CN104968793A - 使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n-丁醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于生产丁醇的方法和系统。具体而言，本发明的方法和系统使用互养共培养物用于从合成气生产丁醇。

Description

使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n-丁醇的方法
发明领域
本发明提供了用于使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n-丁醇和其他含有C4的产物的方法和系统。
发明背景
丁醇是重要的工业化学物质，具有广泛应用。其可以用作发动机燃料，特别地与其可以全部比例添加的汽油组合。异丁醇也可以用作甲基叔丁基醚(MTBE)的前体。当前n-丁醇的世界生产是350万吨/年(77亿lb/年)。此外，正在开发和证明将醇转化为适于飞机燃料使用的长链线性烃，这可以进一步增加对n-丁醇的需求(The Naval Air Warfare Center-WeaponsDivision,(2012)Cobalt和Abermarle)。对于许多国家，已经在酿酒酵母的帮助下将单糖发酵为丁醇。将碳水化合物发酵为丙酮、丁醇和乙醇(ABE)是已知的并且从约1915至1955在世界范围内商业实践(Beesch,S.C.(1953)A Microbiological process Report-Applied Microbiology,1,85-95)。随着石油化学方法的来临和低成本石化原料，基于碳水化合物的方法变得没有吸引力并且终止。
ABE方法的进一步开发和现代化由若干个组织承担。在1980年中期，Corn Products Corporation开发了非孢子性生殖的菌株和多步发酵方法，其相当地提高了方法的经济学(Marlatt,J.A.和R.Datta,(1986)Acetone-Butanol Fermentation Process,Biotechnology Progress(1986)2,1.23-28)。当前，两家公司，Gevo和Butamax参与使用重组微生物转化若干乙醇工厂以生产异丁醇用于新化学物质使用。参见美国专利号8,017,375和美国专利号7,851,188。在全部这些开发中，主要的原料是碳水化合物，主要是来自玉米的淀粉。
碳水化合物原料的限制是公知的并且一些是根本性的。来自农业作物的淀粉和糖遇到食物vs.能源/化学生产的竞争问题以及原料的成本和其可用性。对于木质纤维素原料诸如木质生物质，草等，来自预处理和水解过程的成本和产率是非常限制性的。例如，典型的木质生物质含有50％纤维素而剩余由半纤维素、木质素和其他级分构成。可发酵级份的化学能量含量通常少于原料的50％，对产物产率有根本的限制。
已经进行尝试以提高将多种糖发酵为乙酸盐和丁酸盐的细菌的醇产率。本领域已经寻求采用重组技术以转化细菌诸如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(Green等人(1996)Genetic manipulation of acid formationpathways,Green等人Microbiology),142,2079-2086)和酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)(X.Liu等人(2006)Construction and Characterization of ackDeleted Mutant of Clostridium tyrobutyricum,Biotechnology Pref.,22,1265-1275)。然而，此类技术仅仅导致以低频率发生的转化。
若干种微生物能够使用一碳化合物作为碳源并且一些甚至作为能源。合成气是提供一碳化合物诸如CO和CO2和以及氢气的常见底物。合成气可以通过整个生物质源的气化生产而无需释放某些级份。合成气也可以从其他原料经由：(i)煤，(ii)市政废品，(iii)塑料废品，(iv)石油焦和(v)来自精炼厂或来自纸工业的液体残余物(黑液)的气化生产。合成气也可以从天然气经由蒸汽重整或自热重整(部分氧化)生产。
