CN112852692A

CN112852692A - 一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

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Publication number: CN112852692A
Application number: CN202010289738.XA
Authority: CN
Inventors: 张学礼; 于勇; 徐洪涛
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN112852692B

Abstract

本发明公开了一种产1,5‑戊二胺‑丁二酸盐的重组大肠杆菌，其与作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌相比，1,5‑戊二胺的合成能力提高。本发明还提供产1,5‑戊二胺‑丁二酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，以及其在制备1,5‑戊二胺‑丁二酸盐中的应用。本发明构建的产1,5‑戊二胺‑丁二酸盐的重组大肠杆菌HX028‑54发酵96h生产了0.94mol，207g/L的1,5‑戊二胺‑丁二酸盐，且葡萄糖与赖氨酸无残留，便于后期的分离纯化，具有较大的经济价值。在此基础上进一步优化的重组大肠杆菌HX028‑54‑D的生产效率进一步提高。

Description

一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

目前，全球尼龙产量在600万吨左右，其中尼龙66是最早工业化生产且用途最广泛的品种。但是尼龙66生产的关键中间体己二腈由于技术壁垒及投资门槛较高，售价也较高，目前售价在23000元/吨左右。因此，如果能开发一种比尼龙66更廉价的尼龙产品，将可以极大的促进尼龙产业的发展。具有工业意义的尼龙通常具有以下三种特征：1、二羧酸和二胺的缩聚物，2、二羧酸和二胺需要含有四个以上的CH₂，3、环状内酰胺的聚合物需要含有6个以上的碳原子。结合目前已有的二羧酸和二胺生产技术，丁二酸和1,5-戊二胺缩聚合成的尼龙-54既符合具有工业意义的尼龙的特征(《聚酰胺纤维的化学与工艺学》中国工业出版社，1964年10月第一版，第二章8-16页、第七章212-238页)，又可以廉价的合成。尼龙-54在聚合前需要先制备丁二酸和1,5-戊二胺的等摩尔混合盐作为原料。

丁二酸又称作琥珀酸，是一种优秀的平台化合物。目前丁二酸发酵菌种主要有两大类，第一类是天然产丁二酸菌，另一类是通过代谢工程改造的工程菌，主要是大肠杆菌。天然产丁二酸菌虽然能够高产丁二酸，但其自有很多缺陷，限制了其大规模工业化生产。大肠杆菌在糖发酵过程中虽然只积累少量的丁二酸，但由于其生理遗传背景清晰，易于改造，因此很多研究单位都选取大肠杆菌作为出发菌种，将其改造成高产丁二酸的工程菌。Chatterjee等人构建了以乳糖、果糖、甘露糖和海藻糖等为碳源的工程菌NZN111，发酵生成丁二酸、乙酸和乙醇，并在此基础上筛选出利用葡萄糖为碳源的突变菌株AFP111。Vemuri等人在AFP111中高表达丙酮酸羧化酶基因pyc，两步法培养，丁二酸的最终浓度可达到99.2g/L(841mM)，糖酸转化率为1.1g/g(1.68mol/mol)。Sanchez等人构建出工程菌SBS550MG，可以两步法生产40g/L(339mM)的丁二酸，糖酸转化率达到1.06g/g。Jantama等人构建出重组大肠杆菌KJ073，在厌氧条件下可以生产79g/L(668mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.79g/g(1.2mol/mol)，并进一步在此基础上构建出重组大肠杆菌KJ122，在厌氧条件下可以无机培养基生产80g/L(680mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.89g/g。Zhang等人构建出重组大肠杆菌XZ721，在厌氧条件下可以生产39g/L(327mM)的丁二酸，糖酸转化率达到0.82g/g。ZL201310198953.9(CN104178443B)中，经过代谢工程改造的大肠杆菌HX028的丁二酸产量就可以达到123g/L，转化率达1.56mol/mol，符合工业生产要求。

1,5-戊二胺又名尸胺或1,5-二氨基戊烷，可利用微生物发酵以赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧制得。赖氨酸的价格非常低廉，仅为8000元/吨左右，以此为底物生产1,5-戊二胺具有经济可行性的。大肠杆菌本身带有用于赖氨酸脱羧的功能基因，通过上调其表达强度就可以提高赖氨酸的脱羧效率。大肠杆菌中的1,5-戊二胺操纵子依次包括诱导型启动子Pcad、赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因cadB和赖氨酸脱羧酶的编码基因cadA。在低pH值、高赖氨酸浓度条件下，1,5-戊二胺操纵子上游调节基因cadC被激活，其产物作用于Pcad启动子，激活赖氨酸脱羧酶CadA和赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白CadB的表达合成。CadA催化细胞内的赖氨酸合成1,5-戊二胺，CadB将合成的1,5-戊二胺转运至细胞外。

ZL201810195975.2(CN108531494A)通过在丁二酸生产菌株内过表达cadA，发酵制备1,5-戊二胺和丁二酸，得到了尼龙-54的聚合前体1,5-戊二胺-丁二酸盐。其中，催化赖氨酸脱羧采用的是常用产1,5-戊二胺方法，具体是将cadA基因构建在诱导型质粒上过表达，大量的CadA极大增加了1,5-戊二胺的生产效率，但是这一产1,5-戊二胺的常用方法在发酵制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的过程中存在如下缺陷：首先，cadA过量表达对细胞生长有害，因为赖氨酸是细胞生长所必须的物质，该酶过表达后将导致细胞内的赖氨酸被竞争性催化为1,5-戊二胺，进而导致用于生长的赖氨酸不足而令细胞无法正常生长。所以使用质粒过表达CadA将对细胞造成非常强的生长抑制。为了避免这一问题，通常会在细胞生长好后再诱导cadA基因，ZL201810195975.2(CN108531494A)先进行了30h好氧发酵，并在加入诱导剂IPTG后又发酵了6h，总共准备36h后才开始1,5-戊二胺-丁二酸盐的发酵生产，非常浪费时间和碳源。其次，使用质粒过表达cadA必然要使用抗生素，ZL201810195975.2(CN108531494A)使用了卡那霉素、氯霉素、链霉素三种抗生素，不仅增加了发酵成本，也将增加含抗生素污水的处理成本。而且，过表达过程中质粒丢失是不可避免的问题，导致部分细胞无法表达cadA基因，不利于1,5-戊二胺-丁二酸盐的生产。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何同步进行丁二酸与1,5-戊二胺的高效发酵。

一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，其与作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌相比，1,5-戊二胺的合成能力提高。

所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白和赖氨酸脱羧酶的表达量高于作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌；或所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌菌体中的赖氨酸脱羧酶的含量高于作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌。

所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，按下文的构建方法得到。

本发明提供产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，包括A1或A2：

A1提高作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌中赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因的表达量；

A2在作为出发菌的所述产丁二酸重组大肠杆菌中导入赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述A1中提高作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌中赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因的表达量为以上调控基因表达强度的启动子替换天然启动子，以驱动赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因的表达。

上述导入和替换可通过同源重组实现。

所述上调控基因表达强度的启动子为现有技术中符合要求的启动子，如《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，公开号：CN102286517B)中上调控基因表达强度的启动子，具体如启动子M1-93或启动子mRSL-D；所述启动子M1-93的核苷酸序列为序列表中序列1第1480-1567位，所述启动子mRSL-D的核苷酸序列为序列表中序列5第1-88位。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述出发菌为现有技术中产丁二酸的产量符合工业生产要求的重组大肠杆菌，所述出发菌具体为HX028，所述HX028为产丁二酸的重组大肠杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7550。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌含有DNA片段，所述DNA片段cadBA-mRSL的核苷酸序列为将序列表中序列1或者将序列1中的第1480-1567位替换为序列5的第1-88位而序列1的其它核苷酸保持不变得到的序列。所述DNA片段cadBA-mRSL中第1-50位为一步法同源重组上游同源臂：cadB基因天然启动子上游50位，第51-1479位是FRT-卡那霉素抗性基因-FRT序列，第1480-1567位是启动子，第1568-1617位是一步法同源重组下游同源臂：cadB基因上游50位。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌为在HX028中导入序列表中的序列1或者将序列1中的第1480-1567位替换为序列5的第1-88位而序列1的其它核苷酸保持不变得到的序列，同源重组得到的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌含有表达盒，所述表达盒为上调控基因表达强度的启动子——cadB基因——cadA基因；所述表达盒为序列表中序列2第1430-5079位的序列，或者将序列2第1430-5079位中的第1430-1517位替换为序列5的第1-88位而序列2的其它核苷酸保持不变得到的序列：第1430-1517位为M1-93启动子，第1518-2852位为cadB基因，第2932-5079位为cadA基因。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌为HX028-54。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白为a1或a2的蛋白质：

a1氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；

a2将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白活性的由a1衍生的蛋白质。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述赖氨酸脱羧酶为b1或b2的蛋白质：

b1氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

b2将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有赖氨酸脱羧酶活性的由b1衍生的蛋白质。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因为c1-c3中的任一种DNA分子：

c1编码链的编码序列是序列表中序列2的第1518-2852位的cDNA分子或基因组DNA；

c2在严格条件下与c1限定的DNA分子杂交且编码所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

c3与c1或c2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的cDNA分子或基因组DNA。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述赖氨酸脱羧酶的编码基因为d1-d3中的任一种DNA分子：

d1编码链的编码序列是序列表中序列2的第2932-5079位的cDNA分子或基因组DNA；

d2在严格条件下与d1限定的DNA分子杂交且编码所述赖氨酸脱羧酶的cDNA分子或基因组DNA；

d3与d1或d2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述赖氨酸脱羧酶的cDNA分子或基因组DNA。

上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌含有表达盒，所述表达盒含有启动子和所述启动子驱动的所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因，所述启动子为启动子M1-93，启动子M1-93的序列为序列表中序列1第1480-1567位。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因可在一个表达盒上，也可以在两个表达盒上。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述表达盒中，所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因可位于所述赖氨酸脱羧酶的编码基因的上游，也可位于所述赖氨酸脱羧酶的编码基因的下游。

上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或上述构建方法中，所述表达盒具体含有核苷酸序列是序列2第1430-5079位的DNA：第1430-1517位为M1-93启动子，第1518-2852位为cadB基因，第2932-5079位为cadA基因。

为解决上述技术问题，本发明还提供一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌用的表达盒，所述表达盒含有启动子和所述启动子驱动的所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因；所述启动子为启动子M1-93，启动子M1-93的序列为序列表中序列1第1480-1567位。

上述表达盒中，所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因可位于所述赖氨酸脱羧酶的编码基因的上游，也可位于所述赖氨酸脱羧酶的编码基因的下游。

上述表达盒具体含有核苷酸序列是序列2第1430-5079位的DNA：第1430-1517位为M1-93启动子，第1518-2852位为cadB基因，第2932-5079位为cadA基因。

一种制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法，其包括发酵所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，得到1,5-戊二胺-丁二酸盐，所述发酵采用不含抗生素和辅酶磷酸吡哆醛的培养基培养所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，所述发酵过程中不补充CO₂。所述发酵包括先进行3h的好氧培养后转入厌氧条件下进行厌氧发酵。

本发明还提供上述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌在制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法中的应用，以及上述构建方法在制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法中的应用。

上述表达盒在构建产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的应用，以及在制备1,5-戊二胺-丁二酸盐中的应用也属于本发明的保护范围。

在传统的丁二酸发酵生产中，培养基中需添加碳酸钠、碳酸氢钠等物质来提供二氧化碳供，且发酵产生的是丁二酸二钠，需经过复杂的分离提取才能转化为丁二酸，整个发酵过程中大量使用酸碱溶液，产生大量的废料，并且极大地抬高了丁二酸生产成本。而赖氨酸脱羧的过程中释放出的二氧化碳可用于丁二酸的合成，其脱羧产物1,5-戊二胺可以同丁二酸的两个羧基中和生成1,5-戊二胺-丁二酸盐作为尼龙-54的聚合前体。本发明通过在丁二酸高产菌上过表达赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因cadB和赖氨酸脱羧酶的编码基因cadA，以赖氨酸为中和剂，来控制发酵过程的pH，进行1,5-戊二胺和丁二酸同步发酵的具体机理参见图1：赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白CadB和赖氨酸脱羧酶CadA过表达后，赖氨酸被高效地转运进胞内并催化成1,5-戊二胺。每一分子赖氨酸脱羧产生一份子1,5-戊二胺，过程中释放出的一分子二氧化碳参与合成一分子的丁二酸，再高效的将1,5-戊二胺转运出细胞，1,5-戊二胺带有两个氨基，可以同丁二酸的两个羧基中和，1,5-戊二胺与丁二酸等摩尔中和即得到了1,5-戊二胺-丁二酸盐。1,5-戊二胺和二氧化碳的快速消耗降低了脱羧产物浓度，进一步提高了赖氨酸脱羧效率。整个过程无需诱导，接入种子液后，仅需3h的好氧培养后即可转入厌氧条件下进行1,5-戊二胺-丁二酸盐的发酵生产，简化了发酵步骤。发酵时使用无机盐培养基，无需添加抗生素和辅酶磷酸吡哆醛(PLP)，发酵过程中也无需补充CO₂实现了丁二酸与1,5-戊二胺的同步发酵。改造后的菌株HX028-54的1,5-戊二胺-丁二酸盐的产量可达0.94mol/L，折合207g/L具有非常大的工业应用潜力，可用来生产尼龙-54的聚合前体，避免了将丁二酸与1,5-戊二胺分别纯化出来再进行混合的繁琐步骤，这样做极大的降低了生产成本，减少了碳损失，也使得工艺流程更加环保。

生物材料保藏说明

生物材料的的分类命名：大肠埃希氏菌

生物材料的的拉丁文学名：Escherichia coli

生物材料的菌株编号：HX028

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年5月3日

保藏编号：CGMCC No.7550

附图说明

图1为以本发明重组大肠杆菌同步生产的1,5-戊二胺和丁二酸的机理图。

图2为重组大肠杆菌HX028-54的CadBA*Ⅰ基因簇的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，HX028是专利《生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用》(专利号：ZL201310198953.9，公开号为CN104178443B)中所构建的生产丁二酸的重组大肠杆菌，已于2013年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号为：CGMCC No.7550。

下述实施例中，重组菌株M1-93是《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，公开号：CN102286517B)构建的大肠埃希氏菌信使RNA稳定区文库1(M-Lib1)中的重组菌株，其人工调控元件为启动子M1-93。

下述实施例中，pKD46质粒公众可从天津工业生物技术研究所获得，记载过pKD46质粒的非专利文献是Datsenko,K.A.,and B.L.Wanner.2000.One-step inactivation ofchromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl AcadSci USA,97:6640-6645。

下述实施例中，如无特殊说明，各核苷酸序列的首位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1：产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的构建

1、底盘菌的选取

本发明中底盘菌的性能非常重要，必须是几乎不产杂酸的丁二酸生产菌才能完成1：1生产丁二酸和戊二胺的功能。否则，细菌发酵过程中产生的乙酸、乳酸等单羧酸也会中和一定量的1,5-戊二胺，导致1,5-戊二胺摩尔浓度高于丁二酸，并且单羧酸很难除去，并且由于其只存在一个羧基，在尼龙的聚合过程中会造成聚合链的终止，降低产品的聚合度和强度。HX028是生产丁二酸的重组大肠杆菌，产量为123g/L，转化率达1.56mol/mol，几乎不产杂酸，符合工业生产要求。本实施例以重组大肠杆菌HX028为出发菌。

2、构建重组大肠杆菌HX028-54

对重组大肠杆菌HX028采用一步法同源重组，进行赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因cadB和赖氨酸脱羧酶的编码基因cadA的表达调控，获得了重组大肠杆菌HX028-54。具体包括以下两步：

2.1cadB、cadA表达上调的同源重组片段的扩增

以大肠埃希氏菌信使RNA稳定区文库1(M-Lib1)中的重组菌株M1-93基因组为模板，以8739cadBA*kana frt up和8739cadBA m1-93 down为引物，进行PCR扩增启动子M1-93。扩增程序为：先98℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；72℃延伸10分钟；PCR反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。

重组菌株M1-93人工调控元件为启动子M1-93，启动子M1-93的序列为：

5’-TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCGTATTGTTAGCATGTACGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3’(序列表中序列1第1480-1567位)。

引物序列为：

8739 cadBA*kana frt up：

5’-GTAACTCCGGGTTGATTTATGCTCGGAAATATTTGTTGTTGAGTTTTTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

8739 cadBA m1-93 down：

5’-GCAACAACACCGGTACAGGCAAATAGCCCGATCTTCTTGGCAGAACTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAACGTAC-3’

将扩增得到的DNA片段命名为cadBA*Ⅰ，其序列为序列表中的序列1。序列1中第1-50位为一步法同源重组上游同源臂：cadB基因天然启动子上游50位，第51-1479位是FRT-卡那霉素抗性基因-FRT序列，第1480-1567位是M1-93启动子，第1568-1617位是一步法同源重组下游同源臂：cadB基因上游50位。在具体构建过程中，cadBA*Ⅰ是一个一步法调控片段，cadB和cadA基因表达盒在大肠杆菌上天然存在，并且是在同一个基因簇上。所以具体的实现方法是将cadBA基因簇的启动子更换为高强度人工启动子：M1-93号启动子。

