CN112725322A - 天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌 - Google Patents

天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌，其工程菌用下述方法构建：将重组质粒22b‑PT7‑Asp‑H T187L/N142R/N326L导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，得到表达天冬氨酸酶突变体的工程菌。本发明采用理性设计技术对天冬氨酸酶进行分子改造，经过同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得于底物亲和力提高的天冬氨酸酶突变体，酶活提高为原来的3倍，利用此策略可以显著提天冬氨酸酶的催化活力。经过发酵培养、诱导表达得到菌体细胞沉淀物，再通过透性化处理后得到的透性化细胞作为生物催化剂可将底物巴豆酸特异性催化转化为R‑3‑氨基丁酸。

Description

天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌
技术领域
本发明属于酶工程和生物工程技术领域，具体涉及一种天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染是造成获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的元凶。艾滋病从1981年被首次发现以来，现已经蔓延到全世界，已经发展成为一个严重的全球范围的公共卫生和社会问题。据联合国艾滋病规划联署最新的统计数据显示，全球大约有3530万人是艾滋病携带者，仅2012年就有160万人死于艾滋病。目前的研究中，HIV-1整合酶在HIV-1病毒复制过程中有着重要作用，是介导病毒DNA与宿主细胞内DNA结合从而表达病毒基因的必须酶，在人体内未发现整合酶的功能类似物，因此该酶也逐渐被认为是设计抗艾滋病药物研究的理想治疗靶点。目前FDA批准了三种整合酶抑制剂用于HIV感染者的治疗，已作为药物上市的艾滋病毒整合酶抑制剂分别是雷特格韦(Raltigravir,RAL)、埃替格韦(Elvitegravir,EVG)和度鲁特韦(Dolutegravir,DTG)，均属于以HIV-1整合酶为靶点的具有较好的体内外活性和较小的体内毒性的二酮酸类抑制药物。
研究发现第一代整合酶链转移抑制剂雷特格韦和埃替格韦耐药，需要一天2次给药，且HIV对它们的耐药发展屏障相对较低且存在交叉耐药性。
度鲁特韦(DTG，商品名Tivicay)是2013年被美国FDA批准上市的新一代的抗艾滋病整合酶抑制剂，是目前最热门的抗艾滋病药物，能显著延长艾滋病患者寿命。临床前研究结果显示其毒性小，没有基因毒性和致癌毒性，安全性提高，在大于临床剂量27倍时没有出现明显的生育毒性和致畸毒性。由于其独特的耐药谱、无需激动剂激动，具有更高的耐药发展屏障，可一天1次给药，还有较高的解离半衰期，具有较高的血药浓度等特点，被称为第二代整合酶链转移抑制剂(INSTIs)。度鲁特韦的合成以4-甲氧基乙酰乙酸甲酯为初始原料在一系列反应后得到复杂前体，再通过与R-3-氨基丁醇反应后与2，4-二氟苄胺在EDCI催化下发生偶联反应，最后脱保护得到度鲁特韦。关键化合物R-3-氨基丁醇可以构建度鲁特韦的手性六元环，引入手性官能团，因此R-3-氨基丁醇成为合成度鲁特韦的关键中间体。
目前据报道，以R-3-氨基丁酸为原料，经酯化反应制得R-3-氨基丁酸酯，再经过还原反应、树脂提取、与碱反应获得高质量高纯度的R-3-氨基丁醇的方法，具有树脂可回收，减少废盐废渣产生量，收率较高和产品质量高等优势，并成功解决了不易直接从水中提取产物的问题，解决了传统工艺蒸水耗能大，溶剂萃取不充分等问题。因此R-3-氨基丁酸是合成医药中间体R-3-氨基丁醇的核心原料。随着度鲁特韦在国际市场的影响力日益增加，据分析师们预计到二十一世纪二十年代，度鲁特韦的年度销售额将达到18亿英镑的峰值水平，因此R-3-氨基丁酸作为度鲁特韦原料的市场需求不断增加，市场空间大。R-3-氨基丁酸品质的好坏以及价格的高低对于度鲁特韦的品质及生产成本有着很重要的影响。因此开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本，推广其应用范围的关键步骤。
目前制备R-3-氨基丁酸的方法主要有化学合成法和酶催化法。化学合成法报道了由甲醛为原料，经Horner–Wadsworth–Emmons反应得到2-丁烯酸叔丁酯，再经加成，催化氢化，可得到R-3-氨基丁酸叔丁酯，最后水解得到R-3-氨基丁酸，但此反应需要-78℃低温，反应条件苛刻，操作困难。
还报道了由乙酰乙酸乙酯为原料，与乙酰胺缩合，经不对称氢化，再经水解得到R-3-氨基丁酸的方法，但是此方法需要用到昂贵的不对称氢化催化剂，生产成本较高，重金属污染，不利用工业化大生产。
相对于所报道的R-3-氨基丁酸的化学制备方法原料易燃易爆毒性大、反应条件苛刻、操作困难和产生废料较多等缺陷，生物催化具有反应条件温和、高度选择性、产物纯度高等优点，利用生物酶法催化技术是一种可行的方案，但目前关于生物酶法制备R-3-氨基丁酸的报道效率不高。已有报道的酶催化法，如报道的以消旋的3-氨基丁酸叔丁基酯为原料，经来源于南极假丝酵母的脂肪酶A(CLA-A)立体选择性催化得到R型3-丁酰胺基丁酸叔丁酯，再经CAL-A催化水解得到R-3-氨基丁酸，但此方法转化率低。如报道的来源于芽孢杆菌YM55-1的天冬氨酸酶突变体BSASP-C6催化丁烯酸制备R-3-氨基丁酸的方法，但反应100个小时的转化率仅为60％，反应时间长，转化率低。因此亟需开发一种工艺简单，条件温和、环境友好的生物酶法路线来制备R-3-氨基丁酸。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种天冬氨酸酶突变体。
本发明的第二个目的是提供编码上述天冬氨酸酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供上述天冬氨酸酶突变体的构建方法。
本发明的第四个目的是提供含编码上述天冬氨酸酶突变体的基因的重组质粒。
本发明的第五个目的是提供表达上述天冬氨酸酶突变体工程菌。
本发明的第六个目的是提供表达天冬氨酸酶突变体工程菌发酵生产R-3-氨基丁酸的方法。
本发明的技术方案概述如下：
天冬氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码权利要求1天冬氨酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述天冬氨酸酶突变体的构建方法，包括如下步骤：
(1)天冬氨酸酶空间结构的模拟：运用SWISS-MODEL在线服务器模拟SEQ ID NO.3所示的天冬氨酸酶的空间结构；并运用Verify_3D对结构模型进行评估和优化，获得准确性高的天冬氨酸酶模拟结构；
