CN109402189A - 发酵生产戊二胺的方法及其提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物发酵工程领域，其提供了以赖氨酸硫酸盐发酵生产1，5‑戊二胺的方法及其无固体废弃物的提取方法。其中，发酵制备1,5‑戊二胺的方法包括用表达赖氨酸脱羧酶的细胞催化赖氨酸硫酸盐，调节转化液的pH，萃取以获得油相和水相，精馏油相，获得1，5‑戊二胺，可用于产生聚酰胺。综合利用废弃物从而无固体废弃物产生的方法包括浓缩水相，获得硫酸盐，可用于配制氨基酸发酵培养基。另外，本发明还提供了改进的赖氨酸脱羧酶。

Description

发酵生产戊二胺的方法及其提取方法
技术领域
本发明属于生物发酵工程领域，具体而言，本发明涉及以赖氨酸硫酸盐发酵生产1，5-戊二胺的方法及其无固体废弃物的提取方法，即以赖氨酸硫酸盐为原料发酵生产1，5-戊二胺并综合利用废弃物的技术。
背景技术
1, 5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1, 5-二氨基戊烷(1, 5- Diaminopentane)，可以与二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料（即尼龙）。全球每年生产约700万吨聚酰胺材料，消耗大量石化资源，因此生物法合成聚酰胺的重要组成单体——1,5-戊二胺具有重要的经济学和生态学意义。
全细胞催化法以赖氨酸为底物，利用菌体细胞中的赖氨酸脱羧酶催化产生戊二胺。本公司作为氨基酸发酵领域的领先企业，致力于氨基酸发酵产业的转型升级，开发新型生物基材料市场。首先，本公司授权了中国科学院微生物研究所研究开发的催化生产1,5-戊二胺的技术（参见中国专利申请第201410302561.7号），然后组织本公司内外的技术人员，创造性地开发了包括二氧化碳脱除工艺的发酵生产1,5-戊二胺的方法（参见中国专利申请第201610322421.5号），实现了高效的以赖氨酸为底物的1,5-戊二胺生物催化的产业化生产。
然而，上述技术的具体实施例都是针对赖氨酸盐酸盐为底物的发酵。尽管理论上赖氨酸的各种盐（如，盐酸盐、硫酸盐）并不会对该发酵产生实质性影响，但是，本发明人发现，以赖氨酸盐酸盐为底物同以赖氨酸硫酸盐为底物的发酵生产有许多差异，包括上述技术中所用的酶催化效率对赖氨酸硫酸盐有一定程度的下降，以及会产生固体废弃物造成环境压力。
受本公司委托，本发明人凭借长期积累的经验和艰苦的工作，在酶和生产工艺流程等多方面做出了令人惊讶的改进，开发了对赖氨酸硫酸盐发酵效率有改善的赖氨酸脱羧酶变体及以使用其的发酵生产1，5-戊二胺的方法，并开发了从赖氨酸硫酸盐发酵液中提取1，5-戊二胺的方法，不但可以得到高纯度的戊二胺成品，而且还可以得到高附加值的副产物，无固体废弃物产生且对环境友好。这些改进的技术可以灵活地单独或组合应用，既适合利用部分技术改造现有的生产线的部分，也适合全面使用来设立全新的生产线。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的以赖氨酸硫酸盐发酵生产1，5-戊二胺的方法及其无固体废弃物的提取方法。另外，本发明还提供了改进的赖氨酸脱羧酶。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵制备1, 5-戊二胺的方法，其包括：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12，然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；和
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（1）中的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQID NO：2或4所示，优选如SEQ ID NO：4所示，其能更高效地以赖氨酸硫酸盐为底物进行发酵。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（3）中的pH ≥ 12.5。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（3）中的调节是通过加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物来调节的。其中，优选碱金属氢氧化物是KOH。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（3）中的萃取剂是是脂肪醇或环烷醇，优选是月桂醇。尽管根据相似相容的原理可以选择萃取剂，但是相似相容的原理很含糊，为此本发明人通过数百种的有机溶剂研究发现，脂肪醇或环烷醇（尤其是月桂醇），萃取效率最高。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（4）中的精馏是多级精馏。多级精馏可以使用一个精馏塔，在前级精馏完成后清洁精馏塔，然后用于下一级精馏。然而，优选使用多个精馏塔串联，每一级精馏使用一个精馏塔。在本发明的具体实施方式中，步骤（4）中的精馏是两级精馏。
