CN110791494A

CN110791494A - 一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用

Info

Publication number: CN110791494A
Application number: CN201911191601.4A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 王雅玲; 陈佳敏; 杨套伟; 徐美娟; 张显; 邵明龙; 张佳宁; 彭安褀; 徐淑萍; 吴美琪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: US10865404B1; CN110791494B

Abstract

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，属于基因工程技术领域；所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)的基础上，将第427位谷氨酸突变成了谷氨酰胺。本发明通过将天冬氨酸酶的第427位氨基酸残基突变成谷氨酰胺，改变了活性位点附近的极性环境，更有利于底物反应时的氨供给，从而提高酶活，加强了该酶合成β‑氨基酸的能力，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。

Description

一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用。

背景技术

β-氨基酸在制药工业上是广泛应用的靶分子，是生物活性化合物或天然产物和药物的结构单元。其中β-氨基丁酸是一种有效的引发剂，可在至少40种植物物种中提供广谱性疾病保护。另外β-氨基丁酸可以作为医药中间体β-氨基丁醇的前体物质。β氨基丁醇是一种治疗艾滋病药物杜鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。

天冬氨酸酶的天然底物是天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。但目前的天冬氨酸酶对反应的pH值和温度的条件要求苛刻，依赖高温强碱的反应环境，在温和条件下酶活较低，这一缺陷导致β-氨基酸生产成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用，本发明的天冬氨酸酶突变体在温和条件下的酶活提高，能够提高制备β-氨基酸的反应效率，同时降低反应成本。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种编码上述方案所述天冬氨酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种上述方案所述基因的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体以pET21a作为原始表达载体。

本发明还提供了一种包括上述方案所述重组表达载体的重组菌。

优选的，所述重组菌以大肠杆菌作为宿主菌。

优选的，所述大肠杆菌包括E.coliBL21。

本发明还提供了上述方案所述天冬氨酸酶突变体或所述基因或所述重组表达载体或所述重组菌在制备β-氨基酸中的应用。

优选的，所述β-氨基酸包括β-氨基丁酸。

本发明的有益效果：本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的天冬氨酸酶突变体是在天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)的基础上，将第427位谷氨酸突变成了谷氨酰胺。本发明通过将天冬氨酸酶的第427位氨基酸残基突变成谷氨酰胺，改变了活性位点附近的极性环境，更有利于底物反应时的氨供给，从而提高酶活，加强了该酶合成β-氨基酸的能力，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。试验结果表明，在不同pH条件下本发明的天冬氨酸酶突变体比天冬氨酸酶的酶活均有所上升，在pH 8.0时比酶活提高1.36倍；在pH 9.0时二者以底物巴豆酸进行全细胞转化，本发明的天冬氨酸酶的催化效率明显提高，8h时天冬氨酸酶突变体对巴豆酸转化率达95％，β-氨基丁酸产量达228.28g/L。另外，在不同温度下本发明的天冬氨酸酶突变体比天冬氨酸酶的酶活均有所提高，其中在37℃下提高最多，为1.4倍。

附图说明

图1为BsAspB野生型与突变型的SDS-PAGE图，其中M，蛋白质Marker；泳道1，pET21a；泳道2，纯化原始型AspB；泳道3，纯化E427Q突变体。

具体实施方式

本发明提供了一种天冬氨酸酶突变体(Glu427Gln)，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：MNTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLG 50 IVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAG 100 TSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATH 150 IAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQE 200 FEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHL250 AKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMAS 300 GPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGLVAPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSA 350 SEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKE 400 YVEKSIGIITAINPHVGYETAAKLARQAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQL 450NEILNPYEMTHPGIAGRK*。

本发明的天冬氨酸酶突变体是在天冬氨酸酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：MNTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLG 50 IVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAG 100 TSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATH 150 IAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQE 200 FEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHL 250 AKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMAS 300 GPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGLVAPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSA 350 SEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKE 400 YVEKSIGIITAINPHVGYETAAKLAREAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQL 450 NEILNPYEMTHPGIAGRK*)的基础上，将第427位谷氨酸突变成了谷氨酰胺。本发明通过将天冬氨酸酶的第427位氨基酸残基突变成谷氨酰胺，改变了活性位点附近的极性环境，更有利于底物反应时的氨供给，从而提高酶活，加强了该酶合成β-氨基酸的能力。

