CN115197928B - 天冬氨酸酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及天冬氨酸酶突变体及其在生产氨基酸中的应用。具体来说，本公开涉及一种新的天冬氨酸酶突变体、重组多肽、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，以及生产氨基酸的方法。本公开的天冬氨酸酶突变体是在在对应于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的至少第273和387位中的一个位置处发生突变的突变体。与SEQ IDNO：1所示序列的多肽相比，本发明公开的天冬氨酸酶突变体在高底物浓度、低pH、低反应温度的催化条件下仍具有高酶活的特点，可高效制备目标氨基酸或其盐或其多聚体，以提升其大规模工业化生产的价值。

Description

天冬氨酸酶突变体及其制备方法和用途

技术领域

本公开属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种天冬氨酸酶突变体、重组多肽、编码多肽或重组多肽的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，以及生产氨基酸的方法。

背景技术

天冬氨酸氨裂解酶(aspartate ammonia-lyase，E.C.4.3.1.1)，也被称为天冬氨酸酶(aspartase)，其天然底物为天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。根据文献报道，天冬氨酸酶能够催化L-天冬氨酸生成富马酸的可逆反应。野生型天冬氨酸酶的活性口袋中，有4个能够与α-羧基相结合的位点，为极性氨基酸残基，通常为苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。天冬氨酸酶目前广泛应用于天冬氨酸的生物法合成，并且是现有生物法合成β-丙氨酸第一步所需的酶催化剂。其性质与催化机理已经得到了广泛研究。天冬氨酸酶具有严格的底物特异性，只对富马酸表现出活力。文献报道与前期研究均表明，野生型的天冬氨酸酶对于丙烯酸不存在催化活性或者催化效率极低。

现有技术中公开的通过生物合成法，利用天冬氨酸酶合成β-丙氨酸的步骤如下：

生物合成法生产β-丙氨酸，主要是通过天冬氨酸酶与L-天冬氨酸-α-脱羧酶双酶偶联，催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸，而后脱羧生成β-丙氨酸。该方法的原料富马酸转化为β-丙氨酸时有分子量损失，原子经济性差；反应需要两步完成、过程复杂，影响收率；而且酶催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸的反应为可逆反应，不能完全转化，收率低。因此，国内外的研究工作者们在丙烯酸氨化合成β-丙氨酸的研究中进行了大量的探索工作。

引用文献1筛选得到一株含β-丙氨酸合成酶的藤黄八叠球菌。通过诱变和条件优化后，其丙烯酸转化率仅为1.25％，远远无法满足工业化的需求。因此，为提高β-丙氨酸的产量和转化率，急需提高天冬氨酸酶对丙烯酸的催化效率。

引用文献2公开了一种天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用，所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与野生型天冬氨酸酶的序列相比，还存在下述突变中的一种或多种突变：D20V、V75E、Q89H、L156F、T164I、Y204C、N226I、L258I、M285L、M321I、K324I、K381R、K389I、I406L、R426C和/或P456L。

引用文献3公开了一种天冬氨酸酶突变体及其应用，所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与野生型的序列相比，将野生型天冬氨酸酶的序列的第142位的N替换为V、第188位的H替换为A，进而得到了突变的天冬氨酸酶变体。

引用文献4公开了一种β-丙氨酸的生物合成方法，所述天冬氨酸酶变体的氨基酸序列与野生型天冬氨酸酶的序列相比，含有T187A、M321F、K324I、N326L突变位点之一的天冬氨酸酶突变体即可实现催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变。

虽然现有技术中已经公开了不同的天冬氨酸酶突变体，但是仍然需要提供一种在高底物浓度、低pH、低反应温度的催化条件下仍具有高酶活的特点的天冬氨酸酶突变体，以满足工业生产的需要。

