CN114480357A

CN114480357A - 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

Info

Publication number: CN114480357A
Application number: CN202210086071.2A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 韩瑾; 徐美娟; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-01-25
Also published as: CN114480357B

Abstract

本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ‑氨基丁酸生产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述谷氨酸脱羧酶突变体酶活提高19.8％，同时在60℃孵育24h仍能保持90％的催化活性。以重组谷氨酸棒杆菌的谷氨酸脱羧酶突变体进行转化时，在5L罐中12h分批补料800g底物最终产量高达547.51g/L，比序列如SEQ ID NO.3所述的谷氨酸脱羧酶提高约67.13％，最终底物摩尔转化率达到97.67％。本发明有效提高谷氨酸脱羧酶的酶活以及热稳定性，为工业上高产γ‑氨基丁酸奠定了基础。

Description

一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是指一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)，又名4-氨基丁酸，是一种天然的非蛋白氨基酸，广泛分布在微生物、动物、人体以及植物中。GABA主要作为中枢神经系统的一种抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、预防肥胖及糖尿病等功能。目前工业上微生物法生产GABA主要是用谷氨酸脱羧酶进行全细胞催化，但由于谷氨酸脱羧酶热稳定性较差，因此提高谷氨酸脱羧酶的酶活以及热稳定性对于工业生产具有重要意义。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，并且是一种食品级(GRAS)微生物，以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞进行工业生产GABA更具有安全性，生产的产品可以广泛应用于食品行业。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用。本发明以植物乳杆菌GB 01-21为出发菌株进行ARTP诱变得到植物乳杆菌HG-06，以所获得菌株植物乳杆菌HG-06的谷氨酸脱羧酶为亲本的谷氨酸脱羧酶突变体、包含谷氨酸脱羧酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的谷氨酸脱羧酶突变体酶活及热稳定性均有所提高，将其构建到谷氨酸棒杆菌，全细胞催化效率较高，具有良好的工业前景。

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列由SEQ ID NO 3所示。

本发明的第二个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶突变体，所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施例中，编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列由SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体以pET-28a、PXMJ-19或PMA5作为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种重组菌，包括所述重组表达载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌作为宿主菌。

本发明的第六个目的是提供所述的谷氨酸脱羧酶突变体在合成γ-氨基丁酸生产中的应用。

在本发明的一个实施例中，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为底物，以谷氨酸脱羧酶突变体为催化剂，生产制备γ-氨基丁酸。

在本发明的一个实施例中，合成γ-氨基丁酸的反应条件为25℃-60℃下反应10h以上。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

所述植物乳杆菌HG-06诱变菌株谷氨酸脱羧酶与出发菌株GB 01-21谷氨酸脱羧酶相比具有四个氨基酸残基突变，分别是第72位脯氨酸突变为苏氨酸、第154位丙氨酸突变为苏氨酸、第185位甲硫氨酸突变为缬氨酸以及第412位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

本发明所述突变是将ARTP诱变得到的植物乳杆菌HG-06来源的谷氨酸脱羧酶第309位酪氨酸突变为赖氨酸。

本发明通过将序列为SEQ ID NO.3中的第309位酪氨酸残基突变成赖氨酸残基，不仅提高谷氨酸脱羧酶在较高温度下酶活及稳定性，还增强了该酶在谷氨酸棒杆菌中合成γ-氨基丁酸的能力，使其更适应于工业生产。试验结果表明，在不同温度下本发明的谷氨酸脱羧酶突变体比亲本谷氨酸脱羧酶的酶活均有所上升，并且酶活最高比原始提高了19.8％，同时在60℃孵育24h仍能保持90％的催化活性。在5L罐中12h分批补料800g底物最终产量高达547.51g/L，比亲本的谷氨酸脱羧酶(序列如SEQ ID NO.3所述)67.13％，最终底物摩尔转化率达到97.67％。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明野生酶和突变酶在不同温度下的酶活。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1含编码谷氨酸脱羧酶突变体的基因的重组表达载体的构建