本发明还提供了一种编码上述方案所述天冬氨酸酶突变体的基因(E427Q)，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：ATGAACACCGATGTGCGCATCGAGAAAGACTTTCTGGGCGAGAAGGAAATCCCGAAAGACGCGTACTACGGCGTGCAGACCATCCGCGCCACGGAAAACTTCCCGATTACCGGCTACCGCATTCACCCAGAGCTGATTAAGAGCCTCGGCATCGTGAAAAAGAGCGCCGCGCTGGCCAACATGGAAGTTGGTCTGCTGGACAAAGAGGTTGGCCAGTACATCGTGAAAGCCGCCGACGAAGTGATCGAGGGTAAGTGGAACGACCAGTTCATCGTGGACCCAATCCAAGGCGGTGCGGGCACCAGCATCAACATGAACGCGAACGAGGTGATCGCGAATCGTGCGCTGGAACTGATGGGCGAGGAAAAGGGCAACTACAGCAAGATTAGCCCAAACAGCCACGTGAATATGAGCCAGAGCACCAACGATGCGTTCCCAACGGCCACCCACATCGCCGTTCTGAGTCTGCTGAATCAGCTCATCGAGACGACCAAGTATATGCAGCAAGAGTTCATGAAGAAAGCGGATGAGTTTGCGGGCGTGATCAAGATGGGTCGCTGTCATCTGCAAGATGCGGTGCCGATTCTGCTGGGCCAAGAGTTCGAAGCCTACGCGCGCGTTATCGCGCGCGACATTGAACGCATCGCCAACACCCGCAACAATCTCTACGACATCAACATGGGCGCGACCGCCGTTGGTACGGGTCTCAACGCCGACCCAGAGTACATCAGCATCGTGACCGAACATCTGGCCAAATTCAGTGGTCACCCGCTCCGTAGCGCGCAGCATCTCGTGGATGCGACGCAGAATACCGATTGCTACACGGAGGTGAGCAGCGCGCTCAAAGTGTGCATGATCAACATGAGCAAAATCGCCAACGATCTCCGTCTGATGGCCAGTGGTCCACGTGCCGGTCTGAGTGAAATTGTTCTGCCGGCGCGTCAACCGGGCAGCAGTATTATCCCGGGTCTGGTTGCGCCAGTTATGCCGGAGGTTATGAATCAAGTTGCCTTCCAAGTTTTCGGTAACGATCTGACGATCACGAGCGCCAGCGAAGCGGGCCAGTTTGAGCTCAACGTTATGGAGCCGGTTCTGTTCTTCAACCTCATCCAGAGCATTAGCATCATGACGAATGTGTTCAAAAGCTTTACGGAAAACTGCCTCAAAGGCATCAAGGCCAACGAGGAGCGTATGAAGGAGTACGTGGAAAAGAGCATCGGCATCATCACCGCGATCAATCCGCATGTGGGCTATGAAACCGCGGCGAAGCTGGCCCGTCAAGCGTACCTCACCGGTGAAAGCATCCGCGAGCTGTGCATCAAGTACGGCGTTCTCACCGAGGAGCAGCTGAACGAGATTCTGAACCCGTATGAGATGACGCACCCGGGTATCGCCGGTCGTAAGTAA。

