CN111879860A - 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法 - Google Patents

一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111879860A
CN111879860A CN201911179383.2A CN201911179383A CN111879860A CN 111879860 A CN111879860 A CN 111879860A CN 201911179383 A CN201911179383 A CN 201911179383A CN 111879860 A CN111879860 A CN 111879860A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
pentanediamine
internal standard
fermentation
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911179383.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111879860B (zh
Inventor
邓禹
李国辉
王莉
黄荻萱
毛银
赵运英
周胜虎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201911179383.2A priority Critical patent/CN111879860B/zh
Publication of CN111879860A publication Critical patent/CN111879860A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111879860B publication Critical patent/CN111879860B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample

Abstract

本发明公开了一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。本发明针对复杂的发酵液体系，基于内标以及校准曲线的校准，对现有戊二胺检测方法进行了优化与改进，实现了发酵液中戊二胺的准确定量，平均误差在4.53％以内。这种校准方法消除了复杂发酵液体系对戊二胺检测的干扰，实现了戊二胺生物合成过程中的有效检测，为生物法合成戊二胺的工业化进程奠定了基础。

Description

一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法
技术领域
本发明涉及一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。
背景技术
戊二胺，又称为尸胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，由蛋白质腐败时赖氨酸在脱羧酶作用下经脱羧反应生成。戊二胺是一种重要的化工原料，在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，戊二胺可与二元酸进行聚合反应合成优质高分子材料——新型尼龙。
戊二胺化学合成法采用以不可再生的战略石油作为原料，环境污染严重，无法实现可持续发展。利用生物法转化可再生资源来生产戊二胺，具有污染小，环境友好，可持续发展等优点。因此，发酵生产戊二胺是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。目前已有许多利用微生物成功转化可再生资源来生产戊二胺的研究实例。
在微生物转化法生产戊二胺的过程中，需随时对培养液进行戊二胺浓度的检测。在复杂发酵液体系的影响下，如何有效的检测发酵液中戊二胺含量对于菌株戊二胺生产能力的评价而言至关重要。目前，常用的生物胺检测方法有酶生物传感器法、色谱法、电泳法等，其中色谱法应用最为广泛，主要包括高效液相色谱法(HPLC)、离子色谱法(IC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)以及联用技术等。其中HPLC较为常见，该方法的检测通常需要对样品进行衍生化处理，最常用的衍生剂有丹磺酰氯(Dansyl Chloride，Dns-Cl)、苯甲酰氯(Benzoyl Chloride)、荧光素、咔唑乙酰氯(AQC)、邻苯二甲醛(OPA)、荧光胺(FA)、二硝基苯甲酰氯(Dabs-Cl)等。丹磺酰氯衍生试剂具有衍生操作过程简单、衍生物稳定性好、有较强的荧光和紫外吸收、灵敏度高、反应范围宽等优点。因此，丹磺酰氯成为了高效液相色谱检测生物胺应用最多的衍生试剂。
在实验过程中发现，发酵液体系中含有的复杂培养基成分，尤其是蛋白质、氨基酸等物质，会对戊二胺的定量检测造成一定的干扰，使检测值显著低于其实际含量。此外，在发酵时，整个体系中各物质的浓度是时刻动态变化的，这种变化给戊二胺的有效定量检测也带来了一定的挑战。研究发现，发酵培养基中酵母粉含量对戊二胺准确检测的影响最为明显，当体系中存在大量酵母粉时，通过HPLC方法检测得到的戊二胺含量会显著低于其实际含量。同时还发现，同一培养基体系对戊二胺结构相似物质的检测存在着程度不同但规律类似的影响：1,7-庚二胺和1,6-己二胺受酵母粉的影响规律与戊二胺相同，也存在检测得到的浓度低于实际浓度的情况。因此，基于丹磺酰氯衍生化HPLC检测法对发酵液中戊二胺的检测方法进行优化，创新性地提出了一种全新的检测思路：即利用发酵液对内标的干扰效果来指示其对戊二胺的干扰，以减小检测方法的误差，实现复杂体系中戊二胺的精确检测。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法，是以1,7-庚二胺和/或1,6-己二胺二盐酸盐为内标物，对加入内标物的发酵液进行HPLC检测，用校准模型对检测结果校准，计得到戊二胺含量；
