CN109295028A

CN109295028A - 高酶活天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法

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Publication number: CN109295028A
Application number: CN201811305138.7A
Authority: CN
Inventors: 闵伟红; 高云娜; 方丽; 韩彩静
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: CN109295028B

Abstract

一种天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明所述的高酶活天冬氨酸激酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2～10个、进一步2～6个、再进一步2～3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有天冬氨酸激酶的功能。优选的是经过2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，特别优选的，是对该氨基酸序列中第372位和379位的氨基酸进行定点饱和突变，并利用高通量筛选方法挑选高酶活天冬氨酸激酶突变体。本发明进一步利用电转化法将高酶活力且解除或削弱Lys反馈抑制作用的天冬氨酸激酶突变体的pEC‑AK重组穿梭表达载体转入到北京棒杆菌中，最终获得重组北京棒杆菌M372I‑T379S工程菌，并对其进行发酵产物分析。

Description

高酶活天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法。

背景技术

天冬氨酸激酶(Aspartokinase，AK)广泛存在于细菌、真菌和植物中，是天冬氨酸族氨基酸合成途径中关键限速酶，其催化L-天冬氨酸与三磷酸腺苷 (ATP)反应，生成L-天冬氨酰-4-基磷酸和腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)。然而天冬氨酸激酶是一种别构酶，受到末端产物如苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，可灵活根据终产物的积累情况控制碳流量，因此限制了天冬氨酸族氨基酸的积累。

由于天冬氨酸激酶受到终产物严格的调控，解除终产物对AK的反馈抑制是发展高产末端产物蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸和异亮氨酸菌株的必经之路之一。

天冬氨酸族氨基酸主要采用蛋白质水解法、化学合成法和微生物发酵法生产。因蛋白质水解法和化学合成法具有环境污染严重、危险性大、资源成本高等缺点将逐渐被淘汰，而以生产成本低、环境污染小、节约能源等优点集一身的微生物发酵法逐步成为工业化生产的主要方法，因此高产天冬氨酸族氨基酸工程菌的构建成为研究的热点。

传统上，突变株通过物理或化学诱变剂作用进行随机突变和后续筛选而构建，如筛抗结构类似物和营养缺陷型突变株，但以上方法存在任务重、周期长和很难进一步提高目标物产量等问题。随着基因工程和蛋白质工程技术的发展，对关键酶进行理性或半理性设计及定向改造，从分子水平上对代谢途径进行合理的调控己成为选育高产天冬氨酸族氨基酸菌株的热门方向。例如，在CN104662169A 中已报道制备含有编码在其反馈抑制中解除或者削弱酶基因载体的方法；中国专利CN 1071378 C公开了一种解除反馈抑制的天冬氨酸激酶以及利用该激酶和包含该激酶的宿主生产L-苏氨酸的方法。但寻找更多、更有效的天冬氨酸激酶仍十分重要。

综上所述，本领域急需具有高酶活和解除终产物反馈抑制能力的天冬氨酸激酶突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供具有高酶活且解除Lys抑制作用的天冬氨酸激酶突变体和工程菌及该突变体的制备方法。

本发明成功构建了一株北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌，其保藏编号为CGMCC NO.16340，分类命名为北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期为2018年8月27日。

外源性天冬氨酸激酶(AK)基因来源于北京棒杆菌AS1.299(购自中科院微生物研究所)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，外源性天冬氨酸激酶(AK) 的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

本发明所述的高酶活天冬氨酸激酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2～10个、进一步2～6个、再进一步2～3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有天冬氨酸激酶的功能。优选的是经过2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列；特别优选的，是对该氨基酸序列中第372位和379位的氨基酸进行定点饱和突变(即该突变位点可任意突变为其他19种氨基酸)，并利用高通量筛选方法挑选高酶活天冬氨酸激酶突变体；最终优选的是得到氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的突变体。

本说明所述的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶的第 372位和379位的氨基酸进行定点饱和突变得到的高酶活天冬氨酸激酶突变体的制备方法，其步骤如下：

1)以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)的全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的天冬氨酸激酶(AK) 目的基因片段；

2)利用限制性内切酶EcoRI和NdeI对步骤1)得到的天冬氨酸激酶(AK) 目的基因片段和pET-28a载体进行双酶切后并过夜连接，连接后的产物即为 pET-AK重组质粒；

3)以步骤2)得到的pET-AK重组质粒为模板，利用M372N和T379N引物分别对编码AK的氨基酸序列的372位和379位氨基酸进行定点饱和突变PCR，并将PCR产物分别转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得多种天冬氨酸激酶单突变体菌株，通过高通量筛选的方法挑选出高酶活力天冬氨酸激酶单突变体，即 M372I和T379S菌株；

PCR引物如下(划线部分为突变位点)：

M372N上游引物5’-GTAACACCTGGGTGAGACTGNNNGCCCGCACC-3’

下游引物5’-CTCGTGGGTGCGGGCNNNCAGTCTCACCC-3’

T379N上游引物5’-CATGAACTCTGCNNNAACACCTGGGTGAGACTG-3’

下游引物5’-CACCCAGGTGTTNNNGCAGAGTTCATGGAAGC-3’

4)提取单突变体M372I菌株的质粒，利用T379S上游引物 5’-TTCCATGAACTCTGCGC TAACACCTGGGTGAGAC-3’，下游引物 5’-CACCCAGGTGTTAGCGCAGAGTTCATGGAAGC-3’(划线部分为突变位点) 进行突变PCR，并将PCR产物转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得天冬氨酸激酶突变体M372I-T379S菌株。

5)添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至含有天冬氨酸激酶突变体 M372I-T379S菌株的LB培养基中，过夜培养诱导蛋白表达；

6)对步骤5)得到的菌液进行离心处理，加入PBS缓冲溶液吹悬菌体，通过超声破碎、离心处理后得到的上清液即为粗酶液，经镍柱亲和层析法分离纯化，得到天冬氨酸激酶突变体AK的纯化液，即完成了该高酶活天冬氨酸激酶突变体的构建；

7)对步骤6)得到的天冬氨酸激酶突变体AK纯化液进行反应动力学、最适温度、最适pH、稳定性及抑制剂反馈抑制能力分析。

第二方面，本说明提供了一株北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌及其构建方法。

提取从步骤6)获得的高酶活力且削弱Lys反馈抑制作用AK纯化液的天冬氨酸激酶突变体M372I-T379S菌株质粒，并以其为模板，在引物(上游引物 5’-CATGGAATTCATGGCCCTGGTCGTACAGAA-3’，下游引物5’- GAGGATCCTTAGCGTCCGGTGCCTGC-3’，划线部分分别为EcRI和BamHI酶切位点)的作用下进行PCR反应，将PCR产物与穿梭表达载体pEC-XK99E进行EcRI和BamHI双酶切和过夜连接，获得的连接产物即为pEC-AK重组穿梭表达载体，利用电转化法将其转至北京棒杆菌感受态中，构建的菌株即为北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌。

第三方面，本说明对工程菌进行发酵产物分析。

将工程菌(北京棒杆菌重组菌M372I-T379S)以2％(v/v)接种量转入到100mL 种子培养基(葡萄糖25g/L，玉米浆20g/L，尿素1.25g/L，KH₂PO₄ 1g/L， MgSO₄ 5g/L，pH 7.0)，30℃、200rpm培养12后，将其以5％(v/v))接种量转接至100mL发酵培养基(葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，维生素B₁1mg/L，维生素B₆ 6mg/L，维生素B₁₂ 0.2g/L，生物素0.1mg/L，KH₂PO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，MgSO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，pH 7.0)，使其初始OD₆₀₀＝1.0，30℃、200r/min培养48h，利用高效液相色谱法每4h收集发酵液进行发酵产物测定，发酵30h后发酵产物的产量趋于稳定，总氨基酸含量高达53.64g/L，其中L-蛋氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸产量分别达到0.16g/L、 2.68g/L、5.33g/L和8.39g/L。