以含有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的pET-28a重组质粒为模板，分别以P1/P2、P3/P4为引物，扩增出两个突变位点前后的两段基因，采用融合PCR法构建突变基因，即得到SEQ ID NO.2所示的基因lpgad^Y309K。

P1：ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAAT

P2：TCAGATTTCCGGATGGCATTCTTTCGC

P3：AAAGTTAGTAAATTAGGTGGGGAGTTG

P4：TCAGTGTGTGAATAGGTATTTCTTAGG

利用限制性内切酶HindIII/Ecor I、BamHI/Hind III、BamHI/Mlu I分别对表达质粒pET28a、PXMJ-19、PMA5进行酶切处理以获得线性化载体，目的基因与线性化载体连接后获得重组质粒pET28a-lpgad^Y309K、PXMJ19-lpgad^Y309K、PMA5-lpgad^Y309K，将重组质粒用化学转化法转化至大肠杆菌JM109中，分别涂布于含卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有编码谷氨酸脱羧酶突变体的基因的重组表达载体成功转化至克隆载体大肠杆菌JM109中，经测序验证突变成功的菌液提取重组质粒保存于-20℃冰箱。测序工作由苏州金唯智完成。

实施例2含有谷氨酸脱羧酶突变体工程菌的构建

采用化学法将构建成功的pET28a-lpgad^Y309K重组质粒转化至大肠杆菌BL21中构建E.coli BL21/pET28a-lpgad^Y309K重组菌株，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃下过夜培养，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，验证突变成功的菌液加入甘油并于-80℃冰箱保藏。

采用电穿孔法将构建成功的PXMJ19-lpgad^Y309K重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032中构建C.glutamicum 13032/PXMJ19-lpgad^Y309K重组菌株，涂布于含氯霉素抗性的BHI平板，30℃下培养24h-36h，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，验证突变成功的菌液加入甘油并于-80℃冰箱保藏。

实施例3野生酶和突变酶在不同温度下的酶活测定

重组大肠杆菌经过16℃诱导12h后离心收集菌体破碎细胞，采用镍柱进行蛋白纯化，所得纯化酶添加10％的甘油于4℃贮存备用。实验测定了谷氨酸脱羧酶lpgad野生型(序列见SEQ ID NO.3)以及lpgad^Y309K突变体在25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、55℃、60℃时与L-谷氨酸反应时的酶活(如图1所示)，显示出lpgad^Y309K突变体比野生型具有更高的催化活性，同时在60℃孵育24h仍能保持90％的催化活性。

定义酶活单位为：1个酶活单位(U)等于在30℃下，在1min内催化L-谷氨酸生成1nmolγ-氨基丁酸所需的酶量。比酶活为1mg湿细胞的酶活，单位为U/mg。酶与底物发生脱羧反应的1mL反应体系采用的各物质浓度为：0.01mM PLP、100mM L-谷氨酸钠。在反应之前分别把缓冲液和酶液在30℃下预热5min，然后混匀，在30℃下反应30min，最后迅速煮沸终止反应，离心。用5％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。

HPLC：取反应液用5％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右离心，取上清液用0.22μ膜进行过滤处理。然后进样。色谱柱：dimosoil C18(5μL,250mm×4.6mm)，流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：100％乙腈，检测器：UV Detector，检测波长：360nm，柱温：25℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。过程：0～22min:15％B→50％B；22～22.1min:50％B→15％B；22.1～26min:15％B。

实施例4C.glutamicum 13032/PXMJ19-lpgad^Y309K工程菌制备γ-氨基丁酸

将实施例2中的C.glutamicum 13032/PXMJ19-lpgad^Y309K突变型工程菌进行L-谷氨酸底物的转化。在5L罐中以1L 0.9％NaCl溶液为缓冲体系，菌量OD_600nm控制为20，分批添加100g/l L-谷氨酸，在30℃下反应12h，lpgad^Y309K工程菌分批补料800g底物最终产量高达547.51g/L，比序列如SEQ ID NO.3所述的谷氨酸脱羧酶提高约67.13％，最终底物摩尔转化率达到97.67％。结果表明该突变酶在以谷氨酸棒杆菌为底盘细胞的催化效率明显提升，具有广阔的工业化应用前景。

SEQ ID NO.1：

MAMLYGKHNHEAEEYLEPVFGAPSEQHDLPKYRLPKHSLSPREADRLVRDELLDEGNSRLNLATFCQTYMETEAVELMKDTLRKNAIDKSEYPRTAEIENRCVNIIANLWHAPDDEHFTGTSTTGSSEACMLGGLAMKFAWRKRAQAAGLDLNTHRPNLVISAGYQVCWEKFCVYWDVDMHVVPVDEQHMVLDVNHVLDYVDEYIIGIVGIMGITYTGQYDDLAALDKVVTHYNHQHPKLPVYIHVDAASGGFYTPFIEPQLIWDFRLANVVSINASGHKYGLVYPGVGWVVWRDRQFLPPELVFKVSKLGGELPTMAINFSHSAAQLIGQYYNFIRFGMDGYREIQTKTHDVARYLAAALDKVGEFKMINNGHQLPLICYQLAPREDREWTLYDLSDRLLMNGWQVPTYPFPANLEQQVIQRIVVRADFGMNMAHDFMDDLTKAVHDLNHAHIVYHHDAAPKKYLFTH*

SEQ ID NO.2：

ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATGAAGCTGAAGAATACTTGGAACCAGTCTTTGGTGCGCCTTCTGAACAACATGATCTTCCTAAGTATCGGTTACCAAAGCATTCATTATCCCCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCGTGATGAATTATTAGATGAAGGCAATTCACGACTGAACCTGGCAACTTTTTGTCAGACCTATATGGAAACCGAAGCCGTTGAATTGATGAAGGATACGCTGCGAAAGAATGCCATCGACAAATCTGAGTACCCCCGCACGGCCGAGATTGAAAATCGGTGTGTGAACATTATTGCCAATCTGTGGCACGCACCTGATGACGAACACTTTACGGGTACCTCTACGACAGGCTCCTCTGAAGCTTGTATGTTAGGCGGTTTAGCAATGAAATTCGCCTGGCGTAAACGCGCTCAAGCGGCAGGTTTAGATCTGAATACCCATCGACCTAACCTCGTTATTTCGGCTGGCTATCAAGTTTGCTGGGAAAAGTTTTGTGTCTACTGGGACGTTGACATGCACGTGGTCCCAGTGGATGAGCAACACATGGTCCTTGACGTTAACCACGTCTTAGACTACGTGGACGAATACATTATTGGTATCGTCGGTATCATGGGCATCACTTATACCGGTCAATATGACGACCTAGCCGCACTCGATAAGGTCGTTACTCACTACAATCATCAGCATCCCAAATTACCAGTCTACATTCACGTTGACGCAGCGTCAGGTGGCTTCTATACCCCATTTATTGAGCCGCAACTCATCTGGGACTTCCGGTTGGCTAACGTCGTTTCGATCAACGCCTCCGGGCACAAGTACGGTTTAGTTTATCCCGGGGTCGGCTGGGTCGTTTGGCGTGATCGTCAGTTTTTACCGCCAGAATTAGTCTTCAAAGTTAGTAAATTAGGTGGGGAGTTGCCGACAATGGCGATCAACTTCTCACATAGTGCAGCCCAGCTCATTGGACAATACTATAATTTCATTCGCTTTGGTATGGACGGTTACCGCGAGATTCAAACAAAGACTCACGATGTTGCCCGCTACCTGGCAGCCGCTCTGGATAAAGTTGGTGAGTTTAAGATGATCAATAACGGACACCAACTCCCCCTGATTTGTTACCAACTAGCCCCGCGCGAAGATCGTGAATGGACCCTTTATGATTTATCGGATCGCCTATTAATGAACGGTTGGCAAGTACCAACGTATCCTTTCCCTGCTAATCTGGAACAACAAGTCATCCAACGAATCGTCGTTCGGGCTGACTTTGGCATGAATATGGCCCACGATTTCATGGATGACCTGACCAAGGCTGTCCATGACTTAAACCACGCCCACATTGTCTATCATCATGACGCGGCACCTAAGAAATACCTATTCACACACTGA

SEQ ID NO.3：

MAMLYGKHNHEAEEYLEPVFGAPSEQHDLPKYRLPKHSLSPREADRLVRDELLDEGNSRLNLATFCQTYMETEAVELMKDTLRKNAIDKSEYPRTAEIENRCVNIIANLWHAPDDEHFTGTSTTGSSEACMLGGLAMKFAWRKRAQAAGLDLNTHRPNLVISAGYQVCWEKFCVYWDVDMHVVPVDEQHMVLDVNHVLDYVDEYIIGIVGIMGITYTGQYDDLAALDKVVTHYNHQHPKLPVYIHVDAASGGFYTPFIEPQLIWDFRLANVVSINASGHKYGLVYPGVGWVVWRDRQFLPPELVFKVSYLGGELPTMAINFSHSAAQLIGQYYNFIRFGMDGYREIQTKTHDVARYLAAALDKVGEFKMINNGHQLPLICYQLAPREDREWTLYDLSDRLLMNGWQVPTYPFPANLEQQVIQRIVVRADFGMNMAHDFMDDLTKAVHDLNHAHIVYHHDAAPKKYLFTH*

SEQ ID NO.4：

ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATGAAGCTGAAGAATACTTGGAACCAGTCTTTGGTGCGCCTTCTGAACAACATGATCTTCCTAAGTATCGGTTACCAAAGCATTCATTATCCCCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCGTGATGAATTATTAGATGAAGGCAATTCACGACTGAACCTGGCAACTTTTTGTCAGACCTATATGGAAACCGAAGCCGTTGAATTGATGAAGGATACGCTGCGAAAGAATGCCATCGACAAATCTGAGTACCCCCGCACGGCCGAGATTGAAAATCGGTGTGTGAACATTATTGCCAATCTGTGGCACGCACCTGATGACGAACACTTTACGGGTACCTCTACGACAGGCTCCTCTGAAGCTTGTATGTTAGGCGGTTTAGCAATGAAATTCGCCTGGCGTAAACGCGCTCAAGCGGCAGGTTTAGATCTGAATACCCATCGACCTAACCTCGTTATTTCGGCTGGCTATCAAGTTTGCTGGGAAAAGTTTTGTGTCTACTGGGACGTTGACATGCACGTGGTCCCAGTGGATGAGCAACACATGGTCCTTGACGTTAACCACGTCTTAGACTACGTGGACGAATACATTATTGGTATCGTCGGTATCATGGGCATCACTTATACCGGTCAATATGACGACCTAGCCGCACTCGATAAGGTCGTTACTCACTACAATCATCAGCATCCCAAATTACCAGTCTACATTCACGTTGACGCAGCGTCAGGTGGCTTCTATACCCCATTTATTGAGCCGCAACTCATCTGGGACTTCCGGTTGGCTAACGTCGTTTCGATCAACGCCTCCGGGCACAAGTACGGTTTAGTTTATCCCGGGGTCGGCTGGGTCGTTTGGCGTGATCGTCAGTTTTTACCGCCAGAATTAGTCTTCAAAGTTAGTTATTTAGGTGGGGAGTTGCCGACAATGGCGATCAACTTCTCACATAGTGCAGCCCAGCTCATTGGACAATACTATAATTTCATTCGCTTTGGTATGGACGGTTACCGCGAGATTCAAACAAAGACTCACGATGTTGCCCGCTACCTGGCAGCCGCTCTGGATAAAGTTGGTGAGTTTAAGATGATCAATAACGGACACCAACTCCCCCTGATTTGTTACCAACTAGCCCCGCGCGAAGATCGTGAATGGACCCTTTATGATTTATCGGATCGCCTATTAATGAACGGTTGGCAAGTACCAACGTATCCTTTCCCTGCTAATCTGGAACAACAAGTCATCCAACGAATCGTCGTTCGGGCTGACTTTGGCATGAATATGGCCCACGATTTCATGGATGACCTGACCAAGGCTGTCCATGACTTAAACCACGCCCACATTGTCTATCATCATGACGCGGCACCTAAGAAATACCTATTCACACACTGA。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸生产中的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 1

Met Ala Met Leu Tyr Gly Lys His Asn His Glu Ala Glu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Glu Pro Val Phe Gly Ala Pro Ser Glu Gln His Asp Leu Pro Lys Tyr

20 25 30

Arg Leu Pro Lys His Ser Leu Ser Pro Arg Glu Ala Asp Arg Leu Val

35 40 45

Arg Asp Glu Leu Leu Asp Glu Gly Asn Ser Arg Leu Asn Leu Ala Thr

50 55 60

Phe Cys Gln Thr Tyr Met Glu Thr Glu Ala Val Glu Leu Met Lys Asp

65 70 75 80

Thr Leu Arg Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Ala

85 90 95

Glu Ile Glu Asn Arg Cys Val Asn Ile Ile Ala Asn Leu Trp His Ala

100 105 110

Pro Asp Asp Glu His Phe Thr Gly Thr Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Met Lys Phe Ala Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asp Leu Asn Thr His Arg Pro Asn Leu Val

145 150 155 160

Ile Ser Ala Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Val Tyr Trp

165 170 175

Asp Val Asp Met His Val Val Pro Val Asp Glu Gln His Met Val Leu

180 185 190

Asp Val Asn His Val Leu Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Ile Ile Gly Ile

195 200 205

Val Gly Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Asp Leu Ala

210 215 220

Ala Leu Asp Lys Val Val Thr His Tyr Asn His Gln His Pro Lys Leu

225 230 235 240

Pro Val Tyr Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Pro

245 250 255

Phe Ile Glu Pro Gln Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Ala Asn Val Val

260 265 270

Ser Ile Asn Ala Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val

275 280 285

Gly Trp Val Val Trp Arg Asp Arg Gln Phe Leu Pro Pro Glu Leu Val

290 295 300

Phe Lys Val Ser Lys Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn

305 310 315 320

Phe Ser His Ser Ala Ala Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Ile

325 330 335

Arg Phe Gly Met Asp Gly Tyr Arg Glu Ile Gln Thr Lys Thr His Asp

340 345 350

Val Ala Arg Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Asp Lys Val Gly Glu Phe Lys

355 360 365

Met Ile Asn Asn Gly His Gln Leu Pro Leu Ile Cys Tyr Gln Leu Ala

370 375 380

Pro Arg Glu Asp Arg Glu Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Asp Arg Leu

385 390 395 400

Leu Met Asn Gly Trp Gln Val Pro Thr Tyr Pro Phe Pro Ala Asn Leu

405 410 415

Glu Gln Gln Val Ile Gln Arg Ile Val Val Arg Ala Asp Phe Gly Met

420 425 430

Asn Met Ala His Asp Phe Met Asp Asp Leu Thr Lys Ala Val His Asp

435 440 445

Leu Asn His Ala His Ile Val Tyr His His Asp Ala Ala Pro Lys Lys

450 455 460

Tyr Leu Phe Thr His

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 2

atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60

ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120

cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180

aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaaaccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240

acgctgcgaa agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300

cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360

acctctacga caggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420

tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaata cccatcgacc taacctcgtt 480

atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540

cacgtggtcc cagtggatga gcaacacatg gtccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600

gtggacgaat acattattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660

gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720

ccagtctaca ttcacgttga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780

caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840

tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900

ccagaattag tcttcaaagt tagtaaatta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960

ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020

gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080

ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140

taccaactag ccccgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200

ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttccctg ctaatctgga acaacaagtc 1260

atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320

gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcatgacgcg 1380

gcacctaaga aatacctatt cacacactga 1410

<210> 3

<211> 469

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 3

Met Ala Met Leu Tyr Gly Lys His Asn His Glu Ala Glu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Glu Pro Val Phe Gly Ala Pro Ser Glu Gln His Asp Leu Pro Lys Tyr

20 25 30

Arg Leu Pro Lys His Ser Leu Ser Pro Arg Glu Ala Asp Arg Leu Val

35 40 45

Arg Asp Glu Leu Leu Asp Glu Gly Asn Ser Arg Leu Asn Leu Ala Thr

50 55 60

Phe Cys Gln Thr Tyr Met Glu Thr Glu Ala Val Glu Leu Met Lys Asp

65 70 75 80

Thr Leu Arg Lys Asn Ala Ile Asp Lys Ser Glu Tyr Pro Arg Thr Ala

85 90 95

Glu Ile Glu Asn Arg Cys Val Asn Ile Ile Ala Asn Leu Trp His Ala

100 105 110

Pro Asp Asp Glu His Phe Thr Gly Thr Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu

115 120 125

Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Met Lys Phe Ala Trp Arg Lys Arg

130 135 140

Ala Gln Ala Ala Gly Leu Asp Leu Asn Thr His Arg Pro Asn Leu Val

145 150 155 160

Ile Ser Ala Gly Tyr Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Cys Val Tyr Trp

165 170 175

Asp Val Asp Met His Val Val Pro Val Asp Glu Gln His Met Val Leu

180 185 190

Asp Val Asn His Val Leu Asp Tyr Val Asp Glu Tyr Ile Ile Gly Ile

195 200 205

Val Gly Ile Met Gly Ile Thr Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Asp Leu Ala

210 215 220

Ala Leu Asp Lys Val Val Thr His Tyr Asn His Gln His Pro Lys Leu

225 230 235 240

Pro Val Tyr Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Tyr Thr Pro

245 250 255

Phe Ile Glu Pro Gln Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Ala Asn Val Val

260 265 270

Ser Ile Asn Ala Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Val

275 280 285

Gly Trp Val Val Trp Arg Asp Arg Gln Phe Leu Pro Pro Glu Leu Val

290 295 300

Phe Lys Val Ser Tyr Leu Gly Gly Glu Leu Pro Thr Met Ala Ile Asn

305 310 315 320

Phe Ser His Ser Ala Ala Gln Leu Ile Gly Gln Tyr Tyr Asn Phe Ile

325 330 335

Arg Phe Gly Met Asp Gly Tyr Arg Glu Ile Gln Thr Lys Thr His Asp

340 345 350

Val Ala Arg Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Asp Lys Val Gly Glu Phe Lys

355 360 365

Met Ile Asn Asn Gly His Gln Leu Pro Leu Ile Cys Tyr Gln Leu Ala

370 375 380

Pro Arg Glu Asp Arg Glu Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Asp Arg Leu

385 390 395 400

Leu Met Asn Gly Trp Gln Val Pro Thr Tyr Pro Phe Pro Ala Asn Leu

405 410 415

Glu Gln Gln Val Ile Gln Arg Ile Val Val Arg Ala Asp Phe Gly Met

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Tyr Leu Phe Thr His

465

<210> 4

<211> 1410

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 4

atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60

ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120

cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180

aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaaaccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240

acgctgcgaa agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300

cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360

acctctacga caggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420

tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaata cccatcgacc taacctcgtt 480

atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540

cacgtggtcc cagtggatga gcaacacatg gtccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600

gtggacgaat acattattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660

gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720

ccagtctaca ttcacgttga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780

caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840

tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900

ccagaattag tcttcaaagt tagttattta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960

ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020

gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080

ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140

taccaactag ccccgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200

ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttccctg ctaatctgga acaacaagtc 1260

atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320

gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcatgacgcg 1380

gcacctaaga aatacctatt cacacactga 1410

Claims

1.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于：所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列由SEQ ID NO.3所示。

2.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于：所述谷氨酸脱羧酶突变体由权利要求1中所述谷氨酸脱羧酶第309位酪氨酸残基突变成赖氨酸残基所得；所述谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于：编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。

4.编码权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶突变体的基因。

5.一种含有权利要求2所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体以pET-28a、PXMJ-19或PMA5作为表达载体。

7.一种重组菌，其特征在于：包括权利要求5-6中任一项所述重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌作为宿主菌。

9.权利要求2-3中任一项所述的谷氨酸脱羧酶突变体在合成γ-氨基丁酸生产中的应用。

10.根据权利要求9中所述的应用，其特征在于，以L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为底物，以谷氨酸脱羧酶突变体为催化剂，生产制备γ-氨基丁酸。