CN114621984A - 一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5‑戊二胺的方法，属于生物化工领域。所述的离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5‑戊二胺的方法中，将离子液体、底物赖氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液进行混合，通过一步催化反应即可得到目标产物1,5‑戊二胺，所述离子液体包括胆碱类离子液体与咪唑类离子液体，能够显著提高赖氨酸脱羧酶的活性，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤十分简单，能够快速、高效地获得高收率的1,5‑戊二胺，有利于戊二胺合成的工程化放大。
Description
技术领域
本发明涉及一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法，属于生物化工领域。
背景技术
尼龙，即聚酰胺(锦纶)，在纤维和工程塑料等多个领域都具有重大的应用价值，市场规模达700万吨/年，近年来中国尼龙产量、产能和需求量均呈增长趋势。目前尼龙66是主要品种，但国外公司完全垄断了其核心单体己二胺前驱体己二腈的合成技术。由戊二胺(C5H14N2，分子量102.18，又名尸胺)和二元酸可以合成多种尼龙5X产品，如尼龙52、5T、54、56、510、516、518等，其中尼龙56性能与尼龙66类似，具有更佳的轻质减重、吸湿排汗、耐温性好、高强耐磨、低温染色及本质阻燃等特性，在国防和航天等领域具有广阔的应用前景，被公认为是替代尼龙66的新一代材料。戊二胺也可应用于聚氨酯、螯合剂和添加剂等重要化工产品。在农业方面，戊二胺可参与植物细胞分裂与生长、改善坐果和发育以及胁迫反应等生理过程。在医药方面，戊二胺可用于治疗心律不齐和缓解低血糖等疗效的药物，且能有效治疗痢疾。因此戊二胺在化工、农业和医药方面具有重大的国防和经济社会效益。
化学法合成戊二胺，存在催化剂反应条件苛刻、选择性低、经济性差等问题，多年来无法突破连续稳定生产的要求，因此戊二胺合成技术壁垒较高。生物法合成戊二胺，将减少使用化石资源，转而利用可再生生物资源，具有低碳环保、可持续特性。目前主要集中于发酵法和酶法两条途径，赖氨酸脱羧酶均发挥关键作用。发酵法合成戊二胺的代谢途径复杂，发酵液中有未反应完的成分和微生物代谢副产物等，导致葡萄糖转化率低，后续纯化困难。酶法合成戊二胺，反应过程不需要复杂的发酵调控，且没有副产物的积累，具有明显优势。我国当前L-赖氨酸产量高，产能严重过剩，因此以L-赖氨酸为原料可实现经济性生物合成戊二胺。日本京都大学和法国格勒诺布尔大学对赖氨酸脱羧酶先后进行了深入的晶体结构剖析，发现赖氨酸脱羧酶是由5个二聚体组成的十聚体结构，这种复杂的结构导致生物法合成戊二胺在实际应用中存在赖氨酸脱羧酶活性低和不稳定两个难题。
目前专利CN105316270B、CN105368766A、CN104498519A、CN106148373A、EP3118312B1、US7189543普遍研究大肠杆菌唯一来源的赖氨酸脱羧酶，该酶在碱性条件下不稳定，在L-赖氨酸盐酸盐高浓度催化转化过程中活性和催化强度低，细胞循环利用率差，增加了操作时间、生产成本，降低了戊二胺得率，严重制约了其工业化应用。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：将离子液体、底物L-赖氨酸盐酸盐、磷酸吡哆醛、纯化赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5-戊二胺。
本发明提供的离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法中，将离子液体、底物L-赖氨酸盐酸盐、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液混合，通过一步催化反应即可得到目标产物1,5-戊二胺；其中，所述离子液体包括胆碱类离子液体与咪唑类离子液体，能够显著提高赖氨酸脱羧酶的活性，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤十分简单，能够快速、高效地获得高收率的1,5-戊二胺，有利于戊二胺合成的工程化放大。
本发明中，所述胆碱类离子液体包括胆碱甘氨酸、胆碱丙氨酸、胆碱缬氨酸、胆碱亮氨酸、胆碱异亮氨酸、胆碱苯丙氨酸、胆碱脯氨酸、胆碱赖氨酸、胆碱精氨酸、胆碱组氨酸、胆碱色氨酸、胆碱丝氨酸、胆碱油酸、胆碱磷酸二氢盐、胆碱酪氨酸、胆碱半胱氨酸、胆碱谷氨酸、胆碱氯，任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述咪唑类离子液体包括1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-己基-3-甲基咪唑溴盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑双氰胺盐，任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述离子液体为胆碱类离子液体。
本发明中，所述混合液中离子液体的质量体积百分浓度为0.0001～50％，例如0.0003％、0.0005％、0.0008％、0.001％、0.003％、0.005％、0.008％、0.01％、0.03％、0.05％、0.08％、0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或48％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为0.001～10％。
优选地，所述离子液体为胆碱半胱氨酸离子液体和胆碱谷氨酸离子液体。
优选地，所述底物赖氨酸包括L-赖氨酸盐酸盐。
优选地，所述混合液中底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为1～3mol/L，例如1.2mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.4mol/L、2.5mol/L、2.6mol/L、2.8mol/L或2.9mol/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合液中磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，例如0.002mM、0.004mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.012mM、0.015mM、0.018mM、0.02mM、0.04mM、0.05mM、0.07mM、0.09mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM或0.45mM，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合液的纯的赖氨酸脱羧酶的浓度为0～3000μg/mL，例如0.1μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、3μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、35μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合液的OD600为0.5～50，例如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、22、24、25、27、29、30、40或50，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述赖氨酸脱羧酶为将L-赖氨酸盐酸盐转化为1,5-戊二胺的酶。