引用文献：

引用文献1：楼坚，《生物转化法生产β-丙氨酸的研究》，2006；

引用文献2：WO2019024706A1；

引用文献3：CN110791493A；

引用文献4：CN110923272A。

发明内容

发明要解决的问题

本公开选择天冬氨酸酶作为改造起点，在野生型天冬氨酸酶的基础上，通过人工引入突变，改变其催化性质，使其能够将丙烯酸作为底物生成β-丙氨酸。

本公开提供了天冬氨酸酶突变体及其应用，该天冬氨酸酶突变体在高底物浓度、低pH、低反应温度的催化条件下仍具有高酶活的特点，可高效催化丙烯酸制备β-丙氨酸，进一步提升其大规模工业化生产的价值。

用于解决问题的方案

本公开记载了如下技术方案。

(1)一种多肽，所述多肽具有天冬氨酸酶活性，其中，所述多肽选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：

(i)所述突变体和SEQ ID NO：1所示的序列相比，在对应于SEQ ID NO：1所示序列的至少第273和387位中的一个或多个位置处包含突变；

(ii)与(i)所示序列具有至少98％的序列同一性，且不包括SEQ ID NO：1所示序列的多肽；

(iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：

(a)编码如(i)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(b)(a)的全长互补多核苷酸；

(iv)由(i)、(ii)、(iii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有天冬氨酸酶活性。

(2)根据(1)所述的多肽，其中，所述多肽为包含如下(c)-(d)中至少一组所示的突变的多肽：

(c)对应SEQ ID NO：1所示序列的第273位的氨基酸由半胱氨酸(C)突变为缬氨酸(V)；

(d)对应SEQ ID NO：1所示序列的第387位的氨基酸由半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)。

(3)根据(1)或(2)所述的多肽，其中，所述多肽为包含如下(e)-(h)中至少一组所示的突变的多肽：

(e)对应SEQ ID NO：1所示序列的第187位的氨基酸由苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)；

(f)对应SEQ ID NO：1所示序列的第324位的氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)；

(g)对应SEQ ID NO：1所示序列的第326位的氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)；

(h)对应SEQ ID NO：1所示序列的第439位的氨基酸由半胱氨酸(C)突变为脯氨酸(P)；

任选的，所述多肽还包含如下所示的突变的多肽：

(j)对应SEQ ID NO：1所示序列的第321位的氨基酸由甲硫氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)。

(4)根据(1)-(3)任一项所述的多肽，其中，所述多肽由包含如(k)-(o)任一项所示的序列编码：

(k)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸后得到的序列；

(l)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸后得到的序列；

(m)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列；

(n)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列；

(o)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第156位由亮氨酸突变为苯丙氨酸、第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丝氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列。

(5)根据(1)-(4)任一项所述的多肽，其中，所述多肽包括在(i)所示序列的多肽的N端或C端部位缺失或添加至少一个氨基酸残基。

(6)一种重组多肽，其中，所述重组多肽包括(1)-(5)任一项所述的多肽，以及与所述多肽融合的外源多肽。

(7)一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码(1)-(5)任一项所述多肽的核苷酸序列，或包含编码(6)所述重组多肽的核苷酸序列。

(8)一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，调控序列为包含启动子或核糖体结合位点的核苷酸序列，所述调控序列指导所述突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。

(9)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含(7)所述的多核苷酸，或(8)所述的核酸构建体。

(10)一种重组宿主细胞或重组基因工程菌，其中，所述重组宿主细胞或重组基因工程菌包含(1)-(5)任一项所述的多肽、(6)所述的重组多肽、(7)所述的多核苷酸、(8)所述的核酸构建体，或者(9)所述的重组表达载体。

(11)根据(10)所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌，其中，宿主细胞或基因工程菌来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、微球菌属、短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属；优选地，所述宿主细胞或所述基因工程菌来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒状杆菌属。

(12)如(1)-(5)任一项所述的多肽、(6)所述的重组多肽、(7)所述的多核苷酸、(8)所述的核酸构建体、(9)所述的重组表达载体，或(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌在生产氨基酸或其盐或其多聚体中的应用；

优选地，所述氨基酸为丙氨酸或天冬氨酸；更优选的，所述丙氨酸为β-丙氨酸。

(13)一种生产氨基酸的方法，其中，包括利用(1)-(5)任一项所述的多肽、(6)所述的重组多肽、(7)所述的多核苷酸、(8)所述的核酸构建体、(9)所述的重组表达载体，或(10)-(11)任一项所述的重组宿主细胞或重组基因工程菌生产氨基酸或其盐或其多聚体的步骤；