本发明的基因E427Q是在编码天冬氨酸酶的基因的基础上将编码第427位的谷氨酸的密码子突变成编码谷氨酰胺的密码子；所述编码天冬氨酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：ATGAACACCGATGTGCGCATCGAGAAAGACTTTCTGGGCGAGAAGGAAATCCCGAAAGACGCGTACTACGGCGTGCAGACCATCCGCGCCACGGAAAACTTCCCGATTACCGGCTACCGCATTCACCCAGAGCTGATTAAGAGCCTCGGCATCGTGAAAAAGAGCGCCGCGCTGGCCAACATGGAAGTTGGTCTGCTGGACAAAGAGGTTGGCCAGTACATCGTGAAAGCCGCCGACGAAGTGATCGAGGGTAAGTGGAACGACCAGTTCATCGTGGACCCAATCCAAGGCGGTGCGGGCACCAGCATCAACATGAACGCGAACGAGGTGATCGCGAATCGTGCGCTGGAACTGATGGGCGAGGAAAAGGGCAACTACAGCAAGATTAGCCCAAACAGCCACGTGAATATGAGCCAGAGCACCAACGATGCGTTCCCAACGGCCACCCACATCGCCGTTCTGAGTCTGCTGAATCAGCTCATCGAGACGACCAAGTATATGCAGCAAGAGTTCATGAAGAAAGCGGATGAGTTTGCGGGCGTGATCAAGATGGGTCGCTGTCATCTGCAAGATGCGGTGCCGATTCTGCTGGGCCAAGAGTTCGAAGCCTACGCGCGCGTTATCGCGCGCGACATTGAACGCATCGCCAACACCCGCAACAATCTCTACGACATCAACATGGGCGCGACCGCCGTTGGTACGGGTCTCAACGCCGACCCAGAGTACATCAGCATCGTGACCGAACATCTGGCCAAATTCAGTGGTCACCCGCTCCGTAGCGCGCAGCATCTCGTGGATGCGACGCAGAATACCGATTGCTACACGGAGGTGAGCAGCGCGCTCAAAGTGTGCATGATCAACATGAGCAAAATCGCCAACGATCTCCGTCTGATGGCCAGTGGTCCACGTGCCGGTCTGAGTGAAATTGTTCTGCCGGCGCGTCAACCGGGCAGCAGTATTATCCCGGGTCTGGTTGCGCCAGTTATGCCGGAGGTTATGAATCAAGTTGCCTTCCAAGTTTTCGGTAACGATCTGACGATCACGAGCGCCAGCGAAGCGGGCCAGTTTGAGCTCAACGTTATGGAGCCGGTTCTGTTCTTCAACCTCATCCAGAGCATTAGCATCATGACGAATGTGTTCAAAAGCTTTACGGAAAACTGCCTCAAAGGCATCAAGGCCAACGAGGAGCGTATGAAGGAGTACGTGGAAAAGAGCATCGGCATCATCACCGCGATCAATCCGCATGTGGGCTATGAAACCGCGGCGAAGCTGGCCCGTGAAGCGTACCTCACCGGTGAAAGCATCCGCGAGCTGTGCATCAAGTACGGCGTTCTCACCGAGGAGCAGCTGAACGAGATTCTGAACCCGTATGAGATGACGCACCCGGGTATCGCCGGTCGTAAGTAA。

本发明还提供了一种上述方案所述基因E427Q的重组表达载体；所述重组表达载体优选的以pET21a作为原始表达载体；所述基因E427Q优选的插入在质粒pET21a上的EcoRⅠ和BamHⅠ之间；本发明对构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，所述重组载体的采用以下方法构建：以SEQ ID NO：4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：GCGAAGCTGGCCCGTCAGGCGTACCTCACCGGT)，Rlprimer(序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：GCCTTACTGGTTAGCAGAATG)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO：3所示的基因E427Q；将所述基因E427Q连接到pET21a表达载体中，得到重组表达载体pET21a-E427Q；

本发明还提供了一种包括上述方案所述重组表达载体的重组菌；所述重组菌优选的以大肠杆菌作为宿主菌；所述大肠杆菌优选的包括E.coli BL21(DE3)；本发明对所述重组菌的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，所述重组菌采用以下方法制备得到：所述重组表达载体pET21a-E427Q转化E.coli BL21，获得重组菌，命名为pET21a-E427Q/E.coli BL21。

本发明中所述天冬氨酸酶突变体优选的采用以下方法制备得到：培养所述重组菌，诱导获得天冬氨酸酶突变体；所述培养所述重组菌的培养基优选为LB培养基；所述LB培养基含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；所述LB培养基的pH值为7.2；所述培养的温度优选为37℃；所述培养的时间以培养物的OD600达到0.6～0.9为准；所述诱导的方式优选为在培养基中加入终浓度0.1～1.0mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于16℃诱导培养12～16h。

