CN113881657A

CN113881657A - 一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用

Info

Publication number: CN113881657A
Application number: CN202010634482.1A
Authority: CN
Inventors: 黄玉红; 薛雅鞠; 赵永亮; 张锁江
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: WO2022001121A1; CN117737102A; CN113881657B

Abstract

本发明涉及一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，包括该赖氨酸脱羧酶基因和蛋白序列、构建的表达载体和基因工程菌株并在生物基戊二胺合成中的应用。通过构建表达载体和基因工程菌，诱导表达赖氨酸脱羧酶，全细胞催化合成戊二胺。本发明开发的新型赖氨酸脱羧酶可实现高浓度赖氨酸盐酸盐100％转化，戊二胺生产强度可达204g/L/h，其活性和催化强度均明显高于现有报道的大肠杆菌CadA及其突变体，有利于高效合成高浓度戊二胺，有工业应用前景。

Description

一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，尤其涉及一种稳定高效合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶基因序列、蛋白序列及其构建的表达载体和重组工程菌。

背景技术

尼龙因具有优良的机械性能、耐热性、耐腐蚀性等性质而在纤维和工程塑料等多个领域被广泛应用，近年来中国尼龙产量、产能和需求量均呈增长趋势。其中尼龙66的产量和消费量巨大，但由于其核心单体己二胺的前驱体己二腈的合成技术一直被国外企业垄断，资源紧张，成本波动巨大，且主要来源于石油。

戊二胺为赖氨酸脱羧的产物，与己二胺互为同系物，由戊二胺和二元酸可以合成多种尼龙5X产品，如尼龙52、5T、54、56、510、516、518等，具有更佳的轻质减重、吸湿排汗、耐温性、耐磨性、染色性及本质阻燃等特性，具有广阔的发展前景。生物尼龙5X的合成不仅能够降低对石油资源的依存度，而且能够打破跨国企业对己二胺产品的输出和技术的垄断，在国防和航天等领域具有广阔的应用前景。

生物基尼龙5X的关键是其核心单体戊二胺的高效合成。高效稳定的赖氨酸脱羧酶是生物基戊二胺合成的核心。赖氨酸脱羧酶来源广泛，目前报道存在赖氨酸脱羧酶的微生物主要是大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、耐碱芽胞杆菌(Bacillushalodurans)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等细菌，但目前仅对少数来源的赖氨酸脱羧酶进行深入研究，如来自大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶。

CN105316270B、CN105368766A和CN104498519A中公开了利用大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶CadA构建不同的基因工程菌株，全细胞催化合成戊二胺。同时，天津科技大学使用温度调控型启动子pR-pL和信号肽pelBs对过表达载体进行改造，中国科学院微生物研究所将T7CadB整合至底盘细胞基因组中，提高了戊二胺产量。CN106148373A、EP3118312B1与US7189543对大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶CadA进行序列改造，日本味之素公司通过对CadA的定向进化，筛选到热稳定性更高的突变体，三井化学公司也在其专利中公开了活性提高10-20％的突变体。

但这些突变酶系均仅局限于对大肠杆菌诱导型赖氨酸脱羧酶CadA下改造，来源非常单一，突变菌株在赖氨酸高浓度催化转化过程中活性和催化强度低，细胞循环利用率差，增加了操作时间、生产成本，降低了戊二胺得率而制约了工业化发展。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，包括赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列、编码其的核苷酸序列、基因表达载体以及重组工程菌。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶，可催化L-赖氨酸生成戊二胺，所述赖氨酸脱羧酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)如SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.1～4中任一项所示的氨基酸序列具有≥75％同源性的氨基酸序列；

(II)如SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列。

本发明提供了一种新型高效赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生成戊二胺，该赖氨酸脱羧酶可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，全细胞催化赖氨酸盐酸盐合成戊二胺。同时，本发明提供的赖氨酸脱羧酶在较高的温度以及pH时仍然稳定，且产量较高。

本发明中，将SEQ ID NO.1代表的赖氨酸脱羧酶记为LdcEdw，所述氨基酸序列与大肠杆菌CadA的相似度为86.7％；将SEQ ID NO.2代表的赖氨酸脱羧酶命名为LdcAer，其与大肠杆菌CadA相似度75.77％；将SEQ ID NO.3代表的赖氨酸脱羧酶命名为LdcSal，所述氨基酸序列与大肠杆菌CadA的相似度为92.3％；将SEQ ID NO.4代表的赖氨酸脱羧酶命名为LdcKle，所述氨基酸序列与大肠杆菌CadA的相似度为94.4％。而氨基酸序列对于酶的立体结构以及酶学性质有较大影响，有时少量氨基酸的不同也可能会导致两个酶之间有较大的性质差异，其造成的影响是不可预期的。因此，而正是这两者的差异性赋予了LdcEdw与大肠杆菌CadA不同的酶学性质，也正是这些差异使LdcEdw能够实现对高浓度赖氨酸盐酸盐的高效转化。

同时，除以上四条序列外，与SEQ ID NO.1～4中任一项所示的氨基酸序列具有≥75％(例如同源性大于75％、78％、80％、84％、85％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或99％等)同源性的氨基酸序列也可实现赖氨酸盐酸盐的转化。

本发明所述的赖氨酸脱羧酶的来源于蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、耐碱芽胞杆菌(Bacillus halodurans)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、尸杆菌(Bacteriumcadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、邦戈沙门氏菌(Salmonella bongori)、沙雷氏菌属(Serratia)、博代氏杆菌属(Bordetella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、气单胞菌属(Aeromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)等细菌的赖氨酸脱羧酶基因及其突变体。

优选地，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)或邦戈沙门氏菌(Salmonella bongori)。