(2)通过CDOCKER软件，将所述准确性高的天冬氨酸酶模拟结构与生产R-3-氨基丁酸的底物巴豆酸进行分子对接，分析天冬氨酸酶和底物巴豆酸之间的相互作用类型包括范德华力、π-π相互作用和静电相互作用；
(3)通过虚拟突变得到能提升天冬氨酸酶与底物巴豆酸相互作用的关键残基，所述关键残基包括直接接触底物的残基、不与底物直接接触的第二壳层残基，得到天冬氨酸酶与底物巴豆酸的相互作用提升显著的天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体为氨基酸序列中187位苏氨酸、142位天冬酰胺和326位的天冬酰胺突变为亮氨酸、精氨酸和亮氨酸，其结合能降低，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸酶突变体。
一种含编码上述天冬氨酸酶突变体的基因的重组质粒，用下述方法构建：
(1)设计并合成定点突变的引物：T187L-F、T187L-R、N142R-F、N142R-R、N326L-F、N326L-R；
所述T187L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述T187L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述N142R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、
所述N142R-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示、
所述N326L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示、
所述N326L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
(2)将编码天冬氨酸酶的基因连接在pET-22b质粒上，得到重组质粒22b-PT7-Asp-H，天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码天冬氨酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)以重组质粒22b-PT7-Asp-H为模板，T187L-F和T187L-R作为引物进行第一轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L；
(4)以重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L作为模板，N142R-F和N142R-R作为引物进行第二轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R；
(5)以重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R作为模板，N326L-F和N326L-R作为引物进行第三轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L。
表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L，用下述方法构建：
将重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，得到表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L。
利用上述工程菌发酵生产R-3-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：
(1)将表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L发酵，诱导表达得到菌体细胞沉淀物，透性化处理后得到透性化细胞；
(2)将终浓度250g/L底物巴豆酸溶解在以水为溶剂配制的终浓度100mM的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)和终浓度2mM MgCl2的混合液中，加入终浓度250g/LNH4Cl，用氨水调节pH＝8.0，得第二混合液，将步骤(1)获得的透性化细胞重悬于第二混合液使浓度为8g/L，在摇床中于37℃以200rpm的搅拌速度孵育进行生物转化，得到R-3-氨基丁酸。
本发明的优点：
1.本发明首次采用理性设计技术对天冬氨酸酶进行分子改造，经过同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得于底物亲和力提高的天冬氨酸酶突变体(SEQ ID NO.1)，酶活提高为原来的3倍，利用此策略可以显著提天冬氨酸酶的催化活力。
2.经过发酵培养、诱导表达得到菌体细胞沉淀物，再通过透性化处理后得到的透性化细胞作为生物催化剂可将底物巴豆酸特异性催化转化为R-3-氨基丁酸。
3.本发明R-3-氨基丁酸的产量产率高，为生物法实现R-3-氨基丁酸的工业化生产奠定了基础。
附图说明
图1为天冬氨酸酶空间结构的示意图。
图2为天冬氨酸酶与巴豆酸相互作用的示意图。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详述，以下实施例只是描述性的，本发明所保护范围不限于此。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
Asp-H(天冬氨酸酶)突变位点的理性设计及构建，包括如下步骤：
(1)天冬氨酸酶空间结构的模拟：运用SWISS-MODEL在线服务器模拟SEQ ID NO.3所示的天冬氨酸酶的空间结构；并运用Verify_3D对结构模型进行评估和优化，获得准确性高的天冬氨酸酶模拟结构；
由此整理出天冬氨酸酶突变位点的理性设计思路：从酶与底物相互作用入手，提升酶与底物的相互作用，进而提升催化效率。
(2)通过CDOCKER软件，将所述准确性高的天冬氨酸酶模拟结构与生产R-3-氨基丁酸的底物巴豆酸进行分子对接，分析天冬氨酸酶和底物巴豆酸之间的相互作用类型包括范德华力、π-π相互作用和静电相互作用；
(3)通过虚拟突变得到能提升天冬氨酸酶与底物巴豆酸相互作用的关键残基，关键残基包括直接接触底物的残基、不与底物直接接触的第二壳层残基，得到了天冬氨酸酶与底物巴豆酸的相互作用提升显著的天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体氨基酸序列中187位苏氨酸、142位天冬酰胺和326位的天冬酰胺突变为亮氨酸、精氨酸和亮氨酸，其结合能降低了-1.42kcal/mol，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸酶突变体。
模拟出的天冬氨酸酶空间结构及与巴豆酸相互作用的示意图如图1和图2所示。