附图说明

图1电泳验证结果图：(a)PCR核酸电泳验证结果图(M:2000DNA Marker； 1,AK)；(b)SDS-PAGE验证结果图(M:蛋白Marker；1,WT粗酶液；2,WT 纯化液；3,M372I粗酶液；4,M372I纯化液；5,T379S粗酶液；6,T379S纯化液； 7,M372I-T379S粗酶液；8,M372I-T379S纯化液)；

图2野生型(WT)和突变体(M372I、T379S、M372I-T379S)的反应动力学分析曲线；

图3野生型(WT)和突变体(M372I、T379S、M372I-T379S)的最适pH 曲线；

图4野生型(WT)和突变体(M372I、T379S、M372I-T379S)的最适温度曲线；

图5野生型(WT)和突变体(M372I、T379S、M372I-T379S)的稳定性曲线；

图6野生型(WT)和突变体(M372I、T379S、M372I-T379S)与抑制剂或底物分子间结合能力分析曲线，(a)野生型与底物L-Asp结合能力分析曲线， (b)M372I-T379S突变体AK与底物L-Asp结合能力分析曲线，(c)野生型 AK与抑制剂Lys结合能力分析曲线，(d)M372I-T379S突变体AK与抑制剂 Lys结合能力分析曲线。

具体实施方式

经过长期的研究发现源自北京棒杆菌的天冬氨酸激酶突变体不仅具有优良的比活性，还具有一定的解除赖氨酸反馈抑制能力。下面结合具体实施例，进一步阐述本说明。

实施例1、重组大肠杆菌菌株的构建

(1)AK基因的克隆

利用TAKaRa基因组提取试剂盒提取北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)染色体DNA，以其为模板在克隆引物作用下进行PCR扩增，大量克隆AK目的基因片段，经PCR核酸电泳验证，北京棒杆菌天冬氨酸激酶(AK) 在附图1中1000到2000bp之间有明亮条带，其与SEQ ID NO:1的长度大小相符。试剂均购自TAKaRa公司，设计的克隆引物如下：

上游引物：5'-GGAATTCCATATGGCCCTGGTCGTACAGAA-3'

下游引物：5'-GGAATTCTTAGCGTCCGGTGCCTGCAT-3'

其中划线部分是NdeI和EcoRI限制性酶的酶切切位点。

(2)构建重组大肠杆菌菌株

利用胶回收试剂盒(TAKaRa)回收含AK目的基因片段的PCR产物，将其与pET-28a载体分别进行EcoRI和NdeI双酶切后，16℃恒温金属浴中进行过夜连接，获得pET-AK重组质粒。将其转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得含AK基因的重组大肠杆菌菌株。由于重组大肠杆菌菌株的AK基因未发生突变，因此本发明在后期研究中将其称为野生菌株(WT)。

连接体系如下：

感受态细胞制备：

1)将大肠杆菌BL21(DE3)菌株以2％的接种量接种至10mL不含卡那霉素的 LB液体培养基中，37℃，180r/min，培养12h；

2)取步骤1)活化后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液1mL接种至50mL不含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min培养，OD₅₆₂值达至0.35；

3)将步骤2)菌液转移至预冷的无菌离心筒冰浴10min后，4℃,5000r/min 离心10min，弃上清，收集菌体；

4)取50mL预冷的0.1mol/L GaCl₂溶液将步骤3)菌体重悬，冰浴30min。

5)将步骤4)冰浴后的溶液4℃，5000r/min离心10min，弃上清。再加入 5mL预冷的0.1mol/L GaCl₂溶液，用枪头轻轻吹打重悬菌体，加1mL甘油，分装保存于-80℃冰箱中。