当合成气源是生物质时，气化技术将原料的全部组分主要转化为CO、H2、CO2和一些残余CH4的混合物，通常具有75至80％冷气效率，即原料的化学能源的75至80％可用于进一步的化学或生物学转化至靶产物。剩余的能量可作为热获得，所述热可用于生成蒸汽以提供一些或全部所需的过程能量。此外，可以气化多种原料，可再生的诸如木质生物质、农业残余物、市政废品等或非可再生的诸如天然气，以生产这些主要的组分。使用蒸汽、氧气、空气或其组合可以以以多种技术将天然气经济地重整为合成气。此合成气具有约85％的非常好的冷气效率以使用多种靶组合物生产CO、H2和CO2。
因此，合成气是非常经济的原料，其可衍生自可再生的和非可再生的多种原材料。因此，以高产率和浓度将合成气转化为丁醇将导致此重要化学物质的经济生产。
厌氧细菌从主要合成气组分CO和H2/CO2生产n-丁醇的能力在1990/1991由来自Michigan Biotechnology Institute的队伍发现并报告，(A.Grethlein等人(1991)Evidence of n-Butanol Production from CarbonMonoxide,Journal of Fermentation and Bioengineering,72,1,58-60)；(Grethlien等人(1990)Continuous Production of Mixed Alcohols and Acidsfrom Carbon Monoxide,Journal of Fermentation and Bioengineering,24-25(1):875-885)。晚些，其他组织诸如University of Oklahoma和Oklahoma State University也分离了新的生物即ClostridiumCarboxydivorans，其也显示了此类转化和n-丁醇生产J.S.Liou等人(2005)Clostridium carboxidivorans sp.nov.a solvent producing clostridiumInternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology55(5):2085-2091)。在单个培养发酵中使用这些和其他生物的随后的发酵开发尚未非常成功-达到的n-丁醇浓度在约3g/升的范围并且产率范围为从理论的20至45％(％电子至产物)(参见先前的三份参考和Guilaume Bruant等人(2010)Genomic Analysis of Carbon Monoxide Utilization and ButanolProduction by Clostridium carboxidivorans,PLoS One,5(9))。对于商业成功的方法，n-丁醇浓度应当在8-10g/升的范围并且产率应当在80％范围中，否则加工和分离成本将变得无吸引力。
为了克服这些障碍已经提出了使用一种或多种生物诸如甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)和丙酮丁醇梭菌的多步发酵(Worden等人(1991)Production of butanol and ethanol from synthesis gasvia fermentation,Fuel,70,6154-619)。前者将以低浓度从合成气生产丁酸和丁醇而后者将摄入这些同时转化碳水化合物以生产更多丁醇。因为丙酮丁醇梭菌菌株能够生产15g/升丁醇，分离过程将是可行的。此类组合将提供产率和产物回收的一些增加，但需要两种不同类型的原料，合成气和碳水化合物，以及单独的生物反应器，一个用于气体转化而另一个用于碳水化合物转化，将是非常麻烦的。此外，在这个方案中，主要的原料是饲喂丙酮丁醇梭菌的碳水化合物，而不是饲喂甲基营养丁酸杆菌的更为经济的合成气，并且上述碳水化合物原料的全部限制将是普遍的。
合成气的更有效率的转化发生在当将其转化为乙醇和乙酸盐时。此类合成气转化的生物化学途径由Wood-Ljungdahl途径描述。将合成气发酵为乙醇和乙酸盐提供了若干优势，诸如生物催化剂的高特异性，较低的能量成本(因为低压和低温生物转化条件)，对生物催化剂中毒的更大的抵抗和对预先设定的H2比CO比率几乎没有限制(M.Bredwell等人(1999)Reactor design issues for synthesis-gas fermentations,BiotechnologyProgress 15,834-844)；(Klasson等人(1992),Biological conversion ofsynthesis gas into fuels",International Journal of Hydrogen Energy 17,第281页)。产乙酸菌是能够将合成气组分，如CO、CO2和H2还原性乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径转化为乙酸盐和乙醇的一组厌氧细菌。
已经分离了具有将合成气发酵为乙醇、乙酸和其他有用终产品的能力的若干种厌氧细菌。扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)和Clostridiumautoethanogenum，是首先得知的将CO,CO2和H2转化为乙醇和乙酸的生物中的两种。通常称为同型产乙酸菌的这些微生物具有将CO2还原为乙酸以生产所需要的能量和生产细胞群的能力。使用合成气组分的三种不同组合的乙醇合成的总体化学计量学如下(J.Vega等人(1989)The BiologicalProduction of Ethanol from Synthesis Gas,Applied Biochemistry andBiotechnology,20-1,第781页):
6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2
2CO2+6H2→CH3CH2OH+3H2O
6CO+6H2→2CH3CH2OH+2CO2
原理上根据之前给出的反应中的前两个，通过由同型产乙酸菌发酵CO和/或H2和CO2生产的主要产物是乙醇。同型产乙酸菌也可以生产乙酸盐。乙酸盐生产经由以下反应发生：
4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2
4H2+2CO2→CH3COOH+2H2O
扬氏梭菌，最先已知将合成气发酵为乙醇的自养微生物之一，于1987分离，作为同型产乙酸菌其在其活跃生长期喜好生产乙酸盐(产乙酸)而乙醇主要作为非生长相关产品产生(溶剂产生)(K.Klasson等人(1992)Biological conversion of synthesis gas into fuels,International Journal ofHydrogen Energy 17,第28l页)。
Clostridium autoethanogenum是严格厌氧的，革兰氏阳性的，成孢子的，棒状的，运动细菌，其代谢CO以形成乙醇、乙酸盐和CO2作为终产物，除其使用CO2和H2、丙酮酸盐、木糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖和L-谷氨酸作为底物的能力外(J.Abrini,H.Naveau,E.Nyns,),"Clostridiumautoethanogenum,Sp-Nov,an Anaerobic Bacterium That ProducesEthanol from Carbon-Monoxide",Archives of Microbiology,161(4),第345页，1994)。
厌氧产乙酸微生物提供了经由发酵过程将废气，诸如合成气，转化为有用的产物，诸如乙醇的可行的途径。此类细菌以比通过传统生产方法可达到的更高的特异性，更高的产率和更低的能量成本催化H2和CO2和/或CO转化为酸和/或醇。尽管在乙醇发酵中使用的许多厌氧微生物也生产丁醇作为次级产物，迄今，没有描述一种能够利用合成气发酵方法以生产高产率的丁醇的厌氧微生物。
因此本领域仍然需要在使用合成气作为主要的发酵底物生产丁醇中使用微生物的方法。
发明总结
本文提供的是生产丁醇的方法，所述方法包括在互养共培养物有效将气体底物转化为丁醇和/或丁酸的条件下将选自一氧化碳、二氧化碳和氢气或其组合的气体底物暴露于互养共培养物，所述互养共培养物包含具有Wood Ljungdahl途径的固定C1的同型产乙酸微生物和具有BuCoAAT途径和BuK途径中的至少一种的生产C4丁酸盐的微生物。
在本发明的特别的实施方案中气体底物包含CO和H2。在本发明的其他实施方案中气体底物是通过将天然气重整为CO、CO2，H2和CH4生产的合成气。
在本发明的特别的实施方案中互养共培养物生产丁酸并且固定C1的同型产乙酸微生物将丁酸转化为丁醇。在其他特别的实施方案中互养共培养物生产至少2克/升的丁醇。还在其他特别的实施方案中，互养共培养物生产n-丁醇。
