℃，200 rpm诱导培养6 h后10,000 × g离心10 min收集菌体，菌体重悬于Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液 (pH 5.6)中用于全细胞转化试验。发酵培养基成分为：酵母提取物 0.5 g/l，蛋白胨 1.0 g/l，NaCl 0.5 g/l，3-（N-吗啉基）丙磺酸钠盐（MOPS） 100 mM，pH 7.0。

全细胞转化体系包括：菌体0.4 g，磷酸吡哆醛（PLP） 0.01 mM，Fe²⁺ 10 mM，底物L-赖氨酸添加量分别为100 g/l、150 g/l、250 g/l、300 g/l转化反应在pH 5.6的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中进行，转化条件为37 ℃，200 rpm，转化24小时，其间补加9M 盐酸维持pH稳定。

转化液中L-赖氨酸含量使用SBA-40E型生物传感仪进行检测。1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，反相高效液相色谱检测。具体操作见实施例2。

结果如图3所示，高浓度的底物L-赖氨酸对全细胞转化生产1,5-戊二胺存在抑制作用，最适底物赖氨酸浓度为150 g/l （相当于18.75 g 赖氨酸/ g DCW），在该浓度下，1,5-戊二胺产量达到58 g/l，赖氨酸摩尔转化率达到55.61%。

实施例4、补料分批全细胞转化生产1,5-戊二胺试验

挑取单菌落于5ml含100 ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1%接种量转接到250 ml 含100 ug/ml 氨苄青霉素的种子培养基中，37℃、200 rpm 培养8h。而后按5%比例接种到4 L发酵培养基中，37℃，200 rpm, 1 vvm，培养至OD600约为10，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mM，30 ℃、200rpm、1 vvm诱导培养6小时，离心收集菌体。种子培养基为LB培养基；发酵培养基成分为：1.2% (W/V) 蛋白胨、2.4% (W/V) 酵母提取物、0.4% (V/V) 甘油、17 mM KH₂PO₄、72 mM K₂HPO₄。

转化体系包括：菌体8 g DCW/l，磷酸吡哆醛（PLP） 0.01 mM，Fe²⁺ 10 mM。转化反应在pH 5.6的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中进行，转化条件为37 ℃，200 rpm，转化16小时，其间补加9M 盐酸维持pH稳定。

底物为固体L-赖氨酸盐酸盐粉末，底物分别按如下三种策略补加：

策略1：初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为18.75 g / g DCW，当赖氨酸消耗至2.5 ~ 4 g /g DCW时，补加底物至18.75 g / g DCW。

策略2：初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为10 g / g DCW，转化过程中按10 g L-赖氨酸/g DCW·h速率补加底物。

策略3：初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为18.75 g / g DCW，转化过程中每小时检测底物的消耗情况，并补加相应质量的底物以维持底物在18.75 g / g DCW。

转化液中L-赖氨酸含量使用SBA-40E型生物传感仪进行检测。1,5-戊二胺含量用丹磺酰氯衍生化后，HPLC-MS分析。衍生化操作见实施例2。

HPLC-MS分析使用电喷雾离子质谱，色谱柱为Prevail C18反向柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)。HPLC条件为：流动相A：100% 乙腈，流动相B：0.1 M 乙酸铵溶液，采用梯度洗脱，条件如下：初始：50% A；19 min：90% A；20-30 min：50% A；流速：1.0 ml/min；柱温：40±1 °C；进样量：10 μl。检测使用紫外检测器，检测波长254 nm。

结果如表1所示，应用补料策略1进行全细胞转化，1,5-戊二胺含量可达到221 g/l，摩尔转化率达到92%。应用补料策略2亦可得到205 g/l的1,5-戊二胺转化液。此外，补料策略1和策略2在赖氨酸摩尔转化率上没有显著差异，由于补料策略2操作简便，因而其更适用于工业化生产。

转化产物经HPLC-MS分析（如图4、图5、图6所示），峰1分子量为335（336-1=335），峰2分子量为568（569-1=568），分别于单丹酰尸胺和双丹酰尸胺的分子量吻合。