转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中：

1)取出大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴条件下融化。

2)每100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞分别加入2μL重组质粒或PCR 产物，混匀，冰浴8min，42℃热激90s，再冰浴2min。

3)加入900μL不含卡那霉素的LB培养基至上述感受态细胞中，37℃， 165r/min培养2h。

4)8000r/min离心2min，吸取800μL上清液，将菌体重悬，涂布于含卡那霉素LB固体培养基上，37℃培养箱培养20h。

将菌株送至上海生工生物工程有限公司进行基因测序，北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense,Cp)天冬氨酸激酶(AK)测序结果如SEQ ID NO:1 所示。

实施例2、天冬氨酸激酶突变体的构建

(1)天冬氨酸激酶M372位点突变体的构建

以实施例1(2)中的pET-AK重组质粒为模板，在M372N上游引物 5’-GTAACACCTGGGTGAGACTGNNNGCCCGCACC-3’，下游引物5’-CTCGT GGGTGCGGGCNNNCAGTCTCACCC-3’(划线部分为突变位点)的作用下进行突变PCR反应，利用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR产物和pET-28a载体进行双酶切后并过夜连接(利用实施例1(2)中双酶切和连接体系)，将连接后的产物通过实施1(2)的方法转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得天冬氨酸激酶M372位点突变体菌株。

(2)天冬氨酸激酶T379位点突变体的构建

以实施例1(2)中的pET-AK重组质粒为模板，利用实施例2(1)中的PCR 反应体系和扩增程序，在T379N上游引物5’-CATGAACTCTGCNNNAACACCT GGGTGAGACTG-3’下游引物5’-CACCCAGGTGTTNNNGCAGAGTTCATGGA AGC-3’(划线部分为突变位点)的作用下进行突变PCR反应，对PCR产物和 pET-28a载体进行限制性内切酶EcoRI和NdeI双酶切后并过夜连接(利用实施例1(2)中双酶切和连接体系)，将连接后的产物通过实施1(2)的方法转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得天冬氨酸激酶T379位点突变体菌株。

(3)高通量筛选高酶活突变体

将天冬氨酸激酶M372和T379位点突变体菌株的单菌落分别接种至含有 200μL LB液体培养基的96孔板中，于37℃、180r/min过夜培养，加入IPTG (终浓度为1mmol/L)30℃、130r/min，培养12h诱导蛋白表达。诱导后4000 r/min离心45min，弃上清，加入100μL PBS缓冲溶液重悬菌体，于-20℃、30 min与30℃、50min反复冻融5次使得菌体细胞破碎，胞内蛋白流出。

以L-Asp为底物，对胞内蛋白中的AK进行酶活力测定。酶活测定体系为 800mmol/LKCl、10mmol/L L-Asp、100mmol/L Tris-HCl、800mmol/L NH₄OH、 10mmol/Lβ-巯基乙醇、10.4mmol/L ATP、1.6mmol/L MgSO₄，在上述96孔板中每孔加入100μL酶活测定体系溶液，28℃、130r/min反应30min。反应后加入等体积三氯化铁终止试剂混匀，于波长540nm下测其吸光度。

将酶活力提高明显的突变体菌株送至上海生工生物工程有限公司进行测序，其中一株高酶活天冬氨酸激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQID NO:4所示，对比SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，发现372位点的蛋氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)，即成功构建了高酶活天冬氨酸激酶单突变体M372I菌株。而另一株高酶活天冬氨酸激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，对比SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，发现379位点的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)，即成功构建了高酶活天冬氨酸激酶单突变体T379S菌株。