所述校准模型为：
Figure BDA0002290846950000021
其中，K：转换系数，A1：戊二胺衍生物峰面积，T1：发酵液体系中戊二胺胺浓度，A2：内标衍生物峰面积，T2：内标浓度。
在一种实施方式中，所述转换系数是以发酵液中的干扰物浓度为参比，计算获得。
在一种实施方式中，所述干扰物为酵母提取物，含有多肽或氨基酸。
在一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
(1)建立模拟戊二胺发酵液体系：SOB培养基为基础体系加入不同浓度的酵母抽提物，建立不同的发酵培养基体系，然后向已建立的不同的发酵培养基中加入戊二胺标准品配制不同浓度的模拟戊二胺发酵液体系；
(2)待测样品前处理：在步骤(1)建立的每个戊二胺发酵液体系中添加终浓度0.1g/L内标物和终浓度为1g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，然后用乙醚进行萃取，乙醚经氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶，经0.22μm滤膜过滤后，放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；
(3)建立戊二胺检测校准曲线：根据步骤(2)中测定的戊二胺和内标物的丹磺酰氯衍生物浓度绘制内标物峰面积与酵母抽提物浓度的关系曲线A和酵母抽提物浓度与转换系数K的关系曲线B；
(4)待测戊二胺发酵液样品前处理：将发酵液样品于10000-13000rpm离心10-15min，去除菌体得到发酵上清液。取等体积的上清液和饱和NaHCO3进行混合，用NaOH调节pH至9-11。添加终浓度为0.1g/L内标物和终浓度为1.0g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应。然后用乙醚进行萃取处理，乙醚经氮吹仪吹干后，再用乙腈复溶，经0.22μm滤膜过滤后放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；
(5)根据关系曲线A和关系曲线B获得转换系数K，再根据校正曲线
Figure BDA0002290846950000022
计算发酵液中戊二胺的浓度；其中，K：转换系数，A1：戊二胺衍生物峰面积，T1：发酵液体系中戊二胺胺浓度，A2：内标衍生物峰面积，T2：内标浓度。
在一种实施方式中，所述内标物为1,7-庚二胺，或1,6-己二胺二盐酸盐，或1,7-庚二胺和1,6-己二胺二盐酸盐按摩尔比为1:1的混合物。
在一种实施方式中，以1,7-庚二胺为内标物时，关系曲线A满足：y1＝-0.0037x1+72.9882；关系曲线B满足：y2＝0.0004x2 2-0.0424x2+1.5355；其中，y1为酵母提取物浓度；x1为1,7-庚二胺衍生物峰面积；y2为转换系数；x2为酵母提取物浓度。
在一种实施方式中，以1,6-己二胺二盐酸盐为内标物时，关系曲线A满足：y1＝-y1＝-0.0038x1+57.4106；关系曲线B满足：y2＝0.0002x2 2-0.0338x2+1.4006；其中，y1为酵母提取物浓度；x1为1,6-己二胺二盐酸盐峰面积；y2为转换系数；x2为酵母提取物浓度。
在一种实施方式中，以1,7-庚二胺和1,6-己二胺二盐酸盐的混合物为内标物时，选择二者中峰形对称、不拖尾的为内标，根据对应的关系曲线A和关系曲线B对测定结果进行校准。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有酵母抽提物。
在一种实施方式中，步骤(1)的培养基为SOB培养基，其成分包括：5g/L酵母粉、20g/L胰蛋白胨、0.95g/L MgCl2、0.5g/L NaCl、0.186g/L KCl、使用NaOH将pH调至7.4。高压蒸汽灭菌，115℃，30min。
在一种实施方式中，步骤(1)所述的不同发酵培养基体系可以为包含5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L和40g/L酵母粉浓度的SOB培养基。
在一种实施方式中，衍生试剂丹磺酰氯母液用丙酮溶解配制。
在一种实施方式中，衍生化反应条件为涡旋1-3min，60-70℃水浴避光反应25-40min；
在一种实施方式中，戊二胺HPLC检测条件为：使用C18(2)分析柱(Compass，250×4.6mm，5μm粒径)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长设定为254nm。流动相A和B分别为超纯水和乙腈(HPLC级，用0.45μm膜滤器过滤)，梯度洗脱程序设定为0-6min55％-70％B，6-10min 70％B，10-18min 70-95％B，18-19min 95％B，19-20min 95-55％B，20-21min 55％B；总流速为0.8mL/min。样品进样量为10μL；每个样品检测时间为21min。
本发明还要求保护上述任一方法在食品、医药、化学领域检测戊二胺或其盐方面的应用。