可选地，所述方法以丙烯酸或丙烯酸盐、和氨水为原料，还包括纯化或分离所述氨基酸或其盐或其多聚体的步骤；

优选地，所述氨基酸为丙氨酸或天冬氨酸；更优选的，所述丙氨酸为β-丙氨酸；

优选地，在生产氨基酸的步骤中，丙烯酸或丙烯酸盐浓度为250～400g/L，pH值为7.2～7.8，反应温度为32～37℃。

(14)一种制备(1)-(5)中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括培养含有(10)所述重组宿主细胞或重组基因工程菌，然后从重组宿主细胞、重组基因工程菌或其培养物中回收所述多肽的步骤。

在一个具体的实施方式中，前述(1)-(14)中的多肽为天冬氨酸酶突变体，并且其仍然具有天冬氨酸酶活性。

发明的效果

在一些实施方式中，本公开提供了天冬氨酸酶突变体及其应用。

在一些具体的实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体在250～400g/L的底物浓度下，仍然具有更高的酶活性。

在一些具体的实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体在7.2～7.8的pH值范围内，仍然具有更高的酶活性。

在一些具体的实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体在32～37℃的温度范围内，仍然具有更高的酶活性。

在一些具体的实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体在250～400g/L的底物浓度下，7.2～7.8的pH值范围内和在32～37℃的温度范围内，仍然具有更高的酶活性，可高效催化丙烯酸制备β-丙氨酸，进一步提升其大规模工业化生产的价值。

在一些实施方式中，本公开的重组多肽、分离的多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体分别包含或表达上述天冬氨酸酶突变体，可应用于β-丙氨酸的工业生产。

在一些实施方式中，本公开的生产β-丙氨酸的方法，利用了上述天冬氨酸酶突变体，或重组多肽、重组宿主细胞等，能够实现β-丙氨酸的稳定、高效生产。

附图说明

图1为丙烯酸标准样品高效液相色谱示意图；

图2为β-丙氨酸标准样品高效液相色谱示意图；

图3为突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P全细胞催化丙烯酸反应液液相出峰示意图。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

如本公开所使用的，尽管可以使用其他有机或无机催化剂，但术语“转化(converting)”是指主要由一种或多种的多肽(酶)催化从一个分子到另一个分子的化学转化；其也可以指期望产物的摩尔量与限量底物的摩尔量之间的比率(以％为单位)。

如本公开所使用的，术语“酶活力”定义为，在底物浓度为300g/L，反应温度为35℃，pH为7.5的条件下每分钟催化底物产生1微摩尔(μmol)β-丙氨酸所需要的细胞(含水80％)量定义为1个单位(U)。

如本公开所使用的，术语天冬氨酸氨裂解酶(aspartate ammonia-lyase，E.C.4.3.1.1)，也被称为天冬氨酸酶(aspartase)，其天然底物为天冬氨酸，以高底物特异性和二级羧酸盐结合口袋的特性被选择改造用于β-氨基酸的制备。天冬氨酸酶能够催化L-天冬氨酸生成富马酸的可逆反应。天冬氨酸酶目前广泛应用于天冬氨酸的生物法合成，并且是现有生物法合成β-丙氨酸第一步所需的酶催化剂。

如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

如本公开所使用的，术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的一种多肽或一个催化或碳水化合物结合模块。在本公开的技术方案中，所述片段具有天冬氨酸酶活性。

如本公开所使用的，术语“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。

如本公开所使用的，术语“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多核苷酸或多肽，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸。示例性的，本公开中的“突变体”为具有提高的天冬氨酸酶活性的多肽。

如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。

在本公开中，“突变”还可以包含在对应SEQ ID NO：1所示序列的一个或几个位置处不影响天冬氨酸酶活性的添加、缺失或取代的氨基酸。众所周知，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换、添加或缺失某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性。

在一些实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。

如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。

如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，示例性的，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。

如本公开所使用的，在两种核酸或多肽比较中的术语“序列同一性”或“同一性百分比”，是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。

