CN113122526A

CN113122526A - 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k1、编码基因及应用

Info

Publication number: CN113122526A
Application number: CN202110397915.0A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 沈骥冬; 蔡雪; 金利群; 徐建妙; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2041-04-14
Also published as: CN113122526B

Abstract

本发明公开了一种本发明涉及一种腈水合酶突变体，具体涉及一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA‑K1及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA‑K1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。所述突变体HBA‑K1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其最适pH为9.0，最适温度为35℃。与野生酶HBA相比，突变腈水合酶HBA‑K1的翻译后自修饰效率和比活力得到了改良，可应用于生物催化生产丙烯酰胺、烟酰胺及其它高附加值的酰胺类化合物，化工纤维表面改性和碱性污水处理等生物技术领域。

Description

腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1、编码基因及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水合酶突变体，具体涉及一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

(二)背景技术

腈水合酶能够通过水和作用将各种有机腈化合物的氰基转换成酰胺基，与化学水解法相比生物转化法具有效率高、条件温和、环境污染小、并能在无额外引入保护/修饰基团的情况下实现化学、区域和对映体选择性等优点。为了在工业上利用腈水合酶催化生产丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺等酰胺类化合物，降低该酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤为重要。具体而言，必须提高单位重量酶制备物中腈水合酶的含量。随着生物技术的迅速发展，用基因工程技术手段来构建具有腈水合酶活性的基因重组菌株可以用来克服上述的缺点。此外，利用基因重组菌来表达腈水合酶可以定向表达腈水合酶，以避免催化反应过程中副反应的发生，确保酰胺类目标产物在产生的过程中不被部分水解，从而提高酰胺产品的产量和质量。

腈水合酶的基本结构单位是由α亚基和β亚基结合而成的二聚体，结构单位进一步结合形成4～12聚体(根据来源的物种不同而不同)而发挥活性。腈水合酶在表达翻译的过程中需要摄入金属离子(铁离子或钴离子)，并伴随金属离子配位发生的现象，其活性中心区域的2个半胱氨酸残基在翻译后发生氧化修饰。腈水合酶的翻译后成熟的过程需要特定的分子伴侣来协助腈水合酶摄入金属离子。但是，还没有任何发明公开关于在没有分子伴侣协助的情况下，钴型腈水合酶能主动完成翻译后修饰的实例，同时也没有任何发明公开能人工调节腈水合酶翻译后自修饰效率的具体方法。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种碱性活力改良且无需共表达分子伴侣的钴型腈水合酶突变体HBA-K1，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

本发明还涉及编码所述的腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因(hba-k1)。具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述突变体HBA-K1的最适pH为9.0，最适温度为35℃，比活力为630.2±27.7U/mg，钴离子摄入率为0.76±0.02。

SEQ ID NO.2序列如下：

本发明还涉及含有编码所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因的质粒，以及利用该质粒获得的含有编码所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因的重组菌。

本发明还涉及所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

具体的，所述催化反应在35～40℃、pH8.5～9.0条件下进行。

优选的，所述有机腈化合物为3-氰基吡啶，所述酰胺化合物为3-吡啶甲酰胺。

制备本发明碱性活力改良的钴型腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的方法可按以下步骤进行：

1)将hba-k1和表达载体pET-28a相连接，并将连接产物转化大肠杆菌B121(DE3)，获得包含hba-k1的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变钴型腈水合酶表达；

3)回收并纯化所表达的突变腈水合酶HBA-K1；

4)活性测定。

本发明的有益技术效果主要体现在：与野生酶相比，本发明突变腈水合酶HBA-K1的翻译后自修饰效率提高了100％以上，比活力提高了200％以上，纯化的突变体HBA-K1最适pH为9.0、最适温度为35℃；在最适条件下，突变体HBA-K1纯化酶的比活力比野生型HBA提高了206％，翻译后自修饰效率比野生型HBA提高了111％。本发明的突变腈水合酶HBA-K1可应用于酰胺化合物生产、化工纤维表面改性和污水处理等生物技术领。

