CN108531494A - 一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体的方法 - Google Patents
一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙‑54前体——戊二胺丁二酸盐的方法，它通过在丁二酸生产菌株内过表达赖氨酸脱羧酶，在丁二酸发酵过程中添加赖氨酸进行脱羧反应，两个脱羧产物，戊二胺及CO2分别用于体系pH的调控剂及丁二酸的合成，实现了共发酵生产丁二酸与戊二胺及CO2的固定，且发酵液中的戊二胺丁二酸盐可作为前体进一步用于聚合制备生物基尼龙‑54。与现有的尼龙‑54制备方法相比，本发明工艺简单，成本低，过程安全可控，绿色环保，具有重要的应用价值和良好的经济性。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体的方法。
背景技术
目前，全球尼龙(PA)产量在600万吨左右，并以每年5.4％的速度增长，其中38％用作纤维，46％注塑成型，14％挤压成型，其余深加工制品大约占2％左右，其中中国的消费量占全球尼龙产量的30％。预计到2020年全球尼龙市场将达到437亿美元。然而目前用于生产尼龙的单体仍通过化学加工获得，是化石资源的衍生物。随着化石资源的日渐枯竭以及人们环保意识的加强，以生物质为原料的环境友好型材料开始得到更多重视，因而使用生物基尼龙替代传统尼龙材料是必然趋势。
作为生物基尼龙的代表性产物，尼龙-54具有强度高，渗透性低，耐冲击性和耐油性好，以及一定的耐热性等优点，可用于贮油胶布制品,能显著提高制品的耐燃油渗透能力。尼龙-54是由1,5-戊二胺与丁二酸聚合而成。目前来说，制备流程如下：1)通过发酵、全细胞转化及酶催化等生物转化手段分开合成制备单体丁二酸及戊二胺；2)将上述得到的丁二酸及戊二胺溶液进行混合成盐，得到前体戊二胺丁二酸盐；3)将戊二胺丁二酸盐进行聚合生成尼龙-54。由此可见，目前制备尼龙-54的方法步骤繁琐，且生物合成及分离纯化过程中需要用到大量的酸碱溶液从而产生大量的废料。
考虑到丁二酸及戊二胺自身所带有的酸碱性，可以互相进行调节。因此，在丁二酸的发酵制备过程中，以戊二胺溶液作为碱性调节剂来调控发酵过程中的pH。与此同时，在调控pH的过程中，丁二酸与戊二胺已经形成戊二胺丁二酸盐的形式，并且在发酵液成分中有大量占比，后续可直接作为前体用于尼龙-54的聚合制备。这一方法大大简便了尼龙-54制备的步骤，节约了生产时间，减少了过程废料。然而，此方法仍然存在着一定的缺陷，即戊二胺成本过高，目前戊二胺的市场售价为20000元/kg，然而丁二酸及尼龙制品都为大宗化学品，因此该方法需要严格的成本控制。然而若是在丁二酸生产菌株中过表达赖氨酸脱羧酶的基因，即可使用廉价的赖氨酸(8000元/t)作为碱性调节剂，经过一步脱羧反应后生成戊二胺实现pH的调控，来代替直接添加的昂贵的戊二胺溶液，在原有的优点上进大大减少反应成本。同时，利用脱羧产生的CO2，还可以进行丁二酸的合成，进一步减少了工艺成本，实现了CO2的固定，降低了碳损失，减少了温室气体的排放，使得工艺流程更加环保。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体——戊二胺丁二酸盐的方法，以解决现有技术存在的效果不佳等问题。
一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体，即戊二胺丁二酸盐的方法，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌基因组为模板，以赖氨酸脱羧酶基因cadA两端的引物进行PCR扩增，得到cadA片段；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
将所得的cadA片段克隆至载体pETDuet-1的NdeI和KpnI位点，得到质粒pETDuet-CadA；
以质粒pETDuet-CadA为模板，使用上游引物CadA-4A-F和下游引物CadA-4A-R进行PCR扩增，得到片段CadA-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
以质粒pCDFDuet-1为模板，使用上游引物Fuse-pCDF-F和下游引物Fuse-pCDF-R进行PCR扩增，得到片段CDF-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
以质粒pTrc99a为模板，使用上游引物Trc99a-4A-F和下游引物Trc99a-4A-R进行PCR扩增，得到片段Trc-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
将片段CDF-4A，Trc-4A和CadA-4A进行同源重组拼接，得到重组质粒pCDF-Trc-CadA；
(2)将步骤(1)中所得的重组质粒pCDF-Trc-CadA转移到大肠杆菌AFP111的感受态细胞中，获得过表达赖氨酸脱羧酶的工程菌E.coli SC01；