(4)天冬氨酸激酶双突变体M372I-T379S的构建

利用TAKaRa质粒提取试剂盒提取实施例2(3)中高酶活单突变体M372I 菌株的质粒，利用T379S上游引物 5’-TTCCATGAACTCTGCGCTAACACCTGGGTGAGAC-3’，下游引物 5’-CACCCAGGTGTTAGCGCAGAGTTCATGGAAGC-3’(划线部分为突变位点) 运用实施例2(1)中的PCR反应扩增程序进行突变PCR，并通过实施1(2)的方法将PCR产物转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，获得天冬氨酸激酶双突变体M372I-T379S菌株，其天冬氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

PCR反应体系如下：

实施例3、酶动力学分析及酶学性质表征

(1)粗酶液的分离纯化

将实施例1(2)的重组大肠杆菌菌株(WT)与实施例2中的高酶活突变体 (单突变体M372I和T379S)及双突变体M372I-T379S以2％(v/v)接种量分别转接至100mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min过夜培养后，加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，30℃、130r/min，诱导12h。菌液 8000r/min离心10min，弃上清液，加10mLPBS重悬菌体，经超声破碎30min， 8000r/min离心10min获得的上清液分别为WT粗酶液、M372I粗酶液、T379S 粗酶液和M372I-T379S粗酶液。粗酶液经镍柱亲和层析法分离纯化，500mmol/L 咪唑洗脱得到AK纯化液分别为WT纯化液、M372I纯化液、T379S纯化液和 M372I-T379S纯化液。

将粗酶液和纯化液进行SDS-PAGE蛋白电泳验证，从附图1(b)可以看出粗酶液和纯化液在同一位置处均具有目的条带，表明AK蛋白表达成功，并达到了较理想的纯化效果。

(2)反应动力学分析

本发明的酶动力学分析方法是采用1mL反应体系，测定体系为800mmol/L KCl、10mmol/L L-Asp、100mmol/L Tris-HCl、800mmol/L NH₄OH、10mmol/Lβ- 巯基乙醇、10.4mmol/L ATP、1.6mmol/LMgSO₄，以不同浓度的L-天冬氨酸(分别为0.5mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、 12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L)为底物，每孔加入20μL酶液，28℃、130 r/min反应30min，反应后加入等体积的三氯化铁终止试剂混匀，于波长540nm 下测其吸光度，以Hill方程进行非线性拟合见附图2。

野生型AK的最大反应速率V_max为2.78U/mg·min^-1，单突变体M372I、T379S 和双突变体M372I-T379S AK的V_max分别为38.29U/mg·min^-1、41.75U/mg·min^-1和41.75U/mg·min^-1，较野生型AK分别提高了13.77、15.02和15.60倍。野生型AK的Km值为6.18，而单突变体M372I、T379S和双突变体M372I-T379S 的Km值分别为4.64、4.66和3.25，表明突变后酶与底物亲和力均有所增强。

(3)酶学性质表征

利用实例3(2)中的反应体系对野生型及突变体AK的纯化液分别进行最适pH、最适温度分析和热稳定性研究，每组进行3次平行实验，测定结果见附图3、4、5。

最适温度研究：反应体系不变，在不同温度下(15℃、20℃、25℃、26℃、 28℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)测定AK相对酶活力，以最高酶活定义为100％。

最适pH研究：反应体系其它条件不变，反应体系在不同pH(6、6.5、7、 7.5、8、8.5、9、9.5、10)下，测定AK相对酶活力。以最高酶活定义为100％。

稳定性研究：在最适pH和最适温度下，相同反应体系，每隔1h测定一次酶活。以0h相对酶活定义为100％。

单突变体M372I、T379S和双突变体M372I-T379S较野生型菌株的最适pH 相比均有升高。野生型菌株的最适温度为28℃，单突变体M372I、T379S和双突变体M372I-T379S的最适温度分别为28℃、26℃和30℃，双突变体 M372I-T379S表现出良好的耐热性，这对发酵生产具有重要意义。

野生型AK的半衰期为3.5h,单突变体M372I、T379S和双突变体 M372I-T379S AK的半衰期约为4.5h、4.4h和5.8h，较野生型延长了1.0、0.9 和2.3h，上述结果表明，M372和T379位点突变并未对酶稳定性造成影响，并且突变体比野生型更稳定。