优选地，所述赖氨酸脱羧酶包括来源于微生物的赖氨酸脱羧酶及其突变体。
优选地，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、耐碱芽胞杆菌(Bacillus halodurans)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、毛链霉菌(Streptomycespolosus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、邦戈沙门氏菌(Salmonella bongori)、沙雷氏菌属(Serratia)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、博代氏杆菌属(Bordetella)、气单胞菌属(Aeromonas)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌催化方法具体包括：将底物L-赖氨酸盐酸盐、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和离子液体混合，得到OD600为0.5～30的混合液；所述混合液中底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，离子液体的体积百分浓度为0.0001～50％。
所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
所述基因工程菌株的构建方法包括：将携带有赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因的表达载体转入大肠杆菌菌株中，得到所述基因工程菌株。
所述基因工程菌株能够表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-戊二胺反向转运蛋白CadB，从而有效增加了全细胞催化合成中的物质传递。本发明对于表达载体的种类没有特殊要求，包括能够在大肠杆菌中表达目的基因的各种常用表达载体，例如质粒等。表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中。
优选地，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)菌株。
优选地，所述表达载体的制备方法为：将赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，得到质粒pETDuet-ldc-cadB；然后在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到所述表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB。
所述基因工程菌细胞悬液的制备方法为：将基因工程菌株置于含有氨苄抗生素的LB培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的LB培养基中发酵培养，至OD600为0.6～1(例如0.7、0.8、0.9或1等)时加入诱导剂进行诱导培养，然后离心收集菌体，将菌体重悬，得到所述基因工程菌细胞悬液；
优选地，所述种子液的接种量为0.5～5％，例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.7％或4.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。
优选地，所述诱导培养的时间为5～30h，例如6h、8h、10h、12h、14h、15h、17h、19h、20h、22h、24h、25h、27h或29h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述诱导培养的温度为15～25℃，例如16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述混合液的溶剂为缓冲液。
本发明中，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲液的pH值为5～11，例如5.5、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.5、9、9.5、10、10.5，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为6～8。
本发明中，所述催化反应的温度为35～65℃，例如38℃、40℃、42℃、45℃、47℃、49℃、50℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、60℃、62℃或64℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为45～55℃；
优选地，所述催化反应的时间为0.5～24h，例如0.8h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、14h、15h、17h、19h、20h、21h或23h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述催化反应在振荡的条件下进行。
优选地，所述振荡的转速为100～800rpm，例如150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm或750rpm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述催化反应完成后还包括终止反应的步骤。
优选地，所述全细胞催化终止反应的方法为离心。
优选的，所述纯化酶终止反应的方法为70℃，10min。
优选地，所述纯化赖氨酸脱羧酶催化方法具体包括：将底物L-赖氨酸盐酸盐、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶和离子液体混合；所述混合液中底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，离子液体的体积百分浓度为0.0001～50％。