在本发明的特别的实施方案中固定C1的同型产乙酸微生物选自Clostridium Coskatii、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、Clostridiumauthoethanogenium、和Clostridium ragsdalei。
在本发明的其他特别的实施方案中，生产C4-丁酸盐的微生物选自克鲁维梭菌(Clostridium kluyveri),Clostridium carboxidivorans,和甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)。还在本发明的其他实施方案中生产C4-丁酸盐的微生物使用BuCoAAT途径和/或BuK途径用于生产丁酸盐。
在本发明的特别的实施方案中通过如下形成互养共培养物：首先在适当的发酵条件下生长一种或多种固定C1的同型产乙酸微生物的第一培养物以生产浓度为至少1g/l的乙醇和乙酸盐，和然后用生产C4-丁酸盐的微生物的第二培养物接种第一培养物以生产互养共培养物。在本发明的一些实施方案中，互养共培养物可以在浮游生物反应器中形成并可以进一步从浮游反应器转移到膜支持的生物反应器中。
在本发明的特别的实施方案中将互养共培养物的pH维持在约5.0至7.0之间。
在本发明的其他方面提供了用于将合成气转化为丁醇的厌氧互养系统。该系统包含合成气、培养基、具有Wood Ljungdalii途径的固定C1的同型产乙酸微生物和具有BuCOAT途径和BuK途径中的至少一种的生产C4-丁酸盐的微生物。
在本发明的特别的实施方案中厌氧系统的固定C1的同型产乙酸微生物选自Clostridium Coskatii、扬氏梭菌、Clostridium authoethanogenium，和Clostridium ragsdalei。
在本发明的其他特别的实施方案中厌氧互养系统的生产C4-丁酸盐的微生物选自克鲁维梭菌、Clostridium carboxidivorans,和甲基营养丁酸杆菌。还在其他特别的实施方案中系统含有具有BuCoAT途径和BuK途径的一种或多种生产C4-丁酸盐的微生物。
仍然在本发明的其他特别的实施方案中，将厌氧互养系统的培养基的pH维持在约5.0至7.0之间。
本发明的具体优选的实施方案将从以下某些优选的实施方案和权利要求书的更为详细的描述中显而易见。
附图简述
本发明的这些和其他目的、特征和实施方案将从以下详细描述与附图的组合中更好地理解，其中：
图1是示意性转化途径的示意图，显示从合成气底物输入生产n-丁醇。
图2是产丁酸菌使用丁酰CoA乙酰转移酶途径转化乙酸盐和乙醇以生产丁酸盐的详细的示意图。
图3是产丁酸菌使用丁酰激酶途径转化乙酸盐以生产丁酸盐的详细的示意图。
图4是来自2升发酵运行的丁醇、乙酸盐、和乙醇生产的时间图。
图5是来自38,000升发酵罐的丁醇和乙醇生产和水力停留时间(HRT)的时间图。
发明详述
本发明提供了通过厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产丁醇和其他含有C4的产物的方法。在其他方面，本发明提供了用于将合成气转化为丁醇的厌氧系统。
如本文所用，合成气(synthesis gas)(合成气(syngas))是含有一氧化碳、二氧化碳和通常氢气的气体。“合成气”包括气流，其含有二氧化碳与氢气的组合并且可包括少量或不包括一氧化碳。“合成气”也可以包括可有少量或没有氢气的一氧化碳气流。
如本文所用，术语“互养的”指两种或多种不同类型(例如，生物、种群、株、种、属、科等)的厌氧微生物的关联，其能够形成紧密关联的代谢关系。
如本文所用，术语微生物的“共培养物”指互养微生物的联合孵育或共同孵育。在本发明的背景中，在互养微生物的联合孵育期间共培养物不需要细胞群生长。
在图1中说明的本发明的一个实施方案中，利用两类厌氧微生物以创造互养共培养物用于生产丁酸盐。互养共培养物中的第一类微生物是主要的固定C1的同型产乙酸微生物，其利用合成气作为唯一碳源和电子源并且生产C1化合物诸如乙醇和乙酸盐作为异化代谢产物。互养共培养物中的第二类微生物能够在固定C1的同型产乙酸微生物的异化代谢物(乙醇和乙酸盐)上生长作为其唯一碳源和/或电子源以生产C4碳分子，诸如丁醇或丁酸，作为其主要产物或连同合成气(作为额外的碳源和/或电子源)将固定C1碳的微生物的代谢物转化为C4碳分子。该第二种微生物在本文应当称为生产C4丁酸盐的微生物。有利地，固定C1的同型产乙酸微生物也可以能够将由生产C4的微生物生产的丁酸盐转化为丁醇并且更通常转化为n-丁醇。术语“丁醇”指C4醇的全部4种异构体(例如，2-丁醇、异丁醇、l-丁醇和叔丁醇)并且术语“n-丁醇”指1-丁醇。