第二方面，一种编码第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸，所述核苷酸具有(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列中的任意一个：

(i)编码权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列；

(ii)编码SEQ ID NO.1～4任一项所示的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列；

(iii)如SEQ ID NO.5～8任一项所示的核苷酸序列。

所述的LdcEdw其核酸序列为SEQ ID NO.5所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度74.5％。所述的LdcAer其核酸序列为SEQ ID NO.6所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，GC含量45％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度69.2％。所述的LdcSal其核酸序列为SEQ ID NO.7所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度78.1％。所述的LdcKle其核酸序列为SEQ ID NO.8所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度78.6％。

第三方面，本发明还提供了一种基因表达载体。所述基因表达载体包括：编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸。

优选地，所述基因表达载体为pET质粒，优选为pETDuet质粒。所述表达载体可以是pETDuet，也可以是大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体。优选地，所述基因表达载体还包括编码赖氨酸戊二胺反向转运蛋白的核苷酸序列。

第四方面，本发明还提供一种如第三方面所述的基因表达载体的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

将编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸插入质粒的限制性酶切位点之间，得到所述基因表达载体。

所述构建方法还包括插入赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因的操作。

优选地，所述赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因前还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括大肠杆菌周质空间分泌信号肽。

所述的表达载体中以pelB信号肽为例，但不仅限于该信号肽，可以是大肠杆菌常见的，如dsbA、hlyA、lamB、malE、ompA、ompF、ompT、phoA等。

示例性的，所述构建方法具体包括如下步骤：

将赖氨酸脱羧酶基因ldc和编码赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因cadB，分别插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglⅡ/PacⅠ限制性酶切位点之间，构建质粒pETDuet-ldc-cadB，再在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglⅡ限制性酶切位点连接，最终，构建好的表达载体为pETDuet-ldc-pelB-cadB。

第五方面，一种用于合成戊二胺的重组工程菌，包含如第三方面所述的基因表达载体和/或编码第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸。所述工程菌可以是E.coli BL21(DE3)。

第六方面，本发明还提供一种利用如第五方面所述的宿主细胞制备戊二胺的方法，所述方法包括如下步骤：

将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，所述菌悬液与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛(PLP)的缓冲液混合反应、离心后得到所述戊二胺。

作为本发明优选的技术方案，所述反应的温度为35～65℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃等，时间为0.5-24h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h或24h等，优选为1～4h。

优选地，所述反应时的振荡速率为400～800rpm，例如可以是400rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm或800rpm等。

优选地，所述离心时的转速为8000～12000rpm，例如可以是8000rpm、8500rpm、9000rpm、10000rpm、10500rpm、11000rpm或12000rpm等，时间为1～3min，例如可以是1min、1.5min、2min、2.5min或3min等。

优选地，所述缓冲液中赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1～3M，例如可以是0.1M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M、2M、2.5M或3M等。

优选地，所述缓冲液中PLP的摩尔浓度为0.1～0.5mM，例如可以是0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM或0.5mM等。

优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液。

优选地，所述缓冲液的pH为5～11，例如可以是5、6、6.4、7、7.2、7.5、8、9、10或11等，优选为6～10；所述缓冲液与重悬时使用的溶液相同。

优选地，所述诱导后的菌液离心后，还包括在冻存操作，所述冻存为：在-80℃下冻存1h以上。

优选地，所述制备戊二胺的方法包括如下步骤：

(1)将重组工程菌培养、诱导后得到的菌液离心，冻存后重悬得到菌悬液；

(2)将所述菌悬液与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛的缓冲液混合，所述缓冲液中赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1～3M，磷酸吡哆醛的摩尔浓度为0.1～0.5mM，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH为6～10；

(3)在35～65℃下以400～800rpm振荡反应1～4h，再以8000～12000rpm离心1～3min，得到戊二胺。

本发明中，在合成戊二胺后，检测赖氨酸和戊二胺的方法为：

(1)在反应体系中加入600μL 50mM pH 9的硼酸缓冲液、200μL甲醇、60μL稀释样品、130μL ddH₂O和10μL 1M乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)，室温下放置反应10min，转移至60～80℃水浴1～2h，终止反应；

(2)使用反相高效液相色谱紫外(nm)检测器进行检测，流动相A为100％的乙腈；流动相B为25mM pH 4.8醋酸钠缓冲溶液，流速0.5mL/min；检测柱为C18；柱检测温度：35℃；进样量：2～10μL；波长：284nm。

采用梯度洗脱：0min A:B为20:80；2min A:B为25:75；27min A:B为62.5:37.5；27.01min A:B为20:80；37min A:B为20:80；37.01min结束，所述的梯度洗脱并不仅限于上述梯度洗脱比例。

第六方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的赖氨酸脱羧酶、如第三方面基因表达载体或如第五方面所述的重组的宿主细胞在生物基戊二胺合成中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种能够高效合成戊二胺的新型赖氨酸脱羧酶，所述新型高效赖氨酸脱羧酶同时该赖氨酸脱羧酶可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，全细胞催化赖氨酸盐酸盐合成戊二胺时，在pH为5～9、温度为40～60℃下保持稳定，且催化效率较高，催化强度可达136～204g/L/h；

(2)本发明提供的新型赖氨酸脱羧酶可实现高浓度赖氨酸盐酸盐近完全转化，在pH 6.5、温度为50℃时，戊二胺转化率最大，可达100％，其催化强度可达204g/L/h，其活性和催化强度均明显高于现有报道的大肠杆菌CadA及其突变体，有利于高效合成高浓度戊二胺，有极高的工业应用前景。