(四)附图说明

图1为本发明重组腈水合酶HBA及其突变体HBA-K1的比活力和钴离子相对含量。

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

试验材料和试剂：

1、菌株和载体：含有重组质粒pET-28-HBA的重组大肠杆菌HBA由金斯瑞生物科技股份有限公司全基因合成克隆服务提供。

2、酶类及其它生化试剂：质粒小提试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，Fast Mutagenesis System试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。其他试剂皆为分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加20g/L琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：腈水合酶HBA的定点突变

1)按照Axygen公司质粒小提试剂盒说明书从重组大肠杆菌中提取含有腈水合酶HBA基因的重组质粒pET-28-HBA。野生型腈水合酶HBA的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2)根据野生型腈水合酶HBA的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)设计定点突变引物5’-ACGACCTGGGTGGCAAAGATGGTTTCGGCAAGATC-3’(SEQ ID NO.5)和5’-TTTGCCACCCAGGTCGTGGATACCGTTGTGGTGGTG-3’(SEQ ID NO.6)。

3)按照北京全式金生物技术有限公司Fast Mutagenesis System试剂盒说明书，以步骤1获得的重组质粒pET-28-HBA为模板，步骤2合成的引物，进行单位点定点突变PCR。

4)将定点突变PCR产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过夜培养，从含有Kan抗性筛选平板中挑取单菌落于含有50Kan的LB培养液中，于37℃，快速振荡培养约16h后，将菌液转移至终浓度为15％(v/v)的甘油中，混匀后于-80℃保存。

实施例2：腈水合酶突变体HBA-K1及野生型HBA的酶制备

1)将含有突变体HBA-K1和野生型HBA的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含50μg/mL Kan)培养液中，37℃，180rpm振荡培养16h。

2)将过夜培养活化的菌液以1％的接种量接种到新鲜的LB(含50μg/mL Kan)培养液中，37℃，180rpm振荡培养3h(OD_600nm达到0.6-1.0)。

3)加入终浓度0.5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导，于20℃，150rpm振荡培养约20h。

4)8000rpm离心5min，收集菌体后用PBS缓冲液悬浮菌体。

5)于低温冰水浴下超声波破碎菌体。超声波破碎条件为，功率300W，5s开，10s关，温度为4℃，有效破碎时间为30min。

6)超声波破碎的菌体悬液经15000rpm离心15min后，吸取上清获得含有目的腈水合酶的粗酶液。

7)根据BIO-RAD官方说明用Nuvia^TMIMAC Cartridges预装柱对获得的粗酶液进行纯化，纯化产物经透析脱盐后得到目的蛋白。

实施例3：腈水合酶突变体HBA-K1及野生型HBA的纯化酶的性质测定

1)突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的活性分析

将底物3-氰基吡啶溶于50mM硼酸-硼砂缓冲液(pH 8.0)中，使其终浓度为10mM反应液在40℃下预热5min后，加入酶液使其终浓度为3.7μg/mL，再40℃反应10min，然后加入5M的浓HCl20μL终止反应。用0.22μm的滤膜过滤去除杂质后，用HPLC检测产物3-吡啶甲酰胺的生成量。HPLC的检测条件为，使用安捷伦InfinityLab Poroshell 120EC-C18 column(4.6×150mm,4μm)色谱柱，柱温为36℃，流动相为10％(v/v)乙腈，流速为0.5mL/min，检测波长为215nm；1个酶活单位(U)定义为在给定条件下每分钟水解底物产生1μmol产物所需的酶量。

2)突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的pH活性测定

将突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶酶液置于37℃下于pH7.5，8.0，8.5和9.0的硼酸-硼砂缓冲液中进行酶促反应。以3-氰基吡啶为底物，反应10min，测定纯化的腈水合酶的酶学性质。结果(表1)表明：突变酶HBA-K1及野生型HBA纯化酶的最适pH分别为9.0和8.5。

表1：突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的pH活性

3)突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的热活性测定

将突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶酶液在pH 8.0的硼酸-硼砂缓冲液中，于35，40，45，50和60℃的温度梯度中进行酶促反应。以3-氰基吡啶为底物，反应10min，测定纯化的腈水合酶的酶学性质。结果(表2)表明：突变酶HBA-K1及野生型HBA纯化酶的最适温度分别为35和40℃。