本发明的固定C1的微生物也是同型产乙酸菌。在厌氧条件下，同型产乙酸菌具有从底物，CO+H2O、或H2+CO2或CO+H2+CO2生产乙酸和乙醇的能力。CO或CO2提供了碳源并且H2或CO提供了电子源，用于生产乙酸和乙醇的反应。适用于本发明方法中的固定C1的微生物包括，但不限于，同型产乙酸菌诸如扬氏梭菌,Clostridium autoethanogenum,Clostridium ragsdalei,和Clostridium coskatii。适用于本发明的额外的固定C1的微生物包括Alkalibaculum bacchi,Clostridium thermoaceticum,和醋酸梭菌(Clostridium aceticum)。
在特别的实施方案中，互养的生产C4的微生物是能够在作为其主要碳源的乙醇和/或乙酸盐上生长的产丁酸菌。如本文所称的产丁酸菌指能够将合成气中间物，诸如乙醇和乙酸盐，以及一些将氢气主要转化为n-丁酸盐的任何微生物。本发明的产丁酸菌利用丁酸盐生产的两种不同途径-丁酰CoA乙酰转移酶途径(在图2和3中显示)和丁酰激酶(BuK)途径(在图3中显示)中的至少一种。从图2能够看出，丁酰CoA乙酰转移酶(BuCoAAT)途径将乙醇和乙酸盐转化为丁酸盐：
如图3中所示，BuK途径将乙酸盐和氢气转化为丁酸盐。
在BuCOAAT途径中，通过丁酰CoA中间体将乙醇和乙酸盐转化为丁酸盐。相似地，乙酸盐加上通过H2氧化的还原当量通过丁酰CoA中间体转化为丁酸盐。途径不同在于其从丁酰CoA至丁酸盐的转化步骤。BuCOAAT途径通过BuCOAAT酶将丁酰CoA转化为丁酸盐而BuK途径通过BuK酶转化丁酰CoA。
适用于本发明的产丁酸菌包括含有BuCoAAT途径和BuK途径中的一者或两者且能够在乙酸盐和乙醇上或在乙酸盐和通常在合成气中发现的氢气上生长的任何微生物。
尽管已知许多微生物从多种碳水化合物源生产丁酸盐(丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌、拜氏梭菌、巴氏梭菌、巴克氏梭菌、热丁酸梭菌、丁酸弧菌、八叠球菌属、真细菌属、梭杆菌属，和巨型球菌属)，仅一些已知专有地在乙醇、乙酸或合成气上生长。迄今已经鉴定的微生物为克鲁维梭菌,Clostridium carboxidivorans,和甲基营养丁酸杆菌。
本发明的同型产乙酸生物具有主要的Wood Ljungdahl途径以将来自合成气进料的CO和H2/CO2转化为乙醇和乙酸盐，所述乙醇和乙酸盐然后由产丁酸菌利用以生产丁酸盐。同型产乙酸菌能够摄取丁酸盐并非常有效率地将其转化为n-丁醇因为有利的热动力学。可以发展此类互养以形成非常紧密的关联从而使得物种间质子和电子和物种转移在非常短距离间(约1微米)非常有效率地发生。此类条件在单发酵罐系统中实现好的产物浓度(8-10g/升n-丁醇)和产率(～80％的电子至n-丁醇)。微生物和底物的该组合较之单培养物发酵生产的n-丁醇极大地提高了n-丁醇生产。
本文提供的同型产乙酸菌与产丁酸菌的配对展示了相对于现有技术的巨大进步。表1显示了单培养物生产与使用互养培养物的比较。如结果所示，实现了n-丁醇浓度的4倍增加。因此，在本发明的特别的实施方案中实现了从合成气直接生产丁醇的高产率，这导致从多种原料经济和有效率的生产丁醇的方法。
表I
本发明的不同微生物培养物之间的成功的互养关系需要使同型产乙酸菌和产丁酸菌物理上彼此相关联。在特别的实施方案中，将具有主要的Wood Ljungdahl途径的转化C1的同型产乙酸菌与产丁酸菌在紧密混合的共培养物中集合在一起。例如，首先通过在合成气进料上生长单个物种或已知同型产乙酸菌物种的组合形成互养共培养物。同型产乙酸菌继续生长直到其生产乙醇和乙酸盐，通常浓度为至少1g/l并且更通常为范围8至15g/l的中等浓度范围和产生约2.0的光密度(O.D.)的细胞浓度。一旦同型产乙酸菌已经生产了想要的浓度的乙醇和乙酸盐并且发酵罐已经到达了想要的O.D.，用从在乙酸盐、乙醇和合成气上生长富集的一种或多种选择的产丁酸菌物种接种同型产乙酸菌。通过维持生长和运行条件诸如pH、稀释速度、关键养分等，形成了在不同的微生物之间形成非常紧密的关联的稳定的互养共培养物。