(3)将步骤(2)中得到的工程菌E.coli SC01接种至有氧发酵培养基中，进行有氧发酵；有氧发酵完成后，向反应体系中通入CO2并开始进行厌氧发酵；厌氧发酵过程中，持续向反应体系中通入赖氨酸水溶液；厌氧发酵结束后，所得发酵液经离心并去除菌体后，取上清液进行醇析处理后，得到基尼龙-54前体，即戊二胺丁二酸盐。
步骤(1)中，可将赖氨酸脱羧酶基因cadA替换为赖氨酸脱羧酶基因ldcC
步骤(1)中，在以赖氨酸脱羧酶基因cadA两端的引物进行PCR扩增时，上游引物为GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG，下游引物为GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC。
其中，所述的载体pETDuet-1购买于苏州金唯智生物科技有限公司，且载体pETDuet-1可被替换为其它适用于大肠杆菌AFP111的表达载体。
步骤(1)中，所述的同源重组拼接的方法为：配制反应体系(20μL)：线性载体片段CDF-4A，1μL；片段Trc-4A，1μL；片段CadA-4A，1μL；5x CE Multis Buffer，4μL；ExnaseMultis：2μL；ddH2O，11μL。将反应体系置于37℃反应30min，反应产物于-20℃保存，备用。其中，配制反应体系的试剂购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。
步骤(3)中，工程菌E.coli SC01按照1～5％的体积比接种至有氧发酵培养基中，优选体积比为1％。
步骤(3)中，所述的有氧发酵培养基的配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L氯化钠，50mg/L卡那霉素，34mg/L绿霉素，80mg/L链霉素，15g/L葡萄糖，pH为6.8，补料培养基为300g/L葡萄糖；或者，所述的有氧发酵培养基的配方为：3g/L柠檬酸，4g/L十二水合磷酸氢二钠，8g/L磷酸二氢钾，8g/L磷酸氢二铵，0.2g/L氯化铵，0.75g/L硫酸铵，1g/L七水合硫酸镁，0.01g/L二水合氯化钙，0.5mg/L七水合硫酸锌，0.25mg/L二水合氯化铜，2.5mg/L一水合硫酸锰，1.75mg/L六水合氯化钴，0.12mg/L硼酸，1.77mg/L硫酸铝，0.5mg/L二水合钼酸钠，16.1mg/L柠檬酸铁，20mg/L硫胺素，2mg/L生物素，50mg/L卡那霉素，34mg/L绿霉素，80mg/L链霉素，15g/L葡萄糖，pH为6.8，补料培养基为300g/L葡萄糖。
步骤(3)中，有氧发酵的时间为30～42h，优选36h；温度为30-37℃。
步骤(3)中，有氧发酵进行到24～36h时，在反应体系中加入诱导剂IPTG至反应体系中诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L，并诱导至有氧发酵结束。其中，优选在有氧发酵进行到30h时，在反应体系中加入诱导剂IPTG。
步骤(3)中，诱导剂IPTG可替换为乳糖。
步骤(3)中，步骤(3)中，CO2的通入速度为0.1～2vvm，通入时长为10～20min；之后停止通入CO2，反应体系中脱羧反应会产生CO2，以维持反应体系内的厌氧环境。
步骤(3)中，所述的赖氨酸溶液为赖氨酸或其盐的水溶液，所述的赖氨酸盐包括赖氨酸盐酸盐和赖氨酸硫酸盐等；其中，溶质赖氨酸的浓度为0.68～2.8mol/L，优选浓度为2.2mol/L；其中，通过通入赖氨酸水溶液来维持反应体系内的pH为6.0～7.0，优选6.4～6.8。
有益效果：
(1)与目前广泛应用的生物基尼龙-54的制备方法相比，本发明无需分开进行丁二酸及戊二胺的合成，只需在有氧发酵的过程中同时进行赖氨酸脱羧酶的诱导表达，共发酵制备戊二胺丁二酸盐，实现了尼龙-54的原位聚合，进一步创新了生产工艺，缩短了工艺步骤，简化了工艺流程。
(2)本发明利用了丁二酸与戊二胺物质本身的酸碱性质进行发酵过程pH的调控，避免了生物合成及分离纯化过程中其他酸碱溶液的使用，大大减少了反应废料，提高了过程效率及工艺收率。
(3)本发明通过在丁二酸生产菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，从而利用赖氨酸代替戊二胺作为碱性调节剂加入到生产体系中。因为赖氨酸脱羧酶活性极高，即使加入一步脱羧反应，也不影响整个工艺的进度，并且可以大大降低生产成本。
(4)本发明通过在丁二酸生产菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，将赖氨酸脱羧反应的另一产物CO2作为供体，在外源不添加CO2的情况下，进行丁二酸的合成，实现了CO2的固定，减少了碳损失及温室气体的排放，使得工艺过程更加的绿色环保，经济可靠。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1重组质粒的构建
以大肠杆菌基因组为模板，以赖氨酸脱羧酶基因cadA基因两端的引物进行PCR扩增；得到的cadA片段克隆至载体pETDuet-1的NdeI和KpnI位点，得到重组质粒pETDuet-CadA。