表2：突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的热活性

4)突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的酶促反应动力学参数测定在pH 8.0和40℃的条件下，将突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶于不同底物浓度(3-氰基吡啶的浓度梯度为1～10mM)的反应体系中进行酶促反应，一级反应时间为5min，测定纯化的腈水合酶的酶学性质。采用Lineweaver-Burk双例数作图法测定米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)和催化常数(kcat)。结果表明：突变酶HBA-K1纯化酶的酶促反应动力学参数Km、Vmax和kcat分别为2.8±0.1mM，544.3±2.9U/mg和458.4±2.5s^-1；野生型HBA纯化酶的酶促反应动力学参数Km、Vmax和kcat分别为1.5±0.1mM，141.7±1.6U/mg和119.4±1.3s^-1。突变酶HBA-K1的最大反应速率和催化常数相比野生型HBA提高了284％。

实施例4：腈水合酶突变体HBA-K1及野生型HBA的纯化酶钴离子含量测定

精确量取腈水合酶突变体HBA-K1及野生型HBA纯酶1mg，加入1mL浓硝酸在70℃下保温1h充分消解蛋白质样品，冷却至室温后加入质谱级去离子水稀释至硝酸终浓度为5％。用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)测定样品中钴离子的浓度，每个样品重复三次，以经过相同处理的不含有蛋白质的质谱级去离子水作为阴性对照。结果(图1)表明：突变体HBA-K1及野生型HBA纯化酶的比活力分别为630.2±27.7和206.1±14.6U/mg，单位催化中心相对钴离子含量分别为0.76±0.02和0.36±0.01mol/mol，突变腈水合酶HBA-K1的翻译后自修饰效率提高了111％，比活力提高了206％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1、编码基因及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 443

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met His His His His His His His His His His Asn Gly Ile His Asp

1 5 10 15

Leu Gly Gly Lys Asp Gly Phe Gly Lys Ile Ile Arg Glu Glu Asn Glu

20 25 30

Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile Ala Phe Gly Leu Leu Ile

35 40 45

Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Leu Asp Glu Phe Arg His Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly

65 70 75 80

His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu Val Glu Lys Gly Ile Leu

85 90 95

Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln Thr Tyr Leu Ala Gln Pro

100 105 110

Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro Glu Leu Val Asn His Leu

115 120 125

Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr Val Arg Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val Lys Thr Lys Asn Ile His

145 150 155 160

Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Asp Lys Tyr Gly

165 170 175

Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val Phe Pro Asp Ala Asn Ala

180 185 190

His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu Tyr Cys Ile Arg Phe Glu

195 200 205

Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly Glu Ala Val Tyr Ile Asp

210 215 220

Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser Lys Asp Asn Asn Lys Val

225 230 235 240

His His His His Pro His Pro Glu Ser Phe Trp Ser Ala Arg Ala Lys

245 250 255

Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala

260 265 270

Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu His Glu Leu Gly Pro Met Asn

275 280 285

Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln

290 295 300

Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr

305 310 315 320

Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val Val Glu Asn Thr Asp Thr Val