2.2构建重组大肠杆菌HX028-54

通过Red同源重组技术将丁二酸高产菌HX028染色体上的CadBA基因簇的原始调控区域替换为M1-93，具体步骤如下：

将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至HX028，得到带有pKD46的HX028的感受态细胞。然后将2.1得到的DNA片段cadBA*Ⅰ电转至带有pKD46的HX028感受态细胞，去除pKD46质粒，得到重组大肠杆菌，命名为HX028-54。

电转条件为：将50μL上述感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段cadBA*Ⅰ，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，30℃孵育2小时。取所得菌液100μL涂在含有卡那霉素的LB平板上，39℃过夜培养得到去除pKD46质粒的重组大肠杆菌，命名为HX028-54。重组大肠杆菌HX028-54的CadBA*Ⅰ基因簇(表达盒)的结构如图2所示，cadB及cadA基因的上游启动子为启动子M1-93。重组大肠杆菌HX028-54含有序列2所示的CadBA基因簇，为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT——M1-93号启动子——cadB基因——cadA基因。所述CadBA*Ⅰ基因簇为序列表中的序列2：第1-1429位为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT序列，第1430-1517位为M1-93启动子，第1518-2852位为cadB基因，第2932-5079位为cadA基因。

3、赖氨酸脱羧酶的酶活测定

分别进行HX028和HX028-54的赖氨酸脱羧酶的酶活测定，测定方法如下：

菌株首先在装液量为20mL的100mL三角瓶中培养12小时，37℃，220rpm，培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠)。培养好的菌体作为种子培养液，接种进装有50mL LB培养基的的250mL三角瓶中培养，37℃，220rpm，初始OD_550nm为0.1，培养6小时。培养后收集全部细胞(12,000×g，4℃，20min)，收集后使用100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)清洗一次，并用5mL100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)重悬。重悬后的细胞使用超声细胞破碎仪破碎，破碎后离心去除细胞碎片(12,000×g，30min)，离心后取出上清液，该上清液为粗酶液，用于酶活测定。测定粗酶液中的蛋白质含量，计算酶的比活力。

酶活测定体系总体积为0.5mL，包含10μL粗酶液，10mM L-赖氨酸，0.1mM磷酸吡哆醛，及100mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)。37℃条件下反应30min，100℃处理5min终止反应。37℃条件下每分钟催化产生1μmol的1,5-戊二胺的酶量为1单位(U)。

经检测，由出发菌HX028制备的粗酶液中的赖氨酸脱羧酶的酶活力为0.06U/mg(以粗酶液中的蛋白质量计)，由HX028-54制备的粗酶液中的赖氨酸脱羧酶酶活力提高到了1.2U/mg(以粗酶液中的蛋白质量计)。

实施例2：重组大肠杆菌HX028-54生产1,5-戊二胺-丁二酸盐

1、发酵生产1,5-戊二胺-丁二酸盐

种子培养基和发酵培养基均由以下成分组成：

大量元素：葡萄糖、(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄、MgSO₄·7H₂O；

微量元素：FeCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、ZnCl₂、Na₂MoO₄·2H₂O、H₃BO₃和MnCl₂·4H₂O₂；

水。

以上成分在所述发酵培养基中的浓度可分别为：

大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L，NH₄H₂PO₄ 0.5g/L-5g/L或0.5g/L或1g/L或5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 1g/L-10g/L或1g/L或3g/L或10g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L；

微量元素：FeCl₃·6H₂O 0.2μg/L-5μg/或0.2μg/L或1.5μg/L或5μg/L，CoCl₂·6H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，CuCl₂·2H₂O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，ZnCl₂ 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，H₃BO₃ 0.01μg/L-1μg/L或0.01μg/L或0.1μg/L或1μg/L，MnCl₂·4H₂O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.2μg/L或5μg/L；

本实施例下述实验中具体采用的种子培养基和发酵培养基的组分具体如下：葡萄糖106g/L、NH₄H₂PO₄ 1g/L、(NH₄)₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、FeCl₃·6H₂O 1.5μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.1μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.1μg/L、ZnCl₂ 0.1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg/L、H₃BO₃ 0.1μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.2μg/L和水。

种子培养：250mL三角瓶中种子培养基为50mL，115℃灭菌15min。冷却后将重组大肠杆菌HX028-54按照1％(V/V)的接种量接种于种子培养基，在pH值为7.0、37℃和250rpm的条件下培养16小时得到种子液，用于发酵培养基接种。

发酵培养：发酵罐中培养基为3000mL，将种子液按照接种后发酵体系的OD₅₅₀nm＝0.1的标准接种于发酵培养基。先进行3个小时的好氧培养，条件为37℃，通气量为1vvm，溶氧设定为20％。3小时后转为厌氧发酵，关闭通气阀门，温度为37℃，转速为200rpm。每隔24h取样得到发酵液，发酵液为发酵罐内所有物质，中和剂为4mol/L的L-赖氨酸溶液(厌氧发酵时，大肠杆菌会把葡萄糖代谢为丁二酸，发酵液pH值下降，为了继续发酵，此时需要添加碱性中和剂将pH调整为中性，在本实验中，碱性中和剂为4mol/L的L-赖氨酸溶液，在发酵液pH下降后，一方面碱性的L-赖氨酸会泵入发酵液中来维持pH为中性，另一方面泵入的L-赖氨酸在被催化为戊二胺后碱性变强会继续进行中和，1mol戊二胺可中和1mol丁二酸)。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行HPLC分析测定1,5-戊二胺-丁二酸盐，葡萄糖和赖氨酸。HPLC分析中，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量。发酵液中的葡萄糖、丁二酸和其它有机酸浓度测定采用伯乐公司(Biorad)的Aminex HPX-87H有机酸分析柱。丁二酸标准品购自SIGMA公司，产品目录号为W327700。1,5-戊二胺二盐酸盐标准品购自SIGMA公司，产品目录号为C8561。1,5-戊二胺检测分为衍生化和检测两部分：1)衍生化反应：0.8mL样品(<0.25g/L)+0.24mL碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5，现配)+0.8mL丹磺酰氯溶液(5g/L，溶于丙酮，-20℃冰箱保存)，混匀1min，避光60℃反应15min，加入0.1mL氨水终止反应，室温下静置30min，最后用乙腈定容到4mL，过滤后上机测试。2)液相检测：C18色谱柱，流动相由水和乙腈组成，其中水和乙腈的体积比为25:75，254nm检测。

产量计算：由于添加了大量的L-赖氨酸溶液作为中和剂，导致发酵体积变大，发酵液被稀释，故此计算产量时将发酵体积折算回原始发酵体积，按照公式(1)计算：

产量＝实测产量×(发酵液终体积/发酵液初始体积) (1)

经过检测，HX028-54厌氧发酵96h，每升发酵液生产了0.94mol，207g/L的1,5-戊二胺-丁二酸盐，且葡萄糖与赖氨酸无残留，便于后期的分离纯化，具有较大的经济价值。

本发明实施例1选取《生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用》(专利号：ZL201310198953.9，公开号为CN104178443B)中的丁二酸高产菌HX028为出发菌，该菌丁二酸产量为1.04mol/L，并且几乎不产杂质。使用ZL201110155176.0(CN102286517B)中提到的在染色体上调控基因表达强度的技术，以启动子M1-93对赖氨酸脱羧的基因簇上的两个基因cadB(编码赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白)及cadA(编码赖氨酸脱羧酶)基因进行基因表达上调操作，高效的将赖氨酸转运进胞内并催化成1,5-戊二胺。每一分子赖氨酸脱羧产生一分子1,5-戊二胺，过程中释放出的一分子二氧化碳参与合成一分子的丁二酸，再高效的将1,5-戊二胺转运出细胞与丁二酸等摩尔中和得到1,5-戊二胺-丁二酸盐。且1,5-戊二胺和二氧化碳的快速消耗降低了脱羧产物浓度，提高了菌体HX028的赖氨酸脱羧效率。整个过程无需诱导，接入种子液后，仅需3h的好氧培养后即可转入厌氧条件下进行1,5-戊二胺-丁二酸盐的发酵生产，简化了发酵步骤。发酵时使用无机盐培养基，无需添加抗生素和辅酶磷酸吡哆醛(PLP)，发酵过程中也无需补充CO₂实现了丁二酸与1,5-戊二胺的同步发酵。改造后的菌株HX028-54的1,5-戊二胺-丁二酸盐的产量为0.94mol/L，折合207g/L具有非常大的工业应用潜力，可用来生产尼龙-54的聚合前体，避免了将丁二酸与1,5-戊二胺分别纯化出来再进行混合的繁琐步骤，这样做极大的降低了生产成本，减少了碳损失，也使得工艺流程更加环保。

以上实施例采用了生产丁二酸的重组大肠杆菌HX028作为底盘菌，其它现有技术中生产丁二酸的产量符合工业生产要求的重组大肠杆菌(如参照《生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用》专利号：ZL201310198953.9，公开号为CN104178443B)的方法构建的丁二酸高产菌，参照本发明的方法构建产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，并参照本发明的方法发酵生产1,5-戊二胺-丁二酸盐。

以上实施例采用了启动子M1-93，其它现有技术中能实现染色体上调控基因表达强度的启动子(如《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，公开号：CN102286517B))中其它的在染色体上调控基因表达强度的启动子)也可以替代启动子M1-93，参照本发明的方法构建产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，进而参照本发明的方法发酵生产1,5-戊二胺-丁二酸盐。

实施例3：产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的构建

L-赖氨酸的脱羧效率与1,5-戊二胺的生产速率直接相关。因此，为了进一步的提高尼龙-54盐的产量，需要对cadB和cadA两个基因的表达强度进行更进一步的精确调控，从而进一步的提高尼龙-54盐的生产效率。由于cadB和cadA基因在同一个操纵子下，转录为mRNA后也处于同一条mRNA上。因此，通过对cadB、cadA的转录强度进行精确调控可以有效的调控这两个基因的表达强度。为了找到菌株HX028-54上的cadB和cadA基因的最优表达强度，准备对HX028上cadB和cadA基因的mRNA稳定区序列进一步调控。对mRNA稳定区的调控方法可见《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，公开号：CN102286517B)。

具体到本专利中cadB和cadA基因的调控，方法如下：

1、cadB、cadA表达强度调控的同源重组片段的扩增

以大肠埃希氏菌信使RNA稳定区文库1(M-Lib1)中的重组菌株M1-93基因组为模板，以8739cadBA*kana frt up和8739cadBA-mRSL m1-93 down为引物，进行PCR扩增。扩增程序为：先98℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；72℃延伸10分钟；PCR反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。

引物序列为：

8739 cadBA*kana frtup：

8739 cadBA-mRSL down：

5’-GCAACAACACCGGTACAGGCAAATAGCCCGATCTTCTTGGCAGAACTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGC-3’，其中，N为A、T、C或G。

将扩增得到的DNA片段命名为cadBA-mRSL，其序列为将序列表中序列1的第1480-1567位替换为5’-TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3’，序列1的其它核苷酸保持不变得到的序列。该cadBA-mRSL中第1-50位为一步法同源重组上游同源臂：cadB基因天然启动子上游50位，第51-1479位是FRT-卡那霉素抗性基因-FRT序列，第1480-1567位是启动子，第1568-1617位是一步法同源重组下游同源臂：cadB基因上游50位。