本发明还提供了上述方案所述天冬氨酸酶突变体或所述基因或所述重组表达载体或所述重组菌在制备β-氨基酸中的应用；所述β-氨基酸优选的包括β-氨基丁酸。

本发明的具体实施过程中，以巴豆酸为底物，所述的天冬氨酸酶突变体或其重组菌，无辅酶，在37～55℃，于pH值为7.0～9.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应2～12h，得到包括天冬氨酸酶突变体的制剂；所述转化体系中底物初始浓度优选为300mM；所述转化体系中天冬氨酸酶突变体的浓度优选为0.1～3mg蛋白/mL反应液；所述转化体系中重组菌的质量以菌体湿重计优选为1～400g/L；所述调节pH值的试剂优选为质量百分含量为25％的氨水；所述转化反应体系的pH值优选为8～9。

得到包括天冬氨酸酶突变体的制剂后，本发明优选的还包括对所述制剂中的天冬氨酸酶突变体进行分离纯化，优选的采用以下方法进行：加热去除沉淀蛋白或菌体，将反应液离心，取上清液通过活性炭吸附去除色素，经过减压蒸馏，利用饱和析晶或乙醇沉淀结晶法得到粗品。

得到粗品后，本发明优选的还包括对粗品进行提纯，本发明对所述粗品的提纯方法没有特殊限制，采用本领域常规提纯方法即可，本发明具体实施过程中采用的提纯方法包括色谱分离或吸附分离。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

酶活定义：定义每分钟转化1μmol巴豆酸为β-氨基丁酸所需的酶量为一个酶活单位U。酶活单位为U/mL。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。

天冬氨酸酶酶活测定方法：反应体系(200μL)为300mM的氨，100mM的Na₂HPO₄，300mM的巴豆酸，用5M的NaOH调节pH至7-9.5，加入适量酶液启动反应，37-55℃下反应3h，根据反应中β-氨基丁酸的产量，计算出酶活力。

实施例1含编码天冬氨酸酶突变体的基因的重组表达载体的构建

以含有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的pET-21a重组质粒为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO：5所示)和Rprimer(序列如SEQ ID NO：6所示)为引物，采用全质粒两步PCR法构建突变体质粒(反应体系如表1所示，反应条件如表2所示)，即得到SEQ ID NO：3所示的基因E427Q。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在20μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下孵化3～4h。吸取5μL酶切产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含氨苄霉素(100mg/L)LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有编码天冬氨酸酶突变体的基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，命名为pET21a-E427Q。经测序验证突变成功的菌液加入甘油并于-70℃冰箱保藏。测序工作由苏州金唯智完成。

实施例2产天冬氨酸酶突变体的重组大肠杆菌工程菌构建

将实施例1得到的含正确重组质粒pET21a-E427Q的菌株即为本发明的重组菌pET21a-E427Q/E.coli BL21。

实施例3重组菌pET21a-E427Q/E.coli BL21表达及纯化天冬氨酸酶

将实施例2构建的重组菌pET21a-E427Q/E.coli BL21与表达未突变的原始酶BsAspB(野生型，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的对照菌株pET21a-AspB/E.coli BL21分别接种于10mL含氨苄霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50mL含氨苄霉素的LB培养基中，37℃培养2～3h后加入0.5mM的IPTG于16℃诱导12～16h。4℃，8000rpm离心10min收集细胞并破碎，收集细胞破碎上清液(粗酶液)用于后续纯化。

天冬氨酸酶或天冬氨酸酶突变体的纯化是在60℃中热水浴30min，之后12000rmp离心90min得到纯化酶。所得纯化酶于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，结果参见图1，其中M，蛋白质Marker；泳道1，pET21a；泳道2，纯化原始型AspB；泳道3，纯化E427Q突变体。结果表明得到电泳纯的重组天冬氨酸酶及其突变体。

实施例4天冬氨酸酶的酶活测定及β-氨基丁酸的HPLC检测

将原始酶与突变酶在37℃、45℃、55℃(pH 8.0)和pH 7.0、8.0、9.0、9.5(37℃)不同条件下测酶活，反应3h后用HPLC法测产物β-氨基丁酸的含量。