325 330 335

His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu

340 345 350

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg

355 360 365

Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp

370 375 380

Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met

385 390 395 400

Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr

405 410 415

Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

420 425 430

Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr Val Arg

435 440

<210> 2

<211> 1332

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

atgcatcatc atcatcatca tcaccaccac cacaacggta tccacgacct gggtggcaaa 60

gatggtttcg gcaagatcat tcgtgaggaa aacgagccgc tgttccacaa agactgggaa 120

cgtatcgcgt ttggtctgct gattggcacc gcgggtcagg gcctgtacaa cctggacgag 180

tttcgtcacg cgattgaacg tatgaacccg gtggattatc tgaccagcgg ttactatggt 240

cattgggtgg cgagcattgc gaccctgctg gttgagaagg gtattctgga cgcgagcgaa 300

ctggttagcc gtacccagac ctacctggcg caaccggata ccaagacccc gcgtcgtgag 360

aacccggaac tggtgaacca cctggagcag gttatcaaag tgggcgttag caccgtgcgt 420

gaagttagca gcgcgccgcg tttcaacgtg ggtgaccgtg ttaagaccaa aaacattcat 480

ccgagcggtc acacccgtct gccgcgttac gcgcgtgaca agtatggtgt gattgcgatg 540

taccacggcg cgcacgtttt cccggatgcg aacgcgcacg gtaaaggcga gagcccgcaa 600

cacctgtatt gcattcgttt tgaggcgaac gaactgtggg gtatccagca aggcgaagcg 660

gtgtacattg atctgtggga gagctatctg gaaccggtta gcaaggacaa caacaaagtt 720

caccaccacc acccgcaccc ggagagcttc tggagcgcgc gtgcgaaggc gctggaaagc 780

ctgctgatcg agaaaggcat tctgagcagc gacgcgatcg atcgtgtggt tcagcactac 840

gaacacgagc tgggcccgat gaacggtgcg aaggtggttg cgaaagcgtg gaccgacccg 900

gcgtttaagc agcgtctgct ggaagatccg gagaccgttc tgcgtgagct gggttactat 960

ggcctgcaag gtgaacacat tcgtgtggtt gagaacaccg ataccgtgca caacgtggtt 1020

gtgtgcaccc tgtgcagctg ctatccgtgg ccgctgctgg gtctgccgcc ggcgtggtac 1080

aaagaaccga cctatcgtag ccgtatcgtt aaggagccgc gtaaagtgct gcgtgaggag 1140

ttcggtctgg acctgccgga taccgttgaa attcgtgtgt gggacagcag cagcgagatg 1200

cgttatatgg tgctgccgca gcgtccggaa ggtaccgagg gtatgaccga ggaagagctg 1260

gcgaagatcg tgacccgtga tagcatgatt ggtgttgcga aagtgcaacc gagcagcgtt 1320

accgtgcgtt ga 1332

<210> 3

<211> 443

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met His His His His His His His His His His Asn Gly Ile His Asp

1 5 10 15

Leu Gly Gly Met Asp Gly Phe Gly Lys Ile Ile Arg Glu Glu Asn Glu

20 25 30

Pro Leu Phe His Lys Asp Trp Glu Arg Ile Ala Phe Gly Leu Leu Ile

35 40 45

Gly Thr Ala Gly Gln Gly Leu Tyr Asn Leu Asp Glu Phe Arg His Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Asn Pro Val Asp Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Tyr Gly

65 70 75 80

His Trp Val Ala Ser Ile Ala Thr Leu Leu Val Glu Lys Gly Ile Leu

85 90 95

Asp Ala Ser Glu Leu Val Ser Arg Thr Gln Thr Tyr Leu Ala Gln Pro

100 105 110

Asp Thr Lys Thr Pro Arg Arg Glu Asn Pro Glu Leu Val Asn His Leu

115 120 125

Glu Gln Val Ile Lys Val Gly Val Ser Thr Val Arg Glu Val Ser Ser

130 135 140

Ala Pro Arg Phe Asn Val Gly Asp Arg Val Lys Thr Lys Asn Ile His

145 150 155 160

Pro Ser Gly His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Asp Lys Tyr Gly

165 170 175

Val Ile Ala Met Tyr His Gly Ala His Val Phe Pro Asp Ala Asn Ala

180 185 190

His Gly Lys Gly Glu Ser Pro Gln His Leu Tyr Cys Ile Arg Phe Glu

195 200 205

Ala Asn Glu Leu Trp Gly Ile Gln Gln Gly Glu Ala Val Tyr Ile Asp

210 215 220

Leu Trp Glu Ser Tyr Leu Glu Pro Val Ser Lys Asp Asn Asn Lys Val

225 230 235 240

His His His His Pro His Pro Glu Ser Phe Trp Ser Ala Arg Ala Lys

245 250 255

Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Lys Gly Ile Leu Ser Ser Asp Ala