有益效果：本发明的方法专门针对于发酵液这一复杂体系中戊二胺含量的测定，对现有的丹磺酰氯衍生后的戊二胺HPLC检测方法进行了改进，利用发酵液对内标的干扰效果来指示其对戊二胺的干扰，引入转换系数(K)，建立戊二胺浓度检测校准曲线，最终戊二胺的检测平均误差控制在4.53％以内，实现了微生物发酵生产戊二胺浓度的准确测定，为生物合成戊二胺的工业化进程奠定了检测基础。
附图说明
图1(a)为100mg/L 1,7-庚二胺的峰面积与酵母粉浓度之间的关系曲线A；(b)为酵母粉浓度与转化系数K′之间的关系曲线B；
图2(a)为100mg/L1,6-己二胺二盐酸盐的峰面积与酵母粉浓度之间的关系曲线C；(b)为酵母粉浓度与转化系数K′之间的关系曲线D。
具体实施方式
下述实施例中使用的SOB培养基成分为：
5g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，0.95g/L MgCl2，0.5g/L NaCl，0.186g/L KCl，使用NaOH将pH调至7.4。高压蒸汽灭菌，115℃，30min。
实施例1：1,7-庚二胺为内标物的戊二胺发酵液校准曲线检测法建立
1.模拟构建戊二胺发酵液体系
在SOB培养基中分别添加终浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L的酵母粉。在添加了5g/L酵母粉的SOB培养基中分别添加25mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L的戊二胺标准品，同时均添加0.1g/L的1,7-庚二胺标准品作为内标。再加入1mL浓度为5g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶。于0.22μm滤膜过滤，利用HPLC法检测戊二胺和1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物浓度。在添加了10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L酵母粉的SOB培养基中重复上述操作。
2.建立戊二胺含量检测的校准曲线
由前一步测得的戊二胺和1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积数据(如表1，表2)发现在同一发酵液体系中，两者峰面积之间有明显的相关性。由此引入换算系数K的定义(公式1)：在同一发酵液体系中，HPLC检测到的单位浓度戊二胺的峰面积与单位浓度1,7-庚二胺的峰面积之比。计算各戊二胺发酵液体系中的K值(表3)，在酵母粉浓度相同的一系列戊二胺发酵液体系中，戊二胺浓度对K值的影响较小，故采用K的平均值K′来表示同一发酵液体系中戊二胺与内标物浓度之间的换算关系。
Figure BDA0002290846950000041
K：换算系数，A1：戊二胺衍生物峰面积，T1：发酵液体系中戊二胺浓度，A2：内标衍生物峰面积，T2：内标浓度。
表1戊二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积
Figure BDA0002290846950000051
表2 1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积
Figure BDA0002290846950000052
表3戊二胺和1,7-庚二胺的K值计算
Figure BDA0002290846950000061
结合上述检测结果，建立100mg/L的1,7-庚二胺峰面积与酵母抽提物浓度的关系曲线A，y＝-0.0037x+72.9882，R2＝0.9970；以及酵母抽提物浓度与K′的关系曲线B，y2＝0.0004x2 2-0.0424x2+1.5355，R2＝0.9961；如图1。当检测发酵液中的戊二胺的含量时，只需在样品中加入100mg/L 1,7-庚二胺作为内标，然后，根据HPLC检测获得的1,7-庚二胺衍生物峰面积，从关系曲线-A中找到相对应的酵母粉浓度，再根据确定的体系中酵母粉浓度，从关系曲线-B中确定该体系的换算系数K′，最后通过公式(1)计算戊二胺的浓度。
3.校准曲线法准确性验证
采用上述方法，计算含5g/L酵母提取物的标准戊二胺发酵液体系(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)中检测到的戊二胺含量分别为：25.26mg/L、51.83mg/L、99.74mg/L、157.37mg/L、211.61mg/L，平均误差为3.14％，相对误差值能控制在6％以内。同时按此方式计算其余发酵液体系(酵母粉浓度分别为10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L)中的戊二胺含量，由此获得的戊二胺检测浓度的平均误差为4.35％，相对误差能控制在8.15％以内，能有效地消除了培养基体系的干扰。
4.利用基于1,7-庚二胺建立的戊二胺标准曲线法检测发酵液中戊二胺浓度
采用BL21(DE3)进行戊二胺发酵表达，于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养4h后，添加0.1mM IPTG和终浓度为15g/L的赖氨酸诱导戊二胺合成。诱导表达36h后，检测发酵液中戊二胺的含量。
取500μL戊二胺发酵液与500μL饱和NaHCO3混合，用NaOH调节pH至9.4，在发酵上清液样品中添加100mg/L 1,7-庚二胺作为内标物，加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡1min混匀，于60℃水浴条件下避光反应30min。反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干，用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后等待HPLC检测。