(4)AK与抑制剂及底物结合能力分析

通过微量热泳动仪(Monolith NT.115)对天冬氨酸激酶与抑制剂Lys的结合能力进行分析，测定结果见附图6，通过微量热泳动分析(microscale thermophoresis,MST)得到的解离常数Kd值越小，则表明亲和力越强，反之，亦然。与野生型AK相比较，M372I-T379S突变体与抑制剂Lys解离常数Kd值由1.32mM变为142.38mM，与底物L-Asp解离常数Kd值由686.86mM变为 28.88mM，证明M372I-T379S突变体与底物L-Asp结合能力明显增强，与抑制剂结合强度变弱，这可能是酶活力提高的主要原因。

实施例4、工程菌构建及发酵分析

(1)工程菌株构建

利用TAKaRa质粒提取试剂盒提取实施例3中酶学性质显著改善的双突变体M372I-T379S菌株质粒，将其与穿梭载体pEC-XK99E(购自丰晖生物有限公司)分别进行EcRI和BamH I双酶切，胶回收目的产物AK基因片段和线性穿梭载体pEC-XK99E，在16℃恒温金属浴中进行过夜连接，获得pEC-AK重组穿梭表达载体。利用电转化法将pEC-AK重组穿梭表达载体转入到北京棒杆菌原菌中，获得北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌的菌落呈现圆形、淡黄色、表面光滑、不透明、中央隆起、边缘整齐，一般不运动，2-3天直径可达1.5-3.0mm 的特点。

连接体系如下：

电转化法：

1)取出北京棒杆菌感受态细胞并放在冰上融化，添加pEC-AK重组穿梭表达载体3μL并混匀。

2)立即将上述溶液转移至预冷的0.2cm电转杯中，将电转化杯放入电转化仪中，在电压2500V条件下电击5ms。

3)迅速将lmL电转恢复培养基(蛋白胨5g/L，酵母浸粉2.5g/L，NaCl 10 g/L，脑心浸出液18.5g/L，山梨醇91g/L，p H 7.0)加入到电转杯中混匀。

4)将步骤3)混匀的电转杯中溶液转入到无菌1.5mL EP管中，30℃，160rpm，培养3h。

5)将步骤4)获得的菌液8000r/min离心2min，弃上清液800μL，重悬菌体后涂布在含卡那霉素的固体LB平板上，30℃培养36h。

(2)发酵产物氨基酸含量检测

将北京棒杆菌原菌和北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌分别以2％(v/v) 接种量接入到100mL种子培养基(葡萄糖25g/L，玉米浆20g/L，尿素1.25g/L， KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 5g/L，pH 7.0)，30℃、200rpm培养12后，将其分别以5％(v/v))接菌量转接至100mL发酵培养基(葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，维生素B₁1mg/L，维生素B₆ 6mg/L，维生素B₁₂0.2g/L，生物素0.1mg/L，KH₂PO₄ 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，MgSO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，pH 7.0)中，使其初始OD₆₀₀＝1.0，30℃、200rpm培养0-48h，通过高效液相色谱法对发酵液进行氨基酸含量检测。

每4h收集一次菌株发酵液，经高效液相色谱法检测发现发酵30h后，北京棒杆菌原菌和北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌的发酵产物均比较稳定，北京棒杆菌原菌发酵液的总氨基酸含量为48.72g/L，其中L-蛋氨酸、L-苏氨酸、 L-异亮氨酸和L-赖氨酸产量分别达到0.14g/L、1.93g/L、4.82g/L和6.78g/L，而北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌发酵液的总氨基酸含量高达53.64g/L，其中L-蛋氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸产量分别达到0.16g/L、2.68g/L、 5.33g/L和8.39g/L，较比北京棒杆菌原菌发酵液氨基酸含量分别增长了14.28％、 38.86％、10.58％和23.75％。

<110> 吉林农业大学

<120> 高酶活天冬氨酸激酶突变体、工程菌及该突变体的制备方法

<130> 2018

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1319

<212> DNA

<213> Corynebacterium pekinense

<400> 1

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<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> Corynebacterium pekinense

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Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys

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Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser

100 105 110

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115 120 125

Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp

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Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu

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Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala

165 170 175

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Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala

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Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala

210 215 220

Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala

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275 280 285

Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu

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305 310 315 320

Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp

325 330 335

Gly Arg Arg Ala Val Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn

340 345 350

Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val

355 360 365

Gly Ala Gly Met Gln Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu

370 375 380

Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asp Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu

385 390 395 400

Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala

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Val Tyr Ala Gly Thr Gly Ala

435

<210> 3

<211> 1319

<212> DNA

<213> Corynebacterium pekinense

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<210> 4

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<212> PRT

<213> Corynebacterium pekinense

<400> 4

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<210> 8

<211> 439

<212> PRT

<213> Corynebacterium pekinense

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1 5 10 15

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Val Tyr Ala Gly Thr Gly Ala

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Claims

1.一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2～10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有天冬氨酸激酶的功能。

2.如权利要求1所述的一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2～6个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列。

3.如权利要求2所述的一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2～3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列。

4.如权利要求3所述的一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶经过2个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列。

5.如权利要求4所述的一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的外源性天冬氨酸激酶中第372位和379位的氨基酸进行定点饱和突变而形成的序列。

6.如权利要求4所述的一种高酶活天冬氨酸激酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

7.权利要求5所述的高酶活天冬氨酸激酶突变体的制备方法，其步骤如下：

1)以北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)的全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的天冬氨酸激酶AK目的基因片段；

2)利用限制性内切酶EcoRI和NdeI对步骤1)得到的天冬氨酸激酶AK目的基因片段和pET-28a载体进行双酶切后并过夜连接，连接后的产物即为pET-AK重组质粒；

3)以步骤2)得到的pET-AK重组质粒为模板，利用M372N和T379N引物分别对编码AK的氨基酸序列的372位和379位氨基酸进行定点饱和突变PCR，并将PCR产物分别转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得多种天冬氨酸激酶突变体菌株，通过高通量筛选的方法挑选出高酶活力天冬氨酸激酶突变体M372I和T379S菌株；

PCR引物如下，划线部分为突变位点：

M372N上游引物5’-GTAACACCTGGGTGAGACTGNNNGCCCGCACC-3’

下游引物5’-CTCGTGGGTGCGGGCNNNCAGTCTCACCC-3’

T379N上游引物5’-CATGAACTCTGCNNNAACACCTGGGTGAGACTG-3’

下游引物5’-CACCCAGGTGTTNNNGCAGAGTTCATGGAAGC-3’

4)提取突变体M372I菌株的质粒，利用T379S上游引物5’-TTCCATGAACTCTGCGCTAACACCTGGGTGAGAC-3’，下游引物5’-CACCCAGGTGTTAGCGCAGAGTTCATGGAAGC-3’，划线部分为突变位点；进行突变PCR，并将PCR产物转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得天冬氨酸激酶突变体M372I-T379S菌株；

5)添加异丙基硫代半乳糖苷至含有天冬氨酸激酶突变体M372I-T379S菌株的LB培养基中，过夜培养诱导蛋白表达；

6)对步骤5)得到的菌液进行离心处理，加入PBS缓冲溶液吹悬菌体，通过超声破碎、离心处理后得到的上清液即为粗酶液，再经镍柱亲和层析法分离纯化，得到天冬氨酸激酶突变体纯化液，即完成了该高酶活天冬氨酸激酶突变体的构建。

8.一种北京棒杆菌重组菌M372I-T379S工程菌，其保藏编号为CGMCC NO.16340，分类名为北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年8月27日。