编码天冬氨酸酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
22b-PT7-Asp-H重组质粒，用下述方法构建：
将枯草芽孢杆菌来源的天冬氨酸酶(GenBank:BAA93044.1)的基因进行密码子优化后获得适用于大肠杆菌宿主表达的天冬氨酸酶(SEQ ID NO.3)的基因(SEQ ID NO.4)，按照北京全式金生物生物技术有限公司无缝重组试剂盒的要求，以该基因作为模板，设计引物如下：
ASP-H-F：
5`-AGATATACATATGAACACGGACGTGCGCATTGAG-3`
(SEQ ID NO.5)
ASP-H-R：
5`-CAGCCGGATCTTATTTGCGACCGGCGATGCCCGGA-3`
(SEQ ID NO.6)
22b-PT7-F：
5`-TCGCAAATAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGG-3`
(SEQ ID NO.7)
22b-PT7-R：
5`-CCGTGTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGG-3`
(SEQ ID NO.8)
通过PCR扩增后分别得到0.9kb的ASP-H基因片段；同时以质粒22b-PT7为模板，通过PCR扩增分后别得到3.5kb的载体片段；按照无缝重组试剂盒的要求，将基因片段与载体片段按照比例混合，在连接酶的作用下形成环状重组质粒；将连接体系转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-H。
其中，所述氨苄霉素平板培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，氨苄霉素50mg/L；
所述PCR反应体系以及PCR程序参照北京全式金生物技术有限公司
Figure BDA0002925876380000051
FastPfu Fly DNA Polymerase试剂盒的要求进行，如表1所示：
表1
Figure BDA0002925876380000061
实施例3
含突变基因ASP-HT187L/N142R/N326L重组质粒的制备
基于实施例1理性设计的突变位点，设计并合成定点突变的引物如下：
T187L-F：
5`-GGGCCGCCTGCATCTCCAAGATGCGGTTCCAATTCTGCTGGGTC-3`
(SEQ ID NO.9)
T187L-R：
5`-GGAGATGCAGGCGGCCCATTTTGATCACACCCGCGAATTCGTC-3`
(SEQ ID NO.10)
N142R-F：
5`-GAGCACGCGCGACGCCTTCCCGACCGCGACCCATATC-3`
(SEQ ID NO.11)
N142R-R：
5`-GAAGGCGTCGCGCGTGCTCTGGCTCATGTTCACGTGGCTGTTTGGGCTG-3`
(SEQ ID NO.12)
N326L-F:
5`-GCAAAGTGCTGCCGGTGATGCCGGAGGTGATGAATCAAGTTGCC-3`
(SEQ ID NO.13)
N326L-R:
5`-CATCACCGGCAGCACTTTGCCCGGCATGATGCTACTGCCCGGCTG-3`
(SEQ ID NO.14)
按照无缝重组试剂盒的要求采用无缝连接和反向PCR技术构建含突变基因的重组质粒，主要分为三步：
(1)以重组质粒22b-PT7-Asp-H作为模板，T187L-F和T187L-R作为引物进行第一轮PCR(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃5min，30个循环；72℃10min)，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L；
(2)以重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L作为模板，N142R-F和N142R-R作为引物进行第二轮PCR(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃5min，30个循环；72℃10min)，将获得的PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R；
(3)以质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R作为模板，N326L-F和N326L-R作为引物进行第三轮PCR(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃5min，30个循环；72℃10min)，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过氨苄霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L。
实施例4
表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L(简称工程菌)，用下述方法构建：
将提取的重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30min后，45℃水浴热激90s，再冰浴2min后将菌液均匀地涂布在氨苄霉素平板培养基上，37℃培养18h后挑取单克隆菌落至5mL氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃，220rpm下培养14h后保存甘油菌即可获得高拷贝的工程菌；
所述氨苄抗性的LB液体培养基的配方：
胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，氨苄霉素100mg/L。
作为对照，按照上述同样方法构建包含重组质粒22b-PT7-Asp-H的对照工程菌，其能够表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的天冬氨酸酶。
实施例5
工程菌诱导表达
将工程菌接入到5ml氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃，220rpm下培养12h，按1％接种量接种到100mL氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃，220rpm下培养。当OD600值达到0.8-1时，加入诱导剂IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为0.1mM，诱导温度设置为30℃。诱导6h后，取样以测量细胞密度和天冬氨酸酶突变体活性。并将所有培养物在5000rpm下离心20min收集菌体浆状物，所有实验均重复三次。
实施例6