使用安捷伦porpshell120EC-C18分析柱(4.6×150mm，4μm)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长为254nm；流动相A和B分别为超纯水和HPLC级乙腈，经0.22μm膜滤器过滤后使用；总流速为0.7mL/min，采用梯度洗脱程序，具体设定如下：0-4min，55％-70％B；4-6.7min，70％B；6.7-12min，70-95％B；12-12.6min，95％B；12.6-13.5min，95-55％B；13.5-16min，55％B。样品的进样量为10μL。最终，根据校准曲线法计算戊二胺含量，获得发酵36h后的戊二胺浓度为0.65g/L，实现了发酵液中戊二胺含量的有效检测。
实施例2：1,6-己二胺二盐酸盐为内标物的戊二胺发酵液校准曲线检测法建立
1.模拟构建戊二胺发酵液体系
在SOB培养基中分别添加终浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L的酵母粉。在添加了5g/L酵母粉的SOB培养基中分别添加25mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L的戊二胺标准品，同时均添加100mg/L的1,6-己二胺二盐酸盐标准品作为内标。再加入0.5mL浓度为10mg/mL的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶。于0.22μm滤膜过滤，利用HPLC法检测戊二胺和1,6-己二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物浓度。在添加了10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L酵母粉的SOB培养基中重复上述操作。
2.建立戊二胺含量检测的校准曲线
由前一步测得的戊二胺和1,6-己二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积数据如表4、表5所示，发现在同一发酵液体系中，两者峰面积之间有明显的相关性。由此引入转换系数K的定义(公式1)：在同一发酵液体系中，HPLC检测到的单位浓度戊二胺的峰面积与单位浓度1,6-己二胺二盐酸盐的峰面积之比。计算各戊二胺发酵液体系中的K值(表6)，在酵母粉浓度相同的一系列戊二胺发酵液体系中，戊二胺浓度对K值的影响较小，采用K的平均值K′来表示同一发酵液体系中戊二胺与内标物浓度之间的换算关系。
表4以1,6-己二胺二盐酸盐为内标的戊二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积
Figure BDA0002290846950000081
表5 1,6-己二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积
Figure BDA0002290846950000082
表6戊二胺和1,6-己二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积及K值计算
Figure BDA0002290846950000091
结合上述检测结果，建立100mg/L的1,6-己二胺二盐酸盐峰面积与酵母抽提物浓度的关系曲线C，y＝-0.0038x+57.4106，R2＝0.9963；以及酵母抽提物浓度与K′的关系曲线D，y＝0.0002x2-0.0338x+1.4006，R2＝0.9966(如图2)。当检测发酵液中的戊二胺的含量时，只需在样品中加入100mg/L 1,6-己二胺二盐酸盐作为内标，然后，根据HPLC检测获得的1,6-己二胺二盐酸盐衍生物峰面积，从关系曲线-A中找到相对应的酵母粉浓度，再根据确定的体系中酵母粉浓度，从关系曲线-B中确定该体系的换算系数K′，最后通过公式(1)计算戊二胺的浓度。
3.校准曲线法准确性验证
采用上述方法，计算含5g/L酵母提取物的标准戊二胺发酵液体系(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)中检测到的戊二胺含量分别为：24.96mg/L、50.47mg/L、99.44mg/L、149.77mg/L、205.36mg/L，平均误差为0.90％，相对误差值能控制在3％以内。同时按此方式计算其余发酵液体系(酵母粉浓度分别为10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L)中的戊二胺含量，由此获得的戊二胺检测浓度平均误差为4.53％，相对误差能控制在8.24％以内，能有效地消除了培养基体系的干扰，检测发酵体系中的戊二胺含量。
4.利用基于1,6-己二胺二盐酸盐建立的戊二胺标准曲线法检测发酵液中戊二胺浓度
采用BL21(DE3)于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养6h后，添加0.1mM IPTG和18g/L赖氨酸诱导戊二胺的催化合成。诱导表达30h后，进行取样，检测发酵液中戊二胺的含量。
取500μL戊二胺发酵液与500μL饱和NaHCO3混合，用NaOH调节pH至9.4，在发酵上清液样品中添加100mg/L 1-6-己二胺二盐酸盐作为内标物，再加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡2min混匀，于70℃水浴条件下避光反应25min；反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干；用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后等待HPLC检测。