HPLC：取100μL反应液，加40μL1M的NaHCO₃，混匀后加160μL2,4-二硝基氟苯(20.48mg溶于3mL丙酮)，在60℃中暗处反应1h，取出离心，0.22μ膜过滤。然后进样。色谱柱：dimosoil C₁₈(5μL,250mm×4.6mm)，流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：100％乙腈，检测器：UVDetector，检测波长：360nm，柱温：25℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。过程：0～22min:15％B→50％B；22～22.1min:50％B→15％B；22.1～26min:15％B。

计算得原始酶和突变酶E427Q的比酶活如表3和表4所示。结果显示，在pH 8.0时，E427Q突变体的比酶活比原始酶高1.36倍左右，但二者最适反应pH都是9.0，具有碱性条件依赖性。在不同温度下，二者都是随着温度的升高比酶活逐渐升高，但37℃时比酶活提高最为显著，约为1.4倍。这与427位点突变后活性位点附近极性环境的变化有关，更有利于氨的供给，从而促进了酶促反应。

表3原始酶和E427Q在不同pH下的比酶活(mU/mg)(37℃)

表4原始酶和E427Q在不同温度下的比酶活(mU/mg)(pH 8.0)

实施例5天冬氨酸酶原始型及其突变体E427Q工程菌制备β-氨基丁酸

将实施例2中的AspB原始型与E427Q突变型工程菌进行巴豆酸底物的转化。转化体系10mL，含有200g/L的巴豆酸底物，缓冲液由含2mM的MgCl₂的Tris-HCl组成，加入25％的氨水调节pH至9.0，菌量OD＝44，在55℃下反应8h，β-氨基丁酸产量结果如表5所示。结果显示，突变酶的催化效率明显提升，反应4h时，突变酶E427Q工程菌是原始型全细胞转化的产量的1.3倍。反应8h时，突变酶对底物转化率已达95％。同时原始酶和突变体E427Q都展现出良好的立体选择性，产物的对映体过量值保持在99％以上。表明该天冬氨酸酶突变体具有广阔的工业化应用前景。

表5原始酶和E427Q全细胞转化β-氨基丁酸产量(g/L)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种天冬氨酸酶突变体、包含天冬氨酸酶突变体的重组表达载体和重组菌及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Leu Val Ala Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

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420 425 430

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450 455 460

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465

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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35 40 45

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50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

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130 135 140

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165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Leu Val Ala Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 3

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaacaccg atgtgcgcat cgagaaagac tttctgggcg agaaggaaat cccgaaagac 60

gcgtactacg gcgtgcagac catccgcgcc acggaaaact tcccgattac cggctaccgc 120

attcacccag agctgattaa gagcctcggc atcgtgaaaa agagcgccgc gctggccaac 180

atggaagttg gtctgctgga caaagaggtt ggccagtaca tcgtgaaagc cgccgacgaa 240

gtgatcgagg gtaagtggaa cgaccagttc atcgtggacc caatccaagg cggtgcgggc 300

accagcatca acatgaacgc gaacgaggtg atcgcgaatc gtgcgctgga actgatgggc 360

gaggaaaagg gcaactacag caagattagc ccaaacagcc acgtgaatat gagccagagc 420

accaacgatg cgttcccaac ggccacccac atcgccgttc tgagtctgct gaatcagctc 480

atcgagacga ccaagtatat gcagcaagag ttcatgaaga aagcggatga gtttgcgggc 540

gtgatcaaga tgggtcgctg tcatctgcaa gatgcggtgc cgattctgct gggccaagag 600

ttcgaagcct acgcgcgcgt tatcgcgcgc gacattgaac gcatcgccaa cacccgcaac 660

aatctctacg acatcaacat gggcgcgacc gccgttggta cgggtctcaa cgccgaccca 720

gagtacatca gcatcgtgac cgaacatctg gccaaattca gtggtcaccc gctccgtagc 780

gcgcagcatc tcgtggatgc gacgcagaat accgattgct acacggaggt gagcagcgcg 840

ctcaaagtgt gcatgatcaa catgagcaaa atcgccaacg atctccgtct gatggccagt 900

ggtccacgtg ccggtctgag tgaaattgtt ctgccggcgc gtcaaccggg cagcagtatt 960

atcccgggtc tggttgcgcc agttatgccg gaggttatga atcaagttgc cttccaagtt 1020

ttcggtaacg atctgacgat cacgagcgcc agcgaagcgg gccagtttga gctcaacgtt 1080

atggagccgg ttctgttctt caacctcatc cagagcatta gcatcatgac gaatgtgttc 1140

aaaagcttta cggaaaactg cctcaaaggc atcaaggcca acgaggagcg tatgaaggag 1200

tacgtggaaa agagcatcgg catcatcacc gcgatcaatc cgcatgtggg ctatgaaacc 1260

gcggcgaagc tggcccgtca agcgtacctc accggtgaaa gcatccgcga gctgtgcatc 1320

aagtacggcg ttctcaccga ggagcagctg aacgagattc tgaacccgta tgagatgacg 1380

cacccgggta tcgccggtcg taagtaa 1407

<210> 4

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacaccg atgtgcgcat cgagaaagac tttctgggcg agaaggaaat cccgaaagac 60

gcgtactacg gcgtgcagac catccgcgcc acggaaaact tcccgattac cggctaccgc 120

attcacccag agctgattaa gagcctcggc atcgtgaaaa agagcgccgc gctggccaac 180

atggaagttg gtctgctgga caaagaggtt ggccagtaca tcgtgaaagc cgccgacgaa 240

gtgatcgagg gtaagtggaa cgaccagttc atcgtggacc caatccaagg cggtgcgggc 300

accagcatca acatgaacgc gaacgaggtg atcgcgaatc gtgcgctgga actgatgggc 360

gaggaaaagg gcaactacag caagattagc ccaaacagcc acgtgaatat gagccagagc 420

accaacgatg cgttcccaac ggccacccac atcgccgttc tgagtctgct gaatcagctc 480

atcgagacga ccaagtatat gcagcaagag ttcatgaaga aagcggatga gtttgcgggc 540

gtgatcaaga tgggtcgctg tcatctgcaa gatgcggtgc cgattctgct gggccaagag 600

ttcgaagcct acgcgcgcgt tatcgcgcgc gacattgaac gcatcgccaa cacccgcaac 660

aatctctacg acatcaacat gggcgcgacc gccgttggta cgggtctcaa cgccgaccca 720

gagtacatca gcatcgtgac cgaacatctg gccaaattca gtggtcaccc gctccgtagc 780

gcgcagcatc tcgtggatgc gacgcagaat accgattgct acacggaggt gagcagcgcg 840

ctcaaagtgt gcatgatcaa catgagcaaa atcgccaacg atctccgtct gatggccagt 900

ggtccacgtg ccggtctgag tgaaattgtt ctgccggcgc gtcaaccggg cagcagtatt 960

atcccgggtc tggttgcgcc agttatgccg gaggttatga atcaagttgc cttccaagtt 1020

ttcggtaacg atctgacgat cacgagcgcc agcgaagcgg gccagtttga gctcaacgtt 1080

atggagccgg ttctgttctt caacctcatc cagagcatta gcatcatgac gaatgtgttc 1140

aaaagcttta cggaaaactg cctcaaaggc atcaaggcca acgaggagcg tatgaaggag 1200

tacgtggaaa agagcatcgg catcatcacc gcgatcaatc cgcatgtggg ctatgaaacc 1260

gcggcgaagc tggcccgtga agcgtacctc accggtgaaa gcatccgcga gctgtgcatc 1320

aagtacggcg ttctcaccga ggagcagctg aacgagattc tgaacccgta tgagatgacg 1380

cacccgggta tcgccggtcg taagtaa 1407

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgaagctgg cccgtcaggc gtacctcacc ggt 33

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccttactgg ttagcagaat g 21

Claims

1.一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述天冬氨酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

3.一种包括权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET21a作为原始表达载体。

5.一种包括权利要求3或4所述重组表达载体的重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌作为宿主菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括E.coli BL21。

8.权利要求1所述天冬氨酸酶突变体或权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组表达载体或权利要求5～7任意一项所述重组菌在制备β-氨基酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述β-氨基酸包括β-氨基丁酸。