本领域技术人员将知晓起始和生长共培养物的其他方法。此类方法可包括使用不同底物以首先生长产丁酸菌并然后用同型产乙酸菌接种含有产丁酸菌的发酵培养基。建立能够将合成气转化为丁醇的互养关联的另一种方法涉及生长两种或多种确定的培养物并建立这些单独培养物的配对。
配对的另一方法涉及在发酵罐中使用乙醇和乙酸盐作为底物首先生长生产C4的产丁酸菌直到已经达到丁酸和丁醇的最大生产力目标。一旦已经达到最大生产力目标后，将固定C1的同型产乙酸菌的种子培养物直接添加至含有产丁酸菌培养物的发酵罐中。逐渐增加合成气传质至发酵容器以平衡固定C1的同型产乙酸菌的气体消耗。用于生长产丁酸菌的乙醇或乙酸盐逐渐降低至0因为固定C1的同型产乙酸菌开始提供此底物。
建立互养培养物的该上一方法的修饰涉及在具有静态的或在发酵罐内漂浮的生物膜支持材料的发酵罐中首先生长生产C4的产丁酸菌培养物。此类材料的实例是Mutag Biochips。此方法允许产丁酸菌微生物在载体材料上首先建立生物膜从而增加细胞保留时间对发酵罐的HRT。又一次，在用固定C1的同型产乙酸菌接种发酵罐前达到目标产丁酸菌生产力。
建立能够从合成气生产丁醇的互养培养物的另一方法涉及最初共同混合两种或多种培养物，其中一种是能够在合成气上生长并生产乙醇和乙酸盐的固定C1的同型产乙酸菌。另一培养物是能够将乙醇或乙酸盐转化为丁酸盐的生产C4的产丁酸菌。可以逐渐将乙醇和乙酸盐进料降低至0随着这些底物由固定C1的同型产乙酸菌的生产增加以平衡产丁酸菌生产的底物需要。
本发明的方法可以在本领域技术人员所知的若干类型的发酵装置中的任一种中进行，具有或没有额外的修饰，或在当前正在开发中的其他类型的发酵仪器中进行。实例包括但不限于常规的搅拌罐发酵罐(CSTRS)、气泡柱生物反应器(BCBR)、膜支持的生物反应器(MSBR)、两段式生物反应器、滴流床反应器、膜反应器、含有固定化的细胞的填充床反应器，等。生物反应器也可包括具有固定化的或悬浮的细胞的柱发酵罐，连续流动型反应器、高压反应器、或具有细胞循环的悬浮的细胞反应器。此外，可以在含有任何上述反应器的串联和/或平行反应器系统中安排反应器。例如，多个反应器在一组条件下可用于生长细胞并在另一组条件下生成n-丁醇(或其他产物)并具有最少生长。
用于实践本发明的生物反应器的类型可影响建立共培养物的必要紧密关联。例如，在浮游生物类型生物反应器的情况下，互养共培养物可以在生长期继续并传代至多至较大的发酵容器。在MSBR的情况下，可使用来自浮游生物发酵罐的建立的共培养物以接种膜。然而，也可以通过在添加同型产乙酸菌和添加产丁酸菌之间交替的一系列接种物来接种MSBR。
这些装置将用于发展和维持用于建立互养代谢关联的固定C1的同型产乙酸菌和产丁酸菌培养物。此类装置的主要要求包括：
a.无菌；
b.厌氧条件；
c.用于维持温度、压力和pH的适当的条件；
d.对培养物供给充足的底物量；
e.进行最优传质以对发酵基质提供气体
e.可以从细菌肉汤容易地回收发酵的终产物。
优选地在接种过程中添加适当的气态碳和电子源。除了那些已经描述的，这些气态源来自广泛范围的材料并包括“废”气诸如合成气、油精炼废气、制钢废气、蒸汽产生的“废”气、天然气或石脑油的自热或组合重整、生物质的生物气和产物、煤或精炼残余物气化或后者的混合物。来源可包括气体(含有一些H2)，其是由酵母、梭菌发酵物、和气化的纤维素材料生产的。此类气态底物可作为其他过程的副产物生产或可特异性地生产用于本发明的方法中。本领域技术人员将认识到底物气体的任何来源可用于本发明的实践中，只要能够在适于细菌实施发酵反应的条件下为共培养物的微生物提供充足量的底物气体。
在本发明的一个实施方案中，CO、CO2和H2的来源是合成气。用作底物的合成气可例如，作为煤或精炼残余物气化的气态产物获得。
除了如所描述的那些来源之外，也可以通过容易获得的低成本农业原材料的气化生产合成气明确用于细菌发酵的目的，从而提供将生物质间接发酵为醇的途径。存在多种能够转化为合成气的原材料的实例，因为多数类型的植物可用于此目的。适当的原材料包括，但不限于，多年生牧草诸如柳枝稷、作物残余物诸如玉米秸、加工废料诸如锯屑、来自甘蔗收获(甘蔗渣)或棕榈油生产的副产物，等。本领域技术人员熟知从此类起始材料生成合成气。一般而言，在气化炉中从干燥的生物质主要通过热解、部分氧化和蒸汽重整生成合成气，主要产物是CO，H2和CO2。术语“气化”和“热解”指相似的过程；两个过程均限制生物质所暴露于的氧气的量。术语“气化”有时用于包括气化和热解两者。