本公开涉及的测定“序列同一性”或“同一性百分比”的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

在一些实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体与包含SEQ ID NO：1所示序列的天冬氨酸酶相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。在另外一些实施方式中，本公开的编码天冬氨酸酶突变体的多核苷酸与编码SEQ ID NO：1所示序列的天冬氨酸酶的多核苷酸(所述多核苷酸的序列为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)相比，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。

如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

如本公开所使用的，术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、突变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。例如宿主细胞可以被遗传修饰以表达本公开的多肽。来自宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。“重组多核苷酸”属于“多核苷酸”中的一种。

如本公开所使用的，术语“重组多核苷酸”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。含有重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”。

如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

如本公开所使用的，术语“表达载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。

如本公开所使用的，术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

如本公开所使用的，术语“重组基因”是并非天然存在的基因。重组基因是人造的。重组基因包括可操作地连接到表达控制序列上的蛋白质编码序列。实施方案包括但不限于引入微生物的外源基因、可操作地连接到异源启动子的内源蛋白质编码序列和具有经修改的蛋白质编码序列的基因。重组基因保存在微生物的基因组、微生物中的质粒或微生物中的噬菌体上。

如本公开所使用的，术语“可操作地连接”是指如下的构造：调控序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该调控序列指导该编码序列的表达。示例性的，所述调控序列可以选自启动子和/或增强子编码的序列。

如本公开所使用的，术语“核酸构建体”包含与适合的调控序列有效地连接的编码多肽或结构域或模块的多核苷酸，该调控序列对于在所选细胞或者菌株进行多核苷酸的表达是必需的。在本公开中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。

本公开中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本公开的突变体多肽、编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入编码突变体多肽的多核苷酸或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的具有编码天冬氨酸酶活性的多肽、重组多肽的多核苷酸的细胞即可。在一个实施方案中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸的微生物，例如来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、微球菌属、短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属；优选地，所述宿主细胞或所述基因工程菌来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒状杆菌属。

本公开中的术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化、转染、转导的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本公开的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

天冬氨酸酶的突变体

在一些实施方式中，本公开通过定点突变构建了Bacillus sp.中编码天冬氨酸酶基因的突变文库，从中筛选出可以提高天冬氨酸酶活性的突变体。

在一些实施方式中，本公开的天冬氨酸酶突变体在高底物浓度(250～400g/L％)、低pH(7.2～7.8)、低反应温度(32～37℃)的催化条件下仍具有高酶活的特点，可高效催化丙烯酸制备β-丙氨酸，

在一些实施方式中，本公开的提高天冬氨酸酶活性的突变体的突变位点包括SEQID NO：1所示序列的第273和387位的一个或多个位置的取代的氨基酸。

示例性的，对应SEQ ID NO：1所示序列的第273位的氨基酸由半胱氨酸(C)突变为缬氨酸(V)。

对应SEQ ID NO：1所示序列的第387位的氨基酸由半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)。

在一些实施方式中，本公开提供了天冬氨酸酶突变体，包括与本公开的天冬氨酸酶的突变体具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性，且氨基酸序列不为SEQ ID NO：1所示序列的天冬氨酸酶突变体。

在一些实施方式中，本公开提供了具有天冬氨酸酶活性的蛋白，包括天冬氨酸酶的突变体的N端和C端的至少一端起，存在氨基酸的添加或缺失。

在一些具体的实施方式中，上述天冬氨酸酶的突变体的N端和C端的至少一端起，添加或缺失1-20个氨基酸，优选1-15个，更优选1-10个，更优选1-3个，最优选1个，并且具有天冬氨酸酶活性。

在一些实施方式中，本公开提供了编码天冬氨酸酶的突变体的多核苷酸，多核苷酸编码如SEQ ID NO：1所示序列的突变体。

在一些实施方式中，所述天冬氨酸酶突变体为将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸(记为M321I)、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸(记为N326A)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)。

在一些实施方式中，将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列如(A)～(B)中所述位点的一种或多种突变进行组合；