利用工程菌生产R-3-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：
(1)将工程菌发酵，诱导表达得到菌体细胞沉淀物，将菌体细胞沉淀物重悬于35％(v/v)的乙醇水溶液中，在室温下静置10分钟，在6000rpm下离心10min获得透性化细胞。
(2)将终浓度250g/L底物巴豆酸溶解在以水为溶剂配制的终浓度100mM的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)和终浓度2mM MgCl2的混合液中，加入终浓度250g/LNH4Cl，用氨水调节pH＝8.0，得第二混合液，将步骤(1)获得的透性化细胞重悬于第二混合液使浓度为8g/L，在摇床中于37℃以200rpm的搅拌速度孵育进行生物转化，在第0、12、24和48小时取样，通过加热至80℃持续10分钟停止反应，离心得到上清液，衍生化反应(衍生化反应：将上清液用水稀释500体积倍后，取250μl，加入100μl的终浓度为1mol/L的碳酸氢钠水溶液，再加入400μl的以丙酮为溶剂配置的终浓度36.7mmol/L的DNFB(2,4二硝基氟苯)溶液，在40℃下孵育1.5小时。之后加入200μl终浓度为1mol/L的盐酸停止反应，最后加入1ml体积分数为20％的乙腈水溶液。)用于HPLC检测底物和产物R-3-氨基丁酸含量。
在该反应中，氨水调节反应液的pH为碱性，在中和巴豆酸的酸性时，又保证反应中的铵根离子充足，保证底物巴豆酸能够高效完全转化。镁离子有助于提高酶的活性，提高了反应速率，且促使反应向正方向进行。
实施例7
(1)酶活性的测定：收集1ml用于酶活性测定的发酵液，离心，将沉淀重悬于氨水调节后pH＝8.0的含有300mM巴豆酸、300mM NH4Cl和2mM MgCl 2的1ml HEPES缓冲液(100mM)混合液中。然后将其在37℃的旋转摇床中以200rpm的温度孵育30分钟，在80℃加热20min终止反应，然后通过衍生化反应后用于HPLC测定R-3-氨基丁酸浓度。
按照本发明酶活的定义：37℃条件下，1U/mg定义为每分钟1mg菌体细胞催化产生1nmol R-3-氨基丁酸；计算得工程菌的酶活为1612U/mg，而表达野生型天冬氨酸酶的对照工程菌的酶活为534U/g，工程菌的酶活为对照工程菌的3倍。
生物转化体系的性能优化：经过发酵培养、诱导表达得到菌体细胞沉淀物，再通过透性化处理后得到的透性化细胞作为生物催化剂可将底物巴豆酸特异性催化转化为R-3-氨基丁酸。
首先探究了转化体系中的透性化细胞(细胞催化剂)浓度对R-3-氨基丁酸生物合成的影响，当细胞浓度为8g/L时，转化率和产率可达到99％和98％，产物产量达到23.52g/L；
探究了转化体系中透性化细胞催化形式对产物合成的影响，在24小时通过透性化细胞生物转化的最终产量达到23.52g/L，产率为98％，由于透性化细胞可增强细胞膜的渗透性促进底物巴豆酸的高效进入和产物R-3-氨基丁酸的快速释放，故催化性能优于全细胞和破菌酶液；
探究了巴豆酸底物浓度对产物合成的影响，当底物浓度增加到250g/L时，巴豆酸的转化率和R-3-氨基丁酸的产率在24小时内转化率和产率均达到97％和96％，产量达到287.6g/L，
综上所述，在工程菌发酵表达的基础上，通过转化体系优化后HPLC测得R-3-氨基丁酸产量为287.6g/L，是野生型菌株R-3-氨基丁酸产量(2.3g/L)的125倍；
所述HPLC的检测条件为：检测器为紫外检测器，特征吸收峰为360nm，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相A为0.1％TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液，流动相A与B的比例为75：25(v/v)，柱温为30℃，进样量为10μL，流速为1.0ml/min，R-3-氨基丁酸的保留时间分别为12.5min。
序列表
<110> 天津大学
<120> 天冬氨酸酶突变体及编码基因及工程菌
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu
20 25 30
Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly
50 55 60
Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu
65 70 75 80
Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys
115 120 125
Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Arg Asp Ala
130 135 140
Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu
145 150 155 160
Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Leu His Leu Gln Asp Ala
180 185 190
Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp
210 215 220
Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His
245 250 255
Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp
260 265 270
Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met
275 280 285
Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala
290 295 300
Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile
305 310 315 320
Met Pro Gly Lys Val Leu Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val
325 330 335
Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn
355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr
370 375 380
Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu
385 390 395 400
Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val
405 410 415
Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly
420 425 430
Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Arg Lys
465
<210> 2
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaacacgg acgtgcgcat tgagaaagac ttcctcggcg agaaggagat cccaaaagac 60
gcgtactacg gcgttcagac gattcgcgcc accgaaaatt tcccgatcac cggctaccgc 120
atccacccgg aactgatcaa gagcctcggt atcgtgaaga aaagcgcggc gctggcgaat 180
atggaggtgg gtctgctcga taaggaggtg ggccagtata tcgttaaagc cgccgatgag 240
gtgatcgagg gcaagtggaa cgaccagttc attgttgacc cgatccaagg cggtgccggc 300
acgagtatca acatgaacgc gaacgaggtt atcgcgaatc gtgcgctcga actgatgggc 360
gaggagaaag gcaactatag caagatcagc ccaaacagcc acgtgaacat gagccagagc 420
acgcgcgacg ccttcccgac cgcgacccat atcgccgtgc tcagtctgct caaccagctg 480
atcgaaacca ccaaatacat gcagcaagaa ttcatgaaga aggcggacga attcgcgggt 540
gtgatcaaaa tgggccgcct gcatctccaa gatgcggttc caattctgct gggtcaagaa 600
ttcgaagcgt acgcccgcgt gatcgcgcgt gatatcgaac gcatcgcgaa tacgcgcaac 660
aacctctacg acatcaatat gggcgccacc gccgttggta ccggcctcaa tgccgacccg 720
gagtatatca gcatcgtgac cgagcatctc gcgaagttta gcggtcaccc actgcgtagc 780
gcccagcatc tggttgatgc cacgcaaaac accgactgct acacggaggt gagcagcgcg 840
ctcaaggttt gcatgatcaa tatgagcaag atcgccaacg atctgcgtct catggccagc 900
ggtccacgtg ccggtctgag cgaaattgtg ctcccagccc gccagccggg cagtagcatc 960
atgccgggca aagtgctgcc ggtgatgccg gaggtgatga atcaagttgc cttccaagtt 1020
ttcggcaatg atctgacgat taccagcgcg agcgaggcgg gtcagtttga gctgaacgtg 1080
atggagccag tgctgttttt caacctcatc cagagcatta gtatcatgac gaatgttttc 1140
aagagcttca ccgagaattg cctcaagggc atcaaggcca acgaagagcg catgaaggaa 1200
tacgtggaaa aaagcatcgg tatcatcacc gcgatcaacc cacacgtggg ttacgaaacg 1260
gcggcgaaac tcgcccgcga agcgtatctg accggtgaga gcatccgcga actgtgcatc 1320
aagtatggcg tgctcaccga agaacagctg aacgaaattc tgaacccgta cgaaatgacg 1380
catccgggca tcgccggtcg caaataa 1407
<210> 3
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu
20 25 30
Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly
50 55 60
Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu
65 70 75 80
Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys
115 120 125
Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala
130 135 140
Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu
145 150 155 160
Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala
180 185 190
Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp
210 215 220
Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His
245 250 255
Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp
260 265 270
Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met
275 280 285
Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala
290 295 300
Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile
305 310 315 320
Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val
325 330 335
Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn
355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr
370 375 380
Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu
385 390 395 400
Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val
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Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly
420 425 430
Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Arg Lys
465
<210> 4
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
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<212> DNA
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<210> 9
<211> 44
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<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catcaccggc agcactttgc ccggcatgat gctactgccc ggctg 45

Claims (6)

1.天冬氨酸酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1天冬氨酸酶突变体的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.权利要求1的天冬氨酸酶突变体的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)天冬氨酸酶空间结构的模拟：运用SWISS-MODEL在线服务器模拟SEQ ID NO.3所示的天冬氨酸酶的空间结构；并运用Verify_3D对结构模型进行评估和优化，获得准确性高的天冬氨酸酶模拟结构；
(2)通过CDOCKER软件，将所述准确性高的天冬氨酸酶模拟结构与生产R-3-氨基丁酸的底物巴豆酸进行分子对接，分析天冬氨酸酶和底物巴豆酸之间的相互作用类型包括范德华力、π-π相互作用和静电相互作用；
(3)通过虚拟突变得到能提升天冬氨酸酶与底物巴豆酸相互作用的关键残基，所述关键残基包括直接接触底物的残基、不与底物直接接触的第二壳层残基，得到天冬氨酸酶与底物巴豆酸的相互作用提升显著的天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体为氨基酸序列中187位苏氨酸、142位天冬酰胺和326位的天冬酰胺突变为亮氨酸、精氨酸和亮氨酸，其结合能降低，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的天冬氨酸酶突变体。
4.一种含编码权利要求1天冬氨酸酶突变体的基因的重组质粒，其特征在于用下述方法构建：
(1)设计并合成定点突变的引物：T187L-F、T187L-R、N142R-F、N142R-R、N326L-F、N326L-R；
所述T187L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述T187L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述N142R-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、
所述N142R-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示、
所述N326L-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示、
所述N326L-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
(2)将编码天冬氨酸酶的基因连接在pET-22b质粒上，得到重组质粒22b-PT7-Asp-H，天冬氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述编码天冬氨酸酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)以重组质粒22b-PT7-Asp-H为模板，T187L-F和T187L-R作为引物进行第一轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L；
(4)以重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L作为模板，N142R-F和N142R-R作为引物进行第二轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，获得重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R；
(5)以重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R作为模板，N326L-F和N326L-R作为引物进行第三轮PCR，对PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段，并将其转化入DH5α感受态细胞，通过抗生素筛选、质粒提取和测序验证，重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L。
5.表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L，其特征在于用下述方法构建：
将重组质粒22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行转化，得到表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L。
6.利用权利要求5所述工程菌发酵生产R-3-氨基丁酸的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将表达天冬氨酸酶突变体的工程菌BL21-22b-PT7-Asp-HT187L/N142R/N326L发酵，诱导表达得到菌体细胞沉淀物，透性化处理后得到透性化细胞；
(2)将终浓度250g/L底物巴豆酸溶解在以水为溶剂配制的终浓度100mM的HEPES和终浓度2mMMgCl2的混合液中，加入终浓度250g/LNH4Cl，用氨水调节pH＝8.0，得第二混合液，将步骤(1)获得的透性化细胞重悬于第二混合液使浓度为8g/L，在摇床中于37℃以200rpm的搅拌速度孵育进行生物转化，得到R-3-氨基丁酸。
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