本发明人优化了精馏的参数，使得仅使用两级精馏就可以获得适于制备高品质聚酰胺的1，5-戊二胺成品。优选在本发明第一方面的方法中，第一级精馏的压力（相对1个标准大气压来说，下同）为-0.073~-0.078MPa，优选为-0.075~-0.076MPa，第一级精馏的塔底温度为115~123℃，优选为119~121℃，和/或，第一级精馏的塔顶温度为57~65℃，优选为59~62℃；第二级精馏的压力为-0.073~-0.078MPa，优选为-0.075~-0.076MPa，第二级精馏的塔底温度为185~193℃，优选为189~191℃，和/或，第二级精馏的塔顶温度为127~133℃，优选为129~131℃。
优选在本发明第一方面的方法中，步骤（4）获得的1，5-戊二胺的纯度大于99%。也优选在本发明第一方面的方法中，步骤（4）获得的1，5-戊二胺的含水量小于0.05wt%。这样的1，5-戊二胺适于直接制备高品质的聚酰胺。
在第二方面，本发明提供了综合利用发酵制备1, 5-戊二胺所产生的废弃物的方法，其包括实施本发明第一方面的方法，并且包括如下步骤：
（5）浓缩步骤（3）获得的水相，获得硫酸盐。
即，本发明第二方面的方法包括如下步骤：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12，然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺；和
（5）浓缩步骤（3）获得的水相，获得硫酸盐。
优选本发明第二方面的方法还包括：
（6）将步骤（5）获得的硫酸盐用于配制氨基酸发酵培养基。
本发明第二方面的方法经简单步骤即可获得基本是硫酸盐的固体产品（在本文中被称为“硫酸盐”），该固体产品可直接用于配制氨基酸发酵培养基，因而使得本发明第一方面的方法可以没有固体废弃物。
在第三方面，本发明提供了利用发酵制备的1, 5-戊二胺的方法，其包括实施本发明第一方面的方法或本发明第二方面的方法，并且包括如下步骤：
（7）将步骤（4）获得的1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应，产生聚酰胺。
即，本发明第三方面的方法包括如下步骤：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12，然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺；和
（7）将步骤（4）获得的1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应，产生聚酰胺。
优选本发明第三方面的方法包括如下步骤：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12，然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺；
（5）浓缩步骤（3）获得的水相，获得硫酸盐；和
（7）将步骤（4）获得的1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应，产生聚酰胺。
更优选本发明第三方面的方法包括如下步骤：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12，然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺；
（5）浓缩步骤（3）获得的水相，获得硫酸盐；
（6）将步骤（5）获得的硫酸盐用于配制氨基酸发酵培养基；和
（7）将步骤（4）获得的1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应，产生聚酰胺。
聚酰胺是1，5-戊二胺与任意合适的二元酸聚合形成的产物，例如，尼龙56、尼龙54。优选在本发明第三方面的方法中，步骤（7）的聚酰胺是尼龙56。此时，相应的二元酸是己二酸。
在第四方面，本发明提供了赖氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明第四方面的赖氨酸脱羧酶在第315位带有丙氨酸突变，能更高效以赖氨酸硫酸盐为底物进行发酵。
在第五方面，本发明提供了编码本发明的第四方面的赖氨酸脱羧酶的基因。优选该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在第六方面，本发明提供了包含本发明的第五方面的基因的载体。
在第七方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的第五方面的基因，或用本发明的第六方面的载体转化或者转染而得。优选该宿主细胞是菌种，优选是细菌，如大肠杆菌。
在第八方面，本发明提供了本发明的第四方面的赖氨酸脱羧酶的制备方法，其包括在合适表达的条件下培养本发明的第七方面的宿主细胞，从培养物中分离出本发明第四方面的赖氨酸脱羧酶。
在第九方面，本发明提供了本发明的第四方面的赖氨酸脱羧酶在发酵制备1, 5-戊二胺中的应用。优选在本发明第九方面的应用中，制备1, 5-戊二胺的方法是以赖氨酸硫酸盐为底物制备的，更优选是本发明第一方面的方法。