(A)将第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸(记为K324M)；

(B)将第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸(记为C439P)。

在一些具体的实施方式中，本发明突变获得的天冬氨酸酶突变体选自下列突变体中的一种：

(1)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸(记为M321I)、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸(记为N326A)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)，命名为T187I/C273V/M321I/N326A/C387A；

(2)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸(记为M321I)、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸(记为K324M)、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸(记为N326A)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)，命名为T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A；

(3)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸(记为M321I)、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸(记为N326A)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸(记为C439P)，命名为T187I/C273V/M321I/N326A/C387A/C439P；

(4)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸(记为M321I)、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸(记为K324M)、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸(记为N326A)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸(记为C439P)，命名为T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P；

(5)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，第156位由亮氨酸突变为苯丙氨酸(记为L156F)、第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸(记为T187I)、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸(记为C273V)、第321位由甲硫氨酸突变为亮氨酸(记为M321L)、第326位由天冬酰胺突变为丝氨酸(记为N326S)、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸(记为C387A)、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸(记为C439P)，命名为L156F/T187I/C273V/M321L/N326S/C387A/C439P。

氨基酸的制备方法

在一些实施方式中，本公开可以包括利用前述天冬氨酸酶突变体、重组多肽、多核苷酸、核酸构建体、重组表达载体，重组宿主细胞，重组基因工程菌制备目标氨基酸或其盐或其多聚体。

在一些具体的实施方式中，所述氨基酸为丙氨酸；更优选的，所述丙氨酸为β-丙氨酸。

在一些具体的实施方式中，所述重组基因工程菌可以呈菌体、其细胞破碎物形式或者发酵液，参与反应。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，作为反应原料的丙烯酸的浓度可选择250～400g/L。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，作为反应原料的丙烯酸的浓度优选为300g/L。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，反应温度可选择32～37℃。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，反应温度优选为35℃。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，反应体系pH可选择7.2～7.8。

在一些具体的生产氨基酸的步骤中，反应体系pH优选为7.5。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

本公开构建的天冬氨酸酶突变体均为Bacillus sp.YM55-1来源的野生型天冬氨酸酶(AspB)SEQ ID NO:1的突变体。其中SEQ ID NO:1在文献(Ruifeng Li et al.,Computational redesign of enzymes for regio-and enantioselectivehydroamination.Nat.Chem.Biol.,2018)中有报道，编码基因是本公开序列表中的SEQ IDNO:2。

实施例1：天冬氨酸酶及天冬氨酸酶突变体表达菌株的构建

使用本领域常规分子克隆方法构建含有编码所述天冬氨酸酶及其变体基因的质粒，并且将所得重组质粒转化至合适的宿主细胞中，得到天冬氨酸酶突变体表达菌株。

在本实施例中，使用的载体质粒具体是pET-24a(+)，载体核苷酸序列见SEQ IDNO：3。以含有天冬氨酸酶及其变体编码基因的基因片段为模板，以Primer-F/R(序列分别为TTTAAGAAGGAGATATACATatgaataccgatgttcgtattg(正向引物)，SEQ ID NO：4和AGCACCACCACCACCACCAttttcttccagcaattcccg(反向引物)，SEQ ID NO：5)为引物进行PCR扩增相应的核苷酸基因片段。将pET21a(+)，以内切酶Nde I和Xho I进行线性化处理得到线性化载体。之后，将所述PCR扩增得到的基因片段和pET21a(+)线性化载体按照1:1的摩尔比例混合，通过即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程)构建含有天冬氨酸酶或其变体编码基因的重组质粒。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞，将含有所述天含有天冬氨酸酶或其变体编码基因的重组质粒通过化学转化或电转化导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，通过抗性筛选得到含天冬氨酸酶或其变体基因的大肠杆菌重组菌。

天冬氨酸酶突变体首先基于分子对接软件Rosetta进行设计，再通过上述分子克隆方法进行单点或多点突变，得到本公开所述突变体。

实施例2：菌株培养和发酵

使用常规大肠杆菌LB培养基(Luria-Bertani营养肉汤培养基)以天冬氨酸酶发酵培养基培养实施例1构建的天冬氨酸酶突变体表达菌株。

LB培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。

本公开采用的天冬氨酸酶发酵培养基配方如下：25％甘油，酵母粉6g/L，磷酸氢二钾3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化钠1.48g/L，七水硫酸镁0.25g/L，六水氯化铁0.16g/L，硫酸卡那霉素50mg/L。