附图说明

图1为实施例1中构建的pETDuet-ldcEdw-pelB-cadB表达载体示意图。

图2为实施例5中LdcEdw全细胞催化随反应时间的变化曲线图。

图3为实施例5中LdcAer全细胞催化随反应时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中。

以下实施例中，采用的HPLC检测器为：SPD-20A二极管阵列检测器；检测柱为：C18柱(Shim-pack GIST-HP-C18 column，2.1×100mm，3μm particle size)。

本发明中所用的赖氨酸盐酸盐和戊二胺的检测方法具体步骤如下：

在反应体系中加入600μL 50mM pH为9硼酸缓冲液、200μL甲醇、60μL反应液和130μL ddH₂O和10μL 1M乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)，室温下反应10min后，转移至70℃，静置2h终止反应，并用高效液相色谱(HPLC)进行检测。

HPLC检测器：SPD-20A二极管阵列检测器；检测柱：C18柱；检测温度：35℃；进样量：5μL，波长：284nm。

其中流动相A为乙腈；流动相B为25mM pH 4.8醋酸钠缓冲溶液；流速0.5mL/min；时间程序(流动相B所占比例)：0min 80％；2min 75％；22min51.7％；22.01min 80％；27min80％。

实施例1

本实施例提供含有赖氨酸脱羧酶的基因表达载体及表达其的工程菌株。

将所述赖氨酸脱羧酶命名为LdcEdw，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，与大肠杆菌CadA相似度86.7％；经密码子优化之后，合成LdcEdw的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述核苷酸序列的GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度74.5％。

将所述赖氨酸脱羧酶命名为LdcAer，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，与大肠杆菌CadA相似度75.77％；经密码子优化之后，合成LdcAer的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，所述核苷酸序列的GC含量45％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度69.2％。

将所述赖氨酸脱羧酶命名为LdcSal，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3，与大肠杆菌CadA相似度92.3％；经密码子优化之后，合成LdcSal的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，所述核苷酸序列的GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度78.1％。

将所述赖氨酸脱羧酶命名为LdcKle，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4，与大肠杆菌CadA相似度94.4％；经密码子优化之后，合成LdcKle的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，所述核苷酸序列的GC含量43％，与大肠杆菌CadA核酸序列相似度78.6％。

同时，为了比较本发明提供的赖氨酸脱羧酶的功能，本发明还将大肠杆菌来源的EcCadA(GenBank：WP_001295383.1)作为比较；并将LdcEdw、LdcAer、LdcSal、LdcKle和CadA分别构建在pETDuet质粒的NcoI/SacI之间；同时将CadB(GenBank：WP_000092909.1)基因构建在pETDuet质粒的BglⅡ/PacⅠ之间；编码蛋白的核苷酸序列之前均插入His标签；

再在cadB序列前引入信号肽pelB，构建pETDuet-ldcEdw-pelB-cadB(如图1所示)、pETDuet-ldcAer-pelB-cadB、pETDuet-ldcSal-pelB-cadB、pETDuet-ldcKle-pelB-cadB和pETDuet-EccadA-pelB-cadB质粒，并分别转入E.coli BL21(DE3)底盘细胞，构建全细胞催化合成戊二胺的基因工程菌株，命名为EDW、AER、SAL、KLE和WT，并于-80℃保存。

实施例2

本实施例为分别含有赖氨酸脱羧酶LdcEdw、LdcAer与EcCadA的基因表达载体的全细胞催化比较。

将实施例1中获取的工程菌株EDW、AER和WT在5mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，过夜培养，获得种子液。

然后，将种子液按1％体积的转接量分别转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，20℃继续培养20h。4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。

用50mM pH 6的醋酸钠缓冲液将菌体重悬，进行500μL全细胞催化，其中PLP0.1mM，赖氨酸盐酸盐1M，菌悬液OD为1.5，45℃，500rpm催化1h，12000rpm离心2min，取上清并稀释，检测赖氨酸盐酸盐和戊二胺的含量。

最终检测结果可知：EDW全细胞催化戊二胺的产量是109g/L，是WT产量的1.6倍；AER全细胞催化戊二胺的产量是89.4g/L是WT产量的1.3倍。

实施例3

本实施例中检测不同pH下赖氨酸脱羧酶LdcEdw和LdcAer的全细胞催化

将实施例1中获取的工程菌株EDW在5mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，过夜培养，获得种子液。

将种子液按1％体积的转接量转接入50mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃培养，当OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃继续培养20h后，4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。

将菌体分别用50mM不同pH的缓冲液重悬后，进行500μL全细胞催化，其中PLP0.1mM，赖氨酸盐酸盐1M，菌悬液OD为1.5。

45℃500rpm催化1h，12000rpm离心2min，取上清稀释后检测戊二胺的含量。EDW和AER在pH 4.5～7.5下的全细胞催化结果如下表1，其中，EDW在反应体系pH达到6.5时最高，此时转化率可达99.47％，赖氨酸盐酸盐基本完全被转化，之后体系pH再增高戊二胺产量开始下降；AER在反应体系pH 6时达到最高，此时转化率可达92.26％，当pH升高至7.5，戊二胺产量下降至86.92％。

表1

实施例4

本实施例中检测不同温度对赖氨酸脱羧酶LdcEdw和LdcAer的全细胞催化影响。

将种子液按1％体积的转接量转接入50mL加入有100mg/L氨苄抗生素LB培养基中，37℃培养，当OD₆₀₀为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃继续培养20h，4000rpm离心，收集菌体，-80℃保存。

用pH为8的缓冲液将菌体重悬，进行500μL全细胞催化，其中PLP 0.1mM，赖氨酸盐酸盐1M，菌悬液OD为1.5。

在35～65℃，500rpm条件下催化1h，12000rpm离心2min，取上清稀释后检测戊二胺的含量。EDW和AER在35～65℃下的全细胞催化结果如下表2，不难发现戊二胺产量随着温度的升高先增加后减小，在50℃时，EDW戊二胺转化率最大，为95.95％。

表2

实施例5

本实施例中验证赖氨酸脱羧酶LdcEdw和LdcAer的摇瓶全细胞催化能力。

将实施例1中获取的工程菌株EDW和AER在5mL加入100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃，过夜培养，获得种子液。

用pH为8的磷酸缓冲液、温度为50℃的条件进行20mL摇瓶全细胞催化，体系中浓缩菌体的OD约为10，底物浓度为2M，在0h、1h、2h分别取样，取上清稀释后检测戊二胺的含量。

LdcEdw的检测结果如图2所示，其横坐标为时间(h)，纵坐标为含量(单位mM)，全细胞催化反应前30min就有明显气泡产生。由图可知，赖氨酸盐酸盐的量随时间增加逐渐减少，相对的，戊二胺的含量逐渐增加，反应2h后，赖氨酸盐酸盐已几近完全转化，戊二胺产量为202.3g/L。将体系中浓缩菌体的OD增加至15，底物浓度为2M，反应1h后，赖氨酸盐酸盐已几近完全转化，戊二胺产量为204g/L，戊二胺生产强度为204g/L/h。

LdcAer的检测结果如图3所示，其横坐标为时间(h)，纵坐标为含量(单位mM)，全细胞催化反应前30min就有明显气泡产生，反应4h，戊二胺产量为198.4g/L，催化速率最高可达136g/L/h。

实施例6

本实施例中验证赖氨酸脱羧酶LdcEdw和LdcAer在不同浓度下的体外催化能力。

用超声破碎仪将细胞破碎，功率40-60％，8000rpm离心，沉淀细胞碎片，用0.22μm的滤膜进行过滤，使用5ml的Histrap纯化柱在AKTA蛋白纯化仪上进行蛋白纯化，再用5mLHiTrap Desalting脱盐柱置换保藏液，使用BCA蛋白定量方法测定纯化得到的赖氨酸脱羧酶LdcEdw和LdcAer的浓度。

赖氨酸脱羧酶LdcEdw的体外催化反应体系为500μL，赖氨酸盐酸盐浓度为1.5M，PLP浓度为0.1mM，将LdcEdw纯酶分别稀释10倍和50倍后，加入190μL稀释的纯酶到反应体系。在50℃，pH 6.5，500rpm条件下催化1h，12000rpm离心2min，取上清稀释后检测戊二胺的含量。赖氨酸脱羧酶LdcEdw体外酶催化中，添加60μg纯酶催化反应1h，戊二胺转化率可达到100％，即60μg纯酶能够催化1.5M的赖氨酸盐酸盐，使其完全转换为戊二胺。

赖氨酸脱羧酶LdcAer体外酶催化中，反应体系为500μL，赖氨酸盐酸盐浓度为1.5M，PLP浓度为0.1mM，将LdcAer纯酶稀释50倍加入190uL。在50℃，pH 6，500rpm条件下催化1h，12000rpm离心2min，取上清并稀释，用实施方式中所述方法进行检测，添加60μg纯酶催化反应1h，戊二胺转化率可达到94.43％。

综上所述，本发明提供的赖氨酸脱羧酶LdcEdw能够高效催化合成戊二胺，其全细胞催化的最佳催化温度为50℃，催化体系的最佳pH为6.5，催化强度可达204g/L/h，能够实现高浓度的赖氨酸盐酸盐的完全转化；LdcAer全细胞催化的最佳催化温度为50℃，催化体系的最佳pH为6，其戊二胺转化率可达到97.2％。本发明中，同时以SEQ ID NO.3和4所示的氨基酸序列构建重组工程菌，其同样能够高效表达戊二胺，限于篇幅及出于简明的考虑，此处仅写明实验结果：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列通过实施例1和2的方法构建菌株，在添加1M赖氨酸盐酸盐的全细胞催化中，体系pH为5～10、温度为40～55℃下反应稳定，且最佳催化温度为50℃，催化体系的最佳pH分别为6和7.5，戊二胺的转化率可达72.5％。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用

<130> 20200608

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 714

<212> PRT

<213> Edwardsiella tarda

<400> 1

Met Asn Ile Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Lys Ala Leu Glu Ala Gln Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ile Asp Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Thr Tyr Asn Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Arg Asp Ile Ser Glu Met Asn Glu His Leu Pro Val Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr His Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Ser Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Asn Val Glu Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Leu Lys Ile Arg Gln Ser Thr Asp Ala Tyr Val Asp Glu Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Asn Tyr Val Lys Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Tyr Gly Ala Asn Ala Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Thr Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

Asn Ala Glu Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Met Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Lys Ser Glu Phe Ala Arg Glu Thr Ile Glu Glu Arg

275 280 285

Val Lys Asn Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Val Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Phe Tyr Asn Ala Glu Tyr Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Lys Gly Leu Cys Gly Met Ser Gly Asp

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Ile

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Ser Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Ile Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Arg Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Ser Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu His Ile Asp Glu Ala Lys Cys

450 455 460

Trp Asn Leu Asp Pro Lys Glu Ser Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Asp

465 470 475 480

Glu Asn His Met Phe Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Lys Glu Asp Gly Thr Met Ala Asp Thr Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Ile Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Met Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Gly

580 585 590

Ile His Ala Leu Ile Gln His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Asn Pro His Asn Ala Phe

610 615 620

Gln Met Glu Leu Arg Gly Gln Thr Glu Glu Val Tyr Leu Glu Glu Met

625 630 635 640

Ile Gly Lys Val Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Thr Glu Gln Lys

705 710

<210> 2

<211> 710

<212> PRT

<213> Aeromonas sp.