其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min。
其中，在以赖氨酸脱羧酶基因cadA两端的引物进行PCR扩增时，上游引物为GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG，下游引物为GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC。
实施例2重组质粒的构建
以实施例1中得到的质粒pETDuet-CadA为模板，使用上游引物CadA-4A-F和下游引物CadA-4A-R进行PCR扩增，得到片段CadA-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
以质粒pCDFDuet-1为模板，使用上游引物Fuse-pCDF-F和下游引物Fuse-pCDF-R进行PCR扩增，得到片段CDF-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
以质粒pTrc99a为模板，使用上游引物Trc99a-4A-F和下游引物Trc99a-4A-R进行PCR扩增，得到片段Trc-4A；其中，PCR的条件为：反应体系50μL，具体组份为：基因组模板，1μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；酶，1μL；dNTPs，4μL；5x buffer，10μL；ddH2O，30μL。扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55～57℃退火30s，72℃延伸75s，循环25～30次；72℃延伸10min；
将片段CDF-4A，Trc-4A和CadA-4A进行同源重组拼接，得到重组质粒pCDF-Trc-CadA。
其中，上述各引物的序列如表1所示。
表1
| 引物 | 序列 |
| Trc99a-4A-F | CATGCGAGAGTAGGGAACTGCC |
| Trc99a-4A-R | GGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC |
| Fuse-pCDF-F | CCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC |
| Fuse-pCDF-R | AGGGAGAGCGTCGAGATCC |
| CadA-4A-F | CATATGAACGTTATTGCAATATTG |
| CadA-4A-R | GGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC |
实施例3宿主细胞感受态的制备
利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养E.coli AFP111至OD600＝0.4～0.6，制备成化转感受态。
实施例4重组菌株的构建
将实施例2中经过DNA测序验证的正确质粒pCDF-Trc-CadA，转化到实施例3中得到的丁二酸生产菌株E.coli AFP111的感受态中，构建得到一株携带赖氨酸脱羧酶基因的新菌株E.coli SC01。
实施例5重组菌株E.coli SC01的发酵产丁二酸及戊二胺
将实施例4中得到的工程菌E.coli SC01的冻存管菌株接至LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素、34mg/L绿霉素、80mg/L链霉素)中，37℃，200rpm培养10h后，按1％(v/v)接种量接种至装有3L LB液体培养基(含有50mg/L卡那霉素；34mg/L绿霉素；80mg/L链霉素；15g/L葡萄糖)的7.5L发酵罐中，进行菌株的有氧发酵。
有氧发酵过程中，温度37℃，通空气2vvm，转速400rpm，以25％质量百分比的氨水作为碱性调节剂调控pH值维持在6.8，以300g/L的葡萄糖作为补料培养基调控发酵液糖浓度维持在2g/L已上。有氧发酵30h时，向体系中加入0.5mM IPTG诱导表达赖氨酸脱羧酶。有氧发酵36h后，OD600达到约25时，转入厌氧发酵，温度37℃，补加终浓度30g/L葡萄糖，转速200rpm，通CO2 0.2vvm，通入时长为10min，通入CO2结束后，调节阀门，减小发酵罐出气口。当葡萄糖浓度低于5g/L时，流加300g/L的葡萄糖至最终浓度为30g/L。以300g/L的赖氨酸溶液(pH 7.0)作为碱性调节剂调控pH值维持在6.4，进行厌氧发酵产丁二酸及戊二胺。每隔一段时间取样，液相检测发酵液中丁二酸及戊二胺浓度。厌氧发酵36h时停止发酵，取最终发酵液检测产物浓度。
实施例6
厌氧发酵阶段调控的pH点为6.8，其它同实施例5。
实施例5和6中所得丁二酸戊二胺盐产量记录如表2所示。
| 丁二酸戊二胺盐浓度(mol/L) | |
| 实施例5 | 0.18 |
| 实施例6 | 0.18 |
从上述实施例的结果中可以看出，本发明的制备方法通过在丁二酸生产菌株内过表达赖氨酸脱羧酶，在丁二酸发酵过程中添加赖氨酸进行脱羧反应，成功利用了两个脱羧产物，实现了共发酵生产丁二酸与戊二胺及CO2的固定。另外，发酵液中的戊二胺丁二酸盐可作为前体进一步用于聚合，以制备生物基尼龙-54。因此，本发明方法在简化工艺流程，降低生产成本的同时，也为其他类似聚酰胺类材料的制备提供了一种新的思路，具有重要的应用价值和良好的经济性。
Claims (10)
1.一种利用基因工程菌共发酵制备生物基尼龙-54前体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌基因组为模板，以赖氨酸脱羧酶基因cadA两端的引物进行PCR扩增，所得片段克隆至载体pETDuet-1的NdeI和KpnI位点，得到质粒pETDuet-CadA；以质粒pETDuet-CadA为模板，使用上游引物CadA-4A-F和下游引物CadA-4A-R进行PCR扩增，得到片段CadA-4A；以质粒pCDFDuet-1为模板，使用上游引物Fuse-pCDF-F和下游引物Fuse-pCDF-R进行PCR扩增，得到片段CDF-4A；以质粒pTrc99a为模板，使用上游引物Trc99a-4A-F和下游引物Trc99a-4A-R进行PCR扩增，得到片段Trc-4A；将片段CDF-4A，Trc-4A和CadA-4A进行同源重组拼接，得到重组质粒pCDF-Trc-CadA；
(2)将步骤(1)中所得的重组质粒pCDF-Trc-CadA转移到大肠杆菌AFP111的感受态细胞中，获得过表达赖氨酸脱羧酶的工程菌E.coli SC01；
(3)将步骤(2)中得到的工程菌E.coli SC01接种至有氧发酵培养基中，进行有氧发酵；有氧发酵完成后，向反应体系中通入CO2并开始进行厌氧发酵；厌氧发酵过程中，持续向反应体系中通入赖氨酸水溶液；厌氧发酵结束后，所得发酵液经离心并去除菌体后，取上清液进行醇析处理后，得到生物基尼龙-54前体，即戊二胺丁二酸盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将赖氨酸脱羧酶基因cadA替换为赖氨酸脱羧酶基因ldcC。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在以赖氨酸脱羧酶基因cadA两端的引物进行PCR扩增时，上游引物为GGAATTCCATATGAACGTTATTGCAATATTG，下游引物为GGGGTACCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，工程菌E.coli SC01按照1～5％的体积比接种至有氧发酵培养基中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的有氧发酵培养基的配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，5g/L氯化钠，50mg/L卡那霉素，34mg/L绿霉素，80mg/L链霉素，15g/L葡萄糖，pH为6.8，补料培养基为300g/L葡萄糖；或者，所述的有氧发酵培养基的配方为：3g/L柠檬酸，4g/L十二水合磷酸氢二钠，8g/L磷酸二氢钾，8g/L磷酸氢二铵，0.2g/L氯化铵，0.75g/L硫酸铵，1g/L七水合硫酸镁，0.01g/L二水合氯化钙，0.5mg/L七水合硫酸锌，0.25mg/L二水合氯化铜，2.5mg/L一水合硫酸锰，1.75mg/L六水合氯化钴，0.12mg/L硼酸，1.77mg/L硫酸铝，0.5mg/L二水合钼酸钠，16.1mg/L柠檬酸铁，20mg/L硫胺素，2mg/L生物素，50mg/L卡那霉素，34mg/L绿霉素，80mg/L链霉素，15g/L葡萄糖，pH为6.8，补料培养基为300g/L葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，有氧发酵的时间为30～42h，温度为30～37℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，有氧发酵进行到24～36h时，在反应体系中加入诱导剂IPTG至反应体系中诱导剂IPTG的浓度为0.1～1mmol/L，并诱导至有氧发酵结束。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，CO2的通入速度为0.1～2vvm，通入时长为10～20min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将CO2替换为N2。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的赖氨酸溶液为赖氨酸或其盐的水溶液；其中，溶质赖氨酸的浓度为0.68～2.8mol/L；其中，通过通入赖氨酸水溶液来维持反应体系内的pH为6.0～7.0。
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2018
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