本实施例结果说明本发明所公开的1,5-戊二胺生产菌构建策略可有效协调赖氨酸的摄取、赖氨酸脱羧及戊二胺外排等过程，所构建的菌种生产能力强，配合本发明公开的补料策略，可转化生产得到高浓度的1,5-戊二胺的溶液，远优于现有技术报道。

表1 不同补料策略下全细胞转化生产1,5-戊二胺试验结果*

* 所有数据为三次平行试验的平均值，表示方式为：平均值 ± 标准差。

& 赖氨酸浓度依据累积加入的赖氨酸盐酸盐固体粉末质量换算得到。

a，b同列不同字母表示显著性差异（p< 0.05, n=3）。

实施例5、分泌信号肽的作用验证

根据大肠杆菌E.coli BL21 (DE3) (GenBank: AM946981.2)的赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因cadB基因和赖氨酸脱羧酶基因cadA操纵子序列设计引物：

CadB-BamHI-ET-F：CGCGGATCCTATGAGTTCTGCCAAG；

CadA-kpnI-Duet-R：GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC。

使用上述引物扩增得到CadBA操纵子序列，扩增产物通过酶切连接至质粒pET28a的BamHI 和 NotI 间，从而得到一受T7启动子调控操纵子CadBA表达的重组质粒pET28a-CadBA。此外，利用BglII 和NcoI分别酶切质粒pET28a-CadBA和pET-22b，使用质粒pET-22b的172-bp酶切产物替代质粒pET28a-CadBA的105-bp酶切片段，重新环化后得到一受T7启动子调控操纵子CadBA表达，且在CadB蛋白N端融合分泌信号肽pelB的重组质粒pET28a-pelB-CadBA。将构建的质粒pET28a-CadBA和pET28a-pelB-CadBA用常规方法分别导入大肠杆菌BL21 (DE3)，所得菌株分别命名为BL28-BA和BL28-PBA，并以甘油菌或冻干菌种形式保存。

分别挑取菌株BL21 (DE3)、BL28-BA和BL28-PBA的单菌落于5ml含100 ug/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1%接种量转接到50 ml 含100 ug/ml 氨苄青霉素的液体发酵培养基中， 37℃、200 rpm 培养至OD600约为0.5。加入IPTG至终浓度0.5 mM，并加入底物L-赖氨酸盐酸盐至终浓度12.5 g/l （相当于L-赖氨酸浓度为10 g/l），30 ℃，200 rpm诱导培养12h。发酵培养基成分为：酵母提取物 0.5 g/l，蛋白胨 1.0 g/l，NaCl 0.5 g/l，3-（N-吗啉基）丙磺酸钠盐（MOPS） 100 mM，pH 7.6。

结果如图7所示，基因工程菌BL28-BA和BL28-PBA和对照菌株BL21 (DE3) 相比，单位质量的菌体转化生产1,5-戊二胺能力显著提高(p<0.05)。此外，表达融合蛋白pelB-CadB的菌株BL28-PBA与未融合信号肽pelB菌株BL28-BA相比，单位质量的菌体转化生产1,5-戊二胺能力也有显著提高(p<0.05)。每克BL28-PBA菌株可产出1,5-戊二胺5.4 g，与菌株BL28-BA产量3.1 g/g DCW相比，1,5-戊二胺转化能力提高了1.7倍。

本发明中，cadB和表达cadB的核酸序列的5’端融合的周质分泌信号肽编码序列之间，还可以融合链接一段链接肽。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种表达重组载体及其应用

<130> xb14121902

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> cadB from Escherichia coli BL21 (DE3)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1335)

<400> 1

atg agt tct gcc aag aag atc ggg cta ttt gcc tgt acc ggt gtt gtt 48

Met Ser Ser Ala Lys Lys Ile Gly Leu Phe Ala Cys Thr Gly Val Val

1 5 10 15

gcc ggt aat atg atg ggg agc ggt att gca tta tta cct gcg aac cta 96

Ala Gly Asn Met Met Gly Ser Gly Ile Ala Leu Leu Pro Ala Asn Leu

20 25 30

gca agt atc ggt ggt att gct atc tgg ggt tgg att atc tct att att 144

Ala Ser Ile Gly Gly Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ile Ile Ser Ile Ile