<400> 2

Met Asn Ile Ile Ala Ile Leu Asn His Leu Gly Val Phe Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Gln Leu Gln Ala Ser Leu Glu Arg Lys Gly Phe Glu

20 25 30

Val Val Tyr Pro Val Asp Val Ala Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Lys

35 40 45

Asn Pro Arg Val Cys Gly Ala Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Ser Leu

50 55 60

Gly Leu Cys Lys Glu Ile His Asp Arg Asn Glu Lys Leu Pro Ile Phe

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Asp Gln Ser Thr Leu Asp Ile His Leu Thr Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Asn Val His Phe Phe Glu Tyr Arg Leu Gly Met Ala Asp Asp

100 105 110

Ile Ala Leu Lys Met Gly Gln Ala Thr Gln Glu Tyr Gln Asp Ala Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Glu Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Met

145 150 155 160

Ser Pro Ala Gly Ser Ile Phe Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Phe

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Met Pro Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Val

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Asn Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Ser Arg Asp Thr Ile Ala Ala Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Pro Gly Ala Gln Ala Pro Arg Tyr Ala Val Val Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Gly Phe Ile Lys Glu

305 310 315 320

Ser Leu Asp Thr Pro Tyr Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Ala Met Pro Gly Lys Val Phe Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Ile Lys Gly Asp Val

370 375 380

Glu Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Ser Thr Ser

385 390 395 400

Pro Gln Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Ile Ser Ala Ala Met Met

405 410 415

Arg Gly Asn Thr Gly Lys Arg Leu Ile Lys Asp Ser Ile Asp Arg Ala

420 425 430

Ile Ser Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Asp Gln Ser Glu Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp Asn Ile Asp Thr Val Glu Cys

450 455 460

Trp Lys Leu Asp Pro Lys Asp Asp Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Asp

465 470 475 480

Asp Asn His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Gly Arg Asp Gly Lys Leu Leu Glu Lys Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Leu Val Ser Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Met Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Gln Ser

530 535 540

Lys Ala Met Gln Leu Leu Arg Ala Leu Thr Glu Phe Lys Arg Gly Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Thr Ile Lys Asn Ile Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Ser Phe Tyr Glu Gly Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Ser

580 585 590

Ile His Asp Leu Thr Cys Lys Tyr Arg Leu Pro Glu Leu Met Phe Lys

595 600 605

Ala Phe Asp Val Leu Pro Glu Met Lys Met Thr Pro His Ala Ala Trp

610 615 620

Gln Gln Glu Leu Ala Gly Asn Leu Glu Glu Val Pro Leu Arg Asp Met

625 630 635 640

Val Asp Arg Ile Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Leu Pro Gly Glu Met Val Thr Gln Asp Ser Leu Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Glu Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Leu Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Ser Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Arg

705 710

<210> 3

<211> 714

<212> PRT

<213> Salmonella bongori

<400> 3

Met Asn Val Ile Ala Ile Met Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Gly Leu Asn Phe Arg

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ser Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Leu Asn Glu Tyr Met Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Ser Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Met Gln Val Arg Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp

100 105 110

Ile Ala Ala Lys Ile Arg Gln Asn Thr Asp Glu Tyr Ile Asp Asn Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Ile Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Glu Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Ile Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Tyr Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Asp

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Ile Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Ile

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Lys Ser Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu His Ile Asp Gly Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Ala Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Lys Lys Asp Gly Thr Met Asp Glu Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Leu Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu Arg Gly Ile Ile Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Ile Leu Pro Ala Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Ala Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Val Glu His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Thr Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Glu Thr Glu Glu Val Tyr Leu Glu Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asn Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Asn Thr Lys

705 710

<210> 4

<211> 715

<212> PRT

<213> Serratia sp.

<400> 4

Met Asn Val Ile Ala Ile Met Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asp Phe Arg

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ser Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Tyr Met Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Met Gln Val Arg Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Asn Thr Asp Glu Tyr Ile Asp Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Ile Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Ser Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Glu Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Ile Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Arg Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Arg Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asp Gly Ser Ile Glu Arg Ser

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Lys Gly Glu Ser Glu Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu His Ile Asp Gly Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Ala Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Lys Lys Asp Gly Thr Met Asp Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Val Glu His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Phe Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Ser Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Gln Thr Glu Glu Val Tyr Leu Glu Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Asn Asn Lys

705 710 715

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atgaatatta ttgccatcct gaatcacatg ggcgtgtatt ttaaagaaga accgattcgt 60

gaattacata aagccctgga agcacagaat tttcagattg tgtatcctaa tgatcgcgaa 120

gatttactga aactgatcga taataatgcc cgcttgtgcg gcgttatctt tgattgggat 180

acgtataatc tggacctgtg tcgtgatatt agcgaaatga atgaacatct gccagtgtat 240

gcctttgcta atacacatag taccctggat gtgtctctga gcgatttacg cctgaatgtg 300

gaattttttg aatatgccct gggtgcagcc gaagatattg cactgaaaat tcgtcagtct 360

acggatgcct atgtggatga aatcttacca ccgctgacca aagccctgtt taattatgtt 420

aaagaaggta aatatacgtt ttgcacccca ggtcacatgg gcggtacagc gtttcagaaa 480

tctccagtgg gctcactgtt ttatgatttt tatggcgcca atgccatgaa atcagatatc 540

tctattagcg tgagcgaact gggctcactg ctggatcata cgggtcctca taaagaagcc 600

gaagaatata ttgctcgcac ctttaatgca gaacgtagct atatggtgac caatggtacg 660

agcaccgcca ataaaattgt gggcatgtat agtgctccag cgggctcaac aatcatgatc 720

gataggaact gtcataaatc actgacacat ttaatgatga tgtcagatgt gaccccgatc 780

tattttcgtc cgacacgcaa tgcgtatggc attctgggtg gtattcctaa aagcgaattt 840

gctcgcgaaa ccatcgaaga acgcgttaaa aatacaccta atgcgacgtg gccggttcat 900

gcagttgtga ccaatagtac ctatgatggc ctgttttata atgcggaata tatcaaaaaa 960

accttagatg ttaaaagcat ccattttgat agtgcttggg ttccgtatac caattttagt 1020

ccgatctata aaggcctgtg cggcatgtca ggtgatcgtg tggaaggcaa agttatctat 1080

gaaacccagt ctacacataa actgttagcg gccttttcac aggcgtcaat gattcatgtt 1140

aaaggcgata tcaatgaaga aacctttaat gaagccttta tgatgcatac ctctacgagt 1200

ccacattatg gcatcgttgc tagtatcgaa accgcagccg ccatgatgaa aggtaatgca 1260

ggcaaacgct taatcaatgg tagcatcgaa cgcgctattc gctttcgcaa agaaatcaaa 1320

cgcttacgta gcgaatcaga tggttggttt tttgatgttt ggcagccgga acatatcgat 1380

gaagctaaat gttggaattt agatcctaaa gaatcttggc atggctttaa agatattgat 1440

gaaaatcaca tgtttctcga ccctatcaaa gtgaccttac tgaccccagg catgaaagaa 1500

gatggtacga tggccgatac gggtatcccg gcctctattg ttgccaaata tttagatgaa 1560

catggcatca ttgtggaaaa aacaggtccg tataatctgc tgtttctgtt tagcatcggc 1620

atcgataaaa ccaaagccat gagcttactg cgcggtctga cggattttaa acgcgcctat 1680

gatctgaatc tgcgcgttaa aaatatgtta ccgtctctgt atcgcgaaga tccggaattt 1740

tatgaaaata tgcgcattca ggaactggcc cagggtattc atgccctgat tcagcatcat 1800

aatttaccgg atctgatgta tcgtgccttt gaagttctgc cgacgatggt tatgaatcca 1860

cataatgcgt ttcagatgga actgcgcggt cagacggaag aagtgtatct ggaagaaatg 1920

attggcaaag ttaatgccaa tatgatctta ccgtatcctc caggcgttcc gctggttatg 1980

ccgggcgaaa tgctgaccga agaaagtcgc ccggtgctgg aatttttaca gatgctgtgc 2040

gaaatcggcg cacattatcc gggctttgaa acggatattc acggtgctta tcgtcaggcg 2100

gatggtcgct atacagttaa agttctgaaa acggaacaga aataa 2145

<210> 6

<211> 2133

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgaatatta ttgcaattct gaatcatctg ggcgtgtttt ttaaagaaga accgattcgt 60

cagttacagg cctcattaga acgcaaaggc tttgaagttg tgtatccggt ggatgttgct 120

gacctgctga aactgattga aaaaaatccg cgcgtttgtg gtgcaatttt tgattgggat 180

aaatatagtt taggcctgtg taaagaaatt catgatcgta atgaaaaact gccgattttt 240

gcctttgcca atgatcagag caccttagat attcatctga ccgatctgcg tctgaatgtt 300

catttttttg aatatcgctt aggcatggca gatgatattg ccctgaaaat gggtcaggcc 360

acccaggaat atcaggatgc cattctgccg ccgtttacca aagccctgtt taaatatgtg 420

gaagaaggta aatatacctt ttgtaccccg ggtcacatgg gcggaacggc ctttcagatg 480

tctccggcag gttctatttt ttatgatttt tatggtccga atgcctttaa agcagatgtg 540

tctatttcta tgccggaact gggtagctta ctggatcata gcggtccgca taaagaagca 600

gaagaatata ttgcacgcac ctttaatgca gatcgctctt atattgtgac caatggtacg 660

agcaccgcca ataaaattgt gggcatgtat agcgccccgg ccggctcaac cgtgttagtg 720

gatcgtaatt gtcataaatc actgacccat ctgatgatga tgaatgatgt gaccccgatt 780

tattttcgtc cgacccgtaa tgcctatggc attctgggcg gcattccgca gagcgaattt 840

agtcgcgata ccattgcagc caaagttgca gccaccccgg gtgcacaggc cccgcgctat 900

gcagttgtga ccaatagtac ctatgatggc ttactgtata ataccggctt tattaaagaa 960

tcactggata ccccgtatat tcattttgat agcgcctggg ttccgtatac caattttagt 1020

ccgatttatg aaggcaaatg tggcatgagc ggcgaagcca tgccgggcaa agtgttttat 1080

gaaacccagt caacccataa actgttagcc gccttttcac aggcctcaat gattcatatt 1140

aaaggcgatg tggaagaaga aacctttaat gaagccttta tgatgcatac ctcaacctct 1200

ccgcagtatg gcattgttgc ctcaaccgaa attagcgcag ccatgatgcg cggtaatacc 1260

ggcaaacgtc tgattaaaga tagtattgat cgtgccatta gctttcgcaa agaaattaaa 1320

cgcttacgcg atcagagcga aggttggttt tttgatgttt ggcagccgga taatattgat 1380

accgtggaat gttggaaatt agacccgaaa gatgattggc atggctttaa agatattgat 1440

gataatcaca tgtaccttga tccgattaaa gtgaccctgc tgaccccggg tatgggtcgc 1500

gatggtaaac tgttagaaaa aggtattccg gcctcactgg tgagcaaatt tctggatgaa 1560

cgtggcattg tggttgaaaa aaccggtccg tataatatgc tgtttctgtt tagcattggt 1620

attgatcaga gtaaagccat gcagttactg cgtgccctga ccgaatttaa acgcggctat 1680

gatctgaatc tgaccattaa aaatattctg ccgagtctgt atcgcgaaga tccgagcttt 1740

tatgaaggta tgcgcattca ggaactggcc cagtcaattc atgatttaac ctgtaaatat 1800

cgcttaccgg aattaatgtt taaagccttt gatgtgctgc cggaaatgaa aatgaccccg 1860

catgcagcct ggcagcagga actggcaggt aatctggaag aagttccgtt acgcgatatg 1920

gtggatcgca ttagcgccaa tatgattctg ccgtatccgc cgggcgttcc gttagtgctg 1980

ccgggcgaaa tggtgaccca ggatagtctg ccggtgttag aatttctgga aatgctgtgt 2040

gaaattggtg cacattatcc gggctttgaa accgatattc atggcctgta tcgtcaggcc 2100

gatggctctt ataccgttaa agtgctgcgt taa 2133

<210> 7

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgaatgtga ttgccatcat gaatcacatg ggcgtgtatt ttaaagaaga accgattcgt 60

gaactgcatc gcgcactgga aggcctgaat tttcgcattg tgtatcctaa tgatcgcgag 120

gatctgctga aactgatcga aaataattct cgtctgtgcg gcgttatctt tgattgggat 180

aaatataatc tggaactgtg cgaagaaatt agtaaactga atgaatatat gccactgtat 240

gcgtttgcta atagctatag tacactggat gtgagcttaa atgatttacg catgcaggtt 300

cgcttttttg aatatgcctt aggtgcagcc gcagatattg cggccaaaat ccgtcagaat 360

acggatgaat atatcgataa tatcttacct ccgctgacca aagccctgtt taaatatgtt 420

cgcgaaggca aatatacctt ttgcaccccg ggtcacatgg gcggtacagc gtttcagaaa 480

tctccagttg gtagcatctt ttatgatttt tttggtccta ataccatgaa aagcgatatt 540

agcatctcag tgagcgaact gggtagtctg ctggatcatt caggtccaca taaagaagcc 600

gaagaatata ttgcacgcgt gtttaatgcg gaacgtagct atatggtgac caatggtacg 660

agcaccgcca ataaaattgt gggcatgtat agcgctccag caggctctac agttctgatc 720

gatcgtaatt gtcataaaag tctgacccat ttaatgatga tgtcagatat taccccgatc 780

tattttcgtc cgacacgcaa tgcgtatggt attctgggcg gcatcccaca gagtgaattt 840

cagcatgcaa cgattgctaa acgcgttaaa gaaaccccta atgctacgtg gccggttcat 900

gcagtgatca ccaattctac ctatgatggc ttactgtata atacggatta tatcaaaaaa 960

accttagatg ttaaatcaat ccattttgat agcgcttggg ttccttatac caattttagt 1020

ccgatctatc agggtaaatg cggcatgtca ggcgatcgtg tggaaggcaa aatcatctat 1080

gaaacacaga gtacacataa actgttagca gcgttttcac aggcctctat gattcatgtt 1140

aaaggtgata tcaatgaaga aacctttaat gaagcctata tgatgcatac aacaacctca 1200

ccacattatg gcattgttgc gtccacggaa acagccgcag ccatgatgaa aggtaatgcg 1260

ggcaaacgtc tgatcaatgg ctcaatcgaa cgcgccatca aatttcgcaa agaaatcaaa 1320

cgcctgaaaa gcgaatcaga tggttggttt tttgatgtgt ggcagccgga acatatcgat 1380

ggcgccgaat gttggccgtt acgtagcgat agcgcttggc atggctttaa aaatatcgat 1440

aatgaacaca tgtatttaga tcctatcaaa gtgacaatcc tgacaccggg catgaaaaaa 1500

gatggtacaa tggatgaatt tggcattcca gccagcttag ttgccaaata tttagatgaa 1560

cgcggtatta ttgtggaaaa aaccggtcct tataatttac tgtttctgtt tagtatcggc 1620

atcgataaaa ccaaagccct gtctctgctg cgcgccctga cggaatttaa acgtgccttt 1680

gatctgaatt tacgtgttaa aaatatctta ccggccctgt atcgcgaagc tccggaattt 1740

tatgaaaata tgcgcatcca ggaactggcc cagaatattc ataaactggt ggaacatcat 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgtgcgttt gaagttctgc cgacgatggt tatgaccccg 1860

tataccgcct ttcagaaaga attacatggc gaaaccgaag aagtgtatct ggaagaaatg 1920

gtgggtcgcg ttaatgccaa tatgatcctg ccgtatcctc caggtgttcc gttagttatg 1980

ccaggcgaaa tgattacgga agaaagtcgt ccagtgctgg aatttttaca gatgctgtgc 2040

gaaatcggtg ctcattatcc gggctttgaa acggatattc atggcgccta tcgtcaggct 2100

aatggtcgct atacagttaa agtgctgaaa gaaaatacca aataa 2145

<210> 8

<211> 2148

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgaatgtga ttgccatcat gaatcacatg ggtgtgtatt ttaaagaaga acctattcgc 60

gaattacatc gcgccctgga acgcttagat tttcgcattg tgtatcctaa tgatcgcgat 120

gatctgctga aactgatcga aaataattct cgtctgtgcg gcgttatctt tgattgggat 180

aaatataatc tggaactgtg cgaagaaatt agtaaaatga atgaatatat gccactgtat 240

gcgtttgcca atacctatag tacactggat gtgagtctga atgatttacg catgcaggtt 300

cgcttttttg aatatgccct gggtgccgcc gaagatattg ctaataaaat caaacagaat 360

acagatgaat atatcgatac catcctgcct cctctgacca aagcactgtt taaatatgtt 420

cgcgaaggca aatatacgtt ttgcacccca ggtcacatgg gcggtacagc ctttcagaaa 480

tctccagtgg gtagcatctt ttatgatttt tttggctcta atacaatgaa aagcgatatt 540

agcattagcg tgagcgaact gggttcactg ctggatcata gcggtccaca taaagaagcc 600

gaagaatata ttgcacgcgt gtttaatgcg gaacgtagct atatggtgac caatggtacg 660

agcacagcta ataaaattgt gggcatgtat agcgccccgg ccggctctac agtgctgatc 720

gatcgcaact gtcataaatc actgacacat ctgatgatga tgtcagatat caccccgatc 780

tattttcgtc cgacacgcaa tgcctatggc atcttaggcg gtatcccaca gagcgaattt 840

cagcatgcta caatagcacg tcgcgttaaa gaaacaccta atgcaacctg gccagttcat 900

gcagttatta ccaattctac ctatgatggc ttactgtata atacggattt tatcaaaaaa 960

accttagatg ttaaatcaat ccattttgat agtgcttggg ttccttatac caattttagt 1020

ccgatctatg aaggtaaatg cggcatgtca ggcggtcgtg tggaaggcaa agttatctat 1080

gaaacacagt caacccataa actgctggcc gccttttctc aggctagtat gattcatgtt 1140

aaaggcgatg ttaatgaaga aacctttaat gaggcatata tgatgcatac gacgacgagt 1200

ccacattatg gcattgttgc aagtacggaa acggccgcag ccatgatgcg cggtaatgca 1260

ggcaaacgtc tgatcgatgg ctctatcgaa cgctcaatca aatttcgtaa agaaatcaaa 1320

cgcctgaaag gtgaaagcga aggttggttt tttgatgtgt ggcagccgga acatatcgat 1380

ggcgccgaat gttggccatt acgctcagat agcgcttggc atggctttaa aaatatcgat 1440

aatgaacaca tgtatttaga tcctatcaaa gtgaccctgc tgacaccggg catgaaaaaa 1500

gatggtacaa tggatgattt tggtattcca gctagtattg tggccaaata tttagatgaa 1560

catggtattg ttgtggaaaa aaccggtccg tataatctgc tgtttctgtt tagcatcggc 1620

atcgataaaa ccaaagccct gagcttactg cgcgccctga cggattttaa acgtgcgttt 1680

gatctgaatc tgcgcgttaa aaatatgtta ccgagtctgt atcgtgaaga tccggaattt 1740

tatgaaaata tgcgcatcca ggatttagct cagaatattc ataaactggt ggaacatcat 1800

aatttaccgg atttaatgtt tcgtgccttt gaagtgttac cgagcatggt tatgaccccg 1860

tatgcagcct ttcagaaaga actgcatggt cagacggaag aagtgtatct ggaagaaatg 1920

gtgggtcgcg ttaatgccaa tatgatctta ccgtatcctc cgggcgttcc gttagttatg 1980

ccgggcgaaa tgatcacgga agaatcacgt ccagttctgg aatttttgca aatgctgtgc 2040

gaaatcggcg cccattatcc gggctttgaa acggatattc atggtgccta tcgtcaggcc 2100

gatggtcgct atacggttaa agtgctgaaa gaagaaaata ataaataa 2148

Claims

1.一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)如SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列；

(III)如SEQ ID NO.1～4任一项所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、博代氏杆菌属、霍乱弧菌、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种；

优选地，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌、克雷伯氏菌属、气单胞菌属或邦戈沙门氏菌。

3.一种编码权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸具有(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列中的任意一个：

(i)编码权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列；

(iii)如SEQ ID NO.5～8任一项所示的核苷酸序列。

4.一种用于合成戊二胺的基因表达载体，其特征在于，所述基因表达载体包括：编码如权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列或如权利要求3所述的核苷酸；

优选地，所述基因表达载体为pET质粒，优选为pETDuet质粒；

优选地，所述基因表达载体还包括编码赖氨酸戊二胺反向转运蛋白的核苷酸序列。

5.一种如权利要求4所述的基因表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

将编码如权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列或如权利要求3所述的核苷酸插入质粒的限制性酶切位点之间，得到所述基因表达载体。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括插入赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因的操作；

优选地，所述赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因前还包括信号肽；

优选地，所述信号肽包括大肠杆菌周质空间分泌信号肽；

优选地，所述信号肽包括dsbA、hlyA、lamB、malE、ompA、ompF、ompT、phoA或pelB中的任意一种，优选为pelB。

7.一种用于合成戊二胺的重组工程菌，其特征在于，包含如权利要求4所述的基因表达载体和/或编码权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸。

8.一种利用如权利要求7所述的重组工程菌制备戊二胺的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，所述菌悬液与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛的缓冲液混合反应、离心后得到所述戊二胺。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为35～65℃，时间为0.5～24h；

优选地，所述混合反应的时间为1～4h；

优选地，所述反应时的振荡速率为400～800rpm；

优选地，所述离心时的转速为8000～12000rpm，时间为1～3min；

优选地，所述缓冲液中赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1～3M；

优选地，所述缓冲液中磷酸吡哆醛的摩尔浓度为0.1～0.5mM；

优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液；

优选地，所述缓冲液的pH为5～11，优选为6～10；

优选地，所述方法包括如下步骤：

10.如权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶、如权利要求5或6所述的基因表达载体或如权利要求7所述的重组工程菌在生物基合成戊二胺中的应用。