也可以使用进料入发酵过程中的底物气体的组合来源以改变生物反应器的进料气流中组分的浓度。例如，CO,CO2和H2的主要来源可以为通常展示出37％CO,35％H2,和18％CO2的浓度比例的合成气，但合成气也可以补充有来自其他来源的气体以富集CO(即，轧钢废气富含CO)或H2的水平。
本发明的互养共培养物必须在厌氧条件下培养和使用。如本文所用，“厌氧条件”意为在微生物所暴露的环境的气相中氧气(O2)的水平低于百万分之0.5。本领域技术人员将熟悉用于培养这些微生物的标准厌氧技术(Balch和Wolfe(1976)Appl.Environ.Microbiol.32:781-791；Balch等人,1979,Microbiol.Rev.43:260-296)，其通过引用并入本文。建立的共培养物的其他运行条件将通常包括处于5至7的范围的pH。
用于生长和维持互养共培养物或用于顺序发酵的单独生长的培养物的适当的培养基组合物包括确定的培养基制剂。从储液制备标准生长培养基，其导致以下最终成分每升培养基。给出的量为克除非另外声明。矿物质：NaCl,2；NH4Cl,25；KCl,2.5；KH2PO4,2.5；MgSO4·7H2O,0.5；CaCl2·2H2O,0.1.痕量金属:MnSO4·H2O,0.01；Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O,0.008；CoCl2·6H2O,0.002；ZnSO4·7H2O,0.01；NiCl2·6H2O,0.002；Na2MoO4·2H2O,0.0002,Na2SeO4,0.001,Na2WO4,0.002。维生素(量,mg):吡哆醇HCl,0.10；硫胺素HCl,0.05,核黄素,0.05；泛酸钙,0.05；硫辛酸,0.05；p-氨基苯甲酸,0.05；烟酸,0.05；维生素B12,0.05；巯基乙醇磺酸,0.05；生物素,0.02；叶酸,0.02。以0.1g/L的半胱氨酸(游离碱)；和0.1Na2S·2H2O的终浓度向培养基添加还原剂混合物。也可以通过酵母提取物或玉米浆提供或用此类液体补充培养基成分。
一般而言，将允许互养共培养物的发酵继续进行直到在发酵培养基中生产想要的水平的丁醇。优选地，生产的丁醇的水平处于2克/升至75克/升的范围并且最优选地处于6克/升至15克/升的范围。备选地，当达到某生产速度时可以停止生产，例如，当想要的产物的生产速度已经降低由于，例如，细菌废物积累、底物可用性降低、产物的反馈抑制、活细菌数降低、或由于本领域技术人员所知的任何其他原因中的任一种。此外，存在连续发酵技术，其允许连续补充新鲜培养基而同时移出使用的培养基，包括其中的任何液体产物(即恒化器模式)。也可以使用细胞循环技术以控制细胞密度和因此发酵罐的容积生产率。
由本发明的微生物生产的产物可以从培养物中移出并通过本领域技术人员已知的若干种方法中的任一种纯化。例如，可以通过在大气压或在真空下蒸馏，通过吸收或通过其他基于膜的分离方法诸如渗透蒸发、蒸气渗透等移出丁醇。
更特别地在以下描述本发明并且本文示出的实施例旨在仅作为说明性的，因为其中多种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的。如本文说明书和其后权利要求书全文中所用，单数形式“a”，“an”和“the”的意义包括复数参考除非上下文明确指示。说明书中使用的术语一般而言在本发明的背景中，和在每个术语使用的具体背景中，具有其在本领域中的普通含义。已经更具体地定义了一些术语以为从业者提供关于本发明的描述的额外的指导。
实施例
以下实施例说明本发明的具体实施方案及其多种使用。其仅以解释性的目的示出，并且不被理解为是限制本发明。
实施例1
同型产乙酸菌与产丁酸菌的稳定互养配对的建立
运行2升发酵实验以建立类型菌株同型产乙酸菌，Clostridiumautoethanogenum,和产丁酸菌的混合的培养物的互养配对。Clostridiumautoethanogenum的混合的培养物首先在最少培养基和具有H2-56％,CO-22％,CO2-5％,和CH4-17％(mol％)的组成的合成气上，60mL/min气体流动速率和500-600rpm之间的搅拌生长至O.D.1.7。在添加200mL混合的产丁酸菌培养物时，乙醇和乙酸盐浓度分别为10和5g/L。图4显示了在添加混合的产丁酸菌培养物时发酵罐中乙醇、乙酸盐和丁醇的浓度。丁酸盐和丁醇浓度缓慢增加并且在用产丁酸菌接种6天后，丁醇和丁酸盐浓度分别达到8.4和3.8g/L。丁醇和丁酸盐的增加与乙醇和乙酸盐分别降低至1.8和2.0的浓度相符合。在这个时间期间，多于70％的作为合成气消耗的电子被转化为丁醇和丁酸盐。