35 40 45

ggt gca atg tcg ctg gcg tat gta tat gcc cga ctg gca aca aaa aac 192

Gly Ala Met Ser Leu Ala Tyr Val Tyr Ala Arg Leu Ala Thr Lys Asn

50 55 60

ccg caa caa ggt ggc cca att gct tat gcc gga gaa att tcc cct gca 240

Pro Gln Gln Gly Gly Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Glu Ile Ser Pro Ala

65 70 75 80

ttt ggt ttt cag aca ggt gtt ctt tat tac cat gct aac tgg att ggt 288

Phe Gly Phe Gln Thr Gly Val Leu Tyr Tyr His Ala Asn Trp Ile Gly

85 90 95

aac ctg gcg att ggt att acc gct gta tct tat ctt tcc acc ttc ttc 336

Asn Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ala Val Ser Tyr Leu Ser Thr Phe Phe

100 105 110

cca gta tta aat gat cct gtt ccg gcg ggt atc gcc tgt att gct atc 384

Pro Val Leu Asn Asp Pro Val Pro Ala Gly Ile Ala Cys Ile Ala Ile

115 120 125

gtc tgg gta ttt acc ttt gta aat atg ctc ggc ggt acc tgg gta agc 432

Val Trp Val Phe Thr Phe Val Asn Met Leu Gly Gly Thr Trp Val Ser

130 135 140

cgt tta acc act att ggt ctg gtg ctg gtt ctt att cct gtg gtg atg 480

Arg Leu Thr Thr Ile Gly Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Val Val Met

145 150 155 160

act gct att gtt ggc tgg cat tgg ttt gat gcg gca act tat gca gct 528

Thr Ala Ile Val Gly Trp His Trp Phe Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Ala

165 170 175

aac tgg aat act gcg gat acc act gat ggt cat gcg atc att aaa agt 576

Asn Trp Asn Thr Ala Asp Thr Thr Asp Gly His Ala Ile Ile Lys Ser

180 185 190

att ctg ctc tgc ctg tgg gcc ttc gtg ggt gtt gaa tcc gca gca gta 624

Ile Leu Leu Cys Leu Trp Ala Phe Val Gly Val Glu Ser Ala Ala Val

195 200 205

agt act ggt atg gtt aaa aac ccg aaa cgt acc gtt ccg ctg gca acc 672

Ser Thr Gly Met Val Lys Asn Pro Lys Arg Thr Val Pro Leu Ala Thr

210 215 220

atg ctg ggt act ggt tta gca ggt att gtt tac atc gct gcg act cag 720

Met Leu Gly Thr Gly Leu Ala Gly Ile Val Tyr Ile Ala Ala Thr Gln

225 230 235 240

gtg ctt tcc ggt atg tat cca tct tct gta atg gca gct tcc ggt gct 768

Val Leu Ser Gly Met Tyr Pro Ser Ser Val Met Ala Ala Ser Gly Ala

245 250 255

ccg ttt gca atc agt gct tca acc atc ctc ggt aac tgg gct gcg ccg 816

Pro Phe Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ile Leu Gly Asn Trp Ala Ala Pro

260 265 270

ctg gtt tct gca ttc acc gcc ttt gcg tgc ctg act tct ctg ggc tcc 864

Leu Val Ser Ala Phe Thr Ala Phe Ala Cys Leu Thr Ser Leu Gly Ser

275 280 285

tgg atg atg ttg gta ggc cag gca ggt gta cgt gcc gct aac gac ggt 912

Trp Met Met Leu Val Gly Gln Ala Gly Val Arg Ala Ala Asn Asp Gly

290 295 300

aac ttc ccg aaa gtt tat ggt gaa gtc gac agc aac ggt att ccg aaa 960

Asn Phe Pro Lys Val Tyr Gly Glu Val Asp Ser Asn Gly Ile Pro Lys

305 310 315 320

aaa ggt ctg ctg ctg gct gca gtg aaa atg act gcc ctg atg atc ctc 1008

Lys Gly Leu Leu Leu Ala Ala Val Lys Met Thr Ala Leu Met Ile Leu

325 330 335

atc act ctg atg aac tct gcc ggt ggt aaa gca tct gac ctg ttc ggt 1056

Ile Thr Leu Met Asn Ser Ala Gly Gly Lys Ala Ser Asp Leu Phe Gly

340 345 350

gaa ctg acc ggt atc gca gta ctg ctg act atg ctg ccg tac ttc tac 1104

Glu Leu Thr Gly Ile Ala Val Leu Leu Thr Met Leu Pro Tyr Phe Tyr

355 360 365

tct tgc gtt gac ctg att cgt ttt gaa ggc gtt aac atc cgc aac ttt 1152

Ser Cys Val Asp Leu Ile Arg Phe Glu Gly Val Asn Ile Arg Asn Phe

370 375 380

gtc agc ctg atc tgc tct gta ctg ggt tgc gtg ttc tgc ttc atc gcg 1200

Val Ser Leu Ile Cys Ser Val Leu Gly Cys Val Phe Cys Phe Ile Ala

385 390 395 400

ctg atg ggc gca agc tcc ttc gag ctg gca ggt acc ttc atc gtc agc 1248

Leu Met Gly Ala Ser Ser Phe Glu Leu Ala Gly Thr Phe Ile Val Ser

405 410 415

ctg att atc ctg atg ttc tac gct cgc aaa atg cac gag cgc cag agc 1296

Leu Ile Ile Leu Met Phe Tyr Ala Arg Lys Met His Glu Arg Gln Ser

420 425 430

cac tca atg gat aac cac acc gcg tct aac gca cat taa 1335

His Ser Met Asp Asn His Thr Ala Ser Asn Ala His

435 440

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> cadB from Escherichia coli BL21 (DE3)

<400> 2

Met Ser Ser Ala Lys Lys Ile Gly Leu Phe Ala Cys Thr Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Gly Asn Met Met Gly Ser Gly Ile Ala Leu Leu Pro Ala Asn Leu

20 25 30

Ala Ser Ile Gly Gly Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ile Ile Ser Ile Ile

35 40 45

Gly Ala Met Ser Leu Ala Tyr Val Tyr Ala Arg Leu Ala Thr Lys Asn

50 55 60

Pro Gln Gln Gly Gly Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Glu Ile Ser Pro Ala

65 70 75 80

Phe Gly Phe Gln Thr Gly Val Leu Tyr Tyr His Ala Asn Trp Ile Gly

85 90 95

Asn Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ala Val Ser Tyr Leu Ser Thr Phe Phe

100 105 110

Pro Val Leu Asn Asp Pro Val Pro Ala Gly Ile Ala Cys Ile Ala Ile

115 120 125

Val Trp Val Phe Thr Phe Val Asn Met Leu Gly Gly Thr Trp Val Ser

130 135 140

Arg Leu Thr Thr Ile Gly Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Val Val Met

145 150 155 160

Thr Ala Ile Val Gly Trp His Trp Phe Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Ala

165 170 175

Asn Trp Asn Thr Ala Asp Thr Thr Asp Gly His Ala Ile Ile Lys Ser

180 185 190

Ile Leu Leu Cys Leu Trp Ala Phe Val Gly Val Glu Ser Ala Ala Val

195 200 205

Ser Thr Gly Met Val Lys Asn Pro Lys Arg Thr Val Pro Leu Ala Thr

210 215 220

Met Leu Gly Thr Gly Leu Ala Gly Ile Val Tyr Ile Ala Ala Thr Gln

225 230 235 240

Val Leu Ser Gly Met Tyr Pro Ser Ser Val Met Ala Ala Ser Gly Ala

245 250 255

Pro Phe Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ile Leu Gly Asn Trp Ala Ala Pro

260 265 270

Leu Val Ser Ala Phe Thr Ala Phe Ala Cys Leu Thr Ser Leu Gly Ser

275 280 285

Trp Met Met Leu Val Gly Gln Ala Gly Val Arg Ala Ala Asn Asp Gly

290 295 300

Asn Phe Pro Lys Val Tyr Gly Glu Val Asp Ser Asn Gly Ile Pro Lys

305 310 315 320

Lys Gly Leu Leu Leu Ala Ala Val Lys Met Thr Ala Leu Met Ile Leu

325 330 335

Ile Thr Leu Met Asn Ser Ala Gly Gly Lys Ala Ser Asp Leu Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Thr Gly Ile Ala Val Leu Leu Thr Met Leu Pro Tyr Phe Tyr

355 360 365

Ser Cys Val Asp Leu Ile Arg Phe Glu Gly Val Asn Ile Arg Asn Phe

370 375 380

Val Ser Leu Ile Cys Ser Val Leu Gly Cys Val Phe Cys Phe Ile Ala

385 390 395 400

Leu Met Gly Ala Ser Ser Phe Glu Leu Ala Gly Thr Phe Ile Val Ser

405 410 415

Leu Ile Ile Leu Met Phe Tyr Ala Arg Lys Met His Glu Arg Gln Ser

420 425 430

His Ser Met Asp Asn His Thr Ala Ser Asn Ala His

435 440

<210> 3

<211> 2148

<212> DNA

<213> cadA from Escherichia coli BL21 (DE3)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2148)

<400> 3

atg aac gtt att gca ata ttg aat cac atg ggg gtt tat ttt aaa gaa 48

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

gaa ccc atc cgt gaa ctt cat cgc gcg ctt gaa cgt ctg aac ttc cag 96

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

att gtt tac ccg aac gac cgt gac gac tta tta aaa ctg atc gaa aac 144

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

aat gcg cgt ctg tgc ggc gtt att ttt gac tgg gat aaa tat aat ctc 192

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

gag ctg tgc gaa gaa att agc aaa atg aac gag aac ctg ccg ttg tac 240

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

gcg ttc gct aat acg tat tcc act ctc gat gta agc ctg aat gac ctg 288

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

cgt tta cag att agc ttc ttt gaa tat gcg ctg ggt gct gct gaa gat 336

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

att gct aat aag atc aag cag acc act gac gaa tat atc aac act att 384

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

ctg cct ccg ctg act aaa gca ctg ttt aaa tat gtt cgt gaa ggt aaa 432

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

tat act ttc tgt act cct ggt cac atg ggc ggt act gca ttc cag aaa 480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

agc ccg gta ggt agc ctg ttc tat gat ttc ttt ggt ccg aat acc atg 528

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

aaa tct gat att tcc att tca gta tct gaa ctg ggt tct ctg ctg gat 576

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

cac agt ggt cca cac aaa gaa gca gaa cag tat atc gct cgc gtc ttt 624

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

aac gca gac cgc agc tac atg gtg acc aac ggt act tcc act gcg aac 672

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

aaa att gtt ggt atg tac tct gct ccg gca ggc agc acc att ctg att 720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

gac cgt aac tgc cac aaa tcg ctg acc cac ctg atg atg atg agc gat 768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

gtt acg cca atc tat ttc cgc ccg acc cgt aac gct tac ggt att ctt 816

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

ggt ggt atc cca cag agt gaa ttc cag cac gct acc att gct aag cgc 864

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

gtg aaa gaa aca cca aac gca acc tgg ccg gta cat gct gta att acc 912

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

aac tct acc tat gat ggt ctg ctg tac aac acc gac ttc atc aag aaa 960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

aca ctg gat gtg aaa tcc atc cac ttt gac tcc gcg tgg gtg cct tac 1008

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

acc aac ttc tca ccg att tac gaa ggt aaa tgc ggt atg agc ggt ggc 1056

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

cgt gta gaa ggg aaa gtg att tac gaa acc cag tcc act cac aaa ctg 1104

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

ctg gcg gcg ttc tct cag gct tcc atg atc cac gtt aaa ggt gac gta 1152

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

aac gaa gaa acc ttt aac gaa gcc tac atg atg cac acc acc act tct 1200

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

ccg cac tac ggt atc gtg gcg tcc act gaa acc gct gcg gcg atg atg 1248

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

aag ggt aat gct ggt aag cgt ctg atc aac ggt tcc att gaa cgt gcg 1296

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

atc aaa ttc cgt aaa gag atc aaa cgt ctg aga acg gaa tct gat ggc 1344

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

tgg ttc ttt gat gtt tgg cag ccg gat cat atc gat acg act gaa tgc 1392

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

tgg ccg ctg cgt tct gac agc acc tgg cac ggc ttc aaa aac atc gat 1440

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

aac gag cac atg tat ctt gac ccg atc aaa gtc acc ctg ctg act ccg 1488

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

ggg atg gaa aaa gac ggc acc atg agc gac ttt ggt att ccg gcc agc 1536

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

atc gtg gcg aaa tac ctc gac gaa cat ggc atc gtt gtt gag aaa acc 1584

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

ggt ccg tat aac ctg ctg ttc ctg ttc agc atc ggt atc gat aag acc 1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

aaa gca ctg agc ctg ctg cgt gct ctg act gac ttc aaa cgt gcg ttc 1680

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

gac ctg aac ctg cgt gtg aaa aac atg ctg ccg tct ctg tat cgt gaa 1728

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

gat cct gaa ttc tat gaa aac atg cgt att cag gaa ctg gct caa aat 1776

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

atc cac aaa ctg att gtt cac cac aat ctg ccg gat ctg atg tat cgc 1824

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

gca ttt gaa gtg ctg ccg acg atg gta atg act ccg tat gct gcg ttc 1872

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

cag aaa gag ctg cac ggt atg acc gaa gaa gtt tac ctc gac gaa atg 1920

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

gta ggt cgt att aac gcc aat atg atc ctt ccg tat ccg ccg gga gtt 1968

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

cct ctg gta atg ccg ggt gaa atg atc acc gaa gaa agc cgt ccg gtt 2016

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

ctg gag ttc ctg cag atg ctg tgt gaa atc ggc gct cac tat ccg ggc 2064

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

ttt gaa acc gat att cac ggt gca tac cgt cag gct gat ggc cgc tat 2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

acc gtt aag gta ttg aaa gaa gaa agc aaa aaa taa 2148

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 4

<211> 715

<212> PRT

<213> cadA from Escherichia coli BL21 (DE3)

<400> 4

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

Claims

1.一种重组表达载体，其特征在于其含有表达cadB的核酸序列和表达赖氨酸脱羧酶cadA的核酸序列，上述核酸序列各自受一单独启动子调控转录，表达cadB的核酸序列的5’端融合周质分泌信号肽编码序列。

2. 如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、TorA或HlyA中之一。

3. 如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述的cadB和表达cadB的核酸序列的5’端融合的周质分泌信号肽编码序列之间，还融合链接一段链接肽。

4. 如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体表达cadB的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其突变体。

5. 如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体表达cadA的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或其突变体。

6. 一种基因工程菌，其特征在于所述宿主菌含如权利要求1-5所述重组表达载体。

7. 权利要求6所述基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的用途。

8. 一种全细胞转化合成戊二胺的方法，包括下列步骤：

a）将权利要求6所述的基因工程菌经种子培养基37℃过夜活化后，按1%比例接种到发酵培养基，37℃，200 rpm, 1 vvm，培养至对数中期；

b)加入诱导剂IPTG至终浓度0.5 mM，25~30 ℃、200rpm、1 vvm诱导培养4~6小时，离心收集菌体；

c)转化反应：菌体8~20 g DCW/l，磷酸吡哆醛 0.01~1 mM，Fe²⁺ 1~100 mM，通过补充底物L-赖氨酸，维持底物L-赖氨酸量与菌体量比率在15~25 g / g DCW，转化反应在pH5~8的缓冲体系中进行，转化条件为30~50 ℃，200 rpm，转化8~24小时，其间补加酸维持pH稳定。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤c中补充底物L-赖氨酸为初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为15~25 g / g DCW，当赖氨酸消耗至2.5 ~ 4 g /g DCW时，补加底物至15~25 g / g DCW，优选的为18.75 g / g DCW。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤c中补充底物L-赖氨酸为初始底物L-赖氨酸量与菌体量比率为8~12 g / g DCW，转化过程中按10 g L-赖氨酸/g DCW·h速率补加底物。