使用安捷伦porpshell120EC-C18分析柱(4.6×150mm，4μm)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长为254nm；流动相A和B分别为超纯水和HPLC级乙腈，经0.22μm膜滤器过滤后使用；总流速为0.7mL/min，采用梯度洗脱程序，具体设定如下：0-4min，55％-70％B；4-6.7min，70％B；6.7-12min，70-95％B；12-12.6min，95％B；12.6-13.5min，95-55％B；13.5-16min，55％B。样品的进样量为10μL。最终，采用校准曲线法计算戊二胺含量，获得发酵30h后的戊二胺浓度为0.43g/L。
实施例3：双内标曲线法检测发酵液中戊二胺含量
采用BL21(DE3)于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养8h后，添加0.1mM IPTG和20g/L赖氨酸诱导戊二胺的催化合成。诱导表达36h后，取样检测发酵液中戊二胺的含量。
取500μL戊二胺发酵液与500μL饱和NaHCO3混合，用NaOH调节pH至9.4。为了提高校准的准确性，在发酵上清液样品中添加终浓度100mg/L 1,7-庚二胺和100mg/L 1-6-己二胺二盐酸盐两种物质作为内标物，相互校准戊二胺的检测。加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡1min混匀。60℃水浴条件下避光反应30min，反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干，用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测。最终，选择出峰分离效果较好的内标物，按照其对应的实施例1或实施例2的校准曲线进行计算，确定发酵36h后的戊二胺浓度为0.72g/L，实现了发酵液中戊二胺含量的有效检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法，其特征在于，是以1,7-庚二胺和/或1,6-己二胺二盐酸盐为内标物，对加入内标物的发酵液进行HPLC检测，用校准模型对检测结果校准，计得到戊二胺含量；
所述校准模型为：
Figure FDA0002290846940000011
其中，K：转换系数，A1：戊二胺衍生物峰面积，T1：发酵液体系中戊二胺胺浓度，A2：内标衍生物峰面积，T2：内标浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转换系数是以发酵液中的干扰物浓度为参比，计算获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干扰物为酵母提取物，含有多肽或氨基酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)建立模拟戊二胺发酵液体系：向用于微生物发酵的培养基中加入不同浓度的酵母提取物，建立不同的培养基体系，然后向建立的培养基体系中加入戊二胺标准品，得到不同浓度的模拟戊二胺发酵液体系；
(2)待测样品前处理：在步骤(1)建立的每个戊二胺发酵液体系中添加终浓度0.1g/L内标物和终浓度为1g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹后，用乙腈溶液复溶，滤膜过滤后，放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；
(3)建立戊二胺检测校准曲线：根据步骤(2)中测定的戊二胺和内标物的丹磺酰氯衍生物浓度绘制内标物峰面积与酵母抽提物浓度的关系曲线A和酵母抽提物浓度与转换系数K的关系曲线B；
(4)待测戊二胺发酵液样品前处理：向待测发酵液样品中加入内标物和衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，然后用乙醚进行萃取，将萃取液氮吹，再用乙腈溶液复溶，经滤膜过滤后进行HPLC检测；
(5)根据HPLC检测获得的内标物衍生物峰面积，从关系曲线A中找到相对应的参比物浓度，再根据确定的体系中参比物浓度，从关系曲线B中确定该体系的转换系数K′，最后通过公式
Figure FDA0002290846940000012
计算戊二胺的浓度；其中，K：转换系数，A1：戊二胺衍生物峰面积，T1：发酵液体系中戊二胺浓度，A2：内标衍生物峰面积，T2：内标浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内标物为1,7-庚二胺，或1,6-己二胺二盐酸盐，或1,7-庚二胺和1,6-己二胺二盐酸盐按摩尔比为1:1的混合物，内标物的浓度为0.05～0.15g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以1,7-庚二胺和1,6-己二胺二盐酸盐的混合物为内标物时，选择二者中峰形对称、不拖尾的为用于校准的内标物，根据对应的校准曲线对测定结果进行校准。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述衍生试剂丹磺酰氯母液用丙酮溶解配制。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，衍生化是在60-70℃水浴避光反应25-40min。