实施例2
单步试验性规模BCBR中丁醇生产的实例
首先将38,000升试验性规模鼓泡柱生物反应器(BCBR)达到生溶剂条件，生产多于12g/L的乙醇。对反应器加料合成气作为唯一的碳源和电子源以支持同型产乙酸菌，Clostridium autoethanogenum的生长。平均上合成气的组成是H2-39、CO-29、CO2-17，和CH4-15(mol％)并且在总发酵罐体积26,000升中合成气添加的速率从35至1441b/hr变化。发酵容器的HRT从发酵开始时的8天缓慢逐步降低至800小时时的3.3天。图5是38,000升发酵罐的丁醇和乙醇生产和水力停留时间(HRT)的时间图。800小时后，用产丁酸菌培养物接种生产乙醇的发酵。添加产丁酸菌培养物和HRT进一步降低后，显示丁醇浓度的增加(图5)。一旦观察到初始丁醇生产，HRT进一步降低至2.5天。在这些条件下丁醇浓度上升并保持在高于4g/L并且在接下1000小时中渐进地上升为高至8g/L。增加HRT至9天进一步增加丁醇浓度至总共9g/L。当发酵为2.5天HRT时丁醇浓度最高。在此1000小时时间段中，从合成气消耗到发酵产物的电子流显示60-80％的电子作为丁醇产物终结。

Claims (12)

1.生产丁醇的方法，所述方法包括在互养共培养物有效将气体底物转化为丁醇的条件下将选自由一氧化碳、二氧化碳和氢气或其组合组成的组的气体底物暴露于互养共培养物，所述互养共培养物包含：具有WoodLjungdahl途径的固定C1的同型产乙酸微生物；和具有BuCoAAT途径和BuK途径中的至少一种的生产C4的丁酸盐微生物。
2.权利要求1的方法，其中互养共培养物还生产丁酸并且固定C1的同型产乙酸微生物将丁酸转化为丁醇和/或n-丁醇。
3.权利要求1的方法，其中固定C1的同型产乙酸微生物选自由Clostridium Coskatii、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、Clostridiumauthoethanogenium、和Clostridium ragsdalei组成的组；丁酸盐微生物使用BuCoAAT途径和BuK途径用于生产丁酸盐；并且生产C4的丁酸盐微生物选自由克鲁维梭菌(Clostridium kluyveri)、Clostridium carboxidivorans、和甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)组成的组。
4.权利要求3的方法，其中通过如下形成互养共培养物：首先在适当的发酵条件下生长一种或多种固定C1的同型产乙酸微生物的第一培养物以生产浓度为至少1g/l的乙醇和乙酸盐，和然后用生产C4的丁酸盐微生物的第二培养物接种第一培养物以生产互养共培养物。
5.权利要求4的方法，其中在浮游生物反应器中形成互养共培养物。
6.权利要求8的方法，其中将互养共培养物从浮游反应器转移到膜支持的生物反应器中。
7.权利要求1的方法，其中气体底物包含CO和H2并且气体底物是通过将天然气重整为CO、CO2、H2和CH4生产的合成气。
8.权利要求1的方法，其中互养共培养物的pH维持在约5.0至7.0之间。
9.权利要求2的方法，其中互养共培养物生产至少2克/升的丁醇。
10.用于将合成气转化为丁醇的厌氧互养系统，所述系统包含合成气，培养基，具有Wood Ljungdalii途径的固定C1的同型产乙酸微生物和具有BuCOAT途径和BuK途径中的至少一种的生产C4的丁酸盐微生物。
11.权利要求10的厌氧互养系统，其中固定C1的同型产乙酸微生物选自由Clostridium Coskatii、扬氏梭菌、Clostridium authoethanogenium，和Clostridium ragsdalei组成的组系统含有具有BuCOAT途径和BuK途径的一种或多种生产C4的丁酸盐微生物，并且生产C4的丁酸盐微生物选自由克鲁维梭菌、Clostridium caroxidivorans和甲基营养丁酸杆菌组成的组。
12.权利要求10的厌氧互养系统，其中培养基的pH维持在约5.0至约7.0之间。
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