所述纯化的赖氨酸脱羧酶的制备方法为：将种子液按1％体积的转接量转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD600为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃继续培养20h后，4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。用超声破碎仪将细胞破碎，功率40-60％，8000rpm离心，沉淀细胞碎片，用0.22μm的滤膜进行过滤，使用5ml的Histrap纯化柱在AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白纯化，再用5mL HiTrap Desalting脱盐柱置换保藏液，使用BCA蛋白定量方法测定纯化得到的赖氨酸脱羧酶的浓度。
所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法中，将离子液体、底物L-赖氨酸盐酸盐、辅酶磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液进行混合，通过一步催化反应即可得到目标产物，所述离子液体可以提高赖氨酸脱羧酶的活性和催化效率。在未添加离子液体的条件下，17.5μg的纯化的赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸盐酸盐(1.5M)1h后得到的戊二胺浓度为729.69mM，产率为48.6％。添加离子液体，如胆碱半胱氨酸(浓度为0.5％)后，17.5μg的纯化的赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸盐酸盐(1.5M)1h后得到的戊二胺浓度达到1250.86mM，产率为83.4％，一定浓度的胆碱半胱氨酸显著提高了酶的催化效率和产率。添加浓度为0.05％的胆碱半胱氨酸后，催化反应的Km值为7.602，Vmax值为1541，Kcat值为2101，Kcat/Km值为276.37，相同条件下纯化酶催化反应的Km、Kcat、Vmax和Kcat/Km值分别为：8.41、1500、2046和243.28，一定浓度的胆碱半胱氨酸提高了酶的催化效率、最大反应速率和底物亲和力。添加浓度为0.5％的胆碱半胱氨酸后，对于高底物浓度(2M)催化，反应2h后产物浓度为1602.90mM，产率为80.15％，同等条件下纯化酶催化反应的产物浓度为1514.09mM，产率为75.7％，0.5％的胆碱半胱氨酸提高了酶的高底物浓度催化能力和产率。同样，添加0.01％(v/v)1-十二烷基-3-甲基咪唑溴盐能明显提高赖氨酸脱羧酶的全细胞催化产率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
一种基因工程菌株，制备方法如下：
(1)构建表达载体：将赖氨酸脱羧酶基因(ldc)和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB(GenBank：WP_000092909.1)基因分别插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，构建质粒pETDuet-ldc-cadB，再在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB；
(2)构建基因工程菌株：将步骤(1)中得到的表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB转入BL21(DE3)菌株中，得到基因工程菌株I。
制备例2
赖氨酸脱羧酶纯化酶的制备方法如下：
(1)将制备例1中获取的工程菌株I在5mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，过夜培养，获得种子液。将种子液按1.5％体积的转接量转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6-1时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，15-25℃继续培养20h后，4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。
(2)用超声破碎仪将细胞破碎，功率40-60％，超声2s，暂停3s，8000rpm离心，沉淀细胞碎片，用0.22μm的滤膜进行过滤，使用5ml的Histrap纯化柱AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白纯化，再用5ml HiTrap Desalting脱盐柱置换保藏液，使用BCA蛋白定量方法测定纯化得到的赖氨酸脱羧酶的浓度。
实施例1
(1)准备胆碱甘氨酸、胆碱丙氨酸、胆碱缬氨酸、胆碱亮氨酸、胆碱异亮氨酸、胆碱苯丙氨酸、胆碱脯氨酸、胆碱赖氨酸、胆碱精氨酸、胆碱组氨酸、胆碱色氨酸、胆碱丝氨酸、胆碱油酸、胆碱磷酸二氢盐、胆碱酪氨酸、胆碱半胱氨酸、胆碱谷氨酸、胆碱氯等16种胆碱类离子液体，配成浓度为10％的母液(以水为溶剂)；
(2)在2mL离心管加入200μL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、10μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)，3.5μL浓度为5mg/mL的赖氨酸脱羧酶溶液，186.5μL、184μL浓度为50mM的磷酸盐缓冲液，0、2.5μL步骤(1)得到的胆碱离子液体溶液；将混合溶液在恒温混匀仪中以55℃、500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
采用反相高效液相色谱法测试本实施例得到的1,5-戊二胺的浓度及产率。
方法如下：
将本实施例得到的反应液按照高效液相色谱的进样要求进行稀释，得到稀释反应液；将600μL硼酸缓冲液(50mM，pH值为9)、200μL甲醇、60μL稀释反应液和130μL双蒸水(ddH2O)和10μL浓度为1M的乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM，溶剂为甲醇)，室温下反应10min后，转移至70℃水浴中，静置2h终止反应，并用高效液相色谱(HPLC)进行检测。
色谱条件如下：
HPLC检测器：SPD-20A二极管阵列检测器；检测柱：C18色谱柱(2.1×100mm)；检测温度：35℃；进样量：5μL，波长：284nm。其中，流动相A：乙腈；流动相B：醋酸钠缓冲液(25mM，pH值为4.8)；流速0.5mL/min；时间程序(流动相B所占比例)：0min 80％；2min 75％；22min51.7％；22.01min 80％；27min 80％。
戊二胺的产率＝实测浓度×稀释倍数/底物浓度×100％；其中，实测浓度为通过液相色谱测试得到的浓度。
通过上述检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺产率如下：
| 序号 | 离子液体种类 | 戊二胺产率 | 戊二胺相对产率 |
| 1 | 无添加 | 48.65％ | 100％ |
| 2 | 胆碱甘氨酸 | 55.68％ | 114.45％ |
| 3 | 胆碱丙氨酸 | 53.76％ | 110.50％ |
| 4 | 胆碱缬氨酸 | 49.02％ | 100.76％ |
| 5 | 胆碱亮氨酸 | 45.91％ | 94.37％ |