9.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述HPLC检测条件为：使用C18色谱柱，检测波长为254nm，流动相包括A相和B相；A相为超纯水，B相为乙腈；流速为0.8mL/min，样品进样量为10μL；检测时间≥21min；采用梯度洗脱，洗脱程序具体为：
0-6min：55％-70％B；6-10min：70％B；10-18min：70-95％B；18-19min：95％B；19-20min：95-55％B；20-21min：55％B。
10.权利要求1～9任一所述方法在食品、医药、化学领域检测戊二胺或其盐方面的应用。
CN201911179383.2A 2019-11-27 2019-11-27 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法 Active CN111879860B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911179383.2A CN111879860B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911179383.2A CN111879860B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111879860A true CN111879860A (zh) 2020-11-03
CN111879860B CN111879860B (zh) 2021-09-28

Family

ID=73154233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911179383.2A Active CN111879860B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111879860B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1750126A1 (en) * 2004-05-26 2007-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Method and apparatus for analyzing aminofunctional compound
CN102914606A (zh) * 2012-10-20 2013-02-06 江南大学 白酒中多种生物胺的定性与定量方法
CN103822998A (zh) * 2012-11-19 2014-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 基于液质联用的丹磺酰氯衍生血浆中胺类物质的分析方法
CN103837635A (zh) * 2014-03-27 2014-06-04 中国热带农业科学院农产品加工研究所 一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法
CN104498519A (zh) * 2014-12-19 2015-04-08 南京工业大学 一种表达重组载体及其应用
CN106770864A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 光明乳业股份有限公司 柱前衍生化法和发酵乳制品中组胺的检测方法
JP6158428B2 (ja) * 2014-04-04 2017-07-05 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ １，５−ジアミノペンタンの精製方法
CN109060980A (zh) * 2018-08-07 2018-12-21 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种检测那西肽发酵液中那西肽含量的方法
CN110468167A (zh) * 2018-05-04 2019-11-19 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产1,5-戊二胺的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1750126A1 (en) * 2004-05-26 2007-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Method and apparatus for analyzing aminofunctional compound
CN102914606A (zh) * 2012-10-20 2013-02-06 江南大学 白酒中多种生物胺的定性与定量方法
CN103822998A (zh) * 2012-11-19 2014-05-28 中国科学院大连化学物理研究所 基于液质联用的丹磺酰氯衍生血浆中胺类物质的分析方法
CN103837635A (zh) * 2014-03-27 2014-06-04 中国热带农业科学院农产品加工研究所 一种超高效合相色谱法测定食品中生物胺含量的方法
JP6158428B2 (ja) * 2014-04-04 2017-07-05 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ １，５−ジアミノペンタンの精製方法