具体过程是将含天冬氨酸酶或其变体基因的大肠杆菌重组菌先接种于LB培养基中37℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，再取培养后的发酵液按1％接种量接种于自制天冬氨酸酶发酵培养基，按照分批发酵的方式进行发酵，在37℃，200rpm条件下振荡培养4h后降温30℃，加入终浓度0.5mM的IPTG进行酶的诱导表达，继续培养24h后收取细胞。

实施例3：细胞收集

可采用以下三种方法对实施例2得到的细胞进行收集：

①离心法：将细胞培养液在4000rpm的条件下，离心10min，收集细胞；

②中空纤维膜过滤：将细胞培养液用0.22μm中空纤维膜，收集细胞；

③陶瓷膜过滤：用50KDa陶瓷膜过滤，收集细胞。

在实验室条件下，优选离心法收集细胞(本实施例采用此方法)，进而进行后续实验。

实施例4：酶活检测结果

采用实施例3收集的细胞作全细胞催化丙烯酸检测天冬氨酸酶及天冬氨酸酶突变体活力。

首先配制酶活反应体系：称取15g丙烯酸于烧杯中，用25％-28％氨水调pH为7.5，用纯水定容至50mL备用。称取湿细胞0.1g加入上述反应体系，35℃控温反应1h，以高效液相色谱法检测β-丙氨酸含量，计算酶活力。

进一步的，通过高效液相色谱对于β-丙氨酸的含量的结果进行检测。其中，前述高效液相色谱的检测条件为：所采用色谱柱为氨基柱(Dikma Polyamino HILIC)，流动相为乙腈和磷酸二氢钾(体积比65:35)，柱温40℃，流速1ml/min，采用紫外检测器，检测波长为200nm。

以突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P为例，其通过高效液相色谱法检测β-丙氨酸的含量的结果如图3所示，其示出了突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P催化反应进行1h时丙烯酸和β丙氨酸的液相出峰情况。

作为对照，图1为丙烯酸标准样品高效液相色谱图，丙烯酸出峰时间4.6min；图2为β-丙氨酸标准样品高效液相色谱图，β-丙氨酸出峰时间9.2min。

经过检测，酶活检测的结果如下：

野生型的天冬氨酸酶的比酶活为20U/mg；

突变体T187I/C273V/M321I/N326A/C387A的比酶活为510U/mg，为野生型的天冬氨酸酶的比酶活的34倍；

突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A的比酶活为680U/mg，为野生型的天冬氨酸酶的比酶活的45.3倍；

突变体T187I/C273V/M321I/N326A/C387A/C439P的比酶活为560U/mg，为野生型的天冬氨酸酶的比酶活的37.3倍；

突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P的比酶活为712U/mg，为野生型的天冬氨酸酶的比酶活的47.5倍；

突变体L156F/T187I/C273V/M321L/N326S/C387A/C439P的比酶活为810U/mg，为野生型的天冬氨酸酶的比酶活的54倍。

实施例5：丙烯酸催化制备β-丙氨酸的方法

以表达突变体L156F/T187I/C273V/M321L/N326S/C387A/C439P的重组菌为菌种，通过实施例2的发酵方法以及实施例3的细胞收集方法得到含酶的湿细胞。

以纯水配置300g/L的丙烯酸，缓慢滴加25％-28％的氨水调pH7.5，调pH过程中注意温度不超过20℃。pH调整好后，加入6.0g/L湿细胞，以纯水定容至500mL，控温35±0.2℃，开启搅拌反应24h。

从反应结果来看，前期反应十分迅速，反应0.5h，转化率达20％，反应16h转化率达90％，反应24h转化率达到99％，β-丙氨酸浓度267.2g/L。

可以采用和上述记载的相同或相似的方法，利用不同的重组菌株，通过丙烯酸催化制备β-丙氨酸。

示例性的，还可以采用的突变体菌株如下所示：

突变体T187I/C273V/M321I/N326A/C387A；

突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A；

突变体T187I/C273V/M321I/N326A/C387A/C439P；

突变体T187I/C273V/M321I/K324M/N326A/C387A/C439P。

实施例6-11

按照实施例5的制备方法，改变为丙烯酸浓度、反应温度、反应体系pH等参数进行实验。

实验结果如下表1所示。

表1

本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明书所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，本说明书所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 山东新和成精化科技有限公司

浙江新和成股份有限公司

上虞新和成生物化工有限公司

<120> 天冬氨酸酶突变体及其制备方法和用途

<130> 6268-2123141I

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> Bacillus

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> Bacillus

<400> 2

atgaataccg atgttcgtat tgagaaagac tttttaggag aaaaggagat tccgaaagac 60

gcttattatg gcgtacaaac aattcgggca acggaaaatt ttccaattac aggttatcgt 120

attcatccag aattaattaa atcactaggg attgtaaaaa aatcagccgc attagcaaac 180

atggaagttg gcttactcga taaagaagtt gggcaatata tcgtaaaagc tgctgacgaa 240

gtgattgaag gaaaatggaa tgatcaattt attgttgacc caattcaagg cggggcagga 300

acttccatta atatgaatgc aaatgaagtg attgctaacc gcgcattaga attaatggga 360

gaggaaaaag gaaactattc aaaaattagt ccaaactccc atgtaaatat gtctcaatca 420

acaaacgatg ctttccctac tgcaacgcat attgctgtgt taagtttatt aaatcaatta 480

attgaaacta caaaatacat gcaacaagaa ttcatgaaaa aagcagatga attcgctggc 540

gttattaaaa tgggaagaac gcacttgcaa gacgctgttc ctattttatt aggacaagag 600

tttgaagcat atgctcgtgt aattgcccgc gatattgaac gtattgccaa tacgagaaac 660

aatttatacg acatcaacat gggtgcaaca gcagtcggca ctggcttaaa tgcagatcct 720

gaatatataa gcatcgtaac agaacattta gcaaaattca gcggacatcc attaagaagt 780

gcacaacatt tagtggacgc aactcaaaat acagactgct atacagaagt ttcttctgca 840

ttaaaagttt gcatgatcaa catgtctaaa attgccaatg atttacgctt aatggcatct 900

ggaccacgcg caggcttatc agaaatcgtt cttcctgctc gacaacctgg atcttctatc 960

atgcctggta aagtgaatcc tgttatgcca gaagtgatga accaagtggc attccaagtg 1020

ttcggtaatg atttaacaat tacatctgct tctgaagcag gccaatttga attaaatgtg 1080

atggaacctg tgttattctt caatttaatt caatcgattt cgattatgac taatgtcttt 1140

aaatccttta cagaaaactg cttaaaaggt attaaggcaa atgaagaacg catgaaagaa 1200

tatgttgaga aaagcattgg aatcattact gcaattaacc cacatgtagg ctatgaaaca 1260

gctgcaaaat tagcacgtga agcatatctt acaggggaat ccatccgtga actttgcatt 1320

aagtatggcg tattaacaga agaacagtta aatgaaatct taaatccata tgaaatgaca 1380

catccgggaa ttgctggaag aaaataa 1407

<210> 3

<211> 5310

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag aggggaattg ttatccgctc 300

acaattcccc tatagtgagt cgtattaatt tcgcgggatc gagatctcga tcctctacgc 360

cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc 420

cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg 480

cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc 540

accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat 600

gcaggagtcg cataagggag agcgtcgaga tcccggacac catcgaatgg cgcaaaacct 660

ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac 720

cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg 780

tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg 840

cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc 900

tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga 960

ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg 1020

gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga 1080

tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg 1140

ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc 1200

atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg 1260

cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata 1320

aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca 1380

tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc 1440

tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc 1500

gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata 1560

tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc 1620

gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac 1680

tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 1740

ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 1800

aacgcaatta atgtaagtta gctcactcat taggcaccgg gatctcgacc gatgcccttg 1860

agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca 1920

cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc 1980

attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta 2040

ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc 2100

ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccccac gggtgcgcat gatcgtgctc 2160

ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca 2220

ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca 2280

acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc 2340

tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct 2400

acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc 2460

atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta accgggcatg ttcatcatca 2520

gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta tcattacccc catgaacaga 2580

aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc 2640

cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat 2700

gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc 2760

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 2820

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 2880

gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 2940

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatata tgcggtgtga 3000

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct 3060

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 3120

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 3180

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 3240

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 3300

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 3360

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 3420

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3480

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3540

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3600

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 3660

tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 3720

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 3780

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3840

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga acaataaaac 3900

tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt 3960

cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg tataaatggg 4020

ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg aagcccgatg 4080

cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga 4140

tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc 4200

gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg 4260

tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc 4320

gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc 4380

tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg 4440

agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat gcataaactt ttgccattct 4500

caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga taaccttatt tttgacgagg 4560

ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc 4620

ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc 4680

aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg 4740

agtttttcta agaattaatt catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 4800

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat 4860

attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 4920

gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 4980

ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5040

accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5100

tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 5160

cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 5220

agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 5280

gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca 5310

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 4

tttaagaagg agatatacat atgaataccg atgttcgtat tg 42

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 5

agcaccacca ccaccaccat tttcttccag caattcccg 39

Claims (12)

1.一种天冬氨酸酶突变体，所述天冬氨酸酶突变体具有天冬氨酸酶活性，其中，所述天冬氨酸酶突变体选自如下(i)-(v)组成的组中的任一项：

(i)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸后得到的序列；

(ii)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸后得到的序列；

(iii)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列；

(iv)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第324位的赖氨酸替换为甲硫氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丙氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列；

(v)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第156位由亮氨酸突变为苯丙氨酸、第187位由苏氨酸突变为异亮氨酸、第273位由半胱氨酸突变为缬氨酸、第321位由甲硫氨酸突变为亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为丝氨酸、第387位由半胱氨酸突变为丙氨酸、第439位的半胱氨酸替换为脯氨酸后得到的序列。

2.一种分离的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含编码权利要求1所述天冬氨酸酶突变体的核苷酸序列。

3.一种核酸构建体，其中，所述核酸构建体包含权利要求2所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，调控序列为包含启动子和/或核糖体结合位点的核苷酸序列，所述调控序列指导所述天冬氨酸酶突变体的基因在宿主细胞中表达并合成突变体酶。

4.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含权利要求2所述的多核苷酸，或权利要求3所述的核酸构建体。

5.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的核酸构建体，或者权利要求4所述的重组表达载体。

6.一种重组基因工程菌，其中，所述重组基因工程菌包含权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的核酸构建体，或者权利要求4所述的重组表达载体；

其中，基因工程菌来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、微球菌属、短杆菌属、节杆菌属或微杆菌属。

7.根据权利要求6所述的重组基因工程菌，其中，所述基因工程菌来源于埃希氏菌属、芽孢杆菌属或棒状杆菌属。

8.权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的核酸构建体、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述的重组宿主细胞，或权利要求6-7任一项所述的重组基因工程菌在生产β-丙氨酸中的应用。

9.一种生产β-丙氨酸的方法，其中，包括利用权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的核酸构建体、权利要求4所述的重组表达载体、权利要求5所述的重组宿主细胞，或权利要求6或7所述的重组基因工程菌生产β-丙氨酸的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法以丙烯酸或丙烯酸盐、和氨水为原料，还包括纯化或分离所述β-丙氨酸的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在生产β-丙氨酸的步骤中，丙烯酸或丙烯酸盐浓度为250～400g/L，pH值为7.2～7.8，反应温度为32～37℃。

12.一种制备权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的方法，所述方法包括培养含有权利要求5所述的重组宿主细胞，或者权利要求6或7所述重组基因工程菌，然后从重组宿主细胞的培养物或重组基因工程菌的培养物中回收所述天冬氨酸酶突变体的步骤。