260 265 270

Ile Asp Arg Val Val Gln His Tyr Glu His Glu Leu Gly Pro Met Asn

275 280 285

Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Thr Asp Pro Ala Phe Lys Gln

290 295 300

Arg Leu Leu Glu Asp Pro Glu Thr Val Leu Arg Glu Leu Gly Tyr Tyr

305 310 315 320

Gly Leu Gln Gly Glu His Ile Arg Val Val Glu Asn Thr Asp Thr Val

325 330 335

His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Leu

340 345 350

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Glu Pro Thr Tyr Arg Ser Arg

355 360 365

Ile Val Lys Glu Pro Arg Lys Val Leu Arg Glu Glu Phe Gly Leu Asp

370 375 380

Leu Pro Asp Thr Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Met

385 390 395 400

Arg Tyr Met Val Leu Pro Gln Arg Pro Glu Gly Thr Glu Gly Met Thr

405 410 415

Glu Glu Glu Leu Ala Lys Ile Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

420 425 430

Ala Lys Val Gln Pro Ser Ser Val Thr Val Arg

435 440

<210> 4

<211> 1332

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgcatcatc atcatcatca tcaccaccac cacaacggta tccacgacct gggtggcatg 60

gatggtttcg gcaagatcat tcgtgaggaa aacgagccgc tgttccacaa agactgggaa 120

cgtatcgcgt ttggtctgct gattggcacc gcgggtcagg gcctgtacaa cctggacgag 180

tttcgtcacg cgattgaacg tatgaacccg gtggattatc tgaccagcgg ttactatggt 240

cattgggtgg cgagcattgc gaccctgctg gttgagaagg gtattctgga cgcgagcgaa 300

ctggttagcc gtacccagac ctacctggcg caaccggata ccaagacccc gcgtcgtgag 360

aacccggaac tggtgaacca cctggagcag gttatcaaag tgggcgttag caccgtgcgt 420

gaagttagca gcgcgccgcg tttcaacgtg ggtgaccgtg ttaagaccaa aaacattcat 480

ccgagcggtc acacccgtct gccgcgttac gcgcgtgaca agtatggtgt gattgcgatg 540

taccacggcg cgcacgtttt cccggatgcg aacgcgcacg gtaaaggcga gagcccgcaa 600

cacctgtatt gcattcgttt tgaggcgaac gaactgtggg gtatccagca aggcgaagcg 660

gtgtacattg atctgtggga gagctatctg gaaccggtta gcaaggacaa caacaaagtt 720

caccaccacc acccgcaccc ggagagcttc tggagcgcgc gtgcgaaggc gctggaaagc 780

ctgctgatcg agaaaggcat tctgagcagc gacgcgatcg atcgtgtggt tcagcactac 840

gaacacgagc tgggcccgat gaacggtgcg aaggtggttg cgaaagcgtg gaccgacccg 900

gcgtttaagc agcgtctgct ggaagatccg gagaccgttc tgcgtgagct gggttactat 960

ggcctgcaag gtgaacacat tcgtgtggtt gagaacaccg ataccgtgca caacgtggtt 1020

gtgtgcaccc tgtgcagctg ctatccgtgg ccgctgctgg gtctgccgcc ggcgtggtac 1080

aaagaaccga cctatcgtag ccgtatcgtt aaggagccgc gtaaagtgct gcgtgaggag 1140

ttcggtctgg acctgccgga taccgttgaa attcgtgtgt gggacagcag cagcgagatg 1200

cgttatatgg tgctgccgca gcgtccggaa ggtaccgagg gtatgaccga ggaagagctg 1260

gcgaagatcg tgacccgtga tagcatgatt ggtgttgcga aagtgcaacc gagcagcgtt 1320

accgtgcgtt ga 1332

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

acgacctggg tggcaaagat ggtttcggca agatc 35

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

tttgccaccc aggtcgtgga taccgttgtg gtggtg 36

Claims

1.一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.含有编码权利要求1所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因的质粒。

5.含有编码权利要求1所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1的基因的重组菌。

6.权利要求1所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化反应在35～40℃、pH8.5～9.0条件下进行。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述有机腈化合物为3-氰基吡啶，所述酰胺化合物为3-吡啶甲酰胺。