| 6 | 胆碱异亮氨酸 | 39.89％ | 81.99％ |
| 7 | 胆碱苯丙氨酸 | 34.10％ | 70.09％ |
| 8 | 胆碱脯氨酸 | 35.92％ | 73.83％ |
| 9 | 胆碱赖氨酸 | 44.70％ | 91.88％ |
| 10 | 胆碱精氨酸 | 51.68％ | 106.23％ |
| 11 | 胆碱组氨酸 | 37.63％ | 77.35％ |
| 12 | 胆碱色氨酸 | 37.87％ | 77.84％ |
| 13 | 胆碱丝氨酸 | 46.80％ | 96.20％ |
| 14 | 胆碱油酸 | 47.98％ | 98.62％ |
| 15 | 胆碱磷酸二氢盐 | 52.29％ | 107.48％ |
| 16 | 胆碱酪氨酸 | 44.08％ | 90.61％ |
| 17 | 胆碱半胱氨酸 | 83.39％ | 171.41％ |
| 18 | 胆碱谷氨酸 | 59.09％ | 121.46％ |
| 19 | 胆碱氯 | 50.73％ | 104.28％ |
实施例2
(1)准备胆碱半胱氨酸，配成10％(w/v H2O)母液；
(2)在2mL离心管加入300μL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、10μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)，3.5μL浓度为5mg/mL的赖氨酸脱羧酶溶液，步骤(1)得到的离子液体添加体积分别为0μL、0.5μL、2.5μL、25μL、50μL，50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液添加体积分别为：186.5μL、186μL、184μL、161.5μL、136.5μL；将混合溶液在恒温混匀仪中以55℃、500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。戊二胺浓度检测方法和实施例1相同。
通过检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺产率如下：
实施例3
不同浓度胆碱谷氨酸催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例2的区别仅在于，将步骤(1)(2)中的胆碱半胱氨酸替换为胆碱谷氨酸。
通过检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺产率如下：
实施例4
(1)准备浓度为0.2％(w/v)的胆碱半胱氨酸离子液体；
(2)动力学试验的底物浓度范围为：(0-40mM)，在2mL离心管分别加入0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、80μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL和400μL浓度为50mM的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为7的磷酸盐缓冲液)，10μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)，3.5μL浓度为0.13mg/mL的赖氨酸脱羧酶溶液，2.5μL步骤(1)得到的胆碱离子液体溶液，484μL、474μL、464μL、454μL、444μL、434μL、404μL、384μL、334μL、184μL、84μL浓度为50mM，pH＝7的磷酸盐缓冲液，将混合溶液在恒温混匀仪中以55℃、500rpm催化反应1h，12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。戊二胺浓度检测方法和实施例1相同。
通过非线性回归方程计算得到此反应的Km、Kcat和Vmax值，Km值为7.602，Vmax值为1541，Kcat值为2101，Kcat/Km值为276.37，相同条件下纯化酶催化反应的Km、Kcat、Vmax和Kcat/Km值分别为：8.41、1500、2046和243.28。
实施例5
(1)准备胆碱半胱氨酸，用50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液配成浓度为10％(w/v H2O)母液；
(2)在2mL离心管加入800μL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、20μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)，40μL浓度为5mg/mL的赖氨酸脱羧酶溶液，步骤(1)得到的离子液体添加体积分别为0μL、50μL，50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液添加量分别为140μL、90μL，将混合溶液在恒温混匀仪中以55℃、250rpm催化反应2h得到1,5-戊二胺。戊二胺浓度检测方法和实施例1相同。
通过检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺产率如下：
实施例6
离子液体强化全细胞催化合成1,5-戊二胺，具体步骤如下：
(1)将制备例1提供的基因工程菌株I置于5mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液按1％体积的接种量转接入50mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃发酵培养，至OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，20℃诱导培养20h，4000rpm离心，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH值为8)重悬细胞，得到含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液；
(2)在2mL离心管加入100μL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、10μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)、25μL浓度为10％的离子液体和365μL步骤(1)得到的基因工程菌细胞悬液，振荡混匀，得到的混合液OD600约为1.5；将混合液在恒温混匀仪中以50℃、500rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。戊二胺浓度检测方法和实施例1相同。
通过检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺相对产率如下：