本发明的有益效果在于：以赖氨酸硫酸盐为底物发酵生产1，5-戊二胺，催化效率高，能得到高纯度的戊二胺成品而直接用于合成高质量的聚酰胺，固体废弃物可以直接利用而无需额外处置，对环境友好，而且可以产生高附加值。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 材料检测方法和仪器
采用以下方法和仪器来检测1，5-戊二胺的含量和纯度以及尼龙56的性能指标。
（1）1，5-戊二胺含量分析（单位：g/L）
色谱柱：美国Eclipse XDB-C18column（4.6×150nm；Agilent Technologies，USA）柱。
检测器：二级阵列检测器DAD（检测波长360nm，参比波长400nm）。
流动相：A：pH7.2的磷酸二氢钾水溶液；B：66%的乙腈水溶液
梯度比A：B=5%：95%
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样量：15.0μL
检测方法：采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）HPLC柱前衍生法。
（2）1，5-戊二胺的纯度分析（单位：wt%）
仪器：岛津GC－2010气相色谱仪
色谱柱：石英毛细管柱DB－5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）
升温程序：140 ℃保持15 min，140－250 ℃程序升温，30 ℃/min速率，250 ℃保持5min
进样口温度：220 ℃
FID检测器温度：250 ℃
柱压力：61.8kPa
总流量：24.0 mL/min
线速度：35.5 cm/sec
分流比：20：1
柱流量：1.00 mL/min
进样量：1.0 μL
结果计算：采用气相色谱（GC）归一化法测得
（3）1，5-戊二胺含水量的测试
采用卡尔费休水分测定仪检测。
（4）尼龙56粘度检测
方法参见GB 12006.1，相对粘度越高聚合度越高，体现在性能上就是粘度越高，材料本身的性能会更高。
（5）尼龙56黄色指数检测
方法参见HG/T 3862，颜色指数越高表明产品颜色越重。
实施例2工程菌的构建
参照中国专利申请第201610322421.5号的详细记载，构建生产1，5-戊二胺的工程菌，命名为E. coli BL21 (DE3) P cadB :: PT7/ pET28a-cadA * ，其中赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
另外，根据我们的初步进行的丙氨酸扫描筛选，发现了更适合催化赖氨酸硫酸盐的赖氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，在第315位带有丙氨酸突变，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。基本参照上述方法，所不同的只是代之以该突变基因，构建了生产1，5-戊二胺的工程菌，命名为E. coli BL21 (DE3) P cadB :: PT7/ pET28a-cadA *315 。
实施例3 基于赖氨酸硫酸盐的催化生产
分别取实施例2构建的两种工程菌，参照中国专利申请第201610322421.5号的详细记载，经种子液培养、流加补料培养和IPTG诱导培养，获得OD600达到80左右的菌体培养液，离心获得各自的湿菌体。
配制含有208 g/L赖氨酸硫酸盐和0.2 mmol/L磷酸吡哆醛（PLP）的催化液体系，调控温度至37°C，发酵罐搅拌转速设置为500 rpm，分别加入20 g/L的上述两种湿菌体（折合细胞干重4 g/L），开始全细胞催化。不补加酸性物质调节pH，并且不通空气，利用副产物CO2调节自调控催化体系的pH。每隔1h从发酵罐中取出催化液，12000 × g离心5分钟，倒出上清液，检测1,5-戊二胺产量。结果如表1所示，以前构建的E. coli BL21 (DE3) P cadB :: PT7/pET28a-cadA * 能够有效催化赖氨酸硫酸盐形成1,5-戊二胺，但是催化时间较长，需要4-5小时耗尽赖氨酸；替换了本发明改进的赖氨酸脱羧酶的工程菌E. coli BL21 (DE3) P cadB ::PT7/ pET28a-cadA *315 能够在更短时间（约3小时）完成催化赖氨酸硫酸盐形成1,5-戊二胺，催化效率更高。
表1 不同工程菌在不同时间点催化的1,5-戊二胺产量
按照上述方法，配制含有不同赖氨酸硫酸盐浓度的催化液体系，催化获得不同1，5-戊二胺终浓度的转化液。
实施例4 1，5-戊二胺的提取
分别用如下方法提取1，5-戊二胺：
（1）取按照实施例3的方法获得的1，5-戊二胺含量为108.0g/L的转化液500mL，加入89.0g 40wt% KOH溶液，搅拌均匀后，测得pH为13.2，4000rpm离心10min，得到离心液。
将离心液与月桂醇按照1：3体积比进行逆流液-液萃取，萃取温度为50℃，静置后，溶液分层，得到上层含有游离1，5-戊二胺的油相，下层水相进行浓缩得到成品硫酸钾。
将得到的油相置于1000mm精馏塔内进行精馏，其中，压力控制为-0.076MPa，控制塔底温度为120℃，控制精馏塔顶温度60℃。收集塔底部出料的1，5-戊二胺溶液，其水分含量低于3wt%。
塔底部出料继续精馏，置于精馏塔内进行精馏，其中，塔压力控制为-0.075MPa，控制塔底温度为190℃，控制精馏塔顶温度130℃，稳定进料1.5-2h后，精馏塔达到平衡，检测1，5-戊二胺成品，气相检测其纯度为99.47%，其含水量0.01wt%。
（2）取按照实施例3的方法获得的1，5-戊二胺含量为113.0 g/L的转化液1000mL1，加入197.0g 40wt% KOH溶液，搅拌均匀后，测得pH为12.5，在4000rpm离心10min，得到离心液。
将离心液与月桂醇按照1：3体积比进行逆流液-液萃取，萃取温度为50℃，静置后，溶液分层，得到上层含有游离1，5-戊二胺的油相，下层水相进行浓缩得到成品硫酸钾。
将得到的油相置于1200mm精馏塔内进行精馏，压力控制为-0.076MPa，控制塔底温度为120℃，控制精馏塔顶温度62℃。收集塔底部出料的1，5-戊二胺溶液，其水分含量低于3wt%。
塔底部液相出料继续置于精馏塔内进行精馏，其中，塔压力控制为-0.076MPa，控制塔底温度为190℃，控制精馏塔顶温度130℃，稳定进料1.5-2h后，精馏塔达到平衡，检测1，5-戊二胺成品，气相检测其纯度为99.80%，其含水量0.03wt%。
（3）取按照实施例3的方法获得的1，5-戊二胺含量为40.3 g/L的转化液500mL，加入78.2g 40wt% KOH溶液，搅拌均匀后，测的pH为12.5，4000rpm离心10min，得到离心液。
将离心液与月桂醇按照1：3体积比进行逆流液-液萃取，萃取温度为50℃，静置后，溶液分层，得到上层含有游离1，5-戊二胺的油相，下层水相进行浓缩得到成品硫酸钾。
将得到的油相置于1500mm精馏塔内进行精馏，压力控制为-0.076MPa，控制塔底温度为120℃，控制精馏塔顶温度60℃。收集塔底部出料的1，5-戊二胺溶液，其水分含量低于3wt%。
塔底部液相出料继续置于精馏塔内进行精馏，其中，塔压力控制为-0.075MPa，控制塔底温度为190℃，控制精馏塔顶温度130℃，稳定进料1.5-2h后，精馏塔达到平衡，检测1，5-戊二胺成品，气相检测其纯度为99.16%，其含水量0.02wt%。
（4）取按照实施例3的方法获得的1，5-戊二胺含量为115.7g/L的转化液2200mL，加入619.0g 40wt% KOH溶液，搅拌均匀后，测的pH为12.8，4000rpm离心10min，得到离心液。
将离心液与月桂醇按照1：3体积比进行逆流液-液萃取，萃取温度为50℃，静置后，溶液分层，得到上层含有游离1，5-戊二胺的油相，下层水相进行浓缩得到成品硫酸钾。
将得到的油相置于1500mm精馏塔内进行精馏，压力控制为-0.076MPa，控制塔底温度为120℃，控制精馏塔顶温度60℃。收集塔底部出料的1，5-戊二胺溶液，其水分含量低于3wt%。
塔底部液相出料继续置于精馏塔内进行精馏，其中，塔压力控制为-0.075MPa，控制塔底温度为190℃，控制精馏塔顶温度130℃，稳定进料1.5-2h后，精馏塔达到平衡，检测1，5-戊二胺成品，气相检测其纯度为99.88%，其含水量0.01wt%。
实施例5 硫酸钾的回收利用
取按照实施例4的方法浓缩获得的成品硫酸钾，配制成溶液，按照如下配比加入下列氨基酸的底料培养基中，替代原底料培养基中的氯化钾，用各自工程菌分别进行发酵产各自氨基酸：
（1）赖氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉0.5%，硫酸镁0.8%，玉米浆1%，硫酸钾1.5%，生物素0.001%，糖蜜3%，磷酸1%；发酵时流加70%淀粉糖，45%硫酸铵溶液，温度37℃，pH7.0，发酵50小时。发酵产赖氨酸260g/L。
（2）谷氨酸底料培养基的组成（w/w）：玉米浆3%，硫酸镁0.8%，毛发粉1%，硫酸钾2.5%，生物素0.002%，糖蜜4%，磷酸1.5%；发酵时流加50%淀粉糖，温度32℃，pH7.0，发酵30小时。发酵产谷氨酸180g/L。
（3）苏氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉1.5%，硫酸镁0.8%，玉米浆1%，硫酸钾1.0%，糖蜜5%，磷酸3%；发酵时流加50%淀粉糖，温度37℃，pH7.0，发酵30小时。发酵产苏氨酸140g/L。
（4）色氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉2%，硫酸镁2%，硫酸钾2.5%，糖蜜3%，磷酸2%；发酵时流加50%淀粉糖，温度37℃，pH6.8，发酵40小时。发酵产色氨酸45g/L。
（5）缬氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉3%，硫酸镁1.5%，玉米浆2%，硫酸钾1.5%，糖蜜3%，磷酸1%；发酵时流加70%淀粉糖，温度37℃，pH7.0，发酵100小时，发酵产缬氨酸80g/L。
（6）异亮氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉3%，硫酸镁1.5%，玉米浆4%，硫酸钾2.5%。维生素B10.02%；发酵时流加70%淀粉糖，温度37℃，pH7.0，发酵100小时。发酵产异亮氨酸120g/L。
（7）精氨酸底料培养基的组成（w/w）：酵母粉2%，硫酸镁1.5%，玉米浆4%，硫酸钾2.5%，磷酸3%；发酵时流加70%淀粉糖，温度37℃，pH7.0，发酵100小时。发酵产精氨酸120g/L。
用按照实施例4的方法浓缩获得的成品硫酸钾替代原底料培养基中的氯化钾，发酵指标无明显波动，而且降低了氯离子对不锈钢设备的腐蚀。由于该固体物质被利用直接作为附加值产品，所以本发明的方法在得到高纯度的戊二胺产品的生产过程中不会产生固体废弃物，由此避免了大量可溶性盐废弃物的产生，可大幅减轻废水处理难度，有益于环保。
实施例6 聚酰胺的制备
将成盐釜用氮气置换，加入2.5kg水，然后加入实施例4中分别制备的1，5-戊二胺1.03kg，充分搅拌，加入1.47kg己二酸，控制温度不高于70℃，以防止氧化，制得尼龙盐溶液。
将聚合釜用氮气置换空气，将上述制得的尼龙盐转移至聚合釜中，油浴升至170℃，料温升至122℃时，关闭排气，油温继续升至280℃，抽真空-0.06 MPa，保持该真空度20min，制得尼龙56。
向聚合釜内充入氮气至压力为0.5 MPa时，开始熔融出料，用切粒机造粒。成品90℃在真空干燥箱干燥4小时后进行检测，结果见表2。由表2可知，本发明的提取方法得到的1，5-戊二胺用于尼龙聚合时，所制得的聚合物粘度及色调等性质相当优秀。
表2 用本发明的1，5-戊二胺制备的尼龙56的性质
实施例4中提取方法的编号 尼龙56黄色指数 尼龙56相对粘度
（1） 0.7 2.81
（2） 0.6 3.06
（3） 0.8 2.95
（4） 1.0 2.85
序列表
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> 发酵生产戊二胺的方法及其提取方法
<130> CN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 715
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 3
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
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gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
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675 680 685
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Claims (10)

1.发酵制备1, 5-戊二胺的方法，其包括：
（1）培养表达赖氨酸脱羧酶的细胞；
（2）用步骤（1）获得的细胞催化赖氨酸硫酸盐，获得包含1, 5-戊二胺的转化液；
（3）调节步骤（2）获得的转化液的pH＞12（优选pH ≥ 12.5），然后加入萃取剂萃取，获得油相和水相；和
（4）精馏步骤（3）获得的油相，获得1，5-戊二胺。
2.权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：2或4所示。
3.权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中的调节是通过加入碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物来调节的，优选其中碱金属氢氧化物是KOH。
4.权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中的萃取剂是是脂肪醇或环烷醇，优选是月桂醇。
5.权利要求1所述的方法，其中，步骤（4）中的精馏是多级精馏。
6.权利要求1所述的方法，其中，步骤（4）获得的1，5-戊二胺的纯度大于99%，和/或，步骤（4）获得的1，5-戊二胺的含水量小于0.05wt%。
7.综合利用发酵制备1, 5-戊二胺所产生的废弃物的方法，其包括实施权利要求1-6之任一所述的方法，并且包括如下步骤：
（5）浓缩步骤（3）获得的水相，获得硫酸盐。
8.权利要求7所述的方法，其包括：
（6）将步骤（5）获得的硫酸盐用于配制氨基酸发酵培养基。
9.利用发酵制备的1, 5-戊二胺的方法，其包括实施权利要求1-6之任一所述的方法或权利要求7或8所述的方法，并且包括如下步骤：
（7）将步骤（4）获得的1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应，产生聚酰胺（优选是尼龙56）。
10.赖氨酸脱羧酶、其编码基因、载体、宿主细胞、制备方法或应用，其中，赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
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