CN104498519A (zh) * 2014-12-19 2015-04-08 南京工业大学 一种表达重组载体及其应用
CN106770864A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 光明乳业股份有限公司 柱前衍生化法和发酵乳制品中组胺的检测方法
CN110468167A (zh) * 2018-05-04 2019-11-19 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产1,5-戊二胺的方法
CN109060980A (zh) * 2018-08-07 2018-12-21 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种检测那西肽发酵液中那西肽含量的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVANA MITAR ET AL.: "The Content of Biogenic Amines in Croatian Wines of Different Geographical Origins", 《MOLECULES》 *
SI-JIN LIUA ET AL.: "A comparative analysis of derivatization strategies for the determination of biogenic amines in sausage and cheese by HPLC", 《FOOD CHEMISTRY》 *
张来颖 等: "柱前衍生－高效液相色谱法测定发酵型饮品中的8 种生物胺", 《中国卫生检验杂志》 *
曾萍 等: "六类鱼制品中生物胺的HPLC法测定", 《现代食品科技》 *
朱成龙: "产生物胺酒酒球菌及葡萄酒中生物胺的检测", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
王晓云: "发酵液中戊二胺的分离分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111879860B (zh) 2021-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107085068A (zh) 衍生化hplc－dad法测定药物中小分子脂肪胺的方法
Alwael et al. Development of a rapid and sensitive method for determination of cysteine/cystine ratio in chemically defined media
CN109030658B (zh) 一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法
CN110849980A (zh) 一种l-丙氨酸异丙酯中对映异构体含量的检测方法
Duan et al. Ultrahigh-performance supercritical fluid chromatography and detection of multiple biogenic amines in gentamicin sulfate: method development using computer-assisted modeling
CN111879860B (zh) 一种精确检测发酵液中戊二胺含量的方法
CN111879861B (zh) 一种精确检测发酵液中己二胺含量的方法
CN112730695A (zh) 一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法
CN110068632A (zh) 基于顶空气相色谱测量壳聚糖衍生物氨基含量的方法
CN105628631B (zh) 一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法
CN111879859B (zh) 一种精确检测发酵液中丁二胺含量的方法
CN110715986A (zh) 保健食品中盐酸氨基葡萄糖的测定方法
CN106596783A (zh) 一种测定大蒜素片中大蒜素含量的方法
CN114563495B (zh) 一种乙酰半胱氨酸及其有关物质的检测方法
CN114324647B (zh) 一种同时测定奶粉中维生素k1和k2的方法与应用
CN112505223B (zh) 一种同时检测食品中毒黄素和米酵菌酸含量的方法
CN112881550B (zh) 一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法
CN105067718B (zh) 一种低聚木糖含量的检测方法
CN103163101B (zh) 一种快速测定奶制品中三聚氰胺的方法
CN109387588B (zh) 水溶性紫外吸收剂的分离方法及其应用
CN108088929B (zh) 一种左旋苯甘氨酸乙基邓钾盐的分析方法
CN108645947A (zh) 一种酱油中酪胺含量的检测方法
CN107356687B (zh) 一种丙氨酰-酪氨酸含量的检测方法
CN111474249A (zh) 一种检测环境水样中有机醇胺类化合物的方法
Yu et al. A rapid and rapid method to quantify poly (γ-glutamic acid) content via copper ion complexation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant