CN103898168B

CN103898168B - 一种安全生产1,3‑丙二醇的方法

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Publication number: CN103898168B
Application number: CN201410018638.8A
Authority: CN
Inventors: 宫衡; 高黎荣; 蒋潇; 付水林
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: CN103898168A

Abstract

本发明公开了更安全地生产1,3‑丙二醇的方法，即：通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中大片段连续出现的病毒基因群VH1或（与）VH2中的基因，从而提高1,3‑丙二醇发酵的安全性。相比现有的转化甘油生产1,3‑丙二醇的方法，本发明的方法的优点是：大片段敲除了克雷伯氏杆菌K.pneumoniae中潜在的致病基因，提高克雷伯氏肺炎杆菌的生物安全性。

Description

一种安全生产1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：敲除克雷伯氏肺炎杆菌中引起潜在致病性的大片段基因，从而提高1,3-丙二醇发酵的安全性，同时对生产性能没有影响。

背景技术

1, 3-丙二醇（1, 3-porpanediol，简称1, 3-PD）是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋（PTT）和聚氨醋的单体。PTT已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。现有的1, 3-PD生产法有化学合成法和生物合成法。目前国际上1, 3-PD的合成主要是通过化学法进行的。但是相对于化学合成法而言，生物法合成1, 3-PD的条件更温和、操作简单、副产物少、更绿色环保。随着1, 3-PD需求量的日趋扩大，对于1, 3-PD的生物合成法的研究已越来越受到国内外研究人员的重视。

生物合成法的主要路线是在生物催化剂的作用下将甘油转化为1, 3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1, 3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏柠檬菌（Citrobacter freundii）、丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridia butyricum）等等。其中克雷伯氏杆菌因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。

如：1、刘德华等，一种发酵生产1, 3-PD的高产工艺（申请号：CN200710063347.0），该方法以中间代谢产物3-羟基丙醛为控制指标来促进微生物合成1, 3-PD；2、杜铭等，氧化还原电势调控厌氧发酵生产1, 3-PD方法(申请号：CN200410048122.8)，该方法通过调控发酵体系的氧化还原电势来促进微生物合成1, 3-PD。3、宫衡等，一种转化甘油生产1, 3-PD的方法（专利号：ZL20071008）,该方法通过控制渗透压来促进微生物合成1, 3-PD。

上述方法无一例外的都利用克雷伯氏肺炎杆菌（K. pneumoniae）。但是应用克雷伯氏肺炎杆菌必须考虑的问题就是该菌的生物安全性。克雷伯氏肺炎杆菌是一种条件致病菌，是引起人体细菌感染的常见微生物。克雷伯氏肺炎杆菌中一些菌株是高度危险的，例如最近Shon报道的一株克雷伯氏肺炎杆菌，能感染体质好的年青人并危及生命（Virulence2013(4),107-118）。目前，有关克雷伯氏肺炎杆菌致病性的研究有不少，一些致病基因，如：magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fim, uge, wabG, ureA也陆续在克雷伯氏菌中发现，其中magA被认为是肺炎克雷伯菌中强力的致病基因。因而目前减少克雷伯氏菌致病性的方法主要是也是针对上述这些单个的基因 (Appl Microbiol Biot 2013(97),1997)。

但是研究证据表明，上述基因在克雷伯氏肺炎杆菌中出现的频率与其致病性关联不大，以上述基因来区分各种克雷伯氏肺炎杆菌致病性的强弱是不够的（EnvironMicrobiol,2004(6),584-590）。因此，仅仅敲除上述单个基因显然不能从根本上解除人们应用克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-PD时，对其致病性的担忧。

发明内容

本申请的发明人在研究中发现，克雷伯氏肺炎杆菌中，一些潜在的致病基因是连续出现，并在基因组上形成比较大的片段，其中VH1、VH2片段普遍存在在克雷伯氏肺炎杆菌中。分析VH1、VH2发现这些片段中的基因都是潜在能够引起致病的基因。这些连续、呈大片段出现的致病基因群，目前还未见有研究报道。

本发明目的在于提供一种更安全的利用克雷伯氏菌生产1,3-PD的方法，即：将克雷伯氏肺炎杆菌中VH1、VH2大片段基因群敲除，从而更好地降低克雷伯氏肺炎杆菌的潜在致病性。

本发明一种更安全生产1,3-PD的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1, 3-PD，该方法敲除基因中连续的大片段致病基因群VH1、VH2以提高克雷伯氏肺炎杆菌的安全性，从而更安全地发酵生产1,3-PD。

根据本发明，所述VH1、VH2大片段病毒基因群具体如下：

1）VH1：包含连续的潜在致病基因fepA、fes、ychP、entF、fepC、fepG、fepD、entS、fepB、entC、entE、entB、entA，分别对应SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 13。

2）VH2：包含连续的潜在致病基因 fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH，分别对应SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 22。

3）SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22 数据库来源：fepA、fes、fepC、fepG、fepD、entS、entC、entE、entB、entA、fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH的基因序列来源于大肠杆菌；ychP、entF、 fepB基因序列来源于克雷伯氏肺炎杆菌。

根据本发明，用于转化甘油生成1, 3-PD的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌（K. pneumoniae）。相比现有的转化甘油生产1, 3-PD的方法，本发明的方法的优点是：大片段敲除了克雷伯氏肺炎杆菌（K. pneumoniae）中潜在的致病基因群VH1或（与）VH2的部分或全部，提高了1,3-PD生产的安全性能。