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种离子液体强化赖氨酸脱羧酶合成1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：将离子液体、底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5-戊二胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子液体任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述离子液体包括胆碱类和咪唑类任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述胆碱类离子液体包括胆碱甘氨酸、胆碱丙氨酸、胆碱缬氨酸、胆碱亮氨酸、胆碱异亮氨酸、胆碱苯丙氨酸、胆碱脯氨酸、胆碱赖氨酸、胆碱精氨酸、胆碱组氨酸、胆碱色氨酸、胆碱丝氨酸、胆碱油酸、胆碱磷酸二氢盐、胆碱酪氨酸、胆碱半胱氨酸、胆碱谷氨酸、胆碱氯。
优选地，所述咪唑类离子液体包括1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-己基-3-甲基咪唑溴盐、1-十二烷基-3-甲基咪唑溴盐、1-乙基-3-甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲磺酰)亚胺、1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑双氰胺盐。
优选地，所述离子液体为胆碱类离子液体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述混合液中离子液体的质量体积百分浓度为0.0001～50％，优选为0.001～10％；
优选地，所述离子液体为胆碱半胱氨酸离子液体和胆碱谷氨酸离子液体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述底物赖氨酸包括L-赖氨酸盐酸盐；
优选地，所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L；
优选地，所述混合液中磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM；
优选地，所述混合液的纯的赖氨酸脱羧酶的浓度为0～3000μg/mL；
优选地，所述混合液的OD600为0.5～30。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶；
优选地，所述赖氨酸脱羧酶包括来源于微生物的赖氨酸脱羧酶及其突变体；
优选地，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、迟缓爱德华氏菌、博代氏杆菌属、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞悬液的制备方法为：将基因工程菌株置于含有氨苄抗生素的LB培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的LB培养基中发酵培养，至OD600为0.6～1时加入诱导剂进行诱导培养，然后离心收集菌体，将菌体重悬，得到所述基因工程菌细胞悬液；
优选地，所述种子液的接种量为0.5～5％；
优选地，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；
优选地，所述诱导培养的时间为5～30h；
优选地，所述诱导培养的温度为15～25℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的构建方法包括：将携带有赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因的表达载体转入大肠杆菌菌株中，得到所述基因工程菌株；
优选地，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)菌株；
优选地，所述表达载体的制备方法为：将赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，得到质粒pETDuet-ldc-cadB；然后在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到所述表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述混合液的溶剂为缓冲液；
优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液的pH值为5～11，进一步优选为6～8。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述催化反应的温度为35～65℃，优选为45～55℃；
优选地，所述催化反应的时间为0.5～24h；
优选地，所述催化反应在振荡的条件下进行；
优选地，所述振荡的转速为100～800rpm；
优选地，所述催化反应完成后还包括终止反应的步骤；
优选地，所述全细胞催化终止反应的方法为离心。
优选的，所述纯化酶终止反应的方法为70℃，10min。
优选地，所述纯化赖氨酸脱羧酶催化方法具体包括：将底物L-赖氨酸盐酸盐、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶和离子液体混合；所述混合液中底物L-赖氨酸盐酸盐的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，离子液体的体积百分浓度为0.0001～50％。
所述纯化的赖氨酸脱羧酶的制备方法为：将种子液按1％体积的转接量转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD600为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃继续培养20h后，4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。用超声破碎仪将细胞破碎，功率40-60％，8000rpm离心，沉淀细胞碎片，用0.22μm的滤膜进行过滤，使用5ml的Histrap纯化柱在AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白纯化，再用5mL HiTrap Desalting脱盐柱置换保藏液，使用BCA蛋白定量方法测定纯化得到的赖氨酸脱羧酶的浓度。
所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：离子液体、底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、纯化的赖氨酸脱羧酶或者含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和缓冲液混合，得到的混合液进行催化反应，所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，离子液体的质量体积百分浓度为0.0001～50％；所述离子液体包括胆碱类和咪唑类离子液体；所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
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