2、构建cadB、cadA的启动子文库

通过Red同源重组构建丁二酸高产菌HX028上染色体上的CadBA基因簇的启动子文库，具体步骤如下：

将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至HX028，得到带有pKD46的HX028的感受态细胞。然后将步骤1得到的DNA片段cadBA-mRSL电转至带有pKD46的HX028感受态细胞，去除pKD46质粒，得到CadBA基因簇的启动子文库。

电转条件为：将50μL上述感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段cadBA-mRSL，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200转，30℃孵育2小时。取所得菌液100uL涂在含有卡那霉素的LB平板上，39℃过夜培养得到去除pKD46质粒的CadBA基因簇的启动子文库。启动子文库含有CadBA基因簇，为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT——启动子文库——cadB基因——cadA基因。所述CadBA基因簇的启动子文库为将序列表中的序列2的第1430-1517位替换为5’-TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3’，序列2的其它核苷酸保持不变得到的序列。CadBA基因簇序列中：第1-1429位为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT序列，第1430-1517位为启动子，第1518-2852位为cadB基因，第2932-5079位为cadA基因。

3、CadBA基因簇启动子文库的筛选

从文库中随机挑取10个菌株，命名为HX028-54-A、HX028-54-B、HX028-54-C、HX028-54-D、HX028-54-E、HX028-54-F、HX028-54-G、HX028-54-H、HX028-54-I、HX028-54-J。

由于L-赖氨酸脱羧效率过低时，L-赖氨酸可能无法完全转化为1,5-戊二胺，但由于L-赖氨酸也有中和效果，丁二酸的产量可能不受影响，而在启动子文库中L-赖氨酸的脱羧效率会高低不同，因此，在文库筛选的过程中主要对1,5-戊二胺的产量进行发酵测定。

对这10株菌的L-赖氨酸脱羧酶酶活和1,5-戊二胺发酵产量进行测定，并设置HX028-54作为对照，结果见表1。

表1 10株菌的L-赖氨酸脱羧酶酶活和1,5-戊二胺发酵产量

菌株	赖氨酸脱羧酶酶活(U/mg)	1,5-戊二胺产量(mol)
			HX028-54	1.2	0.94
HX028-54-A	0.89	0.84
			HX028-54-B	0.13	0.12
HX028-54-C	0.61	0.88
			HX028-54-D	1.31	0.97
HX028-54-E	0.65	0.90
			HX028-54-F	0.16	0.23
HX028-54-G	0.31	0.34
			HX028-54-H	0.21	0.33
HX028-54-I	0.22	0.19
			HX028-54-J	0.43	0.55

通过酶活及产量测试，我们发现菌株HX028-54-D的1,5-戊二胺产量要略高于HX028-54的发酵产量，并且，经过进一步检测，发酵液中并无L-赖氨酸剩余，适合于尼龙-54盐的生产。经过测序，HX028-54-D的启动子序列为：

5’-TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCCTAGCCGTAAATTATAGGTTTAAACCAGGAAACAGCT-3’(序列表中序列5第1-88位)，命名为mRSL-D。

通过对信使RNA稳定区的调控，我们获得了更适合于细菌生长和尼龙-54盐生产效率的菌株HX028-54-D，尼龙-54盐的生产效率有了进一步的提高，进一步的降低了生产成本，减少了碳损失，也使得工艺流程更加环保。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<130> GNCSY200509

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaactccgg gttgatttat gctcggaaat atttgttgtt gagtttttgt gtgtaggctg 60

gagctgcttc aagatcccct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 120

gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 180

ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 240

tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 300

gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 360

cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 420

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 480

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 540

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 600

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 660

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 720

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 780

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 840

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 900

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 960

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1020

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1080

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1140

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1200

tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 1260

acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 1320

ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 1380

gagttcttcg cccaccccag cttcaaaagc gctctgaagt tcctatactt tctagagaat 1440

aggaacttcg gaataggaac taaggaggat attcatatgt tatctctggc ggtgttgaca 1500

agagataaca acgttgatat aattgagccc gtattgttag catgtacgtt taaaccagga 1560

aacagctatg agttctgcca agaagatcgg gctatttgcc tgtaccggtg ttgttgc 1617

<210> 2

<211> 5079

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgtaggctg gagctgcttc aagatcccct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg 60

gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga 120

tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg 180

tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg 240

aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 300

ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga 360

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 420

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 480

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 540

ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 600

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 660

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ttgttgccgg taatatgatg gggagcggta ttgcattatt acctgcgaac ctagcaagta 1620

tcggtggtat tgctatctgg ggttggatta tctctattat tggtgcaatg tcgctggcgt 1680

atgtatatgc ccgactggca acaaaaaacc cgcaacaagg tggcccaatt gcttatgccg 1740

gagaaatttc ccctgcattt ggttttcaga caggtgttct ttattaccat gctaactgga 1800

ttggtaacct ggcgattggt attaccgctg tatcttatct ttccaccttc ttcccagtat 1860

taaatgatcc tgttccggcg ggtatcgcct gtattgctat cgtctgggta tttacctttg 1920

taaatatgct cggcggtact tgggtaagcc gtttaaccac tattggtctg gtgctggttc 1980

ttattcctgt ggtgatgact gctattgttg gctggcattg gtttgatgcg gcaacttatg 2040

cagctaactg gaatactgcg gataccactg atggtcatgc gatcattaaa agtattctgc 2100

tctgcctgtg ggccttcgtg ggtgttgaat ccgcagctgt aagtactggt atggttaaaa 2160

acccgaaacg taccgttccg ctggcaacca tgctgggtac tggtttagca ggtattgttt 2220

acatcgctgc gactcaggtg ctttccggta tgtatccgtc ttctgtaatg gcggcttccg 2280

gtgctccgtt tgcaatcagt gcttcaacta tcctcggtaa ctgggctgcg ccgctggttt 2340

ctgcattcac cgcctttgcg tgcctgactt ctctgggctc ctggatgatg ttggtaggcc 2400

aggcaggtgt acgtgccgct aacgacggta acttcccgaa agtttatggt gaagtcgaca 2460

gcaacggtat tccgaaaaaa ggtctgctgc tggctgcagt gaaaatgact gccctgatga 2520

tccttatcac tctgatgaac tctgccggtg gtaaagcatc tgacctgttc ggtgaactga 2580

ccggtatcgc agtactgctg actatgctgc cgtatttcta ctcttgcgtt gacctgattc 2640

gttttgaagg cgttaacatc cgcaactttg tcagcctgat ctgctctgta ctgggttgcg 2700

tgttctgctt catcgcgctg atgggcgcaa gctccttcga gctggcaggt accttcatcg 2760

tcagcctgat tatcctgatg ttctacgctc gcaaaatgca cgagcgccag agccactcaa 2820

tggataacca caccgcgtct aacgcacatt aattaaaagt attttccgag gctcctcctt 2880

tcattttgtc ccatgtgttg ggaggggcct tttttacctg gagatatgac tatgaacgtt 2940

attgcaatat tgaatcacat gggggtttat tttaaagaag aacccatccg tgaacttcat 3000

cgcgcgcttg aacgtctgaa cttccagatt gtttacccga acgaccgtga cgacttatta 3060

aaactgatcg aaaacaatgc gcgtctgtgc ggcgttattt ttgactggga taaatataat 3120

ctcgagctgt gcgaagaaat tagcaaaatg aacgagaacc tgccgttgta cgcgttcgct 3180

aatacgtatt ccactctcga tgtaagcctg aatgacctgc gtttacagat tagcttcttt 3240

gaatatgcgc tgggtgctgc tgaagatatt gctaataaga tcaagcagac cactgacgaa 3300

tatatcaaca ctattctgcc tccgctgact aaagcactgt ttaaatatgt tcgtgaaggt 3360

aaatatactt tctgtactcc tggtcacatg ggcggtactg cattccagaa aagcccggta 3420

ggtagcctgt tctatgattt ctttggtccg aacaccatga aatctgatat ttccatttca 3480

gtatctgaac tgggttctct gctggatcac agtggtccac acaaagaagc agaacagtat 3540

atcgctcgcg tctttaacgc agaccgcagc tacatggtga ccaacggtac ttccactgcg 3600

aacaaaattg ttggtatgta ctctgctcca gcaggcagca ccattctgat tgaccgtaac 3660

tgccacaaat cgctgaccca cctgatgatg atgagcgatg ttacgccaat ctatttccgc 3720

ccgacccgta acgcttacgg tattcttggt ggtatcccac agagtgaatt ccagcacgct 3780

accattgcta agcgcgtgaa agaaacacca aacgcaacct ggccggtaca tgctgtaatt 3840

actaactcta cctatgatgg tctgctgtac aacaccgact tcatcaagaa aacactggat 3900

gtgaaatcca tccactttga ctccgcgtgg gtaccttaca ccaacttctc accgatttac 3960

gaaggtaaat gcggtatgag cggtggccgt gtagaaggga aagtgattta cgaaacccag 4020

tctactcaca aactgctggc ggcgttctct caggcttcca tgatccacgt taaaggtgac 4080

gtaaacgaag aaacctttaa cgaagcttac atgatgcaca ccaccacttc tccgcactac 4140

ggtatcgtgg cgtccactga aaccgctgcg gcgatgatga aaggcaatgc aggtaagcgt 4200

ctgatcaacg gttccattga acgtgcgatc aaattccgta aagagatcaa acgtctgaga 4260

acggaatctg atggctggtt ctttgatgta tggcagccgg atcatatcga taccactgaa 4320

tgctggccgc tgcgttctga cagcacctgg cacggcttca aaaacatcga taacgagcac 4380

atgtatcttg acccgatcaa agtcaccctg ctgactccgg ggatggaaaa agacggcacc 4440

atgagcgact ttggtattcc ggccagcatc gtggcgaaat acctcgacga acatggcatc 4500

gttgttgaga aaaccggtcc gtataacctg ctgttcctgt tcagcatcgg tatcgataag 4560

accaaagcac tgagcctgct gcgtgctctg actgacttca aacgtgcgtt cgacctgaac 4620

ctgcgtgtga aaaacatgct gccgtctctg tatcgtgaag atcctgaatt ctatgaaaac 4680

atgcgtattc aggaactggc tcagaatatc cacaaactga ttgttcacca caatctgccg 4740

gatctgatgt atcgcgcatt tgaagtgctg ccgacgatgg taatgactcc gtatgctgcg 4800

ttccagaaag agctgcacgg tatgaccgaa gaagtttacc tcgacgaaat ggtcggtcgt 4860

attaacgcca atatgatcct tccgtatccg ccgggagttc ctctggtaat gccgggtgaa 4920

atgatcaccg aagaaagccg tccggttctg gagttcctgc agatgctgtg tgaaatcggc 4980

gctcactatc cgggctttga aaccgatatt cacggtgcat accgtcaggc tgatggccgc 5040

tataccgtta aggtattgaa agaagaaagc aaaaaataa 5079

<210> 3

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Ser Ala Lys Lys Ile Gly Leu Phe Ala Cys Thr Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Gly Asn Met Met Gly Ser Gly Ile Ala Leu Leu Pro Ala Asn Leu

20 25 30

Ala Ser Ile Gly Gly Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ile Ile Ser Ile Ile

35 40 45

Gly Ala Met Ser Leu Ala Tyr Val Tyr Ala Arg Leu Ala Thr Lys Asn

50 55 60

Pro Gln Gln Gly Gly Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Glu Ile Ser Pro Ala

65 70 75 80

Phe Gly Phe Gln Thr Gly Val Leu Tyr Tyr His Ala Asn Trp Ile Gly

85 90 95

Asn Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ala Val Ser Tyr Leu Ser Thr Phe Phe

100 105 110

Pro Val Leu Asn Asp Pro Val Pro Ala Gly Ile Ala Cys Ile Ala Ile

115 120 125

Val Trp Val Phe Thr Phe Val Asn Met Leu Gly Gly Thr Trp Val Ser

130 135 140

Arg Leu Thr Thr Ile Gly Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Val Val Met

145 150 155 160

Thr Ala Ile Val Gly Trp His Trp Phe Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Ala

165 170 175

Asn Trp Asn Thr Ala Asp Thr Thr Asp Gly His Ala Ile Ile Lys Ser

180 185 190

Ile Leu Leu Cys Leu Trp Ala Phe Val Gly Val Glu Ser Ala Ala Val

195 200 205

Ser Thr Gly Met Val Lys Asn Pro Lys Arg Thr Val Pro Leu Ala Thr

210 215 220

Met Leu Gly Thr Gly Leu Ala Gly Ile Val Tyr Ile Ala Ala Thr Gln

225 230 235 240

Val Leu Ser Gly Met Tyr Pro Ser Ser Val Met Ala Ala Ser Gly Ala

245 250 255

Pro Phe Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ile Leu Gly Asn Trp Ala Ala Pro

260 265 270

Leu Val Ser Ala Phe Thr Ala Phe Ala Cys Leu Thr Ser Leu Gly Ser

275 280 285

Trp Met Met Leu Val Gly Gln Ala Gly Val Arg Ala Ala Asn Asp Gly

290 295 300

Asn Phe Pro Lys Val Tyr Gly Glu Val Asp Ser Asn Gly Ile Pro Lys

305 310 315 320

Lys Gly Leu Leu Leu Ala Ala Val Lys Met Thr Ala Leu Met Ile Leu

325 330 335

Ile Thr Leu Met Asn Ser Ala Gly Gly Lys Ala Ser Asp Leu Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Thr Gly Ile Ala Val Leu Leu Thr Met Leu Pro Tyr Phe Tyr

355 360 365

Ser Cys Val Asp Leu Ile Arg Phe Glu Gly Val Asn Ile Arg Asn Phe

370 375 380

Val Ser Leu Ile Cys Ser Val Leu Gly Cys Val Phe Cys Phe Ile Ala

385 390 395 400

Leu Met Gly Ala Ser Ser Phe Glu Leu Ala Gly Thr Phe Ile Val Ser

405 410 415

Leu Ile Ile Leu Met Phe Tyr Ala Arg Lys Met His Glu Arg Gln Ser

420 425 430

His Ser Met Asp Asn His Thr Ala Ser Asn Ala His

435 440

<210> 4

<211> 715

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 5

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cctagccgta 60

aattataggt ttaaaccagg aaacagct 88

Claims

1.一种产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，其特征在于：所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌与作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌相比，1,5-戊二胺的合成能力提高。

2.根据权利要求1所述的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，其特征在于：所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白和赖氨酸脱羧酶的表达量高于作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌；或所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌菌体中的赖氨酸脱羧酶的含量高于作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，其特征在于：所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌按照权利要求4-8中任一所述的方法构建。

4.产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：包括A1或A2：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述A1中提高作为出发菌的产丁二酸重组大肠杆菌中赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因的表达量为以上调控基因表达强度的启动子替换天然启动子，以驱动赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因的表达；所述上调控基因表达强度的启动子的核苷酸序列为序列表中序列1第1480-1567位或序列表中序列5第1-88位。

6.根据权利要求1-3中任一所述的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或权利要求4-5任一项所述的构建方法，其特征在于：所述产丁二酸的重组大肠杆菌为HX028，所述HX028在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.7550。

7.根据权利要求2或3所述的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于：所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白为a1或a2的蛋白质：

a1氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质；

a2将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白活性的由a1衍生的蛋白质；

所述赖氨酸脱羧酶为b1或b2的蛋白质：

b1氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质；

b2将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有赖氨酸脱羧酶活性的由b1衍生的蛋白质；

所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因为c1-c3中的任一种DNA分子：

c1编码链的编码序列是序列表中序列表中序列2的第1518-2852位的cDNA分子或基因组DNA；

c3与c1或c2限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的cDNA分子或基因组DNA；

所述赖氨酸脱羧酶的编码基因为d1-d3中的任一种DNA分子：

8.根据权利要求1-3中任一所述的产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或权利要求4-7中任一所述的构建方法，其特征在于：所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌含有表达盒，所述表达盒含有启动子和所述启动子驱动的所述赖氨酸-1,5-戊二胺逆向转运蛋白的编码基因和赖氨酸脱羧酶的编码基因，所述启动子的核苷酸序列为序列表中序列1第1480-1567位或序列表中序列5第1-88位。

9.一种制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法，其特征在于：包括发酵权利要求1-8中任一项所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，得到1,5-戊二胺-丁二酸盐，所述发酵采用不含抗生素和辅酶磷酸吡哆醛的培养基培养所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌，所述发酵过程中不补充CO₂。

10.应用，所述应用为P1或P2：

P1、权利要求1-8中任一项所述产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌或权利要求4-8中任一所述的构建方法在制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法中的应用；

P2、权利要求8中所述的表达盒在构建产1,5-戊二胺-丁二酸盐的重组大肠杆菌的应用或在制备1,5-戊二胺-丁二酸盐的方法中的应用。