附图说明

图1：VH1大片段中致病基因的排列与方向

图2：VH2大片段中致病基因的排列与方向

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

实施例1、VH1与VH2所包含的基因是潜在的致病基因

将VH1与VH2中基因序列与现有的病毒基因库比对，病毒基因库可至中国医学科学院病原生物学研究所，卫生部病源系统生物学重点实验室的收集整理的病毒基因数据库中查询（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm）。查询结果可见，大片段VH1、VH2中所包含的基因，除了fes、ychP、entS外，其它基因均已经被已有的研究证实是致病基因，最初发现于大肠杆菌。

实施例2、在已报道的克雷伯氏肺炎杆菌基因组中含有VH1,VH2大片段且高度同源

表1：VH1片段在已报道克雷伯氏基因组中的分析

将SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22的基因数据转换成蛋白数据并与NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已报道的克雷伯氏基因组数据同源比对，具体比对的基因组为：NC_017540、NC_011283、NC_016845、NC_018522、NC_012731、NC_009648。

表2：VH2片段在已报道克雷伯氏基因组中的分析

比对后在各基因组上对SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22中的基因定位。具体基因数据查找、比对、基因定位采用分子生物学中的通用方法，再此不再叙述。比对定位结果见表1与表2。从表1与表2中可以看出各克雷伯氏肺炎杆菌的基因组中含有VH1与VH2大片段区域，VH1与VH2大片段区域中各基因组所包含的基因是相同的，且与SEQ ID NO 1至SEQ ID NO22中对应的致病基因高度同源（蛋白序列相识度在65％-100％之间）。各致病基因在各克雷伯氏肺炎杆菌组VH1与VH2上不但位置相同，而且方向也一样。

实施例3、VH1与VH2基因片段在产1,3-PD克雷伯氏肺炎杆菌中中也存在

产1,3-PD菌株采用ATCC49790。VH1的上下游引物分别来源于基因fepA（SEQ ID NO1）的下游与基因entA（SEQ ID NO 13）的下游。VH2的上下游引物分别来源于基因fimB（SEQID NO 14）的上游与基因fimH（SEQ ID NO 22）的下游。

将ATCC49790于LB培养基（0.5% 酵母提取物，1% 胰蛋白胨，1% NaCl，pH 7.0）中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的ATCC49790基因组为模板，用设计好的VH1与VH2上下游引物进行PCR反应，PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析。

分析结果如表3所示。从表3中可以看出，ATCC49790的基因组中包含VH1（17678bp）和VH2（8761bp）片段，其片段上所含的基因与VH1,VH2数据库中的病毒基因（SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22）高度同源。

表3：ATCC49790上VH1、VH2分析结果

实施例4、敲除VH1、VH2的克雷伯氏菌在5L发酵罐中发酵生产1,3-PD

斜面培养基的配方如下：

K₂HPO₄3H₂O 7 g/L，（NH₄）₂SO₄ 1 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1 g/L，酵母膏7 g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0，琼脂2 g/L。

种子培养基的配方如下：

K₂HPO₄3H₂O 7 g/L，（NH₄）₂SO₄ 1 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1 g/L，酵母膏7 g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0后加入NaCl调节渗透压。

发酵罐培养基的配方如下：

KCl 0.75 g/L，NaH₂PO₄ 1.38 g/L，（NH₄）₂SO₄ 5.35 g/L，Na₂SO₄ 0.28 g/L，MgSO₄6H₂O 0.26 g/L，柠檬酸 0.42 g/L，酵母粉 2 g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0。

微量元素的配方如下：

ZnCl₂ 34.2 g/L，FeCl₃ 6H₂O 2.7g/L，MnCl₂ 4H₂O 10 g/L，CuCl₂ 2H₂O 0.85 g/L，CoCl₂ 2H₂O 23.8 g/L，H₃BO₃ 0.31 g/L，Na₂MoO₄ 0.25 g/L

实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：

取1.0mL发酵液稀释7~10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓（即不同620nm吸光值）的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD ₆₂₀的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD ₆₂₀值由标准曲线回归关系式计算得出。

1, 3-PD的生成速率定义为：每小时每升发酵液生成的1, 3-PD克数单位为g/L·h。

按照实施例3的方法获得 K. pneumoniae ATCC49790中VH1,VH2的基因片段，用同源重组办法，敲除ATCC49790基因组的VH1 （17678 bp)或（与）VH2 (8761 bp)，获得的重组菌分别为ATCC49790△VH1、ATCC49790△VH2、ATCC49790△VH1VH2。

发酵实验如下：将菌株（ATCC49790△VH1 、ATCC49790△VH2、 ATCC49790△VH1VH2）接入250ml的摇瓶（装液量50ml）进行种子培养20小时，后接入5L发酵罐中（发酵液装液量2L），按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

初始甘油浓度60g/L，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，发酵30小时结束。

对照实验为研究出发菌种K. pneumoniae ATCC49790，发酵结果表4所示：

表4：各菌株发酵结果

菌株	1,3-PD产量（g/L)	1,3-PD生产强度(g/L.h)
			K. pneumoniae ATCC49790	62	2.1
K. pneumoniae ATCC49790△VH1	63	2.1
			K. pneumoniae ATCC49790△VH2	61	2.0
K. pneumoniae ATCC49790△VH1VH2	62	2.1

从表2中可以看出，同出发菌株K. pneumoniae ATCC49790相比，敲除病毒基因群VH1、VH2的菌株，在更安全性的同时，1,3-PD的产量和生产效率均没有降低。

Claims

1.一种利用克雷伯氏肺炎杆菌安全转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中大片段连续出现的致病基因群VH1或/和VH2，提高1,3-丙二醇发酵的安全；所述的致病基因群VH1含有连续的潜在致病基因：fepA、fes、ychP、entF、fepC、fepG、fepD、entS、fepB、entC、entE、entB、entA；所述的致病基因群VH2含有连续的潜在致病基因： fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH。