CN105154476B - 一种通过降低副产物乙酸高效生产1，3－丙二醇的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种将克雷伯氏肺炎杆菌K lebsiella pneum on iae中的两个基因poxB和pta同时敲除，更高效转化甘油生产1，3－丙二醇的方法。本发明的方法的优点是：这两个基因敲除后减少了副产物乙酸的合成，大幅度提高了克雷伯氏肺炎杆菌(K lebsiella pneum on iae)转化甘油生成1，3－丙二醇的生产效率。

Description

一种通过降低副产物乙酸高效生产1，3－丙二醇的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：同时敲除克雷伯氏肺炎杆菌中与乙酸合成相关的两个基因，从而提高1，3－丙二醇发酵的生产水平。
背景技术
1，3－丙二醇(1，3－porpanediol，简称1，3－PD)是一种重要的化工原料，其最重要的用途是作为单体合成新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋 (PTT)。研究表明PTT一种性能特别优异的聚酯材料，因而1，3－PD的工业价值日益引起各国的重视。现在的研究表明：1，3－PD的生产方法中生物合法法因条件温和、操作简单、副产物少、绿色环保，比化学合成法更有工业应用的优势。特别是随着生物柴油工业的发展，产生了大量廉价的工业甘油原料，利用廉价的工业甘油原料生物合成法生产1，3－PD成为现今 1，3－PD生产研究中的一个热点。
自然界中能将甘油转化为1，3－PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsielapneum oniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundii)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)等等。其中克雷伯氏肺炎杆菌因生物转化效率高、生物转化过程操作方便，研究应用最多。但是克雷伯氏肺炎杆菌利用甘油生产1,3-PD的同时还会产生大量的副产物，主要有乳酸、2,3-丁二醇和乙酸等，其中副产物乙酸的毒性最强。
本发明公开了一种通过降低克雷伯氏肺炎杆菌的乙酸合成，提高产物 1,3-PD生物合成的方法。该方法通过同时敲除克雷伯氏菌中与乙酸合成关联的两个基因poxB和pta，以降低克雷伯氏菌中副产物乙酸的合成，提高产物1,3-PD的产量。poxB基因负责编码丙酮酸氧化酶，在生物体内催化丙酮酸合成乙酸；pta基因负责编码磷酸转乙酰酶，该酶是催化乙酰辅酶A合成乙酸中的关键酶，目前有关这两个基因在克雷伯氏菌中的具体作用还没有详细研究，通过同时敲除这两个基因提高1,3-PD的产量的研究更是没有报道。经过检索国家知识产权局(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织 (www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局 (www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。
发明内容
本申请的发明人在研究中发现，同时敲除克雷伯氏菌中两个基因poxB、和pta可以显著降至乙酸的合成，并能显著提高1,3-PD的生物合成。所以，本发明目的在于提供一种更高效生产1，3－PD的方法，即：将克雷伯氏肺炎杆菌中两个基因poxB和pta同时敲除，高效地生产1，3－PD。与现有的技术相比，利用本发明生产1，3－PD时，产生更少的副产物乙酸，极大缓降了后期乙酸积累对发酵的影响，提高了1，3－PD的生产速度，同时因更多的甘油转变为1，3－PD也大大提高了1，3－PD生物合成的转化率。
本发明是通过以下技术方案实现的：将克雷伯氏菌中的两个基因poxB 和pta同时敲除，高效生产1，3－PD。本发明包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3－PD。
根据本发明，所述poxB和pta两个基因具体如下：
1)poxB：负责编码丙酮酸氧化酶(EC 1.2.5.1)，该酶又称丙酮酸脱氢酶；
2)pta：负责编码磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)。
根据本发明，用于转化甘油生成1，3－PD的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)。相比现有的转化甘油生产1，3－PD的方法，本发明的方法的优点是：副产物少，产物合成速度快、转化率高。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
实例中，斜面培养基的配方如下：
K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0，琼脂2g/L。
种子培养基的配方如下：
K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0后加入NaCl调节渗透压。
发酵罐培养基的配方如下：
KCl 0.75g/L，NaH2PO4 1.38g/L，(NH4)2SO4 5.35g/L，Na2SO4 0.28 g/L，MgSO46H2O0.26g/L，柠檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，调整pH7.0。
微量元素的配方如下：
ZnCl2 34.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO3 0.31g/L，Na2MoO4 0.25g/L
实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：
取1.0mL发酵液稀释7￣10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD620的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD620值由标准曲线回归关系式计算得出。发酵液中1，3－PD的测定采用气相色谱法；乙酸的测定采用液相色谱法。产1，3－PD的菌株采用克雷伯氏肺炎杆菌CCTCC M2014574，以下简称M2014574。
实施例1、单独敲除poxB基因严重降低菌体生长，不利于1，3－PD的合成
将M2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％ NaCl，pH7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578的基因组序列 (LOCUS：NC＿009648)上的poxB基因(locus＿tag：KPN＿00904)设计引物， PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH78578上poxB基因的相似度为100％。用同源重组办法，敲除 M2014574基因组的poxB基因(1278bp)，获得的重组菌为M2014574△poxB。
将M2014574与M2014574△pta分别接种于250ml的三角瓶中37℃厌氧与好氧培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。好氧培养时三角瓶用8层纱布封口；厌氧培养条件时接种前瓶里的空气用氮气置换后三角瓶用橡皮塞密闭封口。
培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、1，3－PD以及乙酸的浓度，结果如表1所示。从表1中可以看出，敲除poxB后显著降低了菌体的生长，也导致1，3－PD产量的下降。而且单独敲除poxB基因厌氧培养时单位菌体乙酸合成的速度也没有降低，相反在好氧培养时乙酸合成的速度缺大大增加了。
表1：敲除poxB菌株厌氧与好氧摇瓶培养的结果
实施例2、单独敲除pta基因对菌体生长和1，3－PD的合成几乎没有影响
将M2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％ NaCl，pH7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH78578的基因组序列 (LOCUS：NC＿009648)上的pta基因(locus＿tag：KPN＿02688)设计引物， PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH78578上poxB基因的相似度为100％。用同源重组办法，敲除 M2014574基因组的poxB基因(2133bp)，获得的重组菌为M2014574△pta。
将M2014574与M2014574△pta分别接种于250ml的三角瓶中37℃厌氧与好氧培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。好氧培养时三角瓶用8层纱布封口；厌氧培养条件时接种前瓶里的空气用氮气置换后三角瓶用橡皮塞密闭封口。
培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、1，3－PD以及乙酸的浓度，结果如表2所示。从表2中可以看出，敲除pta后菌体生长和1，3－PD的合成几乎没有影响。
表2：敲除pta菌株厌氧与好氧摇瓶培养的结果
实施例3、同时敲除poxB和pta基因对菌体没有很大的抑制，但是1，3－PD 的合成提高了
按实例1和2的方法同时敲除克雷伯氏肺炎杆菌M2014574，获得的重组菌为M2014574△poxB－pta。
将M2014574与M2014574△poxB－pta分别接种于250ml的三角瓶中37℃厌氧与好氧培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。好氧培养时三角瓶用8层纱布封口；厌氧培养条件时接种前瓶里的空气用氮气置换后三角瓶用橡皮塞密闭封口。
培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、1，3－PD以及乙酸的浓度，结果如表3所示。从表2中可以看出，同时敲除poxB和pta基因后，M2014574 △poxB－pta的菌体生长并没有和单独敲除poxB基因的一样生长受抑制，其菌体生长几乎和出发菌株M2014574一样。比较发现在厌氧条件下M2014574 △poxB－pta的1，3－PD合成提高了，而且乙酸的合成也减少了。
虽然有关poxB和pta是乙酸合成的相关基因在大肠杆菌中有报道，但是一般研究表明pta参与的途径是乙酸合成的关键途径，poxB一般被认为是一条可有可无的补充途径。本发明的研究表明：1)在克雷伯氏肺炎杆菌中poxB能起到更关键的作用，敲除poxB后菌体的生长显著的受到抑制，但是单独敲除poxB并不能降低乙酸的合成；2)同时敲除poxB和pta和菌体的生长特性得到恢复，并且厌氧条件下乙酸的合成降低，而且1，3－PD的产量提高。上述结果都是本发明的新发现和创新之处。
表3：同时敲除poxB和pta菌株厌氧与好氧摇瓶培养的结果
实施例4、同时敲除poxB和pta基因对在5L反应器上1，3－PD的生产水平大大提高了
5L反应器发酵实验如下：将菌株(M2014574△poxB－pta、M2014574) 接入250ml的摇瓶(装液量50ml)进行种子培养20小时，后接入5L发酵罐中(发酵液装液量2L)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。
初始甘油浓度60g/L，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，发酵30小时结束。
发酵结果表4所示。从表4中可以看出，在5L反应器上，同出发菌株 M2014574相比，同时敲除poxB和pta基因的菌株M2014574△poxB－pta 1，3－PD的产量和和转化率大幅度提高，且副产物乙酸的合成显著降低。
表4：两菌株发酵结果

Claims (2)

1.一种更高效转化甘油生产1，3－丙二醇的方法，其特征在于，将克雷伯氏菌中的两个基因poxB和pta同时敲除，高效生产1，3－丙二醇；
所述的poxB和pta基因具体为：poxB基因负责编码丙酮酸氧化酶，该酶又称丙酮酸脱氢酶；pta基因负责编码磷酸转乙酰酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于转化甘油生成1，3－丙二醇的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